CN105821014A - 嗜热共生杆菌meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体 - Google Patents
嗜热共生杆菌meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105821014A CN105821014A CN201510006413.5A CN201510006413A CN105821014A CN 105821014 A CN105821014 A CN 105821014A CN 201510006413 A CN201510006413 A CN 201510006413A CN 105821014 A CN105821014 A CN 105821014A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stdapdh
- meso
- equivalent
- replaces
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了五种辅酶偏好性翻转后的<i>meso</i>-二氨基庚二酸脱氢酶突变体。所用模板酶为来源于嗜热共生杆菌（<i>Symbiobacterium thermophilum</i>）的NADP（H）依赖型<i>meso</i>-二氨基庚二酸脱氢酶(StDapdh)，酶突变后其特征在于：将同源性比较相当于模板酶的35位的氨基酸残基替换为谷氨酸，即R35E；将同源性比较相当于母本酶的35位、36位的氨基酸残基分别替换为谷氨酸及缬氨酸即R35E/R36V；将同源性比较相当于母本酶的35位、36位的氨基酸残基分别替换为天冬氨酸及缬氨酸即R35D/R36V；将同源性比较相当于母本酶的35位、36位的氨基酸残基分别替换为天冬氨酸及谷氨酰胺即R35D/R36Q；将同源性比较相当于StDapdh的35位、36位、76位的氨基酸残基分别替换为谷氨酸、缬氨酸、缬氨酸即R35E/R36V/Y76V；这些突变体酶，辅酶偏好性均由NADP（H）突变为NAD(H)。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质工程领域，涉及一种对生物催化剂meso-二氨基庚二酸脱氢酶的辅酶偏好性改造，并获得使meso-二氨基庚二酸脱氢酶的辅酶偏好性从NADP(H)变为NAD(H)的突变体。
背景技术
D-氨基酸是一种非天然氨基酸，也是重要的手性中间体，在食品、化妆品和制药工业广泛应用（王颖, 李云政,辽宁化工 2003,32, 58-60.）。已知的D-氨基酸脱氢酶多为膜蛋白（Tanigawa M., Shinohara T.,et
al,Amino Acids 2010,38, 247-255; Xu
S. J., Ju J. S., Ma Y. H.,Wei Sheng
Wu Xue Bao 2007,
47, 634-638; Jones H., Venables W. A.,Biochimie 1983,
65, 177-183; Jones H., Venables W. A.,FEBS
Lett. 1983,151, 189-192; Wild J., Obrepalska B.,Mol. Gen. Gent. 1982,186,
405-410; Wild J., Klopotowski T.,Mol. Gen. Gent. 1981,
181, 373-378; Olsiewski P. J., Kaczorowski G. J., Walsh C.,J. Biol. Chem. 1980,
255, 4487-4494.），不能被用于工业生产，仅有meso-二氨基庚二酸脱氢酶(DAPDH)（EC 1.4.1.16）及其突变体可用来进行D-氨基酸的生物合成（Misono H., Soda K.,Journal
Biol. Chem. 1980,255, 10599-10605; Vedha-Peters
K., Gunawardana M., Rozzell
J. D., Novick S. J.,J. Am.n
Chem. Soc. 2006,128, 10923-10929; Akita H., Doi K., Kawarabayasi Y., Ohshima
T.,Biotechnol . Lett.
2012,34, 1693-1699; Akita H., Suzuki H., Doi
K., Ohshima T.,Appl. Microbiol. Biotech. 2013,
98,1135-1143.）。在辅酶偏好性方面，已知的DAPDH酶及突变体的辅酶偏好性均为NADP(H)，到目前为止也没有DAPDH家族酶辅酶偏好性改造的研究报道。相比与辅酶NADP(H)，辅酶NAD(H)有更好的稳定性，更低廉的价格及更广的辅酶循环方法，NAD(H)依赖型氨基酸脱氢酶可使用甲酸脱氢酶（FDH）以及甲酸氨作为辅酶循环体系，而NADP(H)依赖型氨基酸脱氢酶则主要使用葡萄糖脱氢酶（GDH）以及葡萄糖作为辅酶循环体系。氨基酸脱氢酶需要碱性pH条件进行催化反应，GDH循环体系中使用葡萄糖作为底物，循环生成的葡萄糖酸会降低体系的pH值，影响反应的进程，且不易除去，还需另外添加反应所需的铵盐，这些额外成分将增加后续分离工艺难度；FDH循环体系可以使用甲酸氨作为共底物，其中氨直接参与合成，而甲酸被氧化成易挥发除去的CO2，反应液中没有额外杂质，将极大简化后续产物的分离纯化过程，在使用氨基酸脱氢酶合成氨基酸的过程中，使用NAD(H)作辅酶以及FDH做循环***将更有应用优势。因此，获得NAD(H)依赖型的D-氨基酸脱氢酶是非常重要的。
我们从嗜热共生杆菌Symbiobacterium thermophilum中获得了能够还原氨化合成D-丙氨酸的氨基酸脱氢酶StDapdh（Gao X., Chen X., Liu W., Feng J., Wu Q., Hua L., Zhu D.,Appl.
Environ. Microbiol. 2012,78,
8595-8600），该酶可以被直接用来进行D-氨基酸的合成（专利申请号：201210334554.6），在获得X-射线晶体结构（Liu W., Li Z., Huang C.
H., Guo R. T., Zhao L., Zhang D., Chen X., Wu Q., Zhu
D.,Chembiochem 2014,15, 217-222）、通过改造扩增其底物谱至亮氨酸以及苯丙氨酸（Gao X., Huang F., Feng J., Chen X., Zhang H., Wang Z., Wu Q., Zhu D.,Appl.
Environ. Microbiol. 2013）以及更大位阻的氨基酸如叔亮氨酸（专利申请号：201310459718.2）等工作的基础上，获得了辅酶偏好性为NAD(H)依赖型的突变子，将能进一步增加该酶实际应用的可行性。
发明内容
本发明是对生物催化剂meso-二氨基庚二酸脱氢酶的辅酶偏好性改造，并获得使meso-二氨基庚二酸脱氢酶的辅酶偏好性从NADP(H)变为NAD(H)的突变体。
本发明中所用生物催化剂，StDapdh突变体的获取步骤如下：
1.
以pET32-StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis
Kit突变试剂盒引入R35E单位点突变；
2.
以pET32-StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis
Kit突变试剂盒引入R35E/R36V两位点组合突变；
3.
以pET32-StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis
Kit突变试剂盒引入R35D/R36V两位点组合突变；
4.
以pET32-StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis
Kit突变试剂盒引入R35D/R36Q两位点组合突变；
5.
以pET32-StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis
Kit突变试剂盒引入R35D/R36Q/Y76V三位点组合突变；
6.
对所构建的工程菌进行培养、诱导表达，突变体蛋白大多以可溶性形式存在于胞内；
7.
通过Ni-NTA将该突变体蛋白纯化。
本发明具有如下优点：
本发明方法以NADP(H)依赖型氨基酸脱氢酶StDapdh出发，获得了其辅酶偏好性翻转为NAD(H)依赖型的突变子酶。
附图说明：
附图1：相应StDapdh突变子蛋白纯化SDS-PAGE电泳图谱。图中，泳道Ｍ：蛋白质分子量Marker, 泳道1为野生型酶，泳道2-6为纯化后五个的突变子酶： R35E，R35E/R36V，R35D/R36V，R35D/R36Q，R35E/R36V/Y76V。
具体实施方式
以下通过具体的实施例来进一步说明本发明内容，但是这些实施例不构成对本发明的限制。下列实例中所用材料除特别说明外，所用化学药品、试剂均购自Sigma公司。DNA和蛋白质Marker均购自Fermentas公司，蛋白纯化Ni-NTA填料购自GE。Quick Change Mutagenesis
Kit购自Agilent公司，突变引物按照试剂盒要求进行设计。引物合成、DNA序列测定均由金维治公司（北京）进行，pET32质粒载体，TOP10、BL21(DE3)高效感受态购自Novagen。液相色谱分析使用Agilent-1200色谱仪，色谱柱为Eclipse XDB-C18柱(4.6 × 150 mm)。
实施例
1
：基因突变
所用StDapdh基因Genbank号为AP006840.1，先将该基因全合成并连接到pET32载体上获得质粒：pET32-StDapdh，并在大肠杆菌BL21（DE3）中对野生型基因进行可溶表达，表达出的蛋白N-端带有6*his tag。根据需要突变的位点，参照Quick Change Mutagenesis
Kit试剂盒使用说明，合成表1中所用PCR突变引物，从野生型菌种提出质粒DNA，以其为模板进行PCR产物扩增，对扩增出来的PCR产物进行Dpn1切割，切割后进行核酸回收并转化TOP10感受态，挑取单菌落送样测序，对于测序正确的样品，转化BL21菌株。
表
1
：突变
PCR
引物
以pET32-StDapdh质粒为模板，使用引物1和2在质粒上引入R35E单突变，并将突变后产物转化至大肠杆菌TOP10感受态，提取质粒并测序验证，将测序正确的质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，获得表达菌株。分别使用引物3和4，5和6，7和8，重复上述步骤，获得R35E/R36V，R35D/R36V以及R35D/R36Q三个双突变菌株；以R35E/R36V为模板，使用引物9和10，获得R35E/R36V/Y76V三突变菌株。
实施例
2
：突变体酶的表达、初步纯化
将实施例1中获得的突变体菌株分别于2 L LB液体培养基中进行培养，先于37℃培养至OD600约0.8后，加入终浓度0.5 mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达，诱导温度为25℃，诱导时间为20小时。诱导表达结束后，于5000 rpm离心5分钟收集菌体，利用缓冲液A（20 mM
Tris-Cl pH 8.0，50 mM氯化钠）重悬并洗涤菌体，并再次离心菌体。后续所有纯化实验均在4℃进行，所有缓冲液均先预冷至4℃。将洗涤后的菌体用100 mL缓冲液A重悬菌体，高压匀浆破碎，14000 rpm离心30分钟去除破碎沉淀，上清上样用缓冲液A平衡过的Ni-NTA层析柱，并用缓冲液B（20 mM
Tris-Cl pH 8.0, 50mM 咪唑,500 mM氯化钠）去除杂蛋白，用缓冲液C（20 mM
Tris-Cl pH 8.0, 250mM 咪唑,500 mM氯化钠）洗脱出目的蛋白。将目的蛋白对缓冲液D（20 mM
Tris-Cl pH 8.0, 50 mM氯化钠）进行透析，以去除高浓度咪唑以及氯化钠。附图1为纯化后的突变子蛋白电泳图谱。
实施例
3
：突变体的活力测定
突变子的活力利用SPECTRAMAXM2e (MD, USA)酶标仪进行测定，所用测活体系如下：各成分的终浓度分别为：20 mM底物丙酮酸，200 mM底物氯化铵，1 mM辅酶NADH（或NADPH），适量StDapdh突变体纯酶，测活缓冲液为100 mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液pH 9.0，最终体积200 µL。底物以及蛋白样品均先加入96孔板中于30°C平衡10分钟，再向其中添加辅酶NADH起始反应，通过测量340 nm处吸光度的减少来测定酶活力 (NADH在340 nm摩尔消光系数为6.22 mM-1∙cm-1)，酶活力单位定义为催化反应时每分钟消耗1 µmol辅酶NADH所需的酶量，表2为野生型酶以及突变子酶对NADH以及NADPH的比活力，从表中可以看出，所有突变体的辅酶偏好性均从野生型酶的NADP(H)翻转为NAD(H)依赖型。
表
2
野生型酶和突变体对
NADH
以及
NADPH
的比酶活
Claims (9)
1.五种NAD（H）依赖型氨基酸脱氢酶突变体，可以作为生物催化剂。
2.包括：利用来源于嗜热共生杆菌（Symbiobacterium thermophilum）的NADP（H）依赖型氨基酸脱氢酶StDapdh作为模板，通过分子生物学技术进行突变获得NAD（H）依赖型的氨基酸脱氢酶突变体。
3.如权利要求1所述生物催化剂meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其蛋白特征在于，突变体模板为嗜热共生杆菌（Symbiobacterium thermophilum）的meso-二氨基庚二酸脱氢酶或者是与其氨基酸序列相似度不低于80%的蛋白质。
4.如权利要求1所述生物催化剂meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其蛋白序列特征在于将同源性比较相当于StDapdh第35位的精氨酸（R）替换为谷氨酸（E），即R35E。
5.如权利要求1所述生物催化剂meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其蛋白序列特征在于将同源性比较相当于StDapdh第35位的精氨酸（R）替换为谷氨酸（E）；将同源性比较相当于StDapdh第36位的精氨酸（R）替换为缬氨酸（V），即R35E/R36V。
6.如权利要求1所述生物催化剂meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其蛋白序列特征在于将同源性比较相当于StDapdh第35位的精氨酸（R）替换为天冬氨酸(D)；将同源性比较相当于StDapdh第36位的精氨酸（R）替换为缬氨酸（V），即R35D/R36V。
7.如权利要求1所述生物催化剂meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其蛋白序列特征在于将同源性比较相当于StDapdh第35位的精氨酸（R）替换为天冬氨酸(D)；将同源性比较相当于StDapdh第36位的精氨酸（R）替换为谷氨酰胺（Q），即R35D/R36Q。
8.如权利要求1所述生物催化剂meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其蛋白序列特征在于将同源性比较相当于StDapdh第35位的精氨酸（R）替换为谷氨酸(E)；将同源性比较相当于StDapdh第36位的精氨酸（R）替换为缬氨酸（V）；将同源性比较相当于StDapdh第76位的酪氨酸（Y）替换为缬氨酸（V），即R35E/R36V/Y76V。
9.如权利要求1所述生物催化剂meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体，其辅酶偏好性从烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH或NADP+）变为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH或NAD+）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510006413.5A CN105821014A (zh) | 2015-01-07 | 2015-01-07 | 嗜热共生杆菌meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510006413.5A CN105821014A (zh) | 2015-01-07 | 2015-01-07 | 嗜热共生杆菌meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105821014A true CN105821014A (zh) | 2016-08-03 |
Family
ID=56513960
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510006413.5A Pending CN105821014A (zh) | 2015-01-07 | 2015-01-07 | 嗜热共生杆菌meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105821014A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020034209A1 (zh) * | 2018-08-17 | 2020-02-20 | 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 | 氨基酸脱氢酶突变体及其应用 |
| CN111051508A (zh) * | 2017-08-09 | 2020-04-21 | 国立研究开发法人产业技术综合研究所 | D型氨基酸脱氢酶 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1023896A (ja) * | 1996-05-07 | 1998-01-27 | Unitika Ltd | 組換えプラスミド、それにより形質転換された大腸菌、その培養物及びそれを用いたアミノ酸又はその誘導体の製造方法 |
| EP1078991A2 (en) * | 1999-08-17 | 2001-02-28 | Ajinomoto Co., Ltd. | Methods for producing L-amino acids |
| WO2008111708A1 (en) * | 2007-03-09 | 2008-09-18 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | L-threonine overproducing microorganism and method for preparing l-threonine using the same |
| CN104513839A (zh) * | 2013-09-30 | 2015-04-15 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | D-叔亮氨酸的一种生物催化制备方法 |
-
2015
- 2015-01-07 CN CN201510006413.5A patent/CN105821014A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1023896A (ja) * | 1996-05-07 | 1998-01-27 | Unitika Ltd | 組換えプラスミド、それにより形質転換された大腸菌、その培養物及びそれを用いたアミノ酸又はその誘導体の製造方法 |
| EP1078991A2 (en) * | 1999-08-17 | 2001-02-28 | Ajinomoto Co., Ltd. | Methods for producing L-amino acids |
| WO2008111708A1 (en) * | 2007-03-09 | 2008-09-18 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | L-threonine overproducing microorganism and method for preparing l-threonine using the same |
| CN104513839A (zh) * | 2013-09-30 | 2015-04-15 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | D-叔亮氨酸的一种生物催化制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GENBANK: "WP_013932596.1，diaminopimelate dehydrogenase［Pseudothermotoga thermarum］", 《GENBANK》 * |
| XIUZHEN GAO等: "A Novel meso-Diaminopimelate Dehydrogenase from Symbiobacterium thermophilum:Overexpression,Characterization,and Potential for D-Amino Acid Synthesis", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111051508A (zh) * | 2017-08-09 | 2020-04-21 | 国立研究开发法人产业技术综合研究所 | D型氨基酸脱氢酶 |
| WO2020034209A1 (zh) * | 2018-08-17 | 2020-02-20 | 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 | 氨基酸脱氢酶突变体及其应用 |
| US11603521B2 (en) | 2018-08-17 | 2023-03-14 | Asymchem Life Science (Tianjin) Co., Ltd | Amino acid dehydrogenase mutant and use thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10731138B2 (en) | Formate dehydrogenase mutant with improved enzyme activity and stability and construction method thereof | |
| CN103710321B (zh) | 烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其编码基因和应用 | |
| JP2004000114A (ja) | カダベリンの製造方法 | |
| ES2806732T3 (es) | Fábrica de células bacterianas modificadas genéticamente para la producción de tiamina | |
| CN113151198B (zh) | 一种γ-谷酰胺甲胺合成酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用 | |
| US7858351B2 (en) | S-adenosylmethionine synthetase mutants, the DNAs encoding the same and uses of the mutants | |
| Song et al. | Enzymatic production of L-ornithine from L-arginine with recombinant thermophilic arginase | |
| Chung et al. | Purification and characterization of UDP-glucose: tetrahydrobiopterin glucosyltransferase from Synechococcus sp. PCC 7942 | |
| CN106893699B (zh) | 一种粗酶制剂、其制备方法及应用 | |
| CN105821014A (zh) | 嗜热共生杆菌meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体 | |
| Mukhopadhyay et al. | Pyruvate carboxylase from Mycobacterium smegmatis: stabilization, rapid purification, molecular and biochemical characterization and regulation of the cellular level | |
| JP4734959B2 (ja) | 腸内細菌科に属する微生物内で自律複製可能な新規プラスミド | |
| CN106062188A (zh) | 具有提高的转化活性的l‑***糖异构酶变异体及利用该变异体生产d‑塔格糖的方法 | |
| JP2002223771A (ja) | カダベリンの製造方法 | |
| Bednarski et al. | In vitro processing of the proproteins GrdE of protein B of glycine reductase and PrdA of d‐proline reductase from Clostridium sticklandii: formation of a pyruvoyl group from a cysteine residue | |
| Ogura et al. | Biochemical characterization of an L-tryptophan dehydrogenase from the photoautotrophic cyanobacterium Nostoc punctiforme | |
| Nishiya et al. | Characterization of a NADH: dichloroindophenol oxidoreductase from Bacillus subtilis | |
| JP6951702B2 (ja) | トレハンジェリンの製造法 | |
| Li et al. | Cloning, protein sequence clarification, and substrate specificity of a leucine dehydrogenase from Bacillus sphaericus ATCC4525 | |
| WO2015008637A1 (ja) | キサンチンオキシダーゼ遺伝子とそれをコードするアミノ酸配列 | |
| CN105821090B (zh) | 嗜热共生杆菌meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体应用 | |
| JP2014064513A (ja) | ２−デオキシ−ｓｃｙｌｌｏ−イノソースの調製法 | |
| Yan et al. | Characterization of a family I-liked alkaline-resistant inorganic pyrophosphatase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus for rapid determination of sugar nucleotidyltransferase at high temperature | |
| CN105734027A (zh) | 一种黄嘌呤脱氢酶及其编码基因与应用 | |
| KR20120078962A (ko) | 락토바실러스 람노수스 유래 내열성물 생성 ｎａｄｈ 산화효소 및 그 생산 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160803 |