CN105111304B

CN105111304B - 重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法

Info

Publication number: CN105111304B
Application number: CN201510645026.6A
Authority: CN
Inventors: 刘海峰; 周祥山; 应欢; 张元兴; 田守生; 解福生; 方喆; 黄菁; 庞甲佩; 史兆松
Original assignee: SHANDONG EHUA BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd; East China University of Science and Technology; Dong E E Jiao Co Ltd
Current assignee: Huarun Onde Biopharmaceutical Co ltd; East China University of Science and Technology
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2018-12-14
Anticipated expiration: 2035-09-30
Also published as: CN105111304A

Abstract

本发明公开了一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法，属于重组人胰岛素及其类似物的制备领域。本发明将分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清用阳离子层析柱进行纯化，在层析的洗涤时先后采用两种不同洗涤液进行洗涤，更快速的进行目的蛋白的洗脱，缩短洗脱时间，减少目的蛋白沉淀，同时减少洗脱样品体积；在洗脱时采用pH值7.0‑9.0的洗脱液进行洗脱，洗脱后的产物不需进行换相操作，直接加入胰蛋白酶进行酶切转换，转换效率高。本发明方法操作简单，经过一步离子层析纯化完成对发酵液上清的粗纯化和换相操作，能够将样品纯度从14％提高至95％，且纯化后的样品直接进行酶切，酶切转换效率在95％以上，简化生产工艺，节约成本。

Description

重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法

技术领域

本发明涉及一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法，属于重组人胰岛素的制备领域。

背景技术

糖尿病已成为继心脑血管疾病、恶性肿瘤后的第三大威胁人类健康的慢性非传染性疾病。目前，中国糖尿病患病人数已取代印度成为世界第一，世界卫生组织(WHO)预测至2025年全球糖尿病人数将突破3.0亿。

胰岛素制品是最有效的糖尿病治疗药物之一。随着科学技术的发展，从提取动物胰岛素到有机合成胰岛素、半合成人胰岛素，到现如今占主要市场的重组人胰岛素，胰岛素的工业化生产过程已经历了翻天覆地的变化。重组胰岛素前体分为包涵体和分泌蛋白两种形式，分泌蛋白常使用阳离子层析柱，但在样品进行离子纯化前需要初步纯化，如中国专利CN1854299A中提到，胰岛素前体在离子层析纯化前需要经过盐析或微滤步骤进行初步纯化，样品处理程序复杂，操作繁琐，且工艺步骤的增多必然会导致样品收率的降低。

因此，开发一种新的重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法，使纯化后的重组胰岛素前体直接进行酶切，简化生产工艺，将具有重要的市场价值和应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法，该方法经过一步离子层析纯化，能够将重组胰岛素前体纯度从14％提高至95％，且纯化后的样品可直接进行酶切，酶切转换效率在95％以上，简化了生产工艺，节约纯化成本。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明公开了一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法，包括：(1)将阳离子离子层析柱用平衡液进行平衡；(2)将分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清上平衡后的阳离子离子层析柱，依次用平衡液进行平衡、用洗涤液进行洗涤和用洗脱液进行洗脱；收集洗脱产物，得到纯化的重组人胰岛素前体；(3)将纯化的重组人胰岛素前体用胰蛋白酶进行酶切转换，得到缺少B链第30位苏氨酸的人胰岛素；其中，所述洗脱液的pH值为7.0-9.0，优选为7.8-8.5，更优选为8.0-8.5。

其中，所述洗脱液为碳酸氢铵缓冲液、硼酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的任意一种。洗脱液的浓度为0.05-0.3mol/L；优选的，所述洗脱液的浓度为0.1-0.15mol/L。

步骤(2)中所述洗涤过程分为两步，即先用洗涤液A进行洗涤，然后再用洗涤液B进行洗涤；所述洗涤液A包括：缓冲液和无机盐；其中，所述缓冲液为磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或琥珀酸缓冲液中的任意一种；所述无机盐为氯化钠；优选的，所述缓冲液的浓度为0.01-0.2mol/L，优选为0.01-0.05mol/L，最优选为20mmol/L；所述无机盐的浓度为0.01-0.2mol/L，优选为0.01-0.12mol/L，最优选为0.1mol/L。具体的，所述洗涤液A包括：20mmol/L柠檬酸+0.1mol/L NaCl；或者，所述洗涤液A包括：20mmol/L乙酸+0.1mol/L NaCl。

步骤(2)中所述洗涤还包括：用洗涤液A洗涤后，再接着用洗涤液B洗涤阳离子层析柱；所述洗涤液B为盐酸；优选的，所述洗涤液B为1-5mmol/L盐酸；最优选为5mmol/L盐酸。

本发明所述洗涤液A或洗涤液B的pH值为2.0-4.5，优选为3.0-4.0，更优选为3.5-4.0，最优选为4.0。

步骤(1)或步骤(2)中所述的平衡液包括：缓冲液和无机盐；其中，所述缓冲液为磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或琥珀酸缓冲液中的任意一种或多种；所述无机盐为氯化钠；优选的，所述缓冲液的浓度为0.01-0.2mol/L，优选为0.01-0.05mol/L，最优选为20mmol/L；所述无机盐的浓度为0.01-0.12mol/L，优选为0.01-0.1mol/L，最优选为0.01mol/L。具体的，所述平衡液包括：20mmol/L柠檬酸+0.01mol/L NaCl；或者，所述平衡液包括：20mmol/L乙酸+0.01mol/L NaCl。进一步优选的，所述平衡液pH值为2.0-4.5，优选为3.0-4.0，更优选为3.5-4.0，最优选为4.0。

本发明所述重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法中，所述胰蛋白酶的加入量为：按照质量比计，胰蛋白酶：重组人胰岛素前体＝1:100～1:400；优选为1:200；所述酶切的温度为20-40℃；酶切的时间为0.5-3小时；优选的，所述酶切的温度为25-30℃；酶切的时间为1-1.5小时；最优选的，所述酶切的温度为30℃；酶切的时间为1.5小时。

本发明所述的分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清为编码重组人胰岛素前体的基因在真核细胞中进行分泌表达获得的发酵上清；优选的，所述的分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清为编码重组人胰岛素前体的基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞中进行分泌表达获得的发酵上清。所述重组人胰岛素前体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示(参考《重组胰岛素前体转化成人胰岛素和地特胰岛素的工艺研究》，刘海峰，华东理工大学，博士学位论文(2013))。此氨基酸序列包括间隔肽、缺30位的胰岛素B链、小C肽和胰岛素A链四个部分，三个胰蛋白酶酶切位点：Site1为间隔肽与B链之间，Site2和Site3分别为小C肽两端。其中间隔肽及小C肽的长短可以调节，酶切位点可以设计成其他酶的酶切位点，A、B链可以是在此基础上进行其他修饰，因此认为，以上提及的可修饰或微小变化的序列改变都在本发明的保护范围内。

本发明中根据高效液相检测结果显示，目的蛋白重组人胰岛素前体在发酵上清中纯度约14％(发酵液液相检测结果显示有两个较大的色素吸收峰，去除色素峰后纯度在70-80％，特此说明。但本发明中样品均以高效液相检测结果中未去除色素峰的纯度进行统计。)，由于发酵上清中盐浓度较高，需要稀释后才能在上样过程中使目的蛋白吸附在离子层析介质上。重组人胰岛素前体的生产方法在本领域内是已知的，例如，可以参考中国专利CN1873006 A中公开的方法。

本发明将分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清进行预处理后再上平衡后的阳离子离子层析柱；其中，所述预处理包括：将发酵上清稀释，加入缓冲剂，使发酵上清与平衡液具有相同的缓冲盐浓度和pH值；其中，所述缓冲剂为磷酸、乙酸、柠檬酸或琥珀酸中的任意一种；所述缓冲盐浓度为0.01-0.2mol/L，优选为0.01-0.05mol/L，最优选为20mmol/L；所述pH值为2.0-4.5，优选为3.0-4.0，更优选为3.5-4.0，最优选为4.0；所述稀释为稀释5-20倍，优选为稀释10倍；用去离子水或注射用水进行稀释。

本发明用盐酸或氢氧化钠中的任意一种调节平衡液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液或发酵上清的pH值。

本发明方法中，离子层析采用AKTA explorer 100层析工作站，所用层析柱为XK26/200(装填体积为50ml)。所述阳离子层析的离子交换填料为S Sepharose FF、SPSepharose FF、CM Sepharose FF，Source 15 S或Source 30 S中的任意一种；优选为CMSepharose FF；所述阳离子层析柱的温度为20-25℃；所述洗涤液或洗脱液的线性流速为7.5-30mm/min，优选为22.6mm/min，线性流速是体积流速与纯化柱横截面积的比值；检测波长为280nm。

本发明涉及的是分泌蛋白的离子层析纯化方法，是利用重组人胰岛素前体与杂质在特定的缓冲环境下所带有电荷数差异来进行纯化的，且纯化后获得的溶液可以直接进行酶切。该方法通过低于目的蛋白pI的溶液进行上样，平衡，洗涤，使用高于目的蛋白pI的溶液进行洗脱，收集的洗脱溶液为适合酶切的碱性缓冲环境，与后续的酶切步骤相结合，大大简化了纯化步骤，提高了纯度得率。

本发明方法经离子层析洗脱后目的蛋白纯度达96％以上，样品收率为96％以上，胰岛素前体酶切后酶切转化率达95％以上。而按照现有技术的制备方法，均需要在酸性高盐条件下将胰岛素前体蛋白洗脱下来，然后将洗脱收集液通过沉淀或超滤的方法调整至合适的缓冲环境、pH值和合适的盐浓度后才能进行酶切，纯化后重组人胰岛素前体纯度达到92％，样品收率为86-91％，酶切转化率约60-85％；常规方法不仅操作复杂、繁琐，而且随工艺步骤的增多导致重组人胰岛素前体纯度不高、收率低，酶切转化率明显降低。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

(1)本发明中重组人胰岛素前体酵母菌的发酵上清为酸性，pH值3.5左右，通过稀释并用少量缓冲盐调节后直接上样，采用阳离子介质纯化，用洗涤液A洗涤大部分杂质，洗涤液B主要用于减弱柱体中洗涤液A形成的酸性缓冲环境，能使洗脱液更快速的进行目的蛋白的洗脱，缩短洗脱时间，减少目的蛋白沉淀，同时减少洗脱样品的体积。

(2)洗脱收集液pH范围为7.8-8.5，盐浓度较低，可直接进行酶切(胰蛋白酶最适pH范围为7.8-8.5)，减少了工艺步骤。经一步离子层析即完成了对发酵液上清的粗纯化和换相操作，很好的衔接了后续的酶切步骤，简化工艺步骤的同时，提高样品收率。

(3)本发明中粗样样品的上样量范围为40-60g/L床层体积，上样量达70g/L床层体积时，流穿样品中能检出目的蛋白。因此，最终上样量定为60g/L床层体积。目的蛋白经此纯化步骤，纯度从14％提高至95％以上，纯化得率稳定在95％以上，提高了目的蛋白纯度，获得的胰岛素前体酶切转化率达95％以上(酶切方法部分参考中国专利CN102816819B)酶切效果良好，为后续的样品纯化奠定了良好的基础。

附图说明

图1为离子层析纯化前后胰岛素前体蛋白纯度对比；

图2为不同实施例酶切效果对比。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、材料及方法

1.1试验材料及仪器

柠檬酸、磷酸等缓冲剂物质购自Amresco公司，氯化钠(NaCl)、盐酸(HCl)和氢氧化钠(NaOH)购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈(CH₃CN，HPLC级)、三氟乙酸(TFA，HPLC级)购自J&K Chemical公司；分析型高效液相仪器为安捷伦1260，分析型色谱柱为Kromasil-C18-5μm-(4.6mm×250mm)；层析纯化***为瑞典Pharmacia Biotech公司AKTAexplorer 100层析工作站，所用层析柱为XK 26/200(装填体积为50ml)，所用阳离子填料为S Sepharose FF、SP Sepharose FF、CM Sepharose FF、Source 15S、Source 30S，购自GE。

1.2样品纯度检测方法

采用反相层析方法对粗样和纯化收集的样品进行检测，仪器为安捷伦1260分析型高效液相，分析色谱柱：Kromasil-C18-5μm-(4.6mm×250mm)。流动相A相为0.1％TFA；流动相B相：0.1％TFA与80％乙腈混合液。流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为280nm。15-50％B相梯度洗脱25min。保留时间在10-11min的主峰即为重组人胰岛素前体蛋白，保留时间在11-12min的主峰为desB 30蛋白。纯度计算采用面积归一法。

1.3样品纯化得率计算方法

对于本发明中不涉及物质结构变化的实验步骤，如离子纯化步骤，样品纯化得率是指纯化后目的蛋白峰面积与体积的乘积与纯化前目的蛋白峰面积与体积的乘积的比值。对于涉及物质结构变化的实验步骤，理论上一摩尔的重组人胰岛素前体蛋白酶切后获得一摩尔desB 30蛋白，因此酶切步骤的酶切转化率是指实际获得的desB 30蛋白与理论上应获得的desB 30蛋白的摩尔量比值，其中理论的des B30摩尔量即是酶切前胰岛素前体的摩尔量，胰岛素前体及desB30样品的质量分别根据各自的标准曲线计算获得，相应的胰岛素前体的摩尔质量为7043，desB 30的摩尔质量为5707，具体的计算公式如下：

预备实施例1含有重组人胰岛素前体的发酵上清的制备

参考《重组胰岛素前体转化成人胰岛素和地特胰岛素的工艺研究》，刘海峰，华东理工大学，博士学位论文(2013)。

人工合成ILP基因和质粒pPIC9K分别用Xho I和EcoRI进行酶切，回收相应的目的片段和质粒大片段，将两个片段用T4DNA连接酶连接，构建重组质粒pPIC9K::ILP，然后将构建好的重组质粒pPIC9K::ILP大量制备，线性化，电穿孔转化宿主细胞P.pastorisGS115，涂布MGY(His-)平板，挑选高拷贝的阳性克隆(其中，构建的胰岛素前体蛋白(ILP)的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)为：eeaeaeaepk(间隔肽)fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpk(缺少30位苏氨酸的B链)aak(小C肽)giveqcctsicslyqlenycn(A链)。培养所述工程酵母菌株，分泌表达出人胰岛素前体蛋白；将发酵液通过离心获得含有目的蛋白的上清液，其中目的蛋白重组人胰岛素前体在发酵上清中纯度约14％(以高效液相检测结果中未去除色素峰的纯度进行统计)。

实施例1重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法

上样样品为预备实施例1的发酵上清。发酵上清用去离子水稀释至原体积的10倍，称取适量柠檬酸溶入稀释样品至终浓度为20mmol/L。

离子层析纯化方法采用CM Sepharose FF(XK 26/200，50ml)在层析工作站上进行；平衡液为20mmol/L柠檬酸+0.01mol/L NaCl，洗涤液A为20mmol/L柠檬酸+0.1mol/LNaCl，洗涤液B为5mmol/L盐酸，洗脱液为0.1mol/L碳酸氢铵缓冲液；

除洗脱液外所有溶液(包括上样样品、平衡液、洗涤液A、洗涤液B)用盐酸或氢氧化钠调节pH至4.0，洗脱液用盐酸或氢氧化钠调节pH至8.0，保持柱子温度为20-25℃；根据前文提到的线性流速范围，结合实施例所采用的纯化柱规格，纯化过程体积流速范围为4-16ml/min，最优流速为12ml/min；后续的实施例中，为了方便计算及理解，流速均以体积流速表示，检测波长为280nm。

具体步骤为：

(1)采用平衡液平衡柱子4CV(CV是Column Volume的缩写，为纯化柱柱床体积)；

(2)约含3100mg重组人胰岛素前体的稀释溶液上样，上样结束继续采用平衡液平衡4CV；

(3)采用洗涤液A洗涤4CV，收集洗涤峰；

(4)采用洗涤液B洗涤4CV；

(5)采用洗脱液进行洗脱，收集目的蛋白洗脱峰；

(6)称取15mg胰蛋白酶加入洗脱峰中混匀，30℃酶切1.5小时。

粗样样品的上样量约60g/L床层体积。实验结果为发酵上清目的蛋白纯度为14％，含量约为3100mg；洗涤液A收集样品中无目的蛋白，均为杂蛋白；洗涤液B洗涤时不出峰；洗脱液洗脱收集样品中目的蛋白纯度为97.6％，目的蛋白含量约3000mg，胰岛素前体酶切1.5小时后酶切转化率为95.2％。

说明根据实施例1的方法，纯化后重组人胰岛素前体纯度达到97.6％(图1)，样品收率为96.8％，胰岛素前体酶切转化率为95.2％(图2)。

实施例2重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法

上样样品为预备实施例1的发酵上清，发酵上清用去离子水稀释至原体积的10倍，量取适量乙酸溶入稀释样品至终浓度为20mmol/L。

离子层析纯化方法采用S Sepharose FF(XK 26/200，50ml)在层析工作站上进行；平衡液为20mmol/L乙酸+0.01mol/L NaCl，洗涤液A为20mmol/L乙酸+0.1mol/L NaCl，洗涤液B为5mmol/L盐酸，洗脱液为0.15mol/L硼酸缓冲液；

除洗脱液外所有溶液(包括上样样品、平衡液、洗涤液A、洗涤液B)用盐酸或氢氧化钠调节pH至3.5，洗脱液调pH至8.5，保持柱子温度为20-25℃；流速为12ml/min；检测波长为280nm。

具体步骤为：

(1)采用平衡液平衡柱子4CV；

(3)采用洗涤液A洗涤4CV，收集洗涤峰；

(4)采用洗涤液B洗涤4CV；

(5)采用洗脱液进行洗脱，收集目的蛋白洗脱峰；

(6)称取20mg胰蛋白酶加入洗脱峰收集液中混匀，25℃酶切1.5小时。

粗样样品的上样量约60g/L床层体积。实验结果为发酵上清目的蛋白纯度为14.3％，含量约为3100mg；洗涤液A收集样品中无目的蛋白，均为杂蛋白；洗涤液B洗涤时不出峰；洗脱液洗脱收集样品中目的蛋白纯度为96.9％，目的蛋白含量约3010mg，胰岛素前体酶切1.5小时后酶切转化率达95.4％。

说明根据实施例2的方法，纯化后重组人胰岛素前体纯度达到96.9％，样品收率为97.1％，胰岛素前体酶切转化率达95.4％(图2)。

实施例3重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法

上样样品为预备实施例1的发酵上清，发酵上清用去离子水稀释至原体积的10倍。量取适量乙酸加入稀释样品至终浓度为20mmol/L。

离子层析纯化方法采用SP Sepharose FF(XK 26/200，50ml)在层析工作站上进行；平衡液为20mmol/L乙酸+0.01mol/L NaCl，洗涤液A为20mmol/L乙酸+0.1mol/L NaCl，洗涤液B为5mmol/L盐酸，洗脱液为0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)；

除洗脱液外所有溶液(包括上样样品、平衡液、洗涤液A、洗涤液B)用盐酸或氢氧化钠调节pH至4.0，洗脱液用盐酸或氢氧化钠调节pH至8.0，保持柱子温度为20-25℃；流速为12ml/min；检测波长为280nm。

具体步骤为：

(1)采用平衡液平衡柱子4CV；

(3)采用洗涤液A洗涤4CV，收集洗涤液；

(4)采用洗涤液B洗涤4CV；

(5)采用洗脱液进行洗脱，收集目的蛋白洗脱峰；

(6)称取15mg胰蛋白酶加入洗脱峰中混匀，30℃酶切1.5小时。

粗样样品的上样量约60g/L床层体积。实验结果为发酵上清目的蛋白纯度为14.3％，含量约为3100mg；洗涤液A收集样品中无目的蛋白，均为杂蛋白；洗涤液B洗涤不出峰；洗脱液洗脱收集样品中目的蛋白纯度为97.8％，目的蛋白含量约2980mg，胰岛素前体酶切1.5小时后酶切转化率达95.5％。

说明根据实施例3的方法，纯化后重组人胰岛素前体纯度达到96.9％，样品收率为96.1％，胰岛素前体酶切转化率达95.5％(图2)。

实施例4重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法

上样样品为预备实施例1的发酵上清，发酵上清用去离子水稀释至原体积的5倍。称取适量琥珀酸溶入稀释样品至终浓度为0.01mol/L。

离子层析纯化方法采用Source 30S(XK 26/200，50ml)在层析工作站上进行；平衡液为0.01mol/L琥珀酸+0.01mol/L NaCl，洗涤液A为0.01mol/L琥珀酸+0.12mol/L NaCl，洗涤液B为1mmol/L盐酸，洗脱液为0.05mol/L碳酸氢铵缓冲液；

除洗脱液外所有溶液(包括上样样品、平衡液、洗涤液A、洗涤液B)用盐酸或氢氧化钠调节pH至2.0，洗脱液用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.0，保持柱子温度为20-25℃；流速为4ml/min；检测波长为280nm。

具体步骤为：

(1)采用平衡液平衡柱子4CV；

(3)采用洗涤液A洗涤4CV，收集洗涤峰；

(4)采用洗涤液B洗涤4CV；

(5)采用洗脱液进行洗脱，收集目的蛋白洗脱峰；

(6)称取8mg胰蛋白酶加入洗脱峰中混匀，20℃酶切3小时。

粗样样品的上样量约60g/L床层体积。实验结果为发酵上清目的蛋白纯度为14％，含量约为3100mg；洗涤液A收集样品中无目的蛋白，均为杂蛋白；洗涤液B洗涤时不出峰；洗脱液洗脱收集样品中目的蛋白纯度为94％，目的蛋白含量约3000mg，胰岛素前体酶切后酶切转化率为90％。

实施例5重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法

上样样品为预备实施例1的发酵上清，发酵上清用去离子水稀释至原体积的20倍。称取适量磷酸溶入稀释样品至终浓度为0.05mol/L。

离子层析纯化方法采用Source 15S(XK 26/200，50ml)在层析工作站上进行；平衡液为0.2mol/L磷酸+0.12mol/L NaCl，洗涤液A为0.2mol/L磷酸+0.2mol/L NaCl，洗涤液B为5mmol/L盐酸，洗脱液为0.3mol/L硼酸缓冲液；

除洗脱液外所有溶液(包括上样样品、平衡液、洗涤液A、洗涤液B)用盐酸或氢氧化钠调节pH至4.5，洗脱液用盐酸或氢氧化钠调节pH至9.0，保持柱子温度为20-25℃；流速为10ml/min；检测波长为280nm。

具体步骤为：

(1)采用平衡液平衡柱子4CV；

(3)采用洗涤液A洗涤4CV，收集洗涤峰；

(4)采用洗涤液B洗涤4CV；

(5)采用洗脱液进行洗脱，收集目的蛋白洗脱峰；

(6)称取31mg胰蛋白酶加入洗脱峰中混匀，40℃酶切0.5小时。

粗样样品的上样量约60g/L床层体积。实验结果为发酵上清目的蛋白纯度为14％，含量约为3100mg；洗涤液A收集样品中无目的蛋白，均为杂蛋白；洗涤液B洗涤时不出峰；洗脱液洗脱收集样品中目的蛋白纯度为93％，目的蛋白含量约3000mg，胰岛素前体酶切后酶切转化率为91％。

实施例6重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法

上样样品为预备实施例1的发酵上清，发酵上清用去离子水稀释至原体积的10倍。称取适量乙酸溶入稀释样品至终浓度为0.05mol/L。

离子层析纯化方法采用CM Sepharose FF(XK 26/200，50ml)在层析工作站上进行；平衡液为0.05mol/L乙酸+0.12mol/L NaCl，洗涤液A为0.05mol/L乙酸+0.2mol/L NaCl，洗涤液B为3mmol/L盐酸，洗脱液为0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液；

除洗脱液外所有溶液(包括上样样品、平衡液、洗涤液A、洗涤液B)用盐酸或氢氧化钠调节pH至3.0，洗脱液用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.8，保持柱子温度为20-25℃；流速为16ml/min；检测波长为280nm。

具体步骤为：

(1)采用平衡液平衡柱子4CV；

(3)采用洗涤液A洗涤4CV，收集洗涤峰；

(4)采用洗涤液B洗涤4CV；

(5)采用洗脱液进行洗脱，收集目的蛋白洗脱峰；

(6)称取15mg胰蛋白酶加入洗脱峰中混匀，30℃酶切1小时。

粗样样品的上样量约60g/L床层体积。实验结果为发酵上清目的蛋白纯度为14％，含量约为3100mg；洗涤液A收集样品中无目的蛋白，均为杂蛋白；洗涤液B洗涤时不出峰；洗脱液洗脱收集样品中目的蛋白纯度为93％，目的蛋白含量约3000mg，胰岛素前体酶切1小时后酶切转化率为90％。

对比实施例1重组人胰岛素前体的纯化和酶切

上样样品为预备实施例1的发酵上清，发酵上清用去离子水稀释至原体积的10倍，称取适量柠檬酸溶入稀释样品至终浓度为20mmol/L。

离子层析纯化方法采用CM Sepharose FF(XK 26/200，50ml)在层析工作站上进行；平衡液为20mmol/L柠檬酸+0.01mol/L NaCl，洗涤液为20mmol/L柠檬酸+0.1mol/LNaCl，洗脱液为20mmol/L柠檬酸+0.5mol/L NaCl；所有溶液用盐酸或氢氧化钠调节pH至4.0，保持柱子温度为20-25℃；流速为12ml/min；检测波长为280nm。

具体步骤为：

(1)采用平衡液平衡柱子4CV；

(3)采用洗涤液洗涤4CV，收集洗涤峰；

(5)采用洗脱液进行洗脱，收集目的蛋白洗脱峰；

(6)根据洗脱收集液体积，称取适量的碳酸氢铵，逐步加入洗脱液中，边搅拌边加至完全溶液，使溶液中碳酸氢铵的终浓度为0.1mol/L，调节pH为8.0。

(7)称取15mg胰蛋白酶加入(6)的溶液中混匀，30℃酶切1.5小时。

实验结果为发酵上清目的蛋白纯度为14.3％，含量约为3100mg；洗涤液洗涤收集样品中无目的蛋白，均为杂蛋白；洗脱液洗脱收集样品中目的蛋白纯度为92.1％，目的蛋白含量约2824mg。此时重组人胰岛素前体纯度达到92.1％，样品收率为91.1％。

将洗脱收集液调整至合适的缓冲环境及pH值后进行酶切，酶切转化率约60％。分析原因，可能是原洗脱液中的盐浓度较高，对胰蛋白酶的活性有影响，延长酶切时间无好转。

根据对比实施例1的方法，纯化后重组人胰岛素前体纯度达到92.1％(图1)，样品收率为91.1％，酶切转化率约60％(图2)。

对比实施例2重组人胰岛素前体的纯化和酶切

离子层析纯化方法采用CM Sepharose FF(XK 26/200，50ml)在层析工作站上进行；平衡液为20mmol/L柠檬酸+0.01mol/L NaCl，洗涤液为20mmol/L柠檬酸+0.1mol/LNaCl，洗脱液为20mmol/L柠檬酸+0.5mol/L NaCl，所有溶液用盐酸或氢氧化钠调节pH至4.0，保持柱子温度为20-25℃；流速为12ml/min；检测波长为280nm。

具体步骤为：

(1)采用平衡液平衡柱子4CV；

(3)采用洗涤液洗涤4CV，收集洗涤峰；

(5)采用洗脱液进行洗脱，收集目的蛋白洗脱峰；

(6)根据洗脱收集液体积，按照硫酸铵饱和度60％的比例称取适量的硫酸铵，研磨后逐步加入洗脱液中，边搅拌边加至完全溶液。

(7)硫酸铵沉淀样品静置4小时后离心，离心条件：4℃，10000rpm，离心30min，弃上清。

(8)离心沉淀样品用适量浓度为0.1mol/L，pH8.0的碳酸氢铵缓冲液溶解，使胰岛素前体的浓度与实施例1中洗脱样品浓度一致。

(9)称取15mg胰蛋白酶加入(8)的溶液中混匀，30℃酶切1.5小时。

实验结果为发酵上清目的蛋白纯度为14.3％，含量约为3100mg；洗涤液洗涤收集样品中无目的蛋白，均为杂蛋白；洗脱液洗脱收集样品中目的蛋白纯度为92.3％，目的蛋白含量约2832mg。此时重组人胰岛素前体纯度达到92.3％，样品收率为91.4％。

由于直接转换洗脱液环境会导致酶切转化率骤降，因此通过硫酸铵沉淀离心再溶解的步骤来进行换相，重组人胰岛素前体蛋白硫酸铵沉淀离心得率为95％，再溶解后酶切转化率约85％，此时的酶切转化率高于对比实施例1，低于实施例1-3。分析原因，可能是硫酸铵沉淀会导致胰岛素前体蛋白沉淀再溶解的溶液环境仍有少量的硫酸铵成分，对胰蛋白酶的活性有影响。

根据对比实施例2的方法，纯化后重组人胰岛素前体纯度达到92.3％，纯化步骤与沉淀步骤的总收率为86.8％，酶切转化率约85％(图2)。

实施例1与对比实施例1、2的对比结果见表1。

表1对比实施例的结果对比

对比实施例3重组人胰岛素前体的纯化和酶切

上样样品为预备实施例1的发酵上清，发酵上清用去离子水稀释至原体积的10倍，称取适量乙酸溶入稀释样品至终浓度为50mmol/L。

离子层析纯化方法采用CM Sepharose FF(XK 26/200，50ml)在层析工作站上进行；平衡液为50mmol/L NaAC-HAC，洗涤液为50mmol/L NaAC-HAC+0.1mol/L NaCl，洗脱液为50mmol/L NaAC-HAC+0.5mol/L NaCl；所有溶液用盐酸或氢氧化钠调节pH至4.0，保持柱子温度为20-25℃；流速为12ml/min；检测波长为280nm。

具体步骤为：

(1)采用平衡液平衡柱子4CV；

(3)采用洗涤液洗涤4CV，收集洗涤峰；

(5)采用洗脱液进行洗脱，收集目的蛋白洗脱峰；

(6)将洗脱收集液溶解于pH为8.5，25mmol/L Tris-HCL缓冲液中，加入15mg胰蛋白酶混匀，30℃酶切1.5小时。

实验结果为发酵上清目的蛋白纯度为14.3％，含量约为3100mg；洗涤液洗涤收集样品中无目的蛋白，均为杂蛋白；洗脱液洗脱收集样品中目的蛋白纯度为92％，样品收率为90.5％。将洗脱收集液调整至合适的缓冲环境及pH值后进行酶切，酶切转化率约63％。

Claims

1.一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法，其步骤为：（1）将阳离子离子层析柱用平衡液进行平衡；（2）将分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清上平衡后的阳离子离子层析柱，依次用平衡液进行平衡、用洗涤液进行洗涤和用洗脱液进行洗脱；收集洗脱产物，得到纯化的重组人胰岛素前体；（3）将纯化的重组人胰岛素前体用胰蛋白酶进行酶切转换，得到缺少B链第30位苏氨酸的人胰岛素；其特征在于：所述洗脱液为碳酸氢铵缓冲液、硼酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的任意一种；所述洗脱液的浓度为0.05-0.3 mol/L；所述洗脱液的pH值为7.8-8.5；

步骤（1）或步骤（2）中所述的平衡液由缓冲液和无机盐组成；其中，所述缓冲液为磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或琥珀酸缓冲液中的任意一种；所述无机盐为氯化钠；所述缓冲液的浓度为0.01-0.2mol/L；所述无机盐的浓度为0.01-0.12mol/L；所述平衡液的pH值为2.0-4.5；

步骤（2）中所述洗涤为用洗涤液A进行洗涤；用洗涤液A洗涤后，再接着用洗涤液B洗涤阳离子层析柱；所述洗涤液A由缓冲液和无机盐组成；其中，所述缓冲液为磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或琥珀酸缓冲液中的任意一种；所述无机盐为氯化钠；其中，所述缓冲液的浓度为0.01-0.2mol/L，所述无机盐的浓度为0.01-0.2mol/L；其中，所述洗涤液B为1-5mmol/L盐酸；所述洗涤液A或洗涤液B的pH值为2.0-4.5。

2.按照权利要求1所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述洗脱液的pH值为8.0-8.5。

3.按照权利要求1或2所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述洗脱液的浓度为0.1-0.15 mol/L。

4.按照权利要求1所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述洗涤液A中缓冲液浓度为0.01-0.05mol/L；所述洗涤液A中无机盐浓度为0.01-0.12mol/L。

5.按照权利要求4所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述洗涤液A中缓冲液浓度为20mmol/L；所述洗涤液A中无机盐浓度为0.1 mol/L。

6.按照权利要求1所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述洗涤液B为5mmol/L盐酸。

7.按照权利要求1所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述洗涤液A或洗涤液B的pH值为3.0-4.0。

8.按照权利要求7所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述洗涤液A或洗涤液B的pH值为3.5-4.0。

9.按照权利要求1所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：步骤（1）或步骤（2）中所述的平衡液中的缓冲液浓度为0.01-0.05mol/L ；所述无机盐的浓度为0.01-0.1mol/L；

所述平衡液的pH值为3.0-4.0；

步骤（3）中胰蛋白酶的加入量为：按照质量比计，胰蛋白酶：重组人胰岛素前体=1:100-1:400；

所述酶切的温度为20-40℃；酶切的时间为0.5-3小时。

10.按照权利要求9所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述缓冲液浓度为20mmol/L；所述无机盐的浓度为0.01mol/L，所述平衡液的pH值为3.5-4.0；

步骤（3）中胰蛋白酶的加入量为：胰蛋白酶：重组人胰岛素前体= 1:200；

所述酶切的温度为25-30℃；酶切的时间为1-1.5小时。

11.按照权利要求1所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述阳离子离子层析柱的离子交换填料为S Sepharose FF、SP Sepharose FF、CM Sepharose FF，Source 15 S或Source 30 S中的任意一种；所述阳离子离子层析柱的温度为20-25℃；所述洗涤液或洗脱液的线性流速为7.5-30mm/min。

12.按照权利要求11所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述洗涤液或洗脱液的线性流速为22.6mm/min。

13.按照权利要求1所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述的分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清为编码重组人胰岛素前体的基因在真核细胞中进行分泌表达获得的发酵上清。

14.按照权利要求13所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述的分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清为编码重组人胰岛素前体的基因在毕赤酵母细胞中进行分泌表达获得的发酵上清。

15.按照权利要求1所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：将分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清进行预处理后再上平衡后的阳离子离子层析柱；其中，所述预处理包括：将发酵上清稀释，加入缓冲剂，使发酵上清与平衡液具有相同的缓冲盐浓度和pH值；其中，所述缓冲剂为磷酸、乙酸、柠檬酸或琥珀酸中的任意一种；所述缓冲盐浓度为0.01-0.2mol/L；所述pH值为2.0-4.5；所述稀释为稀释5-20倍。

16.按照权利要求15所述的纯化和酶切转换方法，其特征在于：所述缓冲盐浓度为0.01-0.05mol/L；所述pH值为3.0-4.0；所述稀释为稀释10倍；其中，用去离子水或注射用水进行稀释。