CN103642939A

CN103642939A - 基于长探针同时检测多种微量靶标的方法

Info

Publication number: CN103642939A
Application number: CN201310643752.5A
Authority: CN
Inventors: 汪平; 徐英武; 吕洪玉
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2013-12-03
Filing date: 2013-12-03
Publication date: 2014-03-19
Anticipated expiration: 2033-12-03
Also published as: CN103642939B

Abstract

本发明公开了一种基于长探针同时检测多种靶标的方法，包括以下特征：1）获取待检测的靶标及其内参18S rRNA的核酸序列，再在每种待检测靶标及其内参18S rRNA的保守区设计紧密相连的两条寡核苷酸的鉴别探针；2）设计通用引物及选择填充物长序列，通用序列Tag2的3′与上游鉴别探针的5′相连组成上游LDR探针，填充物长序列与通用序列Tag1的5′端及下游鉴别探针的3′端相连组成下游LDR长探针；3）将上游LDR探针和下游LDR长探针与待检测的靶标样品一起进行连接酶检测反应；4）利用上、下游通用引物扩增连接产物，通过琼脂糖核酸电泳获得条带信息，从而获知混合靶标的感染情况。

Description

基于长探针同时检测多种微量靶标的方法

技术领域

本发明涉及一种多重性微量检测分析方法，具体涉及一种基于连接酶反应的新型长探针微量核酸电泳检测方法。

背景技术

病原体作为一类重要病害微生物，严重影响临床诊断、水与环境分析、食品安全及生物防治等诸多方面。特别是2013年在中国中部地区爆发的H7N9高致病禽流感，再次向人类提出控制和检测病原体已经成为一项非常必要与紧迫的任务。因此，建立有效的诊断方法对于病原体的防治以及提高动植物的品质都具有非常重要的意义。

马铃薯作为世界性粮食作物之一，长期受到多种马铃薯病毒的侵染，对马铃薯的产量与品质均造成严重的影响。在病毒侵染农作物长期共生进化过程中，寄主通过基因沉默抵御病毒的侵染，而病毒为了对抗寄主基因沉默防御机制产生了具有拮抗功能的沉默抑制因子，这些抑制因子具有解除或干扰宿主的基因沉默途径的功能(Olivier V,2001.,Lakatos L et al.,2006）。研究这些抑制因子，有助于深入理解病毒与宿主间的相互作用关系，对于进一步防御病原体的具有重要的意义。目前在马铃薯病毒中已发现马铃薯卷叶病毒(Potato leafrollvirus，PLRV)P0基因、烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)16kDa基因、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)2b基因、甜菜西方黄化病毒(Beet western yellows virus，BWYV）P0基因、马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)HcPro(Helper component-proteinase)基因、马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX）P25基因具有抑制基因沉默的功能(Renovell et al.,2012;Moissiard and Voinnet2004;Chiu et al.,2010;Fukuzawa et al.,2010)，这六种抑制因子均是通过Argonaute(AGO)家族蛋白介导基因沉默。鉴于马铃薯能同时被多种病毒感染，极有可能多种抑制因子同时参与抑制多种病毒感染的现象，从而介导基因沉默的现象，同时由于参与介导基因沉默的抑制因子在马铃薯中的含量的比较低，因此，建立一种方法同时检测多种微量病原体就显得尤为迫切与必要。

目前涉及植物病原体的检测方法很多如：指示植物检测法、电镜技术、以蛋白为基础的免疫学方法、核酸介导的分子生物学方法。指示植物检测法（吴凌娟等，2003；徐洁，2002）具有检测便捷、操作简单等优点，但需要专门防虫温室，培养时间较长，而且需要定期杀虫与浇水。此外，指示植物与病毒种类的不同，采用的光照和温度培养的条件也相应的不同。这些条件制约着指示植物鉴定法的应用。吴兴泉等（2004）利用电镜技术成功鉴定带有花叶症状的马铃薯感染PVX病毒。但电镜技术受到以下限制：的操作环境必须是真空，对观察者的操作技术以及知识储备要求比较高，同时需要对所检测的生物样品进行取材、漂洗、固定、脱水、浸透、包埋、聚合、切片以及染色等步骤的处理，消耗时间长（Naja et al.,2008;Nishiyamaet al.,2010）。因此，利用电镜技术检测马铃薯病毒受到很大的限制。Singh et al（1992）利用免疫学方法成功区分PVY^N，PVY^O，PVY^N:O三种株系，但是Weidemann et al（1998）利用免疫学检测技术检测PVY^N和PVY^NTN时，出现血清交叉反应，并且检测结果不稳定。此外，免疫学检测方法不能用于纯度与含量低病毒以及缺少外壳蛋白的类病毒检测。同时该方法容易被污染易产生假阳性（Matic S et al.,2009）。

核酸介导的分子生物学方法因操作简单快捷，目前广泛被应用于各种病原体的检测检验中。常见的核酸介导的分子生物学方法有：聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）、核酸分子杂交技术（Nucleic acid hybridization technique）。PCR技术利用一对特异性引物与相关试剂扩增DNA的一种特异性方法，与传统检测方法以及免疫学方法相比，PCR检测技术极大地提高病原体检测的灵敏度和精确性。即使是极其微量的DNA，利用PCR检测也能达到极易检测的水平。此外，PCR检测技术克服了免疫学检测方法不能检测类病毒、同种病毒的不同株系以及休眠种薯的缺陷（Erlich,1989.,Suo et al,2009.,Song et al,2009.,Lee et al,2009）。通常情况下，动植物体同时受到多种病原体入侵感染，因此建立一种同时检测多种病原体的检测方法就显得尤为重要。与普通PCR检测方法相比，多重PCR检测技术具有在一次反应中可以检测多种病原体，降低检测的时间和成本。但是多重PCR对引物的设计要求特别高，多对引物之间的发夹结构、错配以及退火温度的差异都可能导致低效率的扩增，甚至没有扩增。并且需要对反应条件进行优化，特别需要对引物浓度比进行优化，过程复杂，消耗时间长（Li et al,2009.,Boonham et al,2003）。这些因素极大的限制多重PCR的应用。

以基因芯片为代表的核酸介导的分子杂交技术近年广泛的应用于病原体的检测，Busti等（2002）设计6种特异性的连接酶检测反应（ligase detection reaction,LDR）探针，其中每一对探针由鉴别寡核酸和通用探针组成，将通用探针进行荧光标记，从而达到检测的目的。Szemes等（2005）将锚定探针（padlock probes,PLPs）技术和通用芯片技术结合用于检测属、种和亚种水平的植物病原生物鉴定，锚定探针的连接产物在通用荧光标记引物的作用下进行荧光标记，通过玻片杂交的达到鉴别不同病原体，该方法具有良好的特异性和灵敏性。Wang等（2011）设计11组LDR探针，其中上游LDR探针由上游鉴别探针和上游通用靶标组成，下游LDR探针由下游鉴别探针、Zip code序列以及下游通用靶标序列组成。通过设计这11组LDR探针与事先点制好的Zip通用芯片杂交，成功的检测10种马铃薯病毒和18S rRNA阳性对照样品。上述方法由于多重性好、灵敏度高、特异性强等优势广受研究者的青睐，但由于芯片杂交容易出现假阳性，检测过程需要对不同的参数进行优化、检测的样品需要荧光标记、需要合成长的探针势必增加检测的成本。因此需要建立一种多重性好、特异性强、灵敏度相对高、操作简单快捷、成本低的检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于长探针同时检测多种靶标的方法，该方法属于用于电泳检测多种微量靶标的长探针LDR-PCR扩增方法，该方法能具有简捷可靠、易于操作、灵敏度高、特异性强、多重性好以及价格便宜等优势，使用该方法能对任何不同科、属和种的病原体进行检测和鉴定。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于长探针同时检测多种靶标的方法（即多重LDR-PCR同时检测多种微量混合靶标的方法），包括以下步骤：

1）、获取待检测的靶标及其内参18S rRNA的核酸序列，利用相关软件（例如NCBI）比对每种靶标的各个株系的核酸序列，获得每种靶标的保守区；再在每种待检测靶标及其内参18SrRNA的保守区设计紧密相连的两条寡核苷酸的鉴别探针（长度为20～25bp），即上游鉴别探针和下游鉴别探针，所述上、下游鉴别探针是一对首尾相连并与各自的靶标序列互补的寡聚核苷酸，每种待检测的靶标及其内参18S rRNA分别设计两组上、下游鉴别探针；

即，获取待检测靶标的核酸序列，利用获取每种靶标序列的全长序列，合成相应的上下游引物，通过RT-PCR获取相应的全长靶标序列，并利用相应的软件对每种靶标的多个株系的核酸序列进行相应的比对，从而获取相应的保守区；再分别在每种靶标的保守区设计长度为20～25bp两条紧密相连的寡核苷酸鉴别探针，即上游鉴别探针和下游鉴别探针，上、下游鉴别探针是一对首尾相连并与各自的靶序列互补的寡核苷酸；

2）、设计通用引物及选择填充物长序列，所述通用引物由上、下游通用引物组成，所述填充物、通用引物以及待检测的靶标序列均无同源性且不形成稳定空间结构的寡聚核苷酸；通用序列Tag2的3′与上游鉴别探针的5′相连组成上游LDR探针，填充物长序列与通用序列Tag1的5′端及下游鉴别探针的3′端相连组成下游LDR长探针；通用序列Tag1与下游通用引物互补，通用序列Tag2与上游通用引物相同；

备注说明：每种待检测靶标的对应的填充物的长度不一样，每种待检测靶标对应的长度均唯一；

梯度长片段填充物和上下游通用引物均是根据大小和空间结构与靶序列均无同源性且不形成稳定的空间结构（如发夹结构和二聚体）。梯度长片段填充物是长度范围在126～716bp的寡核苷酸，分别与Tag1的5′端、下游鉴别探针的3′端相连组成下游LDR长探针；Tag2的3′与上游鉴别探针的5′相连组成上游LDR探针；梯度长片段的填充物用于检测通用引物扩增的连接产物。

3）、将上游LDR探针和下游LDR长探针与待检测的靶标样品一起进行连接酶检测反应，得到连接产物；

4）利用上、下游通用引物扩增连接产物，通过琼脂糖核酸电泳获得条带信息，从而获知混合靶标的感染情况；

当出现与上述待检测靶标长度相同的条带时，被认定为感染了该待检测靶标；

反之，当没有出现任何条带时，被认定为没有感染待检测靶标。

作为本发明的基于长探针同时检测多种靶标的方法的改进：

所述待检测的靶标为16kDa^TRV、2b^CMV、P0^BWYV、HcPro^PVY、P25^PVX、P0^PLRV；

所述步骤4）为：

16kDa^TRV连接产物扩增长度为204bp；2b^CMV连接产物扩增长度为312bp；P0^BWYV连接产物扩增长度为398bp；18S rRNA连接产物扩增长度为474bp；HcPro^PVY连接产物扩增长度为578bp；P25^PVX连接产物扩增长度为647bp；P0^PLRV连接产物扩增长度为793bp。

作为本发明的基于长探针同时检测多种靶标的方法的进一步改进：

所述上游通用引物为：5′>GGCATCGCATAACATAAGCA<3′，下游通用引物为：

5′>GTCCGTCCAACCGTCTG<3′；通用序列Tag1与下游通用引物互补，通用序列Tag2与上游通用引物相同。

作为本发明的基于长探针同时检测多种靶标的方法的进一步改进：所述的填充物长序列为以下序列的一部分：

5′>ATGGGGAGGGGAAGGGTTCAGTTGAAGAGGATCGAAAACAAAATCAACAGGCAGGTCACTTTCTCAAAGAGAAGGTCTGGTTTGCTGAAGAAAGCCCATGAGATCTCTGTGCTT TGTGATGCTGAGGTGGCTCTGATTGTTTTCTCTACCAAAGGGAAGGTCTTTGAGTATTCTACTGATTCTTGTATGGAAAGGATTCTTGAAAGGTATGAGAGATATTCATATGCAGAGAGG CAACTTATTGCACATGATCTCGAACAAAATGGAAGCTGGACTCTGGAGCATGCGAAGCTCAAGGCTAGGATGGAGATTTTACAAAGAAATCAAAAGTATTTCATGGGAGAAGATCTCGACTCCTTGAGTCTTAAAGAGCTTCAAAATTTGGAGCAGCAGCTTGATTCTGCTCTCAAA CACATCAGGTCGAGAAAGAACCAAGTTATGCACGAATCCATTTCGGATCTTCAGAAAAAGGATAAGGCATTGCAGGAGCAAAACAACGTGCTTGCCAAGCAGGTGAAGGAGAAAGAAAAGGAATTACTTGCCGAACAGGCACAATGGGATATTCAGCATAATCAAACACTTGACACATCCTCTATCCTTCCACAAACGTTGCTGCCCTTGGACACTATTGGGACTGCGTCCTACCAAGCAATTAGAAGCAGCGAAAGAGAAGATGAGGCAAGACCATCTCGACATCG

CCCTTGGATGCTTAGCCATCTTGATTAATAG<3′；

其中16kDa^TRV填充物为594～719碱基，共126个碱基；2b^CMV填充物为487～719碱基，共233个碱基；P0^BWYV填充物为401～719碱基，共319个碱基；18S rRNA填充物为323～719碱基，共397个碱基；HcPro^PVY填充物为221～719碱基，共499个碱基；P25^PVX填充物为114～719碱基，共606个碱基；P0^PLRV填充物为4～719碱基，共716个碱基。

备注说明：单划线的为上游引物的位置，双划线的为下游引物（所有的一样）。

作为本发明的基于长探针同时检测多种靶标的方法的进一步：产生梯度长度的连接产物，每种长度对应固定靶标，采用电泳的方法可以将其清晰的区分。

本发明的基于长探针同时检测多种靶标的方法：通过不对称PCR获得梯度长度的下游长探针，且制作所有靶标下游长探针过程中使用的下游引物相同，节约了实验合成成本。本发明的基于长探针同时检测多种微量靶标的方法，克服现有多重LDR-PCR方法合成长探针以及使用基因芯片成本高的缺陷，具有成本低、检测快速、可同时检测多种靶标。本发明设计7对特异性探针，其中上游探针由生物公司直接合成，该部分由待检测模板互补的序列的特异性上游探针与Tag2两部分序列组成；下游长探针通过不对称PCR割胶单链回收得到，该部分由待检测的模板互补的特异性下游探针序列、长片段填充物以及Tag1三部分组成。通过连接酶检测反应（ligase detection reaction，LDR）7种连接产物的长度能明显区分；本发明设计特异性探针具有高的退火温度且连接产物具有相同的Tag，扩增的产物大小在203-793bp之间。依据本发明所建立的多重LDR-PCR反应体系，能实现一次LDR-PCR反应同时检测7种靶标，即16kDa^TRV、2b^CMV、P0^BWYV、18S rRNA、HcPro^PVY、P25^PVX、P0^PLRV的检测效果。

综上所述，本发明设计7组LDR探针，其中上游探针LDR由上游通用靶标和上游鉴别探针组成，下游LDR探针由下游鉴别探针、填充物长序列及下游通用靶标组成。本发明不需要通过荧光标记等手段进行芯片杂交，只需要通过简单的电泳就能达到区分检测多种微量靶标的目的，具有多重性好、特异性强、灵敏度相对高、操作简单快捷、成本低的检测优势。不仅对新检测方法的发展具有重要的理论意义，而且对于提升病原检测水平，防止危险性病原传入我国具有重要的实践意义和应用前景。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是本发明的同时检测多种混合微量靶标的方法的原理示意图。

具体实施方式

本发明的基于长探针同时检测多种微量靶标的方法，具体实施方案包括以下步骤：

1）分别对感染马铃薯病毒的马铃薯样品进行检测，确定马铃薯病毒中基因沉默抑制的因子的种类。目前在马铃薯病毒中已发现有6种沉默抑制因子，分别为烟草脆裂病毒16kDa（16kDa^TRV）基因、黄瓜花叶病毒2b（2b^CMV）基因、甜菜西方黄化病毒P0（P0^BWYV）基因、马铃薯Y病毒HcPro（HcPro^PVY）基因、马铃薯X病毒P25（P25^PVX）基因、马铃薯卷叶病毒P0（P0^PLRV）基因；

从NCBI网站下载待检测的6种抑制因子和内参18S rRNA的核酸序列，并克隆6种沉默抑制因子全序列和内参18S rRNA的部分核酸序列。使用DNAStar软件比对每种抑制因子和内参18S rRNA的各个株系的核酸序列比对，寻找保守区，利用Primer5.0在保守区设计紧密相连的两条寡核苷酸鉴别探针（一对首尾相连并与各自的靶序列互补的20～25bp左右的寡核苷酸）；

2）设计填充物长序列和通用靶标：填充物长序列和通用靶标与待检测的靶标之间没有任何同源性的寡核苷酸。填充物长序列与Tag1的5′端、下游鉴别探针的3′端相连组成下游长探针；Tag2的3′与上游鉴别探针的5′相连组成上游探针；梯度长片段的填充物用于检测通用引物扩增的连接产物，检测的原理和过程如图1所示；

3）将上、下游探针与待检测样品靶标一起进行连接酶检测反应，只有当检测到靶标序列与互补的两条寡核苷酸接头对应处碱基完全匹配，连接反应才能进行，下游的鉴别探针和填充物长序列才能被上、下游通用引物扩增，经过电泳得到相应的长度梯度的PCR扩增产物；反之则不能形成连接产物，下游的鉴别探针和填充物长序列亦不能被扩增；

4）扩增结果的检测采用本领域公知的方法，得到核酸电泳图像文件，采用阴性对照和阳性对照，确定阳性对照的值为30ng，阴性对照小于10ng，经软件和图像分析扩增条带的灰度值，进而得知感染的马铃薯样品中抑制因子分布情况。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：一种基于新型长探针同时检测多种微量靶标的方法，分别对疑似感染的50份马铃薯病毒的叶样品进行检测，确定感染样品中的沉默抑制因子的种类，公知常见有6种，分别为烟草脆裂病毒16kDa基因（16kDa^TRV）、黄瓜花叶病毒2b基因（2b^CMV）、甜菜西方黄化病毒P0基因（P0^BWYV）、马铃薯Y病毒HcPro基因（HcPro^PVY）、马铃薯X病毒P25基因（P25^PVX）、马铃薯卷叶病毒P0基因（P0^PLRV）；本发明方法具体依次进行如下步骤：

1）从NCBI网站下载待检测的6种抑制因子和内参18S rRNA的核酸序列，克隆相应的全长序列，全长引物见表1，并用DNAstar软件对每一种抑制因子和内参的各个株系的核酸序列进行序列进行比对，寻找保守区；再利用Primer5.0软件分别在每种抑制因子和内参的保守区内设计紧密相连的两条寡核苷酸鉴别探针，每种设计两组，具体如表2所示：

表1本发明中待检测靶标及连接产物的全长引物

备注说明：UP是通用引物，设置内参的目的是为了起到对照作用。

表2本发明设计的鉴别探针

2）设计通用引物、Tag1、Tag2以及填充物长序列：

通用引物由上游通用引物5′>GGCATCGCATAACATAAGCA<3′和下游通用引物5′>GTCCGTCCAACCGTCTG<3′组成。Tag1与下游通用引物互补，Tag2与上游通用引物相同。即，Tag1为：5′>CAGACGGTTGGACGGAC<3′。

所涉及到填充物长序列具体为5′>ATGGGGAGGGGAAGGGTTCAGTTGAAGAGGATCGAAAACAAAATCAACAGGCAGGTCACTTTCTCAAAGAGAAGGTCTGGTTTGCTGAAGAAAGCCCATGAGATCTCTGTGCTTTGTGATGCTGAGGTGGCTCTGATTGTTTTCTCTACCAAAGGGAAGGTCTTTGAGTATTCTACTGATTCTTGTATGGAAAGGATTCTTGAAAGGTATGAGAGATATTCATATGCAGAGAGGCAACTTATTGCACATGATCTCGAACAAAATGGAAGCTGGACTCTGGAGCATGCGAAGCTCAAGGCTAGGATGGAGATTTTACAAAGAAATCAAAAGTATTTCATGGGAGAAGATCTCGACTCCTTGAGTCTTAAAGAGCTTCAAAATTTGGAGCAGCAGCTTGATTCTGCTCTCAAACACATCAGGTCGAGAAAGAACCAAGTTATGCACGAATCCATTTCGGATCTTCAGAAAAAGGATAAGGCATTGCAGGAGCAAAACAACGTGCTTGCCAAGCAGGTGAAGGAGAAAGAAAAGGAATTACTTGCCGAACAGGCACAATGGGATATTCAGCATAATCAAACACTTGACACATCCTCTATCCTTCCACAAACGTTGCTGCCCTTGGACACTATTGGGACTGCGTCCTACCAAGCAATTAGAAGCAGCGAAAGAGAAGATGAGGCAAGACCATCTCGACATCGAGCCAATGCAGTACTCCTGCCCCCTTGGATGCTTAGCCATCTTGATTAATAG<3′，其中16kDa^TRV填充物为594～719碱基，共126个碱基；2b^CMV填充物为487～719碱基，共233个碱基；P0^BWYV填充物为401～719碱基，共319个碱基；18S rRNA填充物为323～719碱基，共397个碱基；HcPro^PVY填充物为221～719碱基，共499个碱基；P25^PVX填充物为114～719碱基，共606个碱基；P0^PLRV填充物为4～719碱基，共716个碱基。填充物长序列与通用引物没有任何同源性。

填充物连接分别与下游鉴别探针的3′端、Tag1的5′端相连组成下游LDR长探针，上游鉴别探针的5′端与Tag2的3′端相连组成上游LDR探针，每种靶标组装形成的探针有两组，通过不对称PCR扩增获得下游长探针序列见表3。

表3本发明中下游长探针序列

注：Tag1=CAGACGGTTGGACGGAC。

所述上游探针具体为表4：

表4本发明中上游探针序列

注：Tag2=GGCATCGCATAACATAAGCA。

3）提取疑似感染的50份马铃薯病毒叶组织的总RNA并反转录成cDNA

（1）马铃薯叶片样品总RNA提取

将100mg叶片冻干粉（液氮研磨）置于1.5ml EP管中，随即加入1ml Trizol，匀浆于冰上放置5min。加入200ul氯仿。剧烈震荡30s，放于冰上5～10min，分层后4，℃12000r/min离心20min，取上清液至另一1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇（约0.5ml）轻轻混匀，-20℃放置2h或-80℃放置1h，

弃上清，加1ml75%乙醇洗涤，轻轻混匀，

用枪头吸干乙醇，真空干燥5-10min（目的是不要过分干燥），所得的RNA溶解在25μL DEPC灭菌水中。上述所有操作所涉及的枪头和EP管均需要0.1%（w/v）DEPC灭菌水处理。

（2）总RNA的反转录

cDNA合成体系（总反应体积20μL）：将（1）所得的总RNA2.0μL，随机引物(50μM)1μL，5×RT Buffer4μL，dNTP(2.5mΜ)4μL，Rnase Inhibior0.5μL，RNase1μL，DEPC H₂O7.5μL。反应条件为5min，425℃0min。将反应所得转录产物-20℃保存备用。

3）将上述所得的7种上游探针和下游长探针（每种待检测靶标均选择第一组探针，第二组备用）与上述疑似感染的50份马铃薯病毒的转录产物进行连接酶检测反应（Ligase detectionreaction,LDR）。

LDR反应体系

具体条件为：先进行95℃3min变性反应，然后95℃30s，65℃4min，进行35个循环，得到连接产物。

备注说明：每一种产品的转录产物分别进行如上操作。

4）然后用通用上游引物5′>GGCATCGCATAACATAAGCA<3′和下游通用引物5′>GTCCGTCCAACCGTCTG<3′PCR扩增连接产物，

PCR扩增体系为：

PCR扩增条件如下：先进行95℃3min变性反应，然后95℃30s，58℃30s，72℃1min，进行35个循环。然后取5μl扩增产物进行电泳。

经过跑胶分析，所得电泳结果为：

在50个样品中，检测“204bp”的有3例，“312bp”的有2例，“398bp”的有4例，“578bp”的有5例，“647bp”的有4例，“793bp”的有2例，其中，“204bp”和“398bp”混合感染的有2例，“578bp”和“647bp”混合感染的有2例，“204bp”、“398bp”以及“578bp”混合感染的有1例。

为了充分说明本发明方法的优越性，发明人作如下的对比实验：

1.对照例1：

采用传统PCR为基础方法，分别对50例与实施例1相同的疑似感染马铃薯病毒的样品进行检测检测，确定样品感染沉默抑制因子的种类。目前在马铃薯病毒中确认的沉默抑制因子的种类有6种，分别为烟草脆裂病毒16kDa（16kDa^TRV）基因、黄瓜花叶病毒2b（2b^CMV）基因、甜菜西方黄化病毒P0（P0^BWYV）基因、马铃薯Y病毒HcPro（HcPro^PVY）基因、马铃薯X病毒P25（P25^PVX）基因、马铃薯卷叶病毒P0（P0^PLRV）基因。6种抑制因子和内参18S rRNA的常规PCR方法检测用引物具体如表1所示。

与实施例1相比较，对照例1采用传统的PCR方法，两种方法检测符合率为100%,但PCR一次只能检测一种靶标，检测50个样品、7种靶标需要350次的PCR，操作费时长，试剂消耗多，本发明虽然比普通PCR多一步检测步骤，但一次能检测多种靶标，操作总时间短，试剂消耗少，具有明显的方法与成本上的优越性。

2.对照例2：

采用随机引物反转录的LDR-PCR通用基因芯片方法（参见，汪平2011年Biosen Bioelectron26:3719724），分别对50例与实施1相同的样品进行检测，确定样品感染的抑制因子的种类。目前在马铃薯病毒中确认的沉默抑制因子的种类有6种，分别为分别为烟草脆裂病毒16kDa（16kDa^TRV）基因、黄瓜花叶病毒2b（2b^CMV）基因、甜菜西方黄化病毒P0（P0^BWYV）基因、马铃薯Y病毒HcPro（HcPro^PVY）基因、马铃薯X病毒P25（P25^PVX）基因、马铃薯卷叶病毒P0（P0^PLRV）基因。

1）从NCBI上下载上述6种抑制因子序列和内参18S rRNA的核酸序列，并且用DNAstar软件比对每种抑制因子和内参的各个株系的核酸序列进行序列比对，寻找保守区，利用Primer5.0软件分别在每种抑制因子和内参的保守区内设计紧密相连的两条寡核苷酸鉴别探针，每种设计两组，共设计14组，具体如表2所示。

2）设计通用引物以及完全互补的Zip code和cZip code：

通用引物以及完全互补的Zip code和cZip code彼此以及靶序列没有同源性的寡聚核苷酸。cZip code分别与下游鉴别探针3′端、Tag2的5′分别相连，组成下游探针；上游鉴别探针5′与Tag1的3′相连组成上游探针。Tag2与上游通用引物分别相同，Tag1与下游通用引物互补。通用引物由上游通用引物5′>GGCATCGCATAACATAAGCA<3′和下游通用引物5′>GTCCGTCCAACCGTCTG<3′组成。

将每种抑制因子和内参的下游鉴别探针、Tag2与Zip code相连（共30组），组成下游探针；上游鉴别探针与Tag1组成上游探针。利用Primer5.0分析连接好的上游探针和下游探针，筛选符合待检测靶标的唯一最优鉴别探针和Zip code序列（见表5）。Zip code和cZip code用于杂交检测互补的同引物扩增的连接产物，检测原理和过程具体参见Wang等2011年在Biosen Bioelectron26:3719-3724发表的文章。通过连接酶检测反应获得的长度～100bp的连接产物均含一对Tag序列、一组Zip-code序列以及一对鉴别探针。每种待检测靶标对应Zip-code

表5：Zip code和cZip code序列

3）将步骤2）中所得的上游探针和下游探针与上述50例待检测样品转录产物放在一起进行连接酶检测反应（Ligase detection reaction,LDR），具体条件为：先进行95℃3min变性反应，然后95℃30s，65℃4min，进行35个循环，得到长度～100bp的连接产物。只有当检测到DNA与互补的两条的寡聚核苷酸接头处对应处碱基完全匹配，连接反应才能进行，Zipcode才能被上下游通用引物扩增与标记，然后与通用基因芯片上的相应的cZip code序列探针杂交；反之则不能形成连接产物，Zip code不能被扩增。其中将上游通用引物的5′端进行Cy5荧光标记，由上海生工完成。

4）制备通用芯片，具体内容如下：采用醛基修饰的载玻片作为固相载体，分别向其上固定6种抑制因子与内参的所对应的3′端（dT）₁₀NH₂的Zip code序列作为通用芯片。然后将步骤3）中25μl的含有Cy5荧光标记PCR扩增产物经真空浓缩并溶于10μl的杂交液中，与通用芯片在42℃杂交3h。

5）杂交后随后分别用0.2×SSC和0.1×SSC中冲洗5分钟；用洗耳球吹干后用扫描仪进行扫描。用扫描仪扫描，杂交结果检测采用本领域公知的方法，采用激光聚焦扫描仪（GenPixTm Personal4100A，Axon Instruments）扫读，得到Cy5图像文件，经软件分析，结果与实施1的结果完全吻合。

备注说明：本发明相对于上述对照例2具有如下技术优势：

与上述对照例2相比，本发明检测成本低廉，不需要对检测的探针进行Cy5荧光标记、合成长探针、探针的点制以及杂交优化等繁杂的操作。同时上述对照2在杂交过程中容易出现假阳性，势必影响检测的可靠性。本发明是一种多重性好、特异性强、灵敏度相对高、操作简单快捷、成本低的检测方法。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江农林大学

<120> 基于长探针同时检测多种微量靶标的方法

<160> 14

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 16 kDa^TRV的上游鉴别探针

<400> 1

gtaaacgctt tgaagcaaga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 16 kDa^TRV的下游鉴别探针

<400> 2

aatcgagaaa tctggaaaca 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2b^CMV的上游鉴别探针

<400> 3

ttaccgtttt atcagataga tgg 23

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2b^CMV的下游鉴别探针

<400> 4

ttcggaacta atagagatg 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P0^BWYV的上游鉴别探针

<400> 5

acagtttcac ttgttcgttg 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P0^BWYV的下游鉴别探针

<400> 6

aaccgaccgc taacagctac ag 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 18S rRNA的上游鉴别探针

<400> 7

cgatcagata ccgtcctagt c 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 18S rRNA的下游鉴别探针

<400> 8

tcaaccataa acgatgccg 19

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HcPro^PVY的上游鉴别探针

<400> 9

tatgaaatcc gcaagcatcc a 21

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HcPro^PVY的下游鉴别探针

<400> 10

aatggaacaa ggaaactct 19

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P25^PVX的上游鉴别探针

<400> 11

gagtttagcc tagagcccca c 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P25^PVX的下游鉴别探针

<400> 12

ttctacttgg aaacatcatt 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P0^PLRV的上游鉴别探针

<400> 13

ccgtgacctt atgggcaat 19

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P0^PLRV的下游鉴别探针

<400> 14

catcagcatt tggttcggtc t 21

Claims

1.基于长探针同时检测多种靶标的方法，其特征在于包括以下特征：

1）、获取待检测的靶标及其内参18S rRNA的核酸序列，利用相关软件比对每种靶标的各个株系的核酸序列，获得每种靶标的保守区；再在每种待检测靶标及其内参18S rRNA的保守区设计紧密相连的两条寡核苷酸的鉴别探针，即上游鉴别探针和下游鉴别探针，所述上、下游鉴别探针是一对首尾相连并与各自的靶标序列互补的寡聚核苷酸，每种待检测的靶标及其内参18S rRNA分别设计两组上、下游鉴别探针；

4）、利用上、下游通用引物扩增连接产物，通过琼脂糖核酸电泳获得条带信息，从而获知混合靶标的感染情况；

2.根据权利要求1所述的基于长探针同时检测多种靶标的方法，其特征在于：

所述待检测的靶标为16kDa ^TRV、2b^CMV、P0^BWYV、HcPro^PVY、P25^PVX、P0^PLRV；

所述步骤4）为：

16kDa ^TRV连接产物扩增长度为204bp；2b^CMV连接产物扩增长度为312bp；P0^BWYV连接产物扩增长度为398bp；18S rRNA连接产物扩增长度为474bp；HcPro^PVY连接产物扩增长度为578bp；P25^PVX连接产物扩增长度为647bp；P0^PLRV连接产物扩增长度为793bp。

3.根据权利要求2所述的基于长探针同时检测多种靶标的方法，其特征在于：

4.根据权利要求3所述的基于长探针同时检测多种靶标的方法，其特征在于：所述的填充物长序列为以下序列的一部分：

CCCTTGGATGCTTAGCCATCTTGATTAATAG<3′；

5.根据权利要求4所述的基于长探针同时检测多种靶标的方法，其特征在于：产生梯度长度的连接产物，每种长度对应固定靶标，采用电泳的方法可以将其清晰的区分。

6.根据权利要求1～5所述的基于长探针同时检测多种靶标的方法，其特征在于：

步骤1）所述的鉴别探针具体如下：