CN105803114A - 猪博卡病毒检测和分型富集多重pcr快速诊断试剂盒 - Google Patents

猪博卡病毒检测和分型富集多重pcr快速诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪博卡病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒(即，同时检测所有已知猪博卡病毒基因型的富集多重PCR快速诊断试剂盒)，包含PCR反应液、标准品、对照品，盒体设有容器孔，分别放置PCR反应液管、PBoV G1病毒标准品管、PBoV G2病毒标准品管、PBoV G3病毒标准品管、阳性对照品管、阴性对照品管和引物管，通过一次PCR反应，能够对待测样品是否为猪博卡病毒及属于PBoV G1，PBoV G2和PBoV G3哪个基因群进行快速鉴定，特异性好、灵敏度高、简便快捷，适用于临床及科研中对猪博卡病毒的快速检测及分类研究，具有较高的使用价值。

Description

猪博卡病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒
技术领域
本发明属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种同时检测所有已知猪博卡病毒基因型的多重PCR快速诊断试剂盒，可在同一个反应管内同时检测所有已知猪博卡病毒基因型，适用于临床及科研中对猪博卡病毒的快速检测。
背景技术
自2009年首次在瑞典患断奶仔猪多***衰竭综合征(PMWS)的猪体内发现猪博卡病毒(PBoV)以来，越来越多的研究报道表明猪群中出现了一系列的猪博卡病毒，并且在世界范围内广泛流行，但对其致病性、基因分型、鉴别诊断方法等方面还比较薄弱。
猪博卡病毒是单链线性无囊膜DNA病毒，基因组大小为4786～5905bp，其基因分型目前尚无统一的分类标准，已报到的猪博卡病毒主要有PBoV1、PBoV2、PBoV3、PBoV4和PBoV5等亚型。各亚型PBoV的基因组结构基本一致，目前认为基因组编码3个开放阅读框(ORF)，ORF1在5’末端，编码非结构蛋白NS1，该结构在病毒基因组的复制过程中起到重要作用，含有与病毒解螺旋酶、滚环复制和三磷酸腺苷酶(ATPase)活性相关的保守序列。ORF2在3’末端编码2个衣壳蛋白VP1和VP2其中VP1和VP2是其主要的抗原基因。ORF3为特有开放阅读框，编码非结构蛋白NP1。研究表明NS1基因较为保守，而VP1/2基因较易发生突变。
猪博卡病毒的病原学检测方法主要有常规PCR、nanoPCR、实时荧光定量PCR(SYBRGreenⅠ和TaqMan探针)和LAMP等，但这些方法通常都是针对单一的基因型。因为猪博卡病毒存在较大的核苷酸变异，所以针对上述针对不同的参考株来设计猪博卡病毒的检测引物，存在很多假阴性结果。Yong等将PBoV的全基因组核苷酸序列、NS1基因、VP1基因、VP2基因的核苷酸序列分别采用MEGA5软件进行分析并构建***进化树。结果显示选取PBoV全基因组、NS1基因、VP1基因和VP2基因所构建的***进化树基本一致，均分为3个大的分支(3个基因群)，分别称为基因群PBoVG1，PBoVG2和PBoVG3，而各基因群内的小分支可以划分为PBoV基因亚型，PBoV各株之间的基因序列具有多样性，基因群内的病毒株仍保持较高的保守性，不同基因群的病毒株则差异较大。
基于猪博卡病毒基因组和开放阅读框核酸序列构建的基因进化树，将猪博卡病毒分为3个大的基因群PBoVG1，PBoVG2和PBoVG3是建立快速检测PBoV所有基因型多重PCR诊断方法的基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种猪博卡病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒(一种同时特异灵敏地检测所有已知猪博卡病毒基因型感染的靶标富集多重PCR快速诊断试剂盒)。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种猪博卡病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒(同时特异灵敏地检测所有已知猪博卡病毒基因型感染的靶标富集多重PCR快速诊断试剂盒)，该试剂盒包括3对猪博卡病毒基因群特异性组合引物和1对通用引物；
所述3对猪博卡病毒基因群特异性组合引物为：
PBoVG1-F：5’-GGCATCGCATAACATAAGCAAATACCCATACTCACAAAG-3’
PBoVG1-R：5’-GTCCGTCCAACCGTCTGGTGATTGATTCATTGCTG-3’
PBoVG2-F：5’-GGCATCGCATAACATAAGCATCCACTGCTTCGAGAACATC-3’
PBoVG2-R：5’-GTCCGTCCAACCGTCTGTTCCCTGACATCTTTCCATT-3’
PBoVG3-F：5’-GGCATCGCATAACATAAGCAGAAATGTTAGAAGCTGTTGA-3’
PBoVG3-R：5’-GTCCGTCCAACCGTCTGTACAGGTGACGTTTATTGC-3’；
1对通用引物为：
UF：5’-GGCATCGCATAACATAAGCA-3’
UR：5’-GTCCGTCCAACCGTCTG-3’。
备注说明：上述带下划线的，指共同的通用引物序列。
作为本发明的猪博卡病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒的改进，该试剂盒包括a)PCR反应液、b)标准品、c)阳性对照品、d)阴性对照品、e)引物。
所述PCR反应液包含PCR反应缓冲液，耐热DNA聚合酶和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物。所述PCR反应缓冲液含有缓冲液，氯化镁混合物。
所述PCR标准品由PBoVG1标准品、PBoVG2标准品、PBoVG3标准品组成；所述PBoVG1标准品序列如SEQIDNO:1所述，所述PBoVG2标准品序列如SEQIDNO:2所述，所述PBoVG3标准品序列如SEQIDNO:3所述。
所述阳性对照品为：含PBoVG1、PBoVG2、PBoVG3这三种猪博卡病毒基因群组的阳性质粒混合品(每种病毒浓度约为300ng/μL)。
所述阴性对照品为灭菌双蒸水ddH2O。
所述引物为3对猪博卡病毒基因群组特异性组合引物和1对通用引物，序列如表1。
所述每对猪博卡病毒基因群特组异性组合引物均在特异性引物序列的5′端均连一段共同的通用引物序列。
表1本发明中所设计的PCR引物
在本发明中，每对引物的上下游引物同管包装。即，每对特异性组合引物的上下游引物同管包装，一对通用引物的上下游引物同管包装。
本发明的同时特异检测所有已知猪博卡病毒基因型感染的富集多重PCR快速诊断试剂盒保存于-20度。本发明的试剂盒能用于检测猪博卡病毒三个基因群PBoVG1，PBoVG2和PBoVG3。
本发明试剂盒的使用方法：
每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。
病毒样品核酸提取：根据产品使用说明书，用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒(AXYGEN)从猪粪样本中提取病毒核酸。
病毒的检测：取2.0μL已抽提的待测样品核酸DNA/RNA(浓度约为150ng/μL)为模板进行多重PCR反应，其中10×PCRbuffer2.0μL，25mMMgCl22.0μL，2.5mΜdNTP1.6μL，TaqDNAPolymerase2.5U，表1所述的3对组合引物和1对通用引物，其中PBoVG1，PBoVG2和PBoVG3上下游引物终浓度各为0.01μM，通用引物UF和UR终浓度各为0.2μM，加ddH2O至反应体系总体积为20μL；反应参数分为两步：95℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s，15个循环；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min，4℃保存。将扩增产物进行1.5％琼脂糖电泳检测。
结果报告：根据PBoVG1，PBoVG2和PBoVG3基因目标片段的有无，对是否有猪博卡病毒及属于哪个猪博卡病毒基因群进行鉴定。
本发明具有如下技术优势：本发明通过三对猪博卡病毒基因群组特异性组合引物和一对通用引物联合使用，建立富集三重PCR扩增体系，能够对待测样品是否含有猪博卡病毒及属于PBoVG1，PBoVG2和PBoVG3哪个基因群进行快速鉴定，特异性高。试剂盒的最低灵敏度为102copies/μL，可检测出样品中的低浓度DNA。使用范围广，能够用于该病毒流行病学调查以及实验室检测。
本发明分别针对3大基因群设计特异性引物，特异性引物能扩增本基因群内的所有序列，但不能扩增其它基因群的序列，结合多重PCR技术可以一次同时检测所有基因型猪博卡病毒，并具有高特异性、检测时间短、检测成本低等优点。针对普通多重PCR存在的各组引物对扩增效率不一致，采用靶标富集多重PCR方法，即通过分别设计特异性组合引物(特异性引物序列的5′端均连一段共同的通用引物序列)和1对通用引物，在特异性组合引物先进行适当扩增再利用通用引物对扩增产物进行扩增，达到均衡扩增各靶标的目的，是一种较为理想的检测方法。开发一种同时特异灵敏地检测所有已知猪博卡病毒基因型感染的多重PCR快速诊断试剂盒，有助于提升病毒检测水平，在猪博卡病毒分子流行病毒学研究，疾病诊断和防治等方面具有重要的应用前景。
综上所述，本发明提供一种同时检测所有已知猪博卡病毒基因型的富集多重PCR快速诊断试剂盒，包含PCR反应液、标准品、对照品，盒体设有容器孔，分别放置PCR反应液管、PBoVG1病毒标准品管、PBoVG2病毒标准品管、PBoVG3病毒标准品管、阳性对照品管、阴性对照品管和引物管，通过一次PCR反应，能够对待测样品是否为猪博卡病毒及属于PBoVG1，PBoVG2和PBoVG3哪个基因群进行快速鉴定，特异性好、灵敏度高、简便快捷，适用于临床及科研中对猪博卡病毒的快速检测及分类研究，具有较高的使用价值。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为试剂盒结构示意图。
图2为三组猪博卡病毒对应引物的特异性检测。泳道1-8从左至右依次为：PBoVG1、PBoVG2、PBoVG3、(PBoVG1+PBoVG2+PBoVG3)、(PBoVG1+PBoVG2)、(PBoVG1+PBoVG3)、(PBoVG2+PBoVG3)和去离子水阴性对照。
图3为本发明对三组猪博卡病毒的灵敏性检测。泳道1-7从左至右依次为：1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100、0copies/μLPBoVG1，PBoVG2和PBoVG3质粒标准品混合物。注：上述浓度是指PBoVG1，PBoVG2和PBoVG3各自的浓度。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于本发明。
实施例1试剂盒结构
参见图1，一种同时特异检测三种猪博卡病毒感染的富集多重PCR快速诊断试剂盒，包含：PCR反应液、PBoVG1病毒标准品、PBoVG2病毒标准品、PBoVG3病毒标准品、阳性对照品、阴性对照品、盒体，盒体设有容器孔，分别用于放置PCR反应液管、PBoVG1病毒标准品管、PBoVG2病毒标准品管、PBoVG3病毒标准品管、阳性对照品管和阴性对照品管等，其中PCR反应液(包含PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物)有3管(标记为)、PBoVG1病毒标准品为1管(标记为▲)、PBoVG2病毒标准品为1管(标记为●)、PBoVG3病毒标准品为1管(标记为■)，阳性对照品为3管(标记为)，阴性对照品为3管(标记为□)，三种猪博卡病毒基因群组特异性组合引物3管(标记为)，通用引物1管(标记为★)。
实施例2质粒标准品制备
第一步：引物合成
本发明所设计的三组猪博卡病毒基因群组特异性组合引物及通用引物序列(见表1)由上海生工生物公司技术服务公司合成，合成量为每引物2OD。
第二步：病毒总DNA/RNA提取
将含有PBoVG1，PBoVG2和PBoVG3毒源的猪粪样品置于1.5mL离心管中，根据产品使用说明书，用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒(AXYGEN)从猪粪样本中提取病毒核酸，得到病毒DNA(153ng/μL)。
第三步：PCR扩增
PCR反应体系(总反应体积25μL)：10×PCRbuffer2.5μL，25mMMgCl22.5μL，2.5mΜdNTP2μL，TaqDNAPolymerase1.25U，以第二步中提取的2.0μL的每一组猪博卡病毒DNA为模板，第一步中合成的每一组猪博卡病毒引物(上下游引物终浓度各为0.2μM)，加ddH2O至反应体系总体积为25μL。反应在Bio-RadS1000PCR扩增仪进行反应参数为：95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环，72℃10min。
第四步：质粒标准品制备
将第三步获得的3种扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，按照DNAGelExtractionKit操作方法回收目的片段，将回收产物连接到PMD18-T载体上，通过大肠杆菌DH5α感受态转化，挑取其中白色单菌落进行鉴定，重组质粒序列委托上海生工生物公司进行序列测定。利用PlasmidMiniprepKit提取测序正确的重组质粒DNA，利用Nanodrop2000定量PBoVG1，PBoVG2和PBoVG3重组质粒浓度分别为2.3×1011copies/μL、4.9×1011copies/μL、1.8×1011copies/μL，以无菌双蒸水将重组质粒按照1.0×105～1.0×100Copies/μL10倍梯度稀释制备质粒标准品。
实施例3本发明检测三种猪博卡病毒基因群组特异性实验
第一步：引物合成
同实施例2中第一步。
第二步：特异性检测
按照富集多重PCR反应体系配制8份相同的反应液，即10×PCRbuffer2.0μL，25mMMgCl22.0μL，2.5mΜdNTP1.6μL，TaqDNAPolymerase2.5U，表1中所述的3对组合引物和1对通用引物，其中PBoVG1，PBoVG2和PBoVG3上下游组合引物终浓度各为0.01μM，通用引物UF和UR终浓度各为0.2μM，第一～第七份分别加入1.0×105copies/μL的PBoVG1，PBoVG2，PBoVG3，PBoVG1+PBoVG2+PBoVG3，PBoVG1+PBoVG2，PBoVG1+PBoVG3，PBoVG2+PBoVG3质粒标准品1.0μL，第八份加1.0μL去离子水作为阴性对照，加ddH2O至反应体系总体积为20μL。反应参数分为两步：95℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s15个循环；94℃30s，60℃30s，72℃30s30个循环；72℃10min。取5μLPCR产物，与1μLLoadingBuffer混匀后，点样于1.5％琼脂糖凝胶电泳板孔中，120V电压，电泳30min，于紫外荧光成相仪下拍照判定，结果参见图2，判定标准详见表1对应PCR产物大小PBoVG1：569bp，PBoVG2：329bp和PBoVG3：422bp，可见本发明中构建的多重PCR反应体系特异性较好。
实施例4本发明检测三种猪博卡病毒基因群组敏感性实验
第一步：引物合成
同实施例2中第一步。
第二步：敏感性检测
富集多重PCR敏感性检测体系如下：10×PCRbuffer2.0μL，25mMMgCl22.0μL，2.5mΜdNTP1.6μL，TaqDNAPolymerase2.5U，表1中所述的3对组合引物和1对通用引物，其中PBoVG1，PBoVG2和PBoVG3上下游引物终浓度各为0.01μM，通用引物UF和UR终浓度为0.2μM，10倍系列稀释的同浓度的PBoVG1+PBoVG2+PBoVG3质粒标准品(1.0×105～1.0×100copies/μL，指每种质粒的浓度)模板1.0μL，加ddH2O至反应体系总体积为20μL；反应参数分为两步：95℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s15个循环；94℃30s，60℃30s，72℃30s30个循环72℃10min，4℃保存。取5μL扩增产物进行1.5％琼脂糖电泳检测，结果参见附图3。
常规单重PCR敏感性检测反应体系：10×PCRbuffer2.5μL，25mMMgCl22.5μL，2.5mΜdNTP2μL，TaqDNAPolymerase1.25U，表1中所述的每基因群组病毒引物(即，表1中所述的3对组合引物中的任一)，上下游引物终浓度均为0.2μM，10倍系列稀释的每基因群组质粒标准品(1.0×105～1.0×100copies/μL)模板1.0μL，加ddH2O至反应体系总体积为25μL；在Bio-RadS1000PCR扩增仪进行反应，参数为：95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环，72℃10min。取5μL扩增产物进行1.5％的琼脂糖电泳检测。
试验结果表明，本发明可检测出1×102copies/μL的PBoVG1、PBoVG2和PBoVG3病毒量，而常规单重PCR只能检测到1.0×103copies/μL的PBoVG1、PBoVG2和PBoVG3病毒量，由此可见本发明检测病毒的敏感性高于常规PCR约10倍。由此可见本发明检测3个猪博卡病毒基因群组病毒的敏感性较好。
实施例5本发明检测临床样品试验
第一步：引物合成
同实施例2中第一步。
第二步：样品收集
检测样品共计225份，其中在浙江地区采集猪粪200份，其余全血25份分别从河南、湖南等地的猪场采集。
第三步：总DNA小量抽提
病毒样品提取：根据产品使用说明书，用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒(AXYGEN)从猪粪及血清样本中提取病毒核酸。
第四步：单重PCR检测和富集多重PCR检测
1、普通单重PCR检测
PCR反应体系(总反应体积25μL)：10×PCRbuffer2.5μL，25mMMgCl22.5μL，2.5mΜdNTP2μL，TaqDNAPolymerase1.25U，以第三步中提取的DNA2.0μL为模板，第一步中合成的三组猪博卡病毒引物中的任一(上下游引物终浓度均为0.2μM)，加ddH2O至反应体系总体积为25μL分别进行PCR扩增。反应在Bio-RadS1000PCR扩增仪进行，反应参数为：95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环，72℃10min。取5μL扩增产物进行1.5％的琼脂糖电泳检测。
2、富集多重PCR检测：取2.0μL第三步中提取的RNA/DNA，作为模板进行多重PCR反应，其中10×PCRbuffer2.0μL，25mMMgCl22.0μL，2.5mΜdNTP1.6μL，TaqDNAPolymerase2.5U，表1中所述的3对组合引物和1对通用引物，其中PBoVG1，PBoVG2和PBoVG3上下游引物终浓度各为0.01μM，通用引物UF和UR各0.2μM，加ddH2O至反应体系总体积为20μL；反应参数为分为两步：95℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s15个循环；94℃30s，60℃30s，72℃30s30个循环72℃10min，4℃保存。取5μL扩增产物进行1.5％的琼脂糖电泳检测。
第五步：结果检测
经琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如下：普通单重PCR法检测与本发明检测结果如下：普通PCR检测出PBoVG11份，本发明检测出7份阳性(其中1份同普通PCR检测结果)；普通PCR检测出PBoVG23份，本发明检测出11份(其中3份同普通PCR检测结果)；普通PCR检测出PBoVG324份，本发明检测出43份阳性(其中24份同普通PCR检测结果)；其中普通PCR检测出混合感染4份，本发明检测出混合感染53份(其中4份同普通PCR检测结果)。
备注说明：上述这些“普通PCR检测呈阴性通过本发明检测结果为阳性的样本”经单重实时荧光定量PCR法验证，DNA含量基本都在102～103copies/μL之间。
上述结论表明本发明检测效果较好，在具备良好灵敏度的同时，可一次检测出多个猪博卡病毒基因群组混合感染，大大节约时间和试剂成本，提高检测效率。
对比例1、将特异性引物改成为如下所述；
PBoVG1-F：5’-GGCATCGCATAACATAAGCAAATACCCATACTCACAAAGTGG-3’
PBoVG1-R：5’GTCCGTCCAACCGTCTGGTCCGTCCAACCGTCT-3’
PBoVG2-F：5’-GGCATCGCATAACATAAGCATCCACTGCTTCGAGAACATCC-3’
PBoVG2-R：5’GTCCGTCCAACCGTCTGTTCCCTGACATCTTTCCATTCA-3’
PBoVG3-F：5’-GGCATCGCATAACATAAGCAGTTAGAAGCTGTTGAATCAA-3’
PBoVG3-R：5’GTCCGTCCAACCGTCTGAGTACAGGTGACGTTTATT-3’。
通用引物仍同本发明(即，如表1所述)；其余同本发明。
对比例2、将特异性引物为如下所述：
PBoVG1-F：5’-GGCATCGCATAACATAAGCACAATACCCATACTCACAAAGT-3’
PBoVG1-R：5’GTCCGTCCAACCGTCTGTCCGTCCAACCGTCTG-3’
PBoVG2-F：5’-GGCATCGCATAACATAAGCACACTGCTTCGAGAACATCCCGA-3’
PBoVG2-R：5’GTCCGTCCAACCGTCTGCTGACATCTTTCCATTCACA-3’
PBoVG3-F：5’-GGCATCGCATAACATAAGCAGTTAGAAGCTGTTGAATCA-3’
PBoVG3-R：5’GTCCGTCCAACCGTCTGAAAGTACAGGTGACGTTTA-3’。
通用引物仍同本发明(即，如表1所述)；其余同本发明。
对比例3、将本发明的特异性引物改成同对比例1所述引物，且取消通用引物的使用；其余同本发明。
对比例4、取消通用引物的使用，即，特异性引物仍同本发明(即，如表1所述)；其余同本发明。
对比例5、将通用引物改成如下序列：
UF：GGCATCGCATAACATAAGCT
UR：GTCCGTCCAACCGTCTC；
特异性引物仍同本发明(即，如表1所述)；其余同本发明。
对比实验、将上述对比例1～对比例5所得的试剂盒按照上述实施例4所述方法进行检测，所得结果为：
对比例1只能检测出1.0×104copies/μLPBoVG1、1.0×103copies/μLPBoVG2、1.0×103copies/μLPBoVG3病毒量。
对比例2只能检测出1.0×103copies/μLPBoVG1、1.0×103copies/μLPBoVG2、1.0×103copies/μLPBoVG3病毒量。
对比例3无法检测出1.0×105copies/μLPBoVG1、1.0×105copies/μLPBoVG2、1.0×105copies/μLPBoVG3病毒量。
对比例4无法检测出1.0×105copies/μLPBoVG1、1.0×105copies/μLPBoVG2、1.0×105copies/μLPBoVG3病毒量。
对比例5无法检测出1.0×105copies/μLPBoVG1、1.0×105copies/μLPBoVG2、1.0×105copies/μLPBoVG3病毒量。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
<110>浙江理工大学
<120>猪博卡病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒
<160>3
<210>1
<211>531
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PBoVG1
<400>1
aatacccatactcacaaagtggatgggacagtgagctaatccctgaactgccagggatga60
tttataaactaccaaactattgctacttccaggaactaggtgacataggtgatacaggct120
cagacttaagagaatcatggctagggacagcatgtcccttattctttcttgaaagctcct180
cacatgaggtactaagaacaggagaagaaacaggatttgaatttgattttgattgtggat240
gggtacataatgacagagcattttgtccaccacaatgcgactttaatcccctaatcaaaa300
ccaggcgaagcagaataataatgggttcttcaggaaacacatcagaaccatactatgact360
acaaaaaacctagcaattggatgccaggaccaggaactcgactaaacggacaccaatcag420
gaagcaatctaaaaacatcttctgggccctttaacacatcatgggcaccaccaggggtaa480
cacagggaagtgacacaacctacctaaactcaccagcaatgaatcaatcac531
<210>2
<211>291
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PBoVG2
<400>2
tccactgcttcgagaacatcccgagtgacttcagcgacatggaggagaccgaatgactct60
cgggacggggggaaaatatggggaaataaaaataaaaagaataaaacaaacccttacgag120
gtattcagccagcacatggccaggttcaagccagataaaagctattgtggcttctactgg180
cacagctgccggatggctcgtaagggcacagattatatctttaccgagggaatgagggat240
ttccaaaaacgctgtaaagacaataaatgtgagtggaaagatgtcagggag291
<210>3
<211>384
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PBoVG3
<400>3
gaaatgctagaagctgttgaatcaatgaatgagtcttaagcgcggtcagttccgcggtgt60
tctgtttcctggttataattatttgggtccttttaatcctttggaaaacggtgatcctgt120
caataaagccgacgaggccgcaaaaaaacacgatcaagcttataataattatatcaataa180
aggtttaaatccctacctgaaatttaataaaggtgatcaagactttatcgactctttgca240
gtctgactcttctgtgggcggtaactttgcgcgtgccgtctttcatttgaaaaaacaaat300
tgcgcctgcgctcaacgagcctaaagacacgggggaacctccggcgaaaaaggacaaacg360
cgcgggcaataaacgtcacctgta384

Claims (5)

1.猪博卡病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒包括3对猪博卡病毒基因群特异性组合引物和1对通用引物；
所述3对猪博卡病毒基因群特异性组合引物为：
PBoVG1-F：5’-GGCATCGCATAACATAAGCAAATACCCATACTCACAAAG-3’
PBoVG1-R：5’-GTCCGTCCAACCGTCTGGTGATTGATTCATTGCTG-3’
PBoVG2-F：5’-GGCATCGCATAACATAAGCATCCACTGCTTCGAGAACATC-3’
PBoVG2-R：5’-GTCCGTCCAACCGTCTGTTCCCTGACATCTTTCCATT-3’
PBoVG3-F：5’-GGCATCGCATAACATAAGCAGAAATGTTAGAAGCTGTTGA-3’
PBoVG3-R：5’-GTCCGTCCAACCGTCTGTACAGGTGACGTTTATTGC-3’；
1对通用引物为：
UF：5’-GGCATCGCATAACATAAGCA-3’
UR：5’-GTCCGTCCAACCGTCTG-3’。
2.根据权利要求1所述的猪博卡病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括PCR反应液、PCR标准品、阳性对照品、阴性对照品；
所述PCR标准品由PBoVG1标准品、PBoVG2标准品、PBoVG3标准品组成。
3.根据权利要求2所述的猪博卡病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：
所述阳性对照品为：含PBoVG1、PBoVG2、PBoVG3这三种猪博卡病毒基因群组的阳性质粒混合品。
4.根据权利要求2或3所述的猪博卡病毒检测和分型富集多重PCR快速诊断试剂盒，其特征是：
所述阴性对照品为灭菌双蒸水ddH2O。
5.根据权利要求2或3所述的猪博卡病毒多重实时荧光定量PCR检测和分型诊断试剂盒，其特征是：
每对引物的上下游引物同管包装。
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