CN105802989B - 毕赤酵母表达重组蛋白的载体、基因、方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在毕赤酵母中表达重组蛋白的载体、基因及表达方法，尤其适用于对人组织激肽释放酶的重组表达。本发明的载体上含有编码间隔短肽的核苷酸序列，所述的间隔短肽的氨基酸序列为1‑10个EA或EEAEAEAEPK，同时，上述所述载体在间隔短肽核苷酸序列5，端连接有信号肽核苷酸序列。这使得在毕赤酵母中表达的目的基因比原来不加入间隔短肽时表达量提高，所述信号肽和间隔短肽在设计和使用时可以加在载体上，也可以加在目的蛋白的核苷酸序列上；同时在间隔短肽后再增加前肽使得所表达的hK1的N端结构与天然hK1一致，且目的蛋白经毕赤酵母***表达后具有较高的生物学活性。
Description
技术领域
本发明属于生物工程基因领域，涉及在毕赤酵母中表达重组蛋白的载体、基因、方法及应用。
背景技术
毕赤酵母***是近年来发展很快的真核表达***，与原核表达***相比，它可以对表达的蛋白质进行翻译后加工、折叠和修饰，得到具有正确空间结构和较高生物学活性的重组蛋白。此外，毕赤酵母***还具有发酵方法成熟、发酵密度高、培养简单廉价、外源蛋白可分泌表达、目的蛋白产量高，背景蛋白少、易于目的蛋白纯化等优点。近年来，许多重组蛋白已在毕赤酵母中实现了高效表达，达到克级水平，但仍有多种蛋白表达量较低，提高毕赤酵母外源蛋白表达量成为降低工业化生产成本的关键。
激肽释放酶(也称为激肽原酶)是一种丝氨酸蛋白酶，能使激肽原释放出激肽，它具有很高的生理活性，在人体组织中起着十分重要的生理作用。申请人尝试以毕赤酵母表达一般外源蛋白的方法对人激肽释放酶1(hK1)进行表达，却基本没有表达。
为此，申请人进行了各种尝试，包括在菌株、培养条件、发酵等条件逐渐成熟的情况下，构建高表达的载体以提高外源基因表达量，如信号肽的加入及更改，在信号肽序列和目的蛋白序列之间***几个氨基酸的间隔短肽。通过各种努力，申请人实现了该蛋白在毕赤酵母中的高量表达。
然而，申请人却意外的发现，在利用毕赤酵母表达蛋白酶类药物时，在分泌信号序列和目的蛋白N端之间加入间隔短肽，往往使得目的蛋白N端序列剪切不完全，在N端氨基酸前残留若干间隔短肽对应的氨基酸，使得所表达蛋白与天然蛋白序列不一致，同时影响所表达蛋白活性。然而，重组蛋白，尤其是治疗性蛋白酶类药物，N端结构正确是所有研究工作可以顺利进行的最重要前提之一；如果重组蛋白类药物N端结构不正确，在后期药品注册申报中将根本不可能通过审核。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种在在毕赤酵母中表达重组蛋白的载体、基因及表达方法。具体如下：
本发明的第一个目的是提供一种载体，所述载体上含有编码间隔短肽的核苷酸序列，所述的间隔短肽的氨基酸序列为1-10个EA或EEAEAEAEPK，优选的，为1-5个EA。编码1-5个EA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-5所示，编码EEAEAEAEPK的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
优选地，上述载体在间隔短肽核苷酸序列3，端连接有编码目的蛋白前肽的核苷酸序列，优选的，所述前肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
优选的，上述所述载体在间隔短肽核苷酸序列5，端连接有信号肽核苷酸序列，所述的信号肽为黑曲霉α-淀粉酶信号肽、人血清白蛋白信号肽、酿酒酵母α-factor信号肽及蛋白自身信号肽，更优选的，为人血清白蛋白信号肽和酿酒酵母α-factor信号肽。
更优选的，所述的载体为pAO815，pPIC9，pPIC9K，pPIC3.5，pPIC3.5K，pPICZαA、B、C或pGAPZαA、B、C，更优选为pPIC3.5K，pPICZαA或pGAPZαA。
优选的，所述载体可用于重组酶类蛋白的表达，包括：重组人组织激肽释放酶(rhK1)、重组人血浆激肽释放酶(rhPK1)、重组***性蛋白酶1(rhCELA1)、重组人尿酸酶(rhUOX)、重组人尿激酶(rhUK)，更优选的，为重组人组织激肽释放酶(rhK1)和重组***性蛋白酶1(rhCELA1)。
本发明的另一个目的是提供一种含有间隔短肽的人组织激肽释放酶(hK1)的融合蛋白，所述间隔短肽在人组织激肽释放酶(hK1)的N端，所述的间隔短肽为1-10个EA或EEAEAEAEPK，优选的，为1-5个EA和EEAEAEAEPK。
优选的，上述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7-12所示。
更优选的，上述融合蛋白中，在人组织激肽释放酶和间隔短肽之间还有如SEQ IDNO.20所示的前肽。
更优选的，编码上述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.13-18所示。
更优选的，编码上述融合蛋白的核苷酸序列，在人组织激肽释放酶和间隔短肽的基因序列之间还有如SEQ ID NO.21所示的前肽的基因序列。
本发明的另一个目的是提供一种包含上述所述核苷酸序列的载体。优选的，所述的载体为pAO815，pPIC9，pPIC9K，pPIC3.5，pPIC3.5K，pPICZαA、B、C，pPICZ A、B、C，pGAPZαA、B、C，更优选为pPIC3.5K，pPICZαA或pGAPZαA。
本发明的另一个目的是提供一种包含上述所述载体的毕赤酵母菌株。优选的，所述毕赤酵母菌株为SMD1168、GS115、KM71、X-33或KM71H，更优选为GS115或X-33菌株。
本发明的另一个目的是提供一种N端结构正确的重组人组织激肽释放酶的表达方法，所述方法包含下述步骤：
A.构建含有编码上述信号肽、间隔短肽、前肽和目的蛋白的基因的载体；
B.将步骤A的载体线性化后转入毕赤酵母菌株中，并在合适的条件下培养；
C.回收纯化目的蛋白。
上述所述载体优选为pPIC3.5K，pPICZαA和pGAPZαA。
上述所述毕赤酵母菌株优选为GS115或X33菌株。
本发明的另一个目的是提供一种N端结构正确的重组人组织激肽释放酶的纯化方法，包括以下步骤：
1、发酵液的除杂预处理
将按上述表达方法得到的重组蛋白的发酵液，低温离心收集上清，缓慢加入(NH)2SO4固体粉末并不断搅拌，使其在上清中终浓度为1.2M，pH6.0，0.45μm滤膜过滤。
2、疏水层析
平衡缓冲液为20mM磷酸盐，1.2M(NH)2SO4，pH6.0，洗脱缓冲液为20mM磷酸盐，pH6.0。逐渐提高洗脱缓冲液的比例进行等度洗脱，并收集各个洗脱峰。
3、亲和层析
合并疏水层析收集的含有目的蛋白的样品峰，调节pH7.5，平衡缓冲液为20mM磷酸盐，0.5M NaCl pH7.5，洗脱缓冲液为0.5M NaCl，10mM HCl，pH2.0。洗脱后收集各洗脱峰，过滤除菌，即得到纯化后重组蛋白。
本发明的技术效果主要有：
本发明的信号肽和***的间隔短肽使得在毕赤酵母中表达的目的基因比原来不加入间隔短肽时表达量提高，所述信号肽和间隔短肽在设计和使用时可以加在载体上，也可以加在目的蛋白的核苷酸序列上；同时在间隔短肽后再增加前肽使得所表达的hK1的N端结构与天然hK1一致，且目的蛋白经毕赤酵母***表达后具有较高的生物学活性。
附图说明
图1为重组hK1不同表达质粒构建过程图。
图1-a为重组hK1表达质粒pPICZα-1EA-rhK1构建过程图；图1-b为重组hK1表达质粒pPICZα-1EA-pro-rhK1构建过程图。
图2为不同毕赤酵母X-33菌株小量诱导SDS-PAGE凝胶电泳鉴定图，图中箭头所指即为重组hK1蛋白。
图2-a为含有前肽和不同的连接短肽的毕赤酵母X-33菌株表达一周后，菌液上清SDS-PAGE凝 胶电泳图。其中，泳道1为10-250KD范围的预染蛋白上样Marker。泳道2-7分别为表达质粒依次为pPICZα-1EA-pro-rhK1，pPICZα-2EA-pro-rhK1，pPICZα-3EA-pro-rhK1，pPICZα-4EA-pro-rhK1，pPICZα-5EA-pro-rhK1，pPICZα-EEA-pro-rhK1电转到X-33宿主工程菌筛选获得的阳性单克隆宿主工程菌株培养菌液上清。
图2-b为不含前肽含有不同的连接短肽的毕赤酵母X-33菌株表达一周后，菌液上清SDS-PAGE凝胶电泳图。其中，泳道1为10-250KD范围的预染蛋白上样Marker。泳道2-7是表达质粒依次为pPICZα-1EA-rhK1，pPICZα-2EA-rhK1，pPICZα-3EA-rhK1，pPICZα-4EA-rhK1，pPICZα-5EA-rhK1，pPICZα-EEA-rhK1电转到X-33宿主工程菌中筛选获得的阳性单克隆宿主工程菌株培养菌液上清。
图3为表达载体为pPICZα-1EA-pro-rhK1的筛选获得的重组工程菌株X-33发酵液经AKTATM avant150两步纯化色谱图
其中，图3-a为表达载体为pPICZα-1EA-pro-rhK1的筛选获得的重组工程菌株X-33发酵液经AKTATM avant150疏水纯化色谱图。峰3为分子量较高的重组hK1蛋白，峰4为分子量较低的重组hK1蛋白。
图3-b为表达载体为pPICZα-1EA-pro-rhK1的筛选获得的重组工程菌株X-33发酵液经AKTATM avant150第二步对疏水层析收集到的样品进行亲和层析色谱图。其中所示单一样品峰即为重组hK1蛋白。
图4为表达载体为pPICZα-1EA-pro-rhK1的筛选获得的重组工程菌株X-33发酵液经AKTATM avant150两步纯化后，对收集管进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定图。
其中，图4-a为重组hK1发酵液经AKTATM avant150疏水层析纯化后SDS-PAGE电泳图。图中箭头所指即为重组hK1蛋白。泳道1是10-250KD范围的预染蛋白上样Marker；泳道2-14是不同收集管中的样品。
图4-b为重组hK1蛋白疏水层析收集获得的样品经AKTATM avant150亲和层析纯化后对收集管进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定图，图中箭头所指即为重组hK1蛋白。
其中，泳道1是10-250KD范围的预染蛋白上样Marker；泳道2-4是不同收集管中的样品。
图5为表达载体为pPICZα-1EA-pro-rhK1筛选获得的工程菌株X-33表达的重组hK1经过二步纯化后进行纯度鉴定的高效液相色谱图
其中图5-a为重组hK1样品经过C18反相色谱柱(Zorbax SB-C184.6×250)梯度洗脱色谱图；
图5-b为安捷伦高效液相色谱仪工作站CHEM32对洗脱色谱图进行面积百分比计算报告，可知重组hK1蛋白的面积百分比占据整个色谱峰面积99.6％。
图6-a，6-b，6-c为苯乙内酰硫氨基酸(PTH-AA)混合标准品和重组hK1蛋白N端分析色谱 图
其中，图6-a为苯乙内酰硫氨基酸(PTH-AA)混合标准品(163-12271，Wako)色谱图；
图6-b为表达载体为pPICZα-1EA-rhK1筛选获得的工程菌株X-33表达重组hK1蛋白N端氨基酸残基分析色谱图。5个谱图表示进行5个循环测试后，N端氨基酸所对应的测序谱图，依次为NH2-Ile-Val-Gly-Gly-Trp和NH2-Glu-Ala-Ile-Val-Gly，含有没有完全剪切干净的外源氨基酸；
图6-c为表达载体为pPICZα-1EA-pro-rhK1筛选获得的工程菌株X-33表达重组hK1蛋白N端氨基酸残基分析色谱图。5个谱图表示进行5个循环测试后，N端氨基酸所对应的测序谱图，依次为NH2-Ile-Val-Gly-Gly-Trp，与天然序列完全一致。
图7为发酵过程中重组毕赤酵母工程菌株菌体生长曲线图。
其中，图7-a为发酵过程中重组毕赤酵母工程菌株菌体湿重曲线变化图，曲线显示在甘油流加培养期菌体生长良好，进入对数生长期后，菌体湿重最高达到497g/L，在进入蛋白甲醇诱导表达阶段后，菌体湿重不再增加，进入蛋白稳定表达阶段，直至最后下罐。
图7-b为发酵过程中重组毕赤酵母工程菌株菌体OD600值曲线变化图，曲线显示在甘油流加培养期菌体生长良好，进入对数生长期后，菌体OD600值最高达到308，在进入蛋白甲醇诱导表达阶段后，菌体OD600值不再增加，进入蛋白稳定表达阶段，直至最后下罐。
图8为发酵过程中，实时取样在光学显微镜下观察重组毕赤酵母菌株形态图。图中显示酵母生长状态良好，没有杂菌存在。
图9为发酵过程中重组毕赤酵母工程菌株表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳分析图，图中箭头所指即为重组hK1蛋白。
其中，泳道1是10-250KD范围的预染蛋白上样Marker；泳道2为流加甲醇诱导12小时表达产物，泳道3为流加甲醇诱导24小时表达产物，泳道4为流加甲醇诱导36小时表达产物，泳道5为流加甲醇诱导48小时表达产物，泳道6为流加甲醇诱导60小时表达产物，泳道7为流加甲醇诱导72小时表达产物，泳道8为流加甲醇诱导84小时表达产物。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.不同重组hK1表达载体构建
1.2不含前肽、含有前肽的重组hK1表达载体构建
发明人根据GenBank已公开的人激肽释放酶1(Homo sapiens kallikrein 1)的cDNA序列 (GenBank登录号：BC005313)和已公开的人激肽释放酶1(Homo sapienskallikrein)的氨基酸序列(GenBank登录号：AAA59455.1)，对该基因进行密码子优化后得到本发明的重组hK1基因(SEQ ID NO.19)，构建到pUC57质粒(购自南京金斯瑞科技有限公司)中，得到一种长期保存质粒，记为pUC57-rhK1质粒。
以pUC57-rhK1质粒为模板，上、下游引物分别引入Xho I和Not I酶切位点，在紧接着Xho I酶切位点后分别***重组hK1前肽序列(SEQ ID NO.21)，进行PCR扩增，所用引物序列如下：
不含有前肽的重组hK1上游扩增引物(SEQ ID NO.22)
P1:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGCTATCGTCGGTGGATGGGAA
含有前肽的重组hK1上游扩增引物(SEQ ID NO.23)
P2:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGCTCCTCCTATTCAATCTAGAATCGTCGGTGGATGG GAA
通用下游扩增引物(SEQ ID NO.24)
P3:AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAACTATTTTCAGCGAT
反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶Q5超保真DNA聚合酶(M0491S，购自New England Biolabs公司)，2U/μL。反应条件为98℃10s、55℃30s、72℃30s，30个循环后，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，产物大小与预期大小(760bp左右)一致。将得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化。纯化后，用XhoI(#R0146S,购自New England Biolabs公司)和NotI(#R0189S,购自New EnglandBiolabs公司)双酶切，用T4连接酶连接到pPICZαA(V19520，购自Invitrogen)质粒中，转化到Top10感受态细胞中，在含有Zeocin的LB平板中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到不含前肽、含有前肽的重组hK1表达载体，分别记为pPICZα-rhK1，pPICZα-pro-rhK1。
1.2不含前肽且含有不同间隔短肽的重组hK1表达载体构建
发明人根据步骤1.1中构建的pPICZα-rhK1质粒为模板，上、下游引物分别引入XhoI和NotI酶切位点，在紧接着XhoI酶切位点后***不同间隔短肽EA，进行PCR扩增，所用引物序列如下：
含有1个间隔短肽EA的重组hK1的上游扩增引物(SEQ ID NO.25)
P4:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGCTATCGTCGGTGGATGGGAA
含有2个重复间隔短肽EA的重组hK1的上游扩增引物(SEQ ID NO.26)
P5:CCGCTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCTATCGTCGGTGGATGGGAA
含有3个重复间隔短肽EA的重组hK1的上游扩增引物(SEQ ID NO.27)
P6:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGCTGAGGCTGAAGCTATCGTCGGTGGATGGGAA含有4个重复间隔短肽EA的重组hK1的上游扩增引物(SEQ ID NO.28)
P7:CCGCTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCTGAGGCTGAAGCTATCGTCGGTGGATGGGAA
含有5个重复间隔短肽EA的重组hK1的上游扩增引物(SEQ ID NO.29)
P8:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGCTGAGGCTGAAGCTGAGGCTGAAGCTATCGTCGGTGGATGGGAA
含有间隔短肽EEAEAEAEPK的重组hK1的上游扩增引物(SEQ ID NO.30)
P9:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAAGCTGAACCAAAGATCGTCGGTGGATGGGAA
通用下游扩增引物(SEQ ID NO.24)
P3:AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAACTATTTTCAGCGAT
反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶Q5超保真DNA聚合酶，2U/μL。反应条件为98℃10s、55℃30s、72℃30s，30个循环后，经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，产物大小与预期大小(760bp左右)一致。将得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化。纯化后，用XhoI和NotI双酶切，再用T4连接酶连接到pPICZαA质粒中，转化到Top10感受态细胞中，在含有Zeocin的LB平板中37℃过夜培养。第二天将筛选得到的阳性克隆菌株测序，比对，与预期序列完全一致，即得到不含前肽且含有不同间隔短肽的重组hK1表达载体，分别记为pPICZα-1EA-rhK1(质粒构建如图1-a所示)，pPICZα-2EA-rhK1，pPICZα-3EA-rhK1，pPICZα-4EA-rhK1，pPICZα-5EA-rhK1，pPICZα-EEA-rhK1。
1.3含有不同间隔短肽和前肽的重组hK1表达载体构建
发明人根据步骤1.1中构建的pPICZα-pro-rhK1质粒为模板，上、下游引物分别引入XhoI和NotI酶切位点，在紧接着XhoI酶切位点后***不同间隔短肽EA，进行PCR扩增，所用引物序列如下：
含有1个间隔短肽EA的重组hK1的上游扩增引物(SEQ ID NO.31)
P10:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGCTCCTCCTATTCAATCTAGA
含有2个重复间隔短肽EA的重组hK1的上游扩增引物(SEQ ID NO.32)
P11:CCGCTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCTCCTCCTATTCAATCTAGA
含有3个重复间隔短肽EA的重组hK1的上游扩增引物(SEQ ID NO.33)
P12:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGCTGAGGCTGAAGCTCCTCCTATTCAATCTAGA
含有4个重复间隔短肽EA的重组hK1的上游扩增引物(SEQ ID NO.34)
P13:CCGCTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCTGAGGCTGAAGCTCCTCCTATTCAATCTAGA
含有5个重复间隔短肽EA的重组hK1的上游扩增引物(SEQ ID NO.35)
P14:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGCTGAGGCTGAAGCTGAGGCTGAAGCTCCTCCTATTCAATCTAGA
含有间隔短肽EEAEAEAEPK的重组hK1的上游扩增引物(SEQ ID NO.36)
P15:CCGCTCGAGAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAAGCTGAACCAAAGCCTCCTATTCAATCTAGA
通用下游扩增引物(SEQ ID NO.24)
P3:AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAACTATTTTCAGCGAT
反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶Q5超保真DNA聚合酶，2U/μL。反应条件为98℃10s、55℃30s、72℃30s，30个循环后，经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，产物大小与预期大小(760bp左右)一致。将得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化。纯化后，用XhoI和NotI双酶切，再用T4连接酶连接到pPICZαA质粒中，转化到Top10感受态细胞中，在含有Zeocin的LB平板中37℃过夜培养。第二天将筛选获得的阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到含有不同间隔短肽和前肽的重组hK1表达载体，分别记为pPICZα-1EA-pro-rhK1(质粒构建如图1-b所示)，pPICZα-2EA-pro-rhK1，pPICZα-3EA-pro-rhK1，pPICZα-4EA-pro-rhK1，pPICZα-5EA-pro-rhK1，pPICZα-EEA-pro-rhK1。
实施例2.不同的重组hK1工程菌株的诱导表达
2.1重组hK1工程菌株筛选
按EasySelect Pichia Expression Kit提供的方法将X-33，GS115菌株(C18000，购自Invitrogen)制备成电转染感受态细胞。分别将实施例1中的不同形式的表达载体用SacI(#R0156S,购自New England Biolabs公司)限制性内切酶线性化，并通过乙醇沉淀的方法将线性化载体纯化，电转化上述线性化载体于毕赤酵母X-33和GS115感受态细胞中，涂布含有不同浓度的Zeocin(R250-01，购自Invitrogen公司)的YPD固体培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂糖15g/L)中，30℃培养3-5天，就有阳性单克隆重组菌株生成。
2.2重组菌株诱导鉴定
挑取步骤2.1中获得的不同的高表达单克隆重组菌株于5mL BMGY培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO43g/L，KH2PO411.8g/L，YNB 13.4g/L，生物素4×10-4g/L，甘油10g/L)中，于50mL无菌离心管中30℃，220rpm培养，至OD600＝2.0-6.0时，取1mL保存菌种，并将剩余菌液重悬后转移到5mL BMMY培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO43g/L，KH2PO411.8g/L，YNB13.4g/L，生物素4×10-4g/L，甲醇5mL/L)中小量诱导表达，每隔24h补加甲醇至终浓度为1％(v/v)。一周后，离心收集菌液上清，图2-a，2-b不为同的形式的重组hK1表达载体筛选获得的重组菌株的SDS-PAGE凝胶电泳图。
2.3重组hK1工程菌株扩大诱导表达
分别挑取步骤2.2中获得的不同的重组hK1基因工程菌株接种于改良发酵BSM培养基(甘油40g/L，H3PO49mL/L，CaSO4·2H2O 0.3g/L，K2SO46.07g/L，MgSO4·7H2O 4.97g/L，KOH1.38g/L)中，并用浓氨水调节培养基至pH＝6.0。48小时后，待菌体密度生长到OD＝2～6，每隔24小时补加甲醇至终浓度为1.0％(v/v)，2mL/L PMT1微量盐(CuSO46.0g/L，KI0.8g/L，MnSO4·H2O 3.0g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，H3BO30.2g/L，CaSO4·2H2O 0.5g/L，ZnCl220g/L，FeSO4·7H2O 65g/L，Biotin 0.2g/L，浓硫酸5mL/L)溶液。一周后，收集发酵培养液。
实施例3.不同的重组hK1工程菌株发酵液纯化
由于重组毕赤酵母菌株表达hK1有两条不同的条带，据研究该两条带均为重组hK1，它们的区别就是糖基化修饰程度不同，且高低比列约为3:7，该两条带蛋白活性相差不大，考虑到毕赤酵母甲醇酵母分泌的重组hK1蛋白中，其糖分主要由甘露糖组成，因此纯化低分子量条带用于后续实验。
本专利主要采用疏水层析和亲和层析两步分离纯化重组hK1发酵液，柱子分别选择为HiTrap Phenyl HP和HiTrap Benzamidine FF，具体步骤如下：
3.1发酵液的除杂预处理
按实施例2步骤2.3中表达方法得到不同的重组hK1重组菌株发酵液上清，12000rpm，15min低温离心收集上清，缓慢加入NH)2SO4固体粉末，并不断地搅拌，使(NH)2SO4在上清中终浓度为1.2M，调节pH6.0，0.45μm滤膜过滤。
3.2疏水层析
运用全自动智能蛋白纯化***(AKTA avant150，购自GE healcare)UNICORN6.1操作软件中DOE方法对预处理获得的重组hK1发酵液进行优化HiTrap Phenyl HP纯化工艺，最终确定为平衡缓冲液为20mM磷酸盐，1.2M(NH)2SO4，pH6.0，洗脱缓冲液为20mM磷酸盐，pH6.0。按照15％-30％-45％-50％-100％逐步提高洗脱缓冲液的比例进行洗脱，收集各个洗脱峰，结果 见图3-a，通过SDS-PAGE电泳确定纯度后合并符合要求的收集管，进行第二步纯化。
3.3亲和层析
合并疏水层析收集的含有目的蛋白的(峰4)样品峰，调节pH7.5，平衡缓冲液为20mM磷酸盐，0.5M NaCl，pH7.5，洗脱缓冲液为0.5M NaCl，10mM HCl，pH2.0。洗脱后收集各洗脱峰，结果如图3-b，SDS-PAGE鉴定(如图4-a、4-b所示)后合并纯度大于95％的洗脱峰，过滤除菌，即得到纯化后重组hK1蛋白。
实施例4不同的重组hK1蛋白N端氨基酸序列分析
4.1重组hK1样品纯度鉴定
本试验主要采用基于Zorbax SB-C18反向色谱柱梯度洗脱的方法，分析实施例3获得的重组hK1纯化样品，利用安捷伦高效液相色谱***(Agilent 1260HPLC)对样品进行纯度分析，结果由图5-a，5-b所示，纯化获得的样品纯度达到99％以上，说明实施例3的纯化工艺完全可行。
4.2重组hK1蛋白N端氨基酸序列分析
本试验主要采用基于经典的Edman降解法的N端序列分析，利用岛津全自动蛋白质多肽测序仪(PPSQ-31A，SHIMADZU)对实施例3中纯化获得的rhK1样品的N端氨基酸序列进行分析，结果由表1所示，当表达载体分别为pPICZα-1EA-rhK1，pPICZα-2EA-rhK1，pPICZα-3EA-rhK1，pPICZα-4EA-rhK1，pPICZα-5EA-rhK1，PICZα-EEA-rhK1时，筛选获得的重组hK1菌株表达重组hK1样品的N端氨基酸残基测序结果均为和EAIVGGW和IVGGW的混合物(见图6-b)，这表明利用此种分子构建策略在毕赤酵母***中表达的重组hK1蛋白其N端序列在信号肽剪切不完全；当表达载体分别为pPICZα-1EA-pro-rhK1，pPICZα-2EA-pro-rhK1，pPICZα-3EA-pro-rhK1，pPICZα-4EA-pro-rhK1，pPICZα-5EA-pro-rhK1，PICZα-EEA-pro-rhK1的时候，筛选获得的重组hK1菌株表达重组hK1样品N端氨基酸残基测序结果均为IVGGW(见图6-c)。按上述实验方案经多次实验所得结果见表1。这表明利用此种分子构建策略在毕赤酵母***中表达的重组hK1蛋白其N端序列与天然序列完全一致。
表1N端氨基酸残基序列分析
4.3重组hK1蛋白生物活性鉴定
首先将反应缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，10mmol/L CaCl2，pH＝8.0)将标准品猪激肽释放酶(购于千红制药的猪激肽释放酶纯品，NO.3712030700)，稀释5个浓度梯度10U/mL，5U/mL，2.5U/mL，1.25U/mL，0.625U/mL，底物为D-Val-Leu-Argp-nitroanilide(购自Sigma-Aldrich公司)，使用时用反应缓冲液稀释至0.2mmol/L。样品用反应缓冲液稀释适当倍数，于96孔板中先每孔加稀释好的底物80μL，然后立即加入稀释好的标准品80μl及各样品，Synergy H1GEN酶标仪(购自BioTek公司)37℃，405nm处进行吸光度检测，1min检测一次，连续检测15min。实验结果见表1，当表达载体分别为pPICZα-1EA-rhK1，pPICZα-2EA-rhK1，pPICZα-3EA-rhK1，pPICZα-4EA-rhK1，pPICZα-5EA-rhK1，PICZα-EEA-rhK1时，筛选获得的重组hK1菌株表达重组hK1样品活性为150IU左右；当表达载体分别为pPICZα-1EA-pro-rhK1，pPICZα-2EA-pro-rhK1，pPICZα-3EA-pro-rhK1，pPICZα-4EA-pro-rhK1，pPICZα-5EA-pro-rhK1，PICZα-EEA-pro-rhK1的时候，筛选获得的重组hK1菌株表达重组hK1样品活性为750IU/mg左右。因此，申请人在解决间隔短肽添加后有剪切不完全的技术问题的同时，也意外的实现了重组hK1表达产物活性有很大提高的技术效果。申请人分析，这是由于在毕赤酵母***中表达的重组hK1蛋白活性与N端剪切正确有密切关系。
实施例5重组hK1工程菌株中试发酵
5.1种子液的培养
将保存于-80℃冰箱的N端氨基酸剪切正确的重组hK1工程甘油菌株划线于YPD平板中，置于30℃培养箱中培养，直至长出单菌落；挑一个单菌落接入10mL的BMGY液体培养基中，30℃，250rpm摇瓶中培养12～18h，得到一级种子液；将培养好的一级种子液以l:100比例再次接种于500mL的BMGY培养基中30℃，200r/min，振荡培养12～18h，至OD600≈6.0，镜检正常就得到二级种子液准备上罐接种用。
5.2高密度发酵条件确定
配制10L的改良发酵BSM培养基(甘油40g/L，H3PO49mL/L，CaSO4·2H2O 0.3g/L，K2SO46.07g/L，MgSO4·7H2O 4.97g/L，KOH 1.38g/L)和1L PMT1微量盐溶液(CuSO46.0g/L，KI0.8g/L，MnSO4·H2O 3.0g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，H3BO30.2g/L，CaSO4·2H2O 0.5g/L，ZnCl220g/L，FeSO4·7H2O 65g/L，Biotin 0.2g/L，浓硫酸5mL/L)溶液，并将改良发酵BSM培养基于赛多利斯
Cplus生物反应器中进行在线灭菌，灭菌后用浓氨水调节培养基至pH＝6.0，并将步骤5.1中500mL二级种子液接种于该培养基中。发酵培养初始条件为：30℃，搅拌转速为：300rpm，pH＝6.0±0.2，添加PMT1微量盐溶液，培养过程中调节搅拌(300～1000rpm)和通空气量(1～3v/v.m)保持溶氧30～100％，当溶氧有一个明显的跃升时，即表明细胞消耗完初始甘油，此时开始流加50％的甘油，当菌体湿重达到400g/L左右，结束甘油流加。然后保持1h高溶氧水平，使细胞代谢残余甘油和甘油代谢副产物。继而开始流加甲醇诱导目的蛋白表达，发酵过程中维持DO不低于20％，温度30℃，pH＝6.0±0.2进行诱导表达。由图7可知，在甘油流加培养过程中，菌体生长良好，很快进入对数生长期，菌体湿重最高达到497g/L，发酵液OD600值最高达到308。在进入蛋白甲醇诱导表达阶段后，菌体湿重和发酵液OD600值不再增加，重组毕赤酵母菌株进入蛋白稳定表达阶段。在整个诱导表达其间，每隔12小时进行取样，并实时取样进行染色镜检，观察重组毕赤酵母菌株的发酵情况和是否发生染菌，并用SDS-PAGE分析表达量，图8为光学显微镜下观察重组毕赤酵母菌株形态，从图中可以发现，重组毕赤酵母生长状态良好，没有观察到杂菌的存在。图9为整个发酵过程中流加甲醇诱导电泳图。经过计算，同摇瓶中相比，重组hK1的酶活达到了600IU/mg以上，发酵液中表达产物达到了1.35g/L以上。申请人分析，采用本专利中的优化方法获得的重组菌株，完全能够产业化扩大生产。
Claims (4)
1.一种在N端含有间隔短肽的人组织激肽释放酶的融合蛋白，所述的间隔短肽为1-5个EA，在人组织激肽释放酶和间隔短肽之间还有如SEQ ID NO.20所示的前肽。
2.编码如权利要求1所述的融合蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.13-17所示。
3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，在人组织激肽释放酶和间隔短肽的核苷酸序列之间还有如SEQ ID NO.21所示的前肽的核苷酸序列。
4.一种N端结构正确的重组人组织激肽释放酶的表达方法，所述方法包含下述步骤：
A.构建含有如权利要求3所述核苷酸序列的载体；
B.将步骤A的载体线性化后转入毕赤酵母菌株中，并在合适的条件下培养；
C.回收纯化目的蛋白。
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