CN107779466A - 用于高等真菌基因中断的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于高等真菌基因中断的方法，通过将含有密码子优化的Cas9基因的表达载体转入单倍体灵芝(Ganoderma lucidum，CGMCC NO.5.26)中，获得了可稳定表达Cas9蛋白的灵芝菌株；然后将经体外转录的gRNA转入此表达Cas9蛋白的灵芝菌株中，通过gRNA识别靶向基因，实现靶向基因的特定位点的中断，并以U6snRNA启动子介导gRNA内源转录，同样使靶向基因的特定位点中断。本发明以灵芝作为模式物种，提供了包含密码子优化的Cas9基因的表达载体和宿主细胞，提供了通过外源转录合成gRNA或内源U6small nuclear RNA(U6 snRNA)启动子转录合成gRNA两种方式构建CRISPR/Cas9基因组编辑的方法。

Description

用于高等真菌基因中断的方法
技术领域
本发明涉及的是一种基因工程领域的技术，具体是一种利用CRISPR/Cas9技术的原理，将Cas9基因及特异的gRNA导入高等真菌细胞从而实现基因中断的方法。
背景技术
高等真菌(higher fungi or mushrooms)是指能形成大型子实体，菌丝含有隔膜，并且在有性生殖阶段能产生分生孢子的真菌，包括部分子囊菌(Ascomycotina)、担子菌(Basidiomycotina)和半知菌(Deuteromycotina)，常见的高等真菌有茯苓、银耳、冬虫夏草、猴头、香菇、灵芝等。高等真菌是天然产物的宝库，它们所产的真菌多糖、甾醇、生物碱、萜类具有提高人体免疫力、抗肿瘤、抗菌等生物活性。因此，高等真菌是具有强大的药物生产潜力的一类微生物，受到学术界和工业界的广泛关注。
然而，高等真菌中缺乏成熟的遗传操作***，特别是基因中断技术，极大的限制了人们对该类微生物代谢调控的认识，以及进一步的遗传改造。在已有的报道中，基因中断主要是通过同源重组的方式进行的，而高等真菌中同源重组效率极低，比如，在裂褶菌(Schizphylhlscommne)中同源重组的比例仅为3.25％，在对现有方法进行改进的尝试中，研究者通过预先敲除裂褶菌的ku80基因，减少非同源性末端连接(NHEJ)的发生几率，使得同源重组效率提高，通过这一方式人们在裂褶菌、平菇、灰盖鬼伞等个别高等真菌中应用了基因中断技术。然而该技术还存在很大的问题，需要预先以同源重组的方式敲除ku80/ku70基因，存在操作困难、效率低下、耗时耗力等问题，大大限制了这一技术的可行性；同时ku80基因的缺失会大大降低原生质体的再生率从而降低基因转化效率，因此大多数具有重要药用价值的高等真菌如茯苓、灵芝、香菇等尚未见基因中断的报道。(Lugones,L.G.,De Jong,J.F.,De Vries,O.M.H.,Jalving,R.,Dijksterhuis,J.,&H.A.B.Mol Microbiol,2004,53(2):707-716.De Jong,J.F.,Ohm,R.A.,De Bekker,C.,H.A.,&Lugones,L.G.FEMS Microbiol Lett,2010,310(1):91-95.Takahashi,T.,Masuda,T.,&Koyama,Y.Mol Genet Genomics,2006,275(5):460-470.)
近年来，CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats,CRISPR associated protein 9)技术迅猛发展，是目前最流行的基因编辑技术，它可以通过由特定RNA(gRNA)介导的Cas9核酸酶在目标序列上引入DNA双链缺口，从而实现靶向基因的中断失活、敲除等。至今，CRISPR/Cas9技术仅在酵母(Saccharomycescerevisiae)、曲霉(Aspergillus niger)、木霉(Trichoderma reesei)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)等低等真菌中有相关报道(Bao,Z.,Xiao,H.,Liang,J.,Zhang,L.,Xiong,X.,Sun,N.,...&Zhao,H.ACS Synth Bio,2014,4(5):585-594.C.S.,Nielsen,J.B.,Kogle,M.E.,&Mortensen,U.H.PloS One,2015,10(7):e0133085.Liu,R.,Chen,L.,Jiang,Y.,Zhou,Z.,&Zou,G.Cell Discovery,2015,1:15007.Schuster,M.,Schweizer,G.,Reissmann,S.,&Kahmann,R.Fungal Genet Bio,2016,89:3-9.)，而尚未见CRISPR/Cas9技术在高等真菌中的成功报道。
虽然CRISPR/Cas9技术存在效率高、专一性强、操作简便等优点，但由于高等真菌遗传背景不清楚，在该类微生物中开发CRISPR/Cas9技术有两大挑战，一是获得适合在高等真菌中表达的Cas9基因，二是确保能在高等真菌中有效表达的gRNA。在本发明中以灵芝(Ganoderma lucidum)这一中国传统的药用高等真菌作为模式生物(现阶段还无法得到基因中断的菌株)，研究CRISPR/Cas9技术在高等真菌中应用的可能性，这一技术的研究可以为今后其他高等真菌的基因中断工作奠定基础。同时，一种高效、简便的基因中断方式为高等真菌基因功能的研究提供了技术平台，对于很多药用活性成分相关基因的解析存在重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种用于高等真菌基因中断的方法，以灵芝作为模式物种，提供了包含密码子优化的Cas9基因的表达载体和宿主细胞，提供了通过外源转录合成gRNA或内源U6small nuclear RNA(U6snRNA)启动子转录合成gRNA两种方式构建CRISPR/Cas9基因组编辑的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明通过外源转录合成单倍体灵芝(Ganoderma lucidum，CGMCC NO.5.26)的gRNA或内源U6small nuclear RNA(U6snRNA)启动子以体外转录或内源转录合成gRNA构建CRISPR/Cas9基因组编辑的方法。
所述方法具体为：通过将含有密码子优化的Cas9基因的表达载体转入单倍体灵芝(Ganoderma lucidum，CGMCC NO.5.26)中，获得了可稳定表达Cas9蛋白的灵芝菌株；然后采用体外转录的方式，将经体外转录的gRNA转入此表达Cas9蛋白的灵芝菌株中，通过gRNA识别靶向基因，实现靶向基因的特定位点的中断；或采用内源转录的方式，以U6snRNA启动子介导gRNA内源转录，同样使靶向基因的特定位点中断。
所述的基因中断，优选在另一株市售的灵芝(红芝，赤芝)Ganoderma lucidum中进行方法验证，该灵芝在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)中保藏编号为5.616。
所述的gRNA，即针对灵芝ura3基因序列设计的靶向识别序列，包括：
gRNA1序列，即5’GGAGCAGAAGCCCCCTGCCA 3’，具体如SEQ ID No.26所示，
gRNA2序列，即5’GGCCTCTTCCGTGTATGAGC 3’，具体如SEQ ID No.27所示，以及
gRNA3序列，即5’AACCGGCTCATACACGGAAG 3’，具体如SEQ ID No.25所示。
所述的体外转录，即构建gRNA1和gRNA2体外转录的DNA模版，通过MEGAscript T7进行体外转录。
所述的内源转录，即根据具有RNA polymerase III活性的灵芝内源的U6snRNA启动子构建内源gRNA表达载体pU1-gRNA3和pU4-gRNA3，通过MEGAscript T7进行内源转录。
本发明还涉及一种密码子优化的Cas9基因，含有SV40NLS核定位信号，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明进一步涉及一种以优化的Cas9基因为基础的表达载体，该表达载体为pMD-Glcas9质粒，其骨架为pMD18-T，且含有上述Cas9基因、启动子Pgpd、终止子Tpdc以及选择标记基因sdhB。
所述的启动子Pgpd为：来源于灵芝Ganoderma lucidum的gpd组成型启动子。
所述的终止子Tpdc为：来源于木霉Trichoderma reesei的pdc终止子。
所述的选择标记基因sdhB为：来源于灵芝Ganoderma lucidum的sdhB点突变基因，具有carboxin的抗性，其记载于Xu,J.W.,Xu,Y.N.,&Zhong,J.J.Appl environMicro.2012,78(22),7968-7976.
本发明进一步涉及一种遗传工程化的宿主细胞，其具有上述表达载体或具有上述Cas9基因。
所述的宿主细胞为高等真菌细胞，不局限于灵芝(Ganoderma sp.)。
本发明进一步涉及一种用于高等真菌、含有RNA polymerase III活性的U6snRNA内源启动子，该内源启动子来源于灵芝(Ganoderma lucidum，CGMCC No.5.26)，这是在高等真菌中发现的首个具有RNA polymerase III活性的启动子。
所述的灵芝Ganoderma lucidum，采用市售的灵芝(红芝，赤芝)Ganodermalucidum经原生质体制备分离得到的单倍体，并经全基因组测序(Chen,S.,Xu,J.,Liu,C.,Zhu,Y.,Nelson,D.R.,Zhou,S.,...&Luo,H.Nat Commun.2012,3,913.)，该灵芝在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)中保藏编号为5.26。
上述细胞的培养及筛选所用到的培养基有：
①土豆汁-葡萄糖-琼脂(PDA)培养基，其组分及含量为：葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾3.0g/L，维生素B1 0.05g/L，土豆汁1L；其制备方法为：将200g去皮新鲜土豆切成小块，加入去离子水1L，煮沸30min，用八层纱布过滤，取滤液，重新定容成1L。
②液体种子培养基，其组分及含量为：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏2.5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，七水硫酸镁0.5g/L，维生素B1 0.05g/L。用稀硫酸调节pH到5.5。
③CYM培养基，其组分及含量为：葡萄糖20g/L，麦芽糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏2g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾4.6g/L，琼脂10g/L，pH自然，溶于1L的0.6mol/L甘露醇渗透压稳定剂中
④基本培养基，其组分及含量为：L-天冬酰胺2g/L，尿嘧啶0.5g/L，葡萄糖20g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾0.46g/L，磷酸氢二钾1g/L，维生素B1 0.125g/L，琼脂10g/L，pH自然，溶于1L的0.6mol/L甘露醇渗透压稳定剂中。
⑤上层选择性培养基，具体为：含有浓度为0.8％的低熔点琼脂糖的CYM培养基或基本培养基。
技术效果
与现有技术相比，本发明通过gRNA体内和体外转录的两种方式中断靶基因序列；高等真菌由于同源重组效率低，很多种属还没有建立基因中断的平台，而对于个别依赖敲除ku80/ku70基因提高同源重组效率而进一步建立基因中断技术的菌株，获得敲除ku80/ku70基因的出发菌株也基于菌株较低的同源重组效率，该过程耗时长、难度大、且不具备推广性，本发明利用CRISPR技术在靶基因序列引入双链DNA缺口，迫使菌株为了修复缺口发生NHEJ和/或提高其同源重组的效率进而中断目的基因，操作简便，可以获得大于9个基因中断的菌株/108个原生质体细胞；该方法可广泛适用于各类高等真菌的基因中断，给高等真菌的遗传改造带来极大的便利，为更好的研究其基因的功能奠定基础。
附图说明
图1为表达载体pMD-Glcas9质粒示意图；
图2为验证Cas9在灵芝5.26中的表达情况的Western Blot图；
图中：泳道M为蛋白Marker(分子量从上到下依次约为170,130,100,70,55,40,35kDa)，泳道1为已有的Cas9蛋白，作为阳性对照，泳道2是灵芝野生型的胞内蛋白，泳道3是Cas9灵芝转化子培养3天后抽提的胞内蛋白，Cas9蛋白大小约为150kDa；
图3为gRNA体外转录验证图；
图中：泳道M为DS-2000DNA Marker电泳结果(片段从上到下依次为2000,1000,750,500,250,100bp)泳道1，2为稀释后gRNA体外转录产物；
图4为gRNA外源转录后转化灵芝5.26，对转化子的ura3基因测序验证是否发生基因中断；
图中：WT是野生型灵芝基因序列，图A的靶标序列为5'GGAGCAGAAGCCCCCTGCCA 3'，图B为5'GGCCTCTTCCGTGTATGAGC 3'；其中，1-3为ura3基因功能中断的灵芝转化子；
图5为gRNA内源表达载体转化(红芝，赤芝，Ganoderma lucidum CGMCC No.5.616)时，对转化子ura3基因测序验证是否发生基因中断；
图中：WT是野生型灵芝(红芝，赤芝，Ganoderma lucidum CGMCC No.5.616)的基因序列，1-9号为ura3中断的灵芝转化子，10号为未发生基因中断的转化子。
具体实施方式
实施例1
Cas9基因的密码子优化和基因的分离。
本实施例具体操作包括：通过对Streptococcus pyogenes的Cas9编码基因进行分析，结合灵芝基因组中的密码子偏好性，将Cas9编码基因作如Seq ID No.1的优化(含SV40NLS入核信号)。基因合成由金斯瑞公司(南京，中国)完成。通过引物Cas9-F:5’ATGGACAAGAAGTACAGCATCGG3’(Seq ID No.2)和Cas9-R:5’TTAGACCTTGCGCTTCTTCTTGGG 3’(Seq ID No.3)可以PCR分离获得该密码子优化的Cas9基因。
所述的密码子优化的Cas9基因的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，该序列(SEQ IDNo.1)由4140个脱氧核苷酸组成，自SEQ ID No.1的5’端的第1-4140位的核苷酸为Cas9基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，自SEQ ID No.1的5’端的第1-3位核苷酸为Cas9基因的起始密码子ATG，SEQ ID No.1的5’端的第4138至4140位核苷酸为终止密码子TAA，自SEQ ID No.1的5’端的第4至4116为Cas9蛋白编码序列，其中SEQ ID No.1的5’端的第10至3147位为RuvC-like nuclease domain，其中SEQ ID No.1的5’端的第2461至2616位为HNH-nuclease domain，自SEQ ID No.1的5’端的第4117至4137位核苷酸所编码的是SV 40NLS入核信号。
如本文所用，术语“优化的Cas9”、“密码子优化的Cas9”、“优化的Cas9基因”、“密码子优化的Cas9基因”指具有序列SEQ ID No.1或其变异形式或衍生物的多核苷酸，能够编码Streptococcus pyogenes的Cas9蛋白。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的，DNA可以是编码链或非编码链。SEQ ID No.1的多核苷酸包括：只编码部分成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
实施例2
构建密码子优化的Cas9基因表达载体，并将其转化入灵芝细胞。
本实施例通过以pMD18-T(含有Amp筛选标记，购自Takara公司)为骨架，构建含有密码子优化的Cas9表达载体，使用灵芝内源的gpd组成型启动子，木霉pdc终止子，灵芝内源sdhB抗性基因(具有carboxin抗性表型)，此表达载体用于灵芝细胞转化。
1)灵芝基因组DNA的提取。
称取0.1-0.2g冻干灵芝菌丝体(Ganoderma lucidum，CGMCC NO.5.26)在液氮中研磨成粉末，将粉末转入1.5mL，经65℃预热的CTAB抽取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，20mmol/L EDTA-Na2，1.4mol/L NaCl，2％CTAB，使用前加入0.1％(V/V)的β-巯基乙醇)中，65℃保温30min，然后在4℃下10000g离心20分钟，取上清液加等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，轻轻摇匀30分钟以上，4℃下10000g离心20分钟。将上清液移入1.5mL离心管后，加入2/3体积经-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5分钟，去除上清后，用75％的乙醇洗涤2-3次，室温晾干后，溶于适量含20g/mL RNase的TE，37℃消化RNA 30min。
2)构建Cas9表达载体。
首先用引物Cas-1-F和Gpd-cas-R从灵芝基因组中扩增获得gpd启动子，用引物Sdh-MD-F和Sdh-cas-R从pJW质粒(Xu,J.W.,Xu,Y.N.,&Zhong,J.J.Appl environMicro.2012,78(22),7968-7976.)中PCR扩增获得sdhB抗性基因，用引物Pdc-F和Pdc-MD-R从木霉基因组(来源中科院植物生理生态研究所)中扩增pdc终止子。之后，以表达质粒pMD18-T为骨架，将Pgpd，Tpdc，sdhB，Cas9基因通过Gibson一步克隆(NEB公司)的方式构建载体，具体构建方式见NEB网站(https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#tabselect2)。转化入克隆宿主Escherichia.coli DH5α中，通过序列验证成功构建Cas9表达载体pMD-Glcas9。
所述的引物，依次如Seq ID No4～No9所示。如下：
Cas-1-F：5’TCCAAAGCCGCTCTCATGGCAT 3’(Seq ID No.4)
Gpd-cas-R：5’GGCCGATGCTGTACTTCTTGTCCATGTTGAGAGGGGGATGAAGAGT 3’(Seq IDNo.5)
Sdh-MD-F：5’TCTGCTCTTCCCGATTGCTGTGCCTGCAGGTCGACGATTACTAGTTGCTCTTCCCGATTGCTGCAT 3’(Seq ID No.6)
Sdh-cas-R：5’TGCCATGAGAGCGGCTTTGGAGCGGCCGCTATGTCTTGCCTTGTCTCG 3’(SeqID No.7)
Pdc-F：5’AAGAAGCGCAAGGTCTGACCCGGCATGAAGTCTGACCG 3’(Seq ID No.8)
Pdc-MD-R：5’ACCCGGGGATCCTCTAGAGATTTGGACGCCTCGATGTCTT 3’(Seq ID No.9)
3)灵芝原生质体的制备和转化。
用溶壁酶处理灵芝菌丝得到灵芝原生质体。将原生质体用160μL STC缓冲液(0.55M的山梨醇，0.1M的Tris-Hcl缓冲液，0.5M的氯化钙，pH为8.0)悬浮，加入1μg质粒DNA、1μg肝素钠以及60μL PTC缓冲液(40％PEG4000(W/V)，0.1M的Tris-HCl缓冲液，1M的氯化钙，pH为8.0)，冰浴30分钟后加入1mL PTC缓冲液混匀，28℃放置30分钟，加入到CYM固体原生质体再生培养基上，30℃放置12小时，加入含有carboxin抗性的上层选择性培养基，使carboxin终浓度为2mg/L，30℃放置20天后可见若干单菌落。
4)灵芝异源表达Cas9蛋白的Western blot验证。
离心收集菌丝，称取6-7.5mg菌丝抽提胞内蛋白。首先将菌丝用1mL裂解液(0.185MNaOH，0.75％β-巯基乙醇)重悬，用震荡器破碎细胞60Hz，3分钟，冰上静置15分钟，加入150μL 55％三氯乙酸，混合均匀后，冰上放置10分钟。离心(10000g，10分钟)弃去上清后，将沉淀用150μL HU缓冲液(48％尿素，5％SDS，0.2M Tris-HCl缓冲液，pH为6.5，5mMEDTA，0.01％溴酚蓝，5％β-巯基乙醇，6％Tris)重悬，于65℃放置10分钟。
立即点样进行SDS-PAGE及Western blot验证。Western blot中所使用的一抗为兔源Cas9抗体(Takara公司)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体。验证结果如图3所示。其中泳道M为蛋白Marker(分子量从上到下依次约为170,130,100,70,55,40,35kDa)，泳道1为含有Cas9的一个已知蛋白，作为阳性对照，泳道2是灵芝野生型菌丝体的胞内蛋白，泳道3是Cas9转化子培养3天后抽提的胞内蛋白。Cas9蛋白大小约为150KDa，从图中可以看出转化子中成功表达了Cas9蛋白。
实施例3
通过体外转录gRNA并转化宿主细胞的方法，具体包括以下步骤：
1)gRNA体外转录模板的构建。
使用人工合成gRNA的方法，并合成打靶同源片段序列(目标基因为ura3)，选用ura3基因不同位置的两种gRNA序列，使用以下引物：
正向引物Glura-F1(Seq ID No.10)：
5'TAATACGACTCACTATAGGAGCAGAAGCCCCCTGCCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC 3'
和反向引物ble-R(Seq ID No.11)：
5'ACACGACCTCCGACCACTCGGCGTACAGCTCGTCCAGGCCGCGCACCCACACCCAG 3'
扩增获得目标片段，其中通过正向引物引入T7启动子(下划线标出序列)。PCR产物纯化回收后通过TA克隆连接于pMD-18T中，转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子，使用正向引物M13F验证转化子并送测序，命名该质粒为pMD-gRNA1。同样，使用以下引物：
正向引物Glura-F2(Seq ID No.12)：
5'TAATACGACTCACTATAGGCCTCTTCCGTGTATGAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
和反向引物ble-R，获得质粒pMD-gRNA2。
以测序正确pMD-gRNA1，pMD-gRNA2质粒为模版，使用以下引物：
正向引物(Seq ID No.13)：5'TCGCGCGTTTCGGTGATGAC 3'和
反向引物(Seq ID No.14)5'AAAAGCACCGACTCGGTGCC 3'扩增获得gRNA1，gRNA2体外转录的DNA模版。
2)gRNA的体外转录。
获得的体外转录模版用苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)抽提，取上清加入等体积氯仿，离心后取上清加入预冷的无水乙醇沉淀半小时，再用75％乙醇清洗一次，晾干，最后用Nuclease free water溶解DNA，即可用于gRNA的体外转录，具体方法参考试剂盒说明书(MEGAscript T7Transcription Kit，Invitrogen公司)。
转录后验证转录情况，如图3，图中：泳道M为DS-2000DNA Marker电泳结果(片段从上到下依次为2000,1000,750,500,250,100bp)，泳道1，2为稀释后gRNA体外转录产物，其中500bp处为gRNA DNA模板序列，下方为gRNA序列。
往反应体系中补充DEPC水至50μL，加入1μL DNase，37℃，20分钟，去除DNA模板；纯化时方法同gRNA转录模板纯化，晾干，加10μL DEPC水溶解，测浓度。
3)gRNA转化宿主细胞及转化子验证。
将gRNA转化灵芝原生质体细胞，转化方法同实施例1。转化后加入到基本培养基上，30℃静置12h后加入含有5-FOA的上层选择性培养基，使5-FOA终浓度为600mg/L，30℃放置30天后可见若干单菌落。
提取灵芝基因组，方法同实施例2。使用正向引物Cura-F(Seq ID No.15)：5’TATACCAACGTCCGTTTCCA 3’和反向引物Cura-R(Seq ID No.16)：5’CATAATCCCAGGTCAAGCAA3’扩增ura3基因，测序验证目标位点基因序列是否发生变化。验证结果如图4，WT是灵芝5.26野生型基因序列，图A是使用gRNA1时，转化子基因序列变化情况，靶标序列为5'GGAGCAGAAGCCCCCTGCCA 3'，其中共获得7株转化子，经验证有4株为在特定位点发生基因中断；图B是使用gRNA2时，转化子基因序列变化情况，靶标序列为为5'GGCCTCTTCCGTGTATGAGC3'，其中共获得6株转化子，经验证有3株为在特定位点发生中断。如图所示，在本发明中，成功实现了在高等真菌灵芝内的基因中断。
实施例4
通过内源启动子转录gRNA的方法，具体包括以下步骤：
1)通过序列比对的方式获得灵芝内源的U6snRNA启动子。
通过在NCBI中找到已有的U6snRNA基因，如曲霉(Aspergillus fumigatus)，红色毛廯菌(Trichophyton rubrum)，在灵芝基因组中进行比对，找到两种可能的U6snRNA基因，将其上游启动子序列命名为pU6-1，pU6-4。
所述的pU6-1基因，其核苷酸序列如Seq ID No.17所示，来源于灵芝Ganodermalucidum，CGMCC NO.5.26。
所述的pU6-4基因，其核苷酸序列如Seq ID No.18所示，来源于灵芝Ganodermalucidum，CGMCC NO.5.26。
2)构建内源gRNA表达载体。
使用正向引物U6-F1(Seq ID No.19)：
5'TCCCCCCGGGGCGGCCGCGAATGCCCAACTTTCTAAACC 3'和
反向引物U6-R1(Seq ID No.20)：
5’GCGCGAAGACGTAGACGTATACAGGTTTGATACGTCTGG 3’
从灵芝基因组中PCR扩增出U6-1启动子，使用正向引物U6-F4(Seq ID No.21)：
5'TCCCCCCGGGGCGGCCGCCGACGCTTTATACCACTCTGAG 3'和反向引物U6-R4(Seq IDNo.22)：5’GCGCGAAGACGTAGACTTTAATGACTGGAGAGCACCG 3’扩增出U6-4启动子。使用正向引物sgRT-F(Seq ID No.23)：5’GCGCGGTCTCAGTCTTCGAGAAGACCTGTTTTAGA 3’和反向引物sgRT-R(Seq ID No.24)：5’GCGACATGCATGCTCTAGACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGC 3’扩增出gRNA末端序列，使用XmaI，SphI，BsaI酶切上述片段后，用T4连接酶连接到pUC19载体上，构建表达载体pUC-U6-1，pUC-U6-4；使用BbsI酶切上述载体，将退火形成双链的gRNA3(Seq IDNo.25)：AACCGGCTCATACACGGAAG片段连接到表达载体上，测序验证后命名gRNA内源表达载体为pU1-gRNA3，pU4-gRNA3。
上述操作使用的酶、载体、菌株有：XmaI，SphI，BbsI，BsaI，T4连接酶，热敏磷酸酶(NEB公司)；表达载体pUC19；克隆宿主Escherichia.coli DH5α。
3)gRNA表达载体转化宿主细胞并验证基因中断效果。
将表达载体pU1-gRNA3，pU4-gRNA3分别转入含有Cas9基因的灵芝5.26原生质体中，转化方法同实施例2。在5-FOA上培养30天得到转化子，挑取转化子到新的5-FOA培养基上，提取基因组并验证ura3基因中断情况，方法同实施例3。测序结果显示转化pU4-gRNA3的灵芝菌株有一株转化子在指定位置处含有127bp基因***，表明使用pU4-gRNA3可以得到在指定位置发生基因编辑的菌株。证明了上述U6snRNA启动子具有RNA polymerase III活性，可以进行gRNA的转录。
实施例5
在其他灵芝菌株中对上述方法进行验证。
1)通过gRNA外源转录的方式构建基因中断菌株的验证。
将表达载体pMD-Glcas9转入(红芝，赤芝，Ganoderma lucidum CGMCC No.5.616)原生质体中，得到含有Cas9基因的宿主细胞，转化及筛选方法同实施例2。将体外转录好的gRNA2转化含有Cas9基因的宿主细胞，转化及筛选方法同实施例3。得到的10株转化子经ura3基因测序验证，序列结果如图5，有9株转化子在指定位置发生基因缺失或***(编号1-9)，有一株没有发生靶基因中断(10号)，WT为灵芝(红芝，赤芝，Ganoderma lucidum CGMCCNo.5.616)野生型ura3基因序列。
2)通过gRNA内源转录的方式构建基因中断菌株的验证。
将表达载体pU1-gRNA3，pU4-gRNA3分别转入含有Cas9基因的灵芝(红芝，赤芝，Ganoderma lucidum CGMCC No.5.616)原生质体中，转化方法同实施例2。在5-FOA上培养20天，pU1-gRNA3到1株转化子，pU4-gRNA3得到2株转化子；挑取转化子到新的5-FOA培养基上，提取基因组并验证ura3基因中断情况，方法同实施例3。测序结果显示使用pU1-gRNA3可以得到124bp基因缺失，使用pU4-gRNA3可以得到354bp和350bp基因***；表明pU1-gRNA3，pU4-gRNA3均可以得到在指定位置发生基因编辑的菌株。
本发明以灵芝作为模式物种，构建了在高等真菌中基于CRISPR技术的基因中断方法，并得到可以用于在高等真菌中转录gRNA的U6snRNA启动子；经验证，通过gRNA内源及外源转录均可以得到靶基因中断的菌株，并在另一株灵芝重复验证其可行性。结果表明使用gRNA外源转录的方式构建基因中断菌株，可以得到9个阳性克隆/108原生质体；使用gRNA内源转录的方式，效率为1-2个阳性克隆/108原生质体。本发明的基因中断方案是首次在高等真菌中建立的以CRISPR/Cas9技术为基础的基因中断技术，跟现有高等真菌的基因中断技术相比，操作便捷，适用性强，具有很大的推广性，可以在通过传统的同源重组无法获得转化子的菌株中实现基因中断，此发明给高等真菌的遗传改造带来极大的便利，为高等真菌代谢途径的研究奠定基础。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

Claims (10)

1.一种用于高等真菌基因中断的方法，其特征在于，通过外源转录合成单倍体灵芝(Ganoderma lucidum，CGMCC NO.5.26)的gRNA或内源U6 snRNA启动子以体外转录或内源转录合成gRNA构建CRISPR/Cas9基因组编辑的方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，通过将含有密码子优化的Cas9基因的表达载体转入单倍体灵芝(Ganoderma lucidum，CGMCC NO.5.26)中，获得了可稳定表达Cas9蛋白的灵芝菌株；然后采用体外转录的方式，将经体外转录的gRNA转入此表达Cas9蛋白的灵芝菌株中，通过gRNA识别靶向基因，实现靶向基因的特定位点的中断；或采用内源转录的方式，以U6 snRNA启动子介导gRNA内源转录，同样使靶向基因的特定位点中断；
所述的gRNA具体为：针对灵芝ura3基因序列设计的靶向识别序列，包括：
gRNA1序列，即5’GGAGCAGAAGCCCCCTGCCA 3’，具体如SEQ ID No.26所示，
gRNA2序列，即5’GGCCTCTTCCGTGTATGAGC 3’，具体如SEQ ID No.27所示，以及
gRNA3序列，即5’AACCGGCTCATACACGGAAG 3’，具体如SEQ ID No.25所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述的体外转录，即构建gRNA1和gRNA2体外转录的DNA模版，通过MEGAscript T7进行体外转录。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的DNA模板，通过以下方式得到：使用人工合成gRNA的方法，并合成打靶同源片段序列，选用目标基因为ura3基因不同位置的两种gRNA序列以及如Seq ID No.10所示的正向引物Glura-F1和如Seq ID No.11所示的反向引物ble-R扩增获得目标片段，PCR产物纯化回收后通过TA克隆连接于pMD-18T骨架中，通过转化大肠杆菌DH5α并挑取转化子，得到pMD-gRNA1质粒，或采用相同方式以如Seq ID No.12所示的正向引物Glura-F2以及如Seq ID No.11所示的反向引物ble-R得到pMD-gRNA2质粒；最后使用如Seq ID No.13所示的正向引物以及如Seq ID No.14所示的反向引物扩增，从而分别获得gRNA1和gRNA2体外转录的DNA模版。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述的内源转录，即根据具有RNApolymerase III活性的灵芝内源的U6 snRNA启动子构建内源gRNA表达载体pU1-gRNA3和pU4-gRNA3，通过MEGAscript T7进行内源转录。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是，所述的内源gRNA表达载体pU1-gRNA3和pU4-gRNA3，通过以下方式得到：通过如Seq ID No.17所示所示的pU6-1和如Seq ID No.18所示的pU6-4基因，分别对应采用如Seq ID No.19所示的正向引物U6-F1和如Seq ID No.20所示的反向引物U6-R1以及采用如Seq ID No.21所示的正向引物U6-F4和如Seq ID No.22所示的反向引物U6-R4分别通过PCR扩增出U6-1启动子和U6-4启动子；然后通过如Seq ID No.23所示的正向引物sgRT-F和如Seq ID No.24所示的反向引物sgRT-R扩增出gRNA末端序列，使用XmaI，SphI，BsaI酶切上述片段后，用T4连接酶连接到pUC19表达载体上，从而构建出表达载体pUC-U6-1和pUC-U6-4；最后使用BbsI酶切上述载体，将退火形成双链的gRNA3，即SeqID No.25连接到表达载体上，得到gRNA内源表达载体pU1-gRNA3和pU4-gRNA3。
7.一种密码子优化的Cas9基因，其特征在于，含有SV40 NLS核定位信号，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
8.一种以优化的Cas9基因为基础的表达载体，其特征在于，该表达载体为pMD-Glcas9质粒，其骨架为pMD18-T，且含有上述Cas9基因、启动子Pgpd、终止子Tpdc以及选择标记基因sdhB。
9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征是，所述的启动子Pgpd为：来源于灵芝Ganoderma lucidum的gpd组成型启动子；所述的终止子Tpdc为：来源于木霉Trichodermareesei的pdc终止子；所述的选择标记基因sdhB为：来源于灵芝Ganoderma lucidum的sdhB点突变基因。
10.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，其具有如权利要求3或4所述的表达载体或具有如权利要求7或8所述的Cas9基因。
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