CN105792836A - 新型sez6调节剂以及应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了新型调节剂,包括抗体及其衍生物,以及使用这样的调节剂治疗增殖性病症的方法。
Description
交叉引用的申请
本申请主张2013年8月28日申请的美国临时专利申请系列号61/871,289的优先权,其通过引用整体并入本文中。
序列表
本申请含有经EFS-Web以ASCII格式提交且在此通过引用整体并入本文中的序列表。该ASCII复本(2014年8月27日建立)的名称为“用于提交的S696971130WOSEQL082714”且尺寸为462,073位字节。
技术领域
本申请总体涉及新型化合物,组合物以及它们在诊断、预防、治疗或改善增殖性病症和其任何扩展、复发、再发或转移中的使用方法。在一个广泛的方面,本发明涉及发作(seizure)相关6同系物(SEZ6)调节剂(包括抗SEZ6抗体和融合构建体)用于增殖性病症的治疗、诊断或预防的用途。本发明的选择的实施方案提供了这种SEZ6调节剂(包括抗体药物缀合物)用于免疫治疗恶性肿瘤的用途,所述免疫治疗优选包括降低肿瘤起始细胞频率。本发明的特别优选的实施方案包括与特定的表位相缔合的调节剂和所公开的调节剂用于治疗某些患者人群诸如患有甲状腺髓样癌、小细胞肺癌的患者人群以及对基于铂的标准护理剂具有耐药性的患者的用途。
背景技术
干细胞和祖细胞分化和细胞增殖是正常正在进行的过程,所述过程一致发挥作用以支持在器官发生期间的组织生长和所有活生物体寿命期间的细胞替代和大多数组织的修复。在事件的正常过程中,细胞分化和增殖是由许多因素和信号控制的,所述因素和信号通常被平衡以保持细胞命运决定和组织结构。因而,在相当大程度上,它是这样受控的微环境,当基于生物体需要适当地生成信号时,所述微环境调节细胞***和组织成熟。在这方面,通常仅在损坏或将死的细胞的更换或生长需要时,发生细胞增殖和分化。不幸的是,细胞增殖和/或分化的破坏可源自众多因素,所述因素包括,例如,各种信号传导的化学物质的不足或过多,改变的微环境的存在,基因突变或它们的一些组合。当正常的细胞增殖和/或分化受到干扰或有点破坏时,它可以导致各种疾病或病症,包括增殖性病症诸如癌症。
癌症的常规治疗包括化疗、放疗、手术、免疫疗法(例如,生物反应调节剂、疫苗或靶向治疗)或者它们的组合。不幸的是,某些癌症对这样的治疗无反应或最低限度响应于这样的治疗。例如,尽管选择的疗法具有一般效力,但是,在一些患者中,肿瘤表现出基因突变,所述基因突变使得它们不响应于选择的疗法。此外,根据癌症的类型和它采用的何种形式,一些可用的治疗,诸如手术,可能不是可行的替代方案。当试图治疗经历了以前的治疗且随后已经复发的患者时,护理疗法的目前标准固有的局限性表现得尤为明显。在这种情况下,失败的治疗方案和所产生的患者恶化可能归因于难治性肿瘤,所述难治性肿瘤往往表现为最终被证明是不可治愈的相对有侵袭性的疾病。虽然在癌症诊断和治疗多年来已经有很大的改进,但是,由于现有疗法不能防止复发、肿瘤复发和转移,许多实体瘤的总体生存率已经大致保持不变。因此,开发用于增殖性病症的更有靶向性且有效的疗法仍然是一个挑战。
发明内容
提供这些及其他目标,通过这些及其他目标,本发明在广义上涉及方法、化合物、组合物及制品,所述方法、化合物、组合物及制品可用于治疗SEZ6相关病症(例如增殖性病症或赘生性病症)。为此,本发明提供新型发作(seizure)相关6同系物(或SEZ6)调节剂,其有效靶向肿瘤细胞及/或癌症干细胞且可用于治疗罹患广泛多种恶性肿瘤的患者。如本文中将更详细论述,存在至少两种天然存在的SEZ6同工型或变体且所公开的调节剂可包含一种同工型或另一种同工型或其两者或与其选择性缔合。此外,在某些实施方案中,所公开的SEZ6调节剂可进一步与一种或多种SEZ家族成员(例如SEZ6L或SEZ6L2)反应,或在其他实施方案中,可经产生及选择以独占地与SEZ6同工型缔合或反应。在优选的实施方案中,本发明更具体地涉及分离的SEZ6调节剂,所述调节剂包含抗体(即,与SEZ6的至少一种同工型免疫优先结合,反应或缔合的抗体),在特别优选的实施方案中,所述抗体与一个或多种细胞毒性剂或治疗结构部分(例如,阿里他汀类,鹅膏蕈碱类和吡咯并苯并二氮杂类)相缔合或缀合。此外,如下广泛讨论的,这样的调节剂可用于提供可用于预防、诊断或治疗增殖性病症的药物组合物。
在本发明的选择的实施方案中,SEZ6调节剂可包含SEZ6多肽或其片段,所述SEZ6多肽或其片段采用分离的形式,或与其他结构部分(例如,与靶向部分相缔合的Fc-SEZ6、PEG-SEZ6或SEZ6)融合或缔合。在其他选择的实施方案中,SEZ6调节剂可包含SEZ6拮抗剂,为了本申请的目的,所述SEZ6拮抗剂应保持意指任何构建体或化合物,所述任何构建体或化合物识别SEZ6,与SEZ6竞争,与SEZ6相互作用,结合SEZ6或与SEZ6相缔合,并且中和,消除,减少,敏化,改编,抑制或控制赘生性细胞(包括肿瘤起始细胞)的生长。在优选的实施方案中,本发明的SEZ6调节剂包含抗SEZ6抗体,或其片段或衍生物,已出人意料地发现,所述抗SEZ6抗体或其片段或衍生物沉默、中和、减少、降低、消耗、缓解、减弱、改编、消除、或以其他方式抑制肿瘤起始细胞繁殖、保持、扩展、增殖或以其他方式促进肿瘤性细胞的存活、复发、再生和/或转移的能力。在特别优选的实施方案中,抗体或免疫反应性片段可以与一种或多种抗癌剂(例如,细胞毒性剂)相缔合或缀合。
关于这种调节剂,应了解,相容抗体可具有多种形式中的任一种,包括例如多无性繁殖系及单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体及人类抗体以及前述各者中的每一者的免疫反应性片段及/或变体。优选实施方案将包含相对非免疫原性抗体,诸如人源化或完全人类构建体。当然,鉴于本公开,本领域技术人员可容易地鉴别与SEZ6抗体调节剂的重链及轻链可变区相关联的一个或多个互补决定区(CDR)及在无过度实验的情况下使用那些CDR工程改造或制造嵌合、人源化或CDR移植抗体。因此,在某些优选实施方案中,所述SEZ6调节剂包含抗体,所述抗体并入一个或多个CDR,所述CDR衍生自本文所述的轻链(图10A)或重链(图10B)连续链鼠可变区(SEQIDNO:20-169)。所述具有人框架的CDR移植的可变区和其变体也示于图10,其包括SEQIDNO:170-199。在优选实施方案中,这种抗体将包含单克隆抗体,且在甚至更优选实施方案中,将包含嵌合、CDR移植或人源化抗体。
编码如图10A和10B中所述的各个氨基酸序列的示例性核酸序列被阐述于所附序列表中,并且包括SEQIDNO:220到399。在这方面,可以理解的是,本发明还包括编码所公开的抗体可变区氨基酸序列(包括序列表中列出的那些)的核酸分子(和相关构建体、载体和宿主细胞)。
更具体而言,在所选实施方案中,相容SEZ6调节剂可包含具有轻链可变区及重链可变区的抗体,其中所述轻链可变区与选自由在以下中所述氨基酸序列组成的组的氨基酸序列具有至少60%同一性的氨基酸序列:SEQIDNO:20,SEQIDNO:22,SEQIDNO:24,SEQIDNO:26,SEQIDNO:28,SEQIDNO:30,SEQIDNO:32,SEQIDNO:34,SEQIDNO:36,SEQIDNO:38,SEQIDNO:40,SEQIDNO:42,SEQIDNO:44,SEQIDNO:46,SEQIDNO:48,SEQIDNO:50,SEQIDNO:52,SEQIDNO:54,SEQIDNO:56,SEQIDNO:58,SEQIDNO:60,SEQIDNO:62,SEQIDNO:64,SEQIDNO:66,SEQIDNO:68,SEQIDNO:70,SEQIDNO:72,SEQIDNO:74,SEQIDNO:76,SEQIDNO:78SEQIDNO:80,SEQIDNO:82,SEQIDNO:84,SEQIDNO:86,SEQIDNO:88,SEQIDNO:90,SEQIDNO:92,SEQIDNO:94,SEQIDNO:96,SEQIDNO:98,SEQIDNO:100,SEQIDNO:102,SEQIDNO:104,SEQIDNO:106,SEQIDNO:108,SEQIDNO:110,SEQIDNO:112,SEQIDNO:114,SEQIDNO:116,SEQIDNO:118,SEQIDNO:120,SEQIDNO:122,SEQIDNO:124,SEQIDNO:126,SEQIDNO:128,SEQIDNO:130,SEQIDNO:132,SEQIDNO:134,SEQIDNO:136,SEQIDNO:138,SEQIDNO:140,SEQIDNO:142,SEQIDNO:144,SEQIDNO:146,SEQIDNO:148,SEQIDNO:150,SEQIDNO:152,SEQIDNO:154,SEQIDNO:156,SEQIDNO:158,SEQIDNO:160,SEQIDNO:162,SEQIDNO:164,SEQIDNO:166和SEQIDNO:168,且其中所述重链可变区与选自由在以下中所述氨基酸序列组成的组的氨基酸序列具有至少60%同一性的氨基酸序列:SEQIDNO:21,SEQIDNO:23,SEQIDNO:25,SEQIDNO:27,SEQIDNO:29,SEQIDNO:31,SEQIDNO:33,SEQIDNO:35,SEQIDNO:37,SEQIDNO:39,SEQIDNO:41,SEQIDNO:43,SEQIDNO:45,SEQIDNO:47,SEQIDNO:49,SEQIDNO:51,SEQIDNO:53,SEQIDNO:55,SEQIDNO:57,SEQIDNO:59,SEQIDNO:61,SEQIDNO:63,SEQIDNO:65,SEQIDNO:67,SEQIDNO:69,SEQIDNO:71,SEQIDNO:73,SEQIDNO:75,SEQIDNO:77,SEQIDNO:79,SEQIDNO:81,SEQIDNO:83,SEQIDNO:85,SEQIDNO:87,SEQIDNO:89,SEQIDNO:91,SEQIDNO:93,SEQIDNO:95,SEQIDNO:97,SEQIDNO:99,SEQIDNO:101,SEQIDNO:103,SEQIDNO:105,SEQIDNO:107,SEQIDNO:109,SEQIDNO:111,SEQIDNO:113,SEQIDNO:115,SEQIDNO:117,SEQIDNO:119,SEQIDNO:121,SEQIDNO:123,SEQIDNO:125,SEQIDNO:127,SEQIDNO:129,SEQIDNO:131,SEQIDNO:133,SEQIDNO:135,SEQIDNO:137,SEQIDNO:139,SEQIDNO:141,SEQIDNO:143,SEQIDNO:145,SEQIDNO:147,SEQIDNO:149,SEQIDNO:151,SEQIDNO:153,SEQIDNO:155,SEQIDNO:157,SEQIDNO:159,SEQIDNO:161,SEQIDNO:163,SEQIDNO:165,SEQIDNO:167和SEQIDNO:169。在其他优选实施方案中,所选调节剂将包含重链及轻链可变区,所述重链及轻链可变区包含与上述鼠序列65%、70%、75%或80%的同一性。在还有其他实施方案中,所选调节剂将包含与所公开的鼠序列的85%、90%或甚至95%的同一性的重链及轻链可变区。
当然,鉴于本公开内容,本领域技术人员可以很容易地识别与上述各重链和轻链可变区各自相缔合的CDR,和使用那些CDR来工程改造或制造嵌合的、人源化或CDR移植抗体,无需过多的实验。在这方面,一些网站数据库是可用的,在输入主题重链或轻链可变区核酸或氨基酸序列后,所述网站数据库自动指定CDR和框架区(根据任何常用的编号***)。这样,在选定的实施方案中,本发明涉及包含从图10A或图10B阐述的可变区序列衍生一个或多个CDR的抗SEZ6抗体。在优选的实施方案中,这样的抗体将包括单克隆抗体和,在甚至更优选的实施方案中,将包括嵌合的、CDR移植的或人源化的抗体。如在下面更详细地讨论的,还有其他实施方案将包含缀合至一种或多种细胞毒性剂或与一种或多种细胞毒性剂相缔合的抗体。
本发明的另一个方面包括从以下获得或衍生的调节剂:SC17.1,SC17.2,SC17.3,SC17.4,SC17.8,SC17.9,SC17.10,SC17.11,SC17.14,SC17.15,SC17.16,SC17.17,SC17.18,SC17.19,SC17.22,SC17.24,SC17.27,SC17.28,SC17.29,SC17.30,SC17.32,SC17.34,SC17.35,SC17.36,SC17.38,SC17.39,SC17.40,SC17.41,SC17.42,SC17.45,SC17.46,SC17.47,SC17.49,SC17.50,SC17.53,SC17.54,SC17.56,SC17.57,SC17.59,SC17.61,SC17.63,SC17.71,SC17.72,SC17.74,SC17.76,SC17.77,SC17.79,SC17.81,SC17.82,SC17.84,SC17.85,SC17.87,SC17.89,SC17.90,SC17.91,SC17.93,SC17.95,SC17.97,SC17.99,SC17.102,SC17.114,SC17.115,SC17.120,SC17121,SC17.122,SC17.140,SC17.151,SC17.156,SC17.161,SC17.166,SC17.187,SC17.191,SC17.193,SC17.199和SC17.200。
在还有其他相容的实施方案中,本发明将包括CDR移植的或人源化的SEZ6调节剂hSC17.16,hSC17.17,hSC17.24,hSC17.28,SC17.34,hSC17.46,SC17.151,SC17.155,SC17.156,SC17.161和SC17.200。还有其他实施方案涉及包含人源化抗体的SEZ6调节剂,其中所述人源化抗体包含轻链可变区和重链可变区,其中所述轻链可变区包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与选自在以下阐述的氨基酸序列的氨基酸序列具有至少60%同一性:SEQIDNO:170,SEQIDNO:172,SEQIDNO:174,SEQIDNO:176,SEQIDNO:178,SEQIDNO:180,SEQIDNO:182,SEQIDNO:184,SEQIDNO:186,SEQIDNO:188和SEQIDNO:190,并且其中所述重链可变区包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与选自在以下阐述的氨基酸序列的氨基酸序列具有至少60%同一性:SEQIDNO:171,SEQIDNO:173,SEQIDNO:175,SEQIDNO:177,SEQIDNO:179和SEQIDNO:181,SEQIDNO:183,SEQIDNO:185,SEQIDNO:187,SEQIDNO:189和SEQIDNO:191。另外,根据本文教导提供,轻链(SEQIDNO:192)和重链(SEQIDNO:193,SEQIDNO:194,SEQIDNO:195,SEQIDNO:196,SEQIDNO:197,SEQIDNO:198和SEQIDNO:199)可变区的某些人源化变体。此外,如上文刚刚描述,编码例举的人源化重链和轻链可变区的核酸序列作为SEQIDNO:370-399被阐述于所附序列表中。
除了上述方面,本发明的其他优选实施方案将包括与一种或多种药物或治疗性结构部分(例如阿里他汀类、鹅膏蕈碱类和吡咯并苯并二氮杂类)缔合或缀合的SEZ6调节剂,以提供调节剂缀合物,所述调节剂缀合物(单独或与其他药物活性剂组合)可特别有效地用于治疗增殖性病症。更一般的是,一旦本发明的调节剂已经被制造和选定,它们可以连接于、融合于、缀合于(例如,共价或非共价地)或以其他方式缔合于药物活性或诊断结构部分或生物相容的改性剂。如本文中所用,术语“缀合物”或“调节剂缀合物”或“抗体缀合物”将被广义地使用,并且在不考虑缔合方法的情况下,保持为意指,与所公开的调节剂相缔合的任何生物活性或可检测的分子或药物。在这方面,可以理解的是,这样的缀合物可以包括(除了所公开的调节剂)肽,多肽,蛋白质,在体内被代谢为活性剂的前体药物,聚合物,核酸分子,小分子,结合剂,模拟剂(mimeticagent),合成药物,无机分子,有机分子和放射性同位素。此外,如上面所描述,所选择的药物或治疗部分可以共价或非共价缔合于,或连接于调节剂,并且显示多种化学计量摩尔比,这取决于,至少部分地取决于用于实现缀合的方法。
本发明的特别优选的方面将包括可用于增殖性病症的诊断和/或治疗的抗体调节剂缀合物或抗体-药物缀合物。这样的缀合物可以由通式M-[L-D]n表示,其中M代表公开的调节剂或目标结合结构部分,L是任选的连接体或连接体单元,D是相容的药物或前体药物和n为约1至约20的整数。应当理解的是,除非上下文另有规定,否则术语“抗体-药物缀合物”或“ADC”或式M-[L-D]n应始终包括含有治疗和诊断结构部分的缀合物。在这样的实施方案中,抗体-药物缀合物化合物通常包括抗SEZ6作为调节剂单元(M),治疗或诊断结构部分(D),以及任选的连接体(L),所述连接体连接药物和抗原结合剂。调节剂可直接或间接缀合到治疗或诊断结构部分。通过连接体连接到所述治疗剂或诊断结构部分的调节剂被称为被“间接缀合的”,而在不存在连接体的情况下连接到所述治疗或诊断结构部分的抗体被称为被“直接缀合”。在优选的实施方案中,所述抗体是包含至少一个CDR的SEZ6mAb,所述CDR来自如上所述的重链和轻链可变区。
如前面所指出,本发明的一个方面可以包括SEZ6多肽与癌症干细胞的意想不到的缔合。因此,在某些其他实施方案中,本发明将包含SEZ6调节剂,其在施用于个体时降低肿瘤起始细胞的频率。优选使用体外或体内有限稀释分析测定频率的降低。在尤其优选实施方案中,该分析可使用体内有限稀释分析进行,其包含将活的人类肿瘤细胞移植至无免疫应答的小鼠中。或者,有限稀释分析可使用体外有限稀释分析进行,其包括将活的人类肿瘤细胞有限稀释沉积至体外集落支持条件(supportingconditions)。在任一种情况下,频率降低的分析、计算或定量将优选包含使用泊松分布统计(Poissondistributionstatistics)以提供精确计算。应了解,尽管这种定量方法为优选,但其他劳动密集度较低的方法(诸如流动式细胞测量术或免疫组织化学)亦可用于提供所需值且因此明确地涵盖于本发明的范围内。在这种情况下,频率的降低可使用已知针对肿瘤起始细胞富集的肿瘤细胞表面标记的流动式细胞测量分析或免疫组织化学检测来测定。
因此,本发明的另一优选实施方案包括治疗SEZ6相关病症的方法,所述方法包括将治疗有效量的SEZ6调节剂施用于有需要的个体,由此降低肿瘤起始细胞的频率。优选的是,SEZ6相关病症包括肿瘤性病症。此外,优选地使用体外或体内有限稀释分析,确定在肿瘤起始细胞频率的降低。
在此方面,应了解,本发明是至少部分基于以下发现:SEZ6免疫原与肿瘤永存细胞(即癌症干细胞)在相关联,所述肿瘤永存细胞与各种赘瘤形成的病源学有关。更具体而言,本申请出人意料地显示,施用各种示例性SEZ6调节剂可介导、降低、消耗、抑制或消除由肿瘤起始细胞引起的致瘤信号传导(即降低肿瘤起始细胞的频率)。此降低的信号传导(无论通过肿瘤起始细胞的消耗、中和、减少、消除、重新程序化或沉默或通过改良肿瘤细胞形态(例如诱导的分化、干细胞微环境破坏(nichedisruption))又可通过抑制肿瘤形成、肿瘤保持、扩增及/或转移及复发而更有效地治疗SEZ6相关病症。
除与癌症干细胞的上述关联外,有证据表明SEZ6同工型可能与包含神经内分泌特征的肿瘤的生长、复发或转移潜力有关。为了本发明的目的,这种肿瘤将包含神经内分泌肿瘤(例如小细胞肺癌和髓样甲状腺瘤)及伪神经内分泌肿瘤。由此,使用本文中所描述的新型SEZ6调节剂介入这种致瘤细胞的增殖可通过一种以上机制(即肿瘤起始细胞降低及破坏致癌途径信号传导)改善或治疗病症,从而提供累加或协同效应。还有其他优选实施方案可利用细胞表面SEZ6的细胞内化作用来递送调节剂介导的抗癌剂。在此方面,应了解,本发明不受任何特定作用机制限制,而是涵盖所公开的调节剂治疗SEZ6相关病症(包括各种赘瘤形成)的广泛用途。
因此,在其他实施方案中,本发明将包括所公开的调节剂在有需要的个体中治疗包括神经内分泌特征的肿瘤(例如小细胞肺癌和髓样甲状腺瘤)的用途。当然,可以将相同调节剂用于这些相同肿瘤的预防,预后,诊断,治疗诊断,抑制或维持治疗。
已进一步发现,所公开的调节剂可有效治疗患有小细胞肺癌或甲状腺髓样癌的患者。此外,如在下面更详细讨论和在实施例中阐述,本发明的抗SEZ6抗体和抗体药物缀合物可特别有效用于治疗某些患者人群如那些患有某些形式的小细胞肺癌的患者,所述某些形式的小细胞肺癌对基于铂的护理药物(例如,卡铂,顺铂或奥沙利铂)的标准具有耐药性。因此,在选定的实施方案中,本发明包括治疗患有对铂具有耐药性的小细胞肺癌的患者的方法,包括施用SEZ6调节剂的步骤。
本发明的其他方面利用所公开的调节剂潜在破坏致癌途径而同时沉默肿瘤起始细胞的能力。这样的多活性SEZ6调节剂(例如,SEZ6拮抗剂)当与护理抗癌剂或减积剂的标准组合使用时可以被证明是特别有效的。因此,本发明的优选实施方案包括使用所公开的调节剂作为抗转移剂,以用于初始治疗后的维持治疗。此外,可按照本发明的教导组合使用两种或更多种SEZ6拮抗剂(例如特异性结合于SEZ6两个离散的表位的抗体)。此外,如在下面详细讨论,可以以缀合或非缀合的状态,以及任选地作为与多种化学或生物抗癌剂组合的敏化剂,使用本发明的SEZ6调节剂。
因此,本发明的另一优选实施方案包括,针对采用抗癌剂的治疗敏化个体中的肿瘤的方法,所述方法包括将SEZ6调节剂施用至个体的步骤。其他实施方案包括,治疗后减少转移或肿瘤复发的方法,所述方法包括将SEZ6调节剂施用至有需要的个体。在本发明的特别优选的方面,SEZ6调节剂将具体导致肿瘤起始细胞频率的减少,如使用体外或体内有限稀释分析所确定。
本发明的更普遍优选的实施方案包括,在有需要的个体中治疗SEZ6相关病症的方法,所述方法包括将SEZ6调节剂施用至个体的步骤。在特别优选的实施方案中,SEZ6调节剂将与抗癌剂相缔合(例如,缀合)。在又其他实施方案中,SEZ6调节剂与SEZ6缔合或结合后将在细胞的表面上或附近进行内化。另外,无论与正常邻近组织相比主题肿瘤组织是否显示升高的SEZ6水平或降低的或抑制的SEZ6的水平,本发明的有利方面(包括信号传导途径的任何干扰和附带的好处)均可实现。特别优选的实施方案将包括,治疗在致瘤性细胞上显示比正常组织或非致瘤性细胞更高水平的SEZ6的病症。
在又另一个方面,本发明将包括,治疗患有肿瘤性病症的个体的方法,所述方法包括施用治疗有效量的至少一种内化SEZ6调节剂的步骤。优选的实施方案将包括,施用内化抗体调节剂,其中,在其他选择的实施方案中,内化抗体调节剂缀合至或缔合至细胞毒性剂。
其他实施方案涉及治疗患有SEZ6相关病症的个体的方法,所述方法包括施用治疗有效量的至少一种消耗SEZ6调节剂的步骤。
在另一个实施方案中,本发明提供维持治疗方法,其中在设计以除去至少肿瘤块的一部分的初始过程(例如,化疗,放射或手术)后一段时间内施用所公开的效应物或调节剂。可在数周期间,数月期间或甚至数年期间施用这样的治疗方案,其中SEZ6调节剂可预防性地发挥作用,以抑制转移和/或肿瘤复发。在其他实施方案中,所公开的调节剂可通过与已知减积方案组合一致施用,以防止或延缓转移、肿瘤维持或复发。
还应该理解的是,本发明的SEZ6调节剂可以被生成并选择,以与SEZ6的一种或多种已知同工型或所述蛋白质的单一同工型反应,或相反的是,本发明的SEZ6调节剂可以包括泛SEZ6调节剂,所述泛SEZ6调节剂与除了SEZ6之外的至少一个额外的SEZ6家族成员(例如,SEZ6L或SEZ6L2和其同工型)起反应,或与除了SEZ6之外的至少一个额外的SEZ6家族成员(例如,SEZ6L或SEZ6L2和其同工型)相缔合。更具体地,如本文所公开,优选的调节剂(如抗体)可被生成并选择,以使它们与仅由SEZ6表现出的结构域(或在其中的表位),或与在两个或更多的SEZ6家族成员之间至少有些保守的结构域反应。
在还有其他优选实施方案中,所述调节剂将与SEZ6的特定表位、部分、基序或结构域缔合或结合。如下文将详细论述,两种SEZ6同工型并入相同的细胞外区域(参见图1E),该细胞外区域包含至少一个N端结构域、两个交替Sushi和CUB结构域,和三个额外的串联Sushi域重复。此外SEZ6蛋白包含跨膜结构域和胞质结构域。因此,在某些实施方案中,所述调节剂将与SEZ6的N端结构域(即成熟蛋白质中的氨基酸1-335)或与其中的表位结合或缔合。本发明的其他方面包含与位于SEZ6的特定Sushi结构域中的特定表位缔合或缀合的调节剂。在此方面,特定调节剂可缔合或结合到位于Sushi结构域1(氨基酸336-395),Sushi结构域2(氨基酸511-572),Sushi结构域3(氨基酸690-748),Sushi结构域4(氨基酸750-813)或Sushi结构域5(氨基酸817-878)的表位。本发明的其他方面包括,缔合或结合到位于SEZ6的特定CUB样结构域的特定表位的调节剂。在这方面,特定调节剂可缔合或结合到位于CUB结构域1(氨基酸397-508)或CUB结构域2(氨基酸574-685)的表位。在进一步的实施方案中,本发明的抗体可结合于SEZ6上的某些表位。
在一个实施方案中,本发明提供了特异性结合于SEZ6蛋白上的表位的分离的抗体,其中所述表位包含氨基酸残基,所述氨基酸残基选自(ⅰ)残基R762,L764,Q777,I779,D781和Q782;(ii)残基R342和K389和(iii)残基T352,S353和H375。
在另一个实施方案中,本发明提供抗体药物缀合物,所述抗体药物缀合物包含直接或间接缀合至治疗性结构部分的抗体,其中该抗体特异性结合至SEZ6蛋白上的表位,其中所述表位包含选自以下的氨基酸残基:(i)残基R762,L764,Q777,I779,D781和Q782;(ii)残基R342和K389和(iii)残基T352,S353和H375。
当然,应了解,上述结构域中的每一者可包含一个以上表位,并且可以与一个以上的仓室(bin)相缔合。关于调节剂或抗体“仓室”,应了解,可使用本领域中公认的技术经由竞争性抗体结合来分析或定位SEZ6抗原,以便界定位于蛋白质上或沿蛋白质定位的特定仓室。尽管本文中更详细地论述且在以下实施例9和10中展示,但若两个抗体(其中一个可称为“参考抗体”、“仓室定界抗体”或“定界抗体”)彼此基本上竞争结合目标抗原,则可认为其位于同一个仓室中。在这种情况下,主题抗体表位可相同、实质上相同或足够靠近(线性含义(当其由少数氨基酸分隔时)或构形性),使得两种抗体被以位阻或静电方式抑制或妨碍与抗原结合。这种界定的仓室可总体上与某些SEZ6结构域相关联(例如参考抗体将与特定结构域中所含表位结合),但相关性并不总是精确(例如结构域中可能存在一个以上仓室或仓室可以构象方式界定且包含一个以上结构域)。应了解,本领域技术人员可容易地确定SEZ6结构域之间的关系且凭经验确定仓室。
关于本发明,使用本领域中公认的技术(例如ELISA、表面等离振子共振或生物层干涉术)的竞争性结合分析界定至少七个相异的仓室,发现其中每个仓室均含有很多抗体调节剂。为了本发明的目的,将七个仓室称为仓室A-F和仓室U。仓室A-F是独特的仓室,并且包含在这些仓室中的每个中的抗体相互竞争结合SEZ6蛋白。仓室U包括,不与仓室A-F中的抗体竞争、但是可以彼此竞争结合的抗体。因此,在所选实施方案中,本发明将包含驻留于选自以下的仓室中的调节剂:仓室A、仓室B、仓室C、仓室D、仓室E、仓室F和仓室U。在其他实施方案中,本发明的缀合物包含驻留于由选自以下的参考抗体界定的仓室中的调节剂:SC17.1,SC17.2,SC17.3,SC17.4,SC17.8,SC17.9,SC17.10,SC17.11,SC17.14,SC17.15,SC17.16,SC17.17,SC17.18,SC17.19,SC17.22,SC17.24,SC17.27,SC17.28,SC17.29,SC17.30,SC17.32,SC17.34,SC17.35,SC17.36,SC17.38,SC17.39,SC17.40,SC17.41,SC17.42,SC17.45,SC17.46,SC17.47,SC17.49,SC17.50,SC17.53,SC17.54,SC17.56,SC17.57,SC17.59,SC17.61,SC17.63,SC17.71,SC17.72,SC17.74,SC17.76,SC17.77,SC17.79,SC17.81,SC17.82,SC17.84,SC17.85,SC17.87,SC17.89,SC17.90,SC17.91,SC17.93,SC17.95,SC17.97,SC17.99,SC17.102,SC17.114,SC17.115,SC17.120,SC17121,SC17.122,SC17.140,SC17.151,SC17.156,SC17.161,SC17.166,SC17.187,SC17.191,SC17.193,SC17.199及SC17.200。在还有其他实施方案中,本发明将包含来自仓室A的调节剂、来自仓室B的调节剂、来自仓室C的调节剂、来自仓室D的调节剂、来自仓室E的调节剂、来自仓室F的调节剂、或来自仓室U的调节剂。还有其他优选实施方案将包含参考抗体调节剂及任何与参考抗体竞争的调节剂。
当在所公开的调节剂的上下文中使用时,术语“竞争”或“竞争抗体”意指抗体之间的结合竞争,如由其中参考抗体或免疫功能性片段实质上阻止或抑制(例如大于40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%)测试抗体与共同抗原的特异性结合的分析法所确定。用于确定这样的竞争的相容方法包含本领域中已知的技术,诸如例如生物层干涉术、表面等离子共振、流动式细胞测量术、竞争性ELISA等。
在一个选择的实施方案中,本发明包括泛SEZ6调节剂,所述泛SEZ6调节剂与SEZ6和至少一种其他SEZ6家族成员(例如,SEZ6L或SEZ6L2)相缔合。在其他选择的实施方案中,本发明包括SEZ6调节剂,所述SEZ6调节剂免疫特异性地与SEZ6的一种或多种同工型相缔合,但不免疫特异性地与任何其他SEZ6家族成员相缔合。在还有其他实施方案中,本发明包括治疗有需要的个体的方法,所述方法包括施用治疗有效量的泛SEZ6调节剂。还有其他实施方案包括治疗有需要的个体的方法,所述方法包括施用治疗有效量的SEZ6调节剂,所述SEZ6调节剂免疫特异性地与SEZ6的一种或多种同工型相缔合,但是并不免疫特异性地与任何其他SEZ6家族成员相缔合。
在一个实施方案中,本发明涉及治疗患有癌症的个体的方法,所述方法包括施用治疗有效量的抗体药物缀合物,所述抗体药物缀合物包含直接或间接缀合至治疗性结构部分的抗体,其中所述抗体特异性结合SEZ6蛋白上的表位,其中所述表位包含选自以下的氨基酸残基:(ⅰ)残基R762,L764,Q777,I779,D781和Q782;(ii)残基R342和K389和(iii)残基T352,S353和H375。在优选的实施方案中,治疗性结构部分将包括阿里他汀类、鹅膏蕈碱类和吡咯并苯并二氮杂类。在一些情况下,可能先前已经采用基于铂的药剂治疗患有癌症的个体。
在另一个实施方案中,本发明涉及治疗患有甲状腺髓样癌的个体的方法,所述方法包括施用治疗有效量的抗体药物缀合物,所述抗体药物缀合物包含直接或间接缀合至治疗性结构部分的抗体。在一个实施方案中,用于治疗患有甲状腺髓样癌的个体的抗体药物缀合物可以包含特异性结合至SEZ6蛋白上的表位的抗体,其中所述表位包含选自以下的氨基酸残基:(i)残基R762,L764,Q777,I779,D781和Q782;(ii)残基R342和K389和(iii)残基T352,S353和H375。在一个优选的实施方案中,所述治疗性结构部分可以包含阿里他汀类、鹅膏蕈碱类和吡咯并苯并二氮杂类。
在进一步的实施方案,本发明涉及治疗患有对铂具有耐药性的小细胞肺癌的个体的方法,所述方法包括施用治疗有效量的抗体药物缀合物,所述抗体药物缀合物包含直接或间接缀合至治疗性结构部分的抗体,其中所述抗体特异性结合至SEZ6蛋白上的表位,其中所述表位包含选自以下的氨基酸残基:(ⅰ)残基R762,L764,Q777,I779,D781和Q782;(ii)残基R342和K389和(iii)残基T352,S353和H375。在优选的实施方案中,先前已经采用基于铂的药剂治疗患有对铂具有耐药性的小细胞肺癌的患者。在另一个优选的实施方案中,所述治疗性结构部分将包括阿里他汀类、鹅膏蕈碱类和吡咯并苯并二氮杂类。
除了上面讨论的治疗用途之外,也将理解的是,本发明的调节剂可用于检测、诊断或分类SEZ6相关病症,特别是增殖性病症。在一些实施方案中,所述调节剂可以施用于个体和在体内被检测到或监测到。本领域的技术人员将理解,可以如下面公开,用标记物或或报道分子对这样的调节剂进行标记,或者使标记物或或报道分子和这样的调节剂相缔合,并且使用多种标准技术(例如,MRI,CAT扫描PET扫描,等)中的任何一种检测这样的调节剂。
因此,在一些实施方案中,本发明将包括体内诊断、检测或监测有需要的个体中的SEZ6相关病症的方法,所述方法包括施用SEZ6调节剂的步骤。
在其他情况下,可在使用本领域公认的方法的体外诊断情况下使用所述调节剂。因此,优选的实施方案包括诊断个体癌症(例如,甲状腺髓样癌或对铂具有耐药性的小细胞肺癌)的方法,所述方法包括以下步骤:(a)提供来自个体的肿瘤样品;(b)将肿瘤样品暴露于采用报道分子标记的抗SEZ6抗体,其中所述抗SEZ6抗体与肿瘤样品(例如甲状腺髓样肿瘤样品,小细胞肺癌肿瘤样品或对铂具有耐药性的小细胞肺癌肿瘤样品)相缔合;和(c)检测与肿瘤样品相缔合的报道分子。在一些实施方案中,提供肿瘤样品的步骤可以与将肿瘤样品暴露于抗SEZ6抗体的步骤或检测与肿瘤样品相缔合的报道分子的步骤分开进行。在一些情况下,在体外例如,使用免疫组织化学来检测与肿瘤样品相缔合的报道分子。在一些情况下,将肿瘤样品暴露于结合SEZ6蛋白上的表位的抗SEZ6抗体,其中所述表位包含氨基酸残基R762,L764,Q777,I779,D781和Q782。
结合本申请可以容易地识别这样的方法,并且使用一般市售的技术如自动板读取器,专用报道分子***等,可容易地进行这样的方法。在所选择的实施方案中,SEZ6调节剂将与存在于样品中的肿瘤永存细胞相缔合。在其他优选的实施方案中,检测或定量步骤将包括肿瘤起始细胞频率的降低及其检测。此外,可以如先前提到的进行有限稀释分析,并且优选采用泊松(poission)分布统计,以为频率的降低提供准确的说明。
与此类似,本发明还提供了可用于诊断和监测SEZ6相关病症如癌症的试剂盒或装置和相关的方法。为了这个目的,本发明优选提供可用于诊断或治疗SEZ6相关病症的制品,所述制品包括含有SEZ6调节剂的容器,和用于使用所述SEZ6调节剂以治疗或诊断SEZ6相关病症的说明材料。在选定的实施方案中,所述装置和相关方法将包括接触至少一种循环肿瘤细胞的步骤。
本发明的其他优选实施方案也利用所公开的调节剂的性质将其作为通过方法(如流式细胞术分析、包括荧光激活细胞分选(FACS)或激光介导的切片)用于鉴定,表征,分离,切分或富集肿瘤起始细胞群体或亚群的手段。
因此,本发明的另一个优选的实施方案涉及鉴定、分离、切分或富集肿瘤起始细胞群体的方法,所述方法包括使所述肿瘤起始细胞与SEZ6调节剂相接触的步骤。
以上为概述且因此必然含有简化、一般化及细节的缺省;因此,本领域技术人员应了解,概述仅为说明性且不意欲造成任何限制。本文中所描述的方法、组合物及/或装置及/或其他主题的其他方面、特征及优点将自本文中阐述的教导变得显而易见。提供概述以按简化形式引入概念的选择,这种概念进一步描述于以下实施方案中。此概述不意欲鉴别所主张主题的关键特征或基本特征,亦不意欲用作确定所主张主题的范围的辅助物。
附图简述
图1A-1E是包括涉及本文描述的SEZ6调节剂的核酸或氨基酸序列的SEZ6的各种表示。图1A和1B(SEQIDNO:1和2)描述全长mRNA序列,其含有分别编码SEZ6变体1和2的开放阅读框架(ORFs)(加下划线)。图1C和1D(SEQIDNO:3和4)提供分别在图1A和1B中表示的ORF的相应的氨基酸序列,其具有表示加下划线的每个蛋白同工型预测的跨膜结构域的氨基酸残基,和表示粗体和加下划线的信号肽的氨基酸残基(残基1-19);图1E描绘两个蛋白同工型(SEQIDNO:3和4)的比对,以说明在每个同工型的胞质末端的序列差异,其中加下划线的残基表示两个序列之间的差异;且图1F提供了SEZ6蛋白的胞外区的示意图,其示出多种结构域的位置。
图2A-2C提供了,SEZ6最接近的人类同工型和恒河猴、食蟹猴、小鼠或大鼠SEZ6蛋白之间的蛋白水平同一性百分比的表格表示(图2A);SEZ6家族基因的每个报告的同工型的多种cDNA或蛋白质序列检索号的表格列表(图2B);和在人类SEZ6、SEZ6L和SEZ6L2蛋白的最长同工型之间的蛋白水平的百分比同一性(图2C)。
图3A-3C提供核酸或氨基酸序列的各种表示,所述核酸或氨基酸序列涉及生产用于产生或表征本文所述的SEZ6调节剂的免疫原或细胞系。对于人类SEZ6,从商业cDNA克隆(BC146292;SEQIDNO:7)构建编码完整成熟的人SEZ6蛋白(图3B;SEQIDNO:6)的特定cDNA克隆(图3A;SEQIDNO:5),其中采用对SEZ6蛋白而言来自数据库参考序列NP_849191(SEQIDNO:3)的已知差异(图3C)。
图4A和4B提供用于在CHO-S细胞中表达Fc-SEZ6构建体和产生蛋白免疫原(图4B;SEQIDNO:9)的cDNA(图4A;SEQIDNO:8),所述蛋白免疫原包含融合到人类IgG2Fc结构域的人类SEZ6的ECD,其中加下划线的序列对应于人类IgG2Fc结构域,加双下划线的序列对应于IgK信号肽,并且粗体的氨基酸对应于用于克隆hSEZ6片段的限制性位点提供的残基。
图5A-5J提供核酸或氨基酸序列的各种表示,所述核酸或氨基酸序列涉及生产用于产生或表征本文所述的SEZ6调节剂的免疫原或细胞系,其中加下划线序列表示被示出的特定SEZ6或SEZ6家庭成员蛋白质的ECD,并且附图包括用于编码成熟鼠SEZ6(图5A,SEQIDNO:10),成熟大鼠SEZ6(图5C,SEQIDNO:12),成熟食蟹猴SEZ6(图5E所示,SEQIDNO:14),人SEZ6L蛋白的成熟ECD(图5G,SEQIDNO:16),或人SEZ6L2蛋白的成熟ECD(图5I,SEQIDNO:18)的构建体的cDNA序列,或由这些cDNA构建体所编码的相应蛋白质,即成熟鼠SEZ6(图5B,SEQIDNO:11),成熟大鼠SEZ6(图5D,SEQIDNO:13),成熟食蟹猴SEZ6(图5F,SEQIDNO:15),人SEZ6L蛋白的成熟ECD(图5H,SEQIDNO:17),或人SEZ6L2蛋白的成熟ECD(图5J,SEQIDNO:19)。
图6A和6B是各种基因的mRNA表达水平的描绘,如使用从肿瘤细胞亚群或正常组织来源的mRNA的全转录(SOLiD)测序所测定。图6A是具有神经内分泌特征的肿瘤相关基因的表格表示;且图6B是在正常组织中和从肺癌衍生的几种非传统异种移植物(NTX)肿瘤中的SEZ6mRNA表达的图形表示。
图7A-7F描绘使用微阵列分析的mRNA表达水平。图7A是对46种肿瘤系和两个正常组织的微阵列概况的无监督簇集的图形表示;图7B和7C是归一化的强度值的表格表示,所述强度值对应于与神经内分泌表型(图7B)或刻缺蛋白(Notch)信号传导途径(图7C)相关的选择的基因的相对表达水平,其中无阴影细胞和相对低的数字表示很少或无表达,并且更黑的细胞和相对较高的数字表示较高的表达水平;图7D是示出如使用qRT-PCR测量的在各种肿瘤和对照组织中HES6mRNA的相对表达水平的图形表示;图7E是归一化的强度值的表格表示,所述强度值对应于指示神经发生、神经承诺(commitment),或对神经命运的分化的选择的基因的相对表达水平,其中非阴影细胞表示很少或无表达,和更黑的细胞表较高表达水平;且图7F是对应于多种NTX肿瘤系中的SEZ6的相对表达的归一化强度值的图形表示。
图8A和8B是SEZ6mRNA转录物的相对表达水平的图形表示,如通过RT-PCR在从正常组织或大块(bulk)神经内分泌NTX肿瘤(图8A)和各种其他NTX肿瘤(图8B)分离的各种RNA样品中所测定。
图9A和9B是示出了人SEZ6的绝对的(图9A)或归一化的(图9B)mRNA表达水平的图形表示,如通过RT-PCR在来自具有十八种不同实体瘤类型之一的患者的整个肿瘤标本(灰色点)或匹配的正常相邻组织(NAT;白色点)中所测量。
图10A-10B提供如本文实施例中所描述分离、克隆和工程改造的一些鼠和人源化的示例性SEZ6调节剂的轻链(图10A)和重链(图10B)可变区的连续氨基酸序列。在所附序列表中列出相应的核酸序列。图10C阐述了人源化抗体SC17.200和SC17.200vL1的轻链和重链的全长氨基酸序列。
图11描述了本发明的示例性调节剂的各种特性。图11A表示如在表格格式中表示的示例性SEZ6调节剂的生物化学和免疫学性质;且图11B提供了抗体结合的结构域和体外杀伤测定中抗体效力之间的相关性。
图12A和12B示出,使用电化学发光测定法测量的SEZ6蛋白表达的检测。图12A示出使用抗SEZ6抗体SC17.33的经工程改造以过表达人SEZ6蛋白的HEK-293T细胞(h293T-HuSEZ6)的SEZ6表达;图12B示出了在各种NTX肿瘤和正常组织裂解物中人类SEZ6的相对蛋白质表达。
图13A和13B示出通过流式细胞术使用各种抗SEZ6抗体对NTX肿瘤细胞上的SEZ6蛋白表达的检测(图13A);而图13B示出了使用各种抗SEZ6抗体的CSC中与NTG亚群相比的SEZ6蛋白的增强的表达(图13B)。
图14A和14B示出,与不表达SEZ6的CSCs相比,表达SEZ6的CSCs显示增强的致瘤性。图14A是等高线图,其表示通过FACS、基于CD324(CSCs的标记物)和SEZ6的表达对肺肿瘤(LU37)中的细胞进行的细胞分选;图14B是植入免疫缺陷小鼠后肿瘤细胞生长的图形表示,所述肿瘤细胞是CD324+SEZ6+(黑色圆圈)或CD324+SEZ6-(白色圆圈)。同时表达CD324和SEZ6的肿瘤细胞显示增强的致瘤性。
图15A和15B分别提供表格和图形的表示,其示出了所公开的调节剂可有效地用作靶向结构部分以便将细胞毒性的有效载荷导向至被工程改造以表达SEZ6的细胞(图15A)和在体外生长的NTX肺肿瘤(LU80,LU37和LU100)(图15B),其中归一化相对发光单位(RLU)的减少指示通过皂草素毒素的内化的细胞杀死。
图16示出了,使用免疫组织化学(IHC)确定的多种SCLC和甲状腺髓样瘤中的SEZ6表达的定量,其中图16A示出了NTXSCLC肿瘤中的SEZ6表达,图16B示出了在SCLC肿瘤微阵列中的SEZ6表达,并且图16C示出了在原发性髓样甲状腺肿瘤中的SEZ6表达。
图17A-17B描绘缀合的抗SEZ6小鼠抗体延缓NTX肿瘤细胞的体外和体内生长的能力。图17A示出了使用抗SEZ6ADCs的对SCLC(LU64)和OV(OV26)NTX肿瘤细胞系的体外杀伤测定的结果;而图17B显示抗SEZ6ADC对体内SCLC(LU86)和LCNEC(LU50)肿瘤的生长的影响。
图18A-18D描绘缀合的人源化抗SEZ6抗体延缓甲状腺细胞系的体外(图18A)和体内(图18B)生长的能力;和延缓四种SCLC肿瘤(LU80,LU64,LU111和LU117)体内生长的能力,和在免疫缺陷小鼠中实现持久缓解的能力(图18C和18D)。
图19示出在亲本小细胞肺癌(SCLC)患者来源的异种移植(PDX)系LU124p2中、与在对奥沙利铂具有耐药性的细胞系LU124OXAHIp2和LU124OXAHIp3中相比的奥沙利铂(oxalaplatin)的剂量响应曲线。
图20示出在亲本SCLCPDX系LU124p1和LU124p3,和对奥沙利铂具有耐药性的细胞系LU124OXAHIp3中SEZ6的mRNA表达。
图21示出在亲本SCLCPDX系LU124p3和对奥沙利铂具有耐药性的细胞系LU124OXAHIp3中SEZ6的蛋白表达。
发明详述
I.简介
虽然本发明可以多种不同形式实施,但本文中公开的是例示本发明的原理的本发明的特定说明性实施方案。应强调的是,本发明不限于所说明的特定实施方案。此外,本文中所使用的任何章节标题是仅用于组织目的且不应视为限制所描述的主题。最终,为了本发明的目的,除非另有说明,否则所有鉴别序列登录号可见于NCBI参考序列(RefSeq)数据库及/或NCBI存档序列数据库。
如上文所论述,已令人惊讶地发现SEZ6表达与肿瘤的生长和增殖性病症(尤其是在具有神经内分泌特征的肿瘤的情况下)相关联,且SEZ6及其变体或同工型提供可用于治疗相关疾病的有效肿瘤标记物。此外,如本申请中所示,已经出人意料地发现,SEZ6标记物或决定簇诸如细胞表面SEZ6蛋白质在与癌症干细胞(也称为肿瘤永存细胞(perpetuatingcell))相关,并且可以被有效地利用,以消除或沉默癌症干细胞。选择性地减少或消除癌症干细胞(例如,通过使用缀合的SEZ6调节剂)的能力是尤其令人惊讶的,因为已知这种细胞通常对许多常规治疗有抗性。也就是说,传统以及更近的靶向治疗方法的有效性,通常受到甚至在面对这些多种治疗方法时能够使癌症永存的抗性癌症干细胞的存在和/或出现的限制。此外,与癌症干细胞相关的决定簇经常由于低的或不一致的表达、未能保持与致瘤性细胞相关或未能呈现在细胞表面而产生差的治疗目标。与现有技术的教导形成鲜明对比的是,本发明公开的化合物和方法有效地克服这个固有抗性以特异性消除、消耗、沉默或促进这样的癌症干细胞的分化,从而使得癌症干细胞不具有保持或重新-诱导基本肿瘤生长的能力。如本文所显示,公开的相对的DAR均质的制剂提供意想不到的稳定性。
更具体地,已经发现的是,SEZ6调节剂(诸如本文中公开的SEZ6调节剂)可有利地用于预后,诊断,治疗诊断,治疗及/或预防有需要的个体中的增殖性病症(例如赘生性病症)。因此,尽管下文将尤其根据特定结构域、区域或表位或在包含神经内分泌特征的癌症干细胞或肿瘤及其与所公开的调节剂的相互作用的情形中广泛论述本发明的优选实施方案,但本领域技术人员应了解,本发明的范围不受这种示例性实施方案限制。实情为,本发明的最广泛实施方案及随附权利要求广泛及明确地涉及SEZ6调节剂(包括缀合的调节剂)及其在预后,诊断,治疗诊断,治疗或预防多种SEZ6相关或介导的病症(包括赘生性或细胞增殖性病症)中的用途,而与任何特定作用机制或特定靶向的肿瘤、细胞或分子组分无关。
为此且如本申请中说明,已经出人意料地发现所公开的SEZ6调节剂可有效用于靶向及消除增殖性或致瘤细胞或以其他方式剥夺其能力以及治疗SEZ6相关病症(例如赘瘤形成)。如本文中所用,“SEZ6相关病症”应始终意指任何在疾病或病症的病程或病源学期间由SEZ6遗传组分或表达的表型或基因型畸变标记、诊断、检测或鉴别的病症或疾病(包括增殖性病症)。在此方面,SEZ6表型畸变或决定簇可例如包含升高或降低的SEZ6蛋白质表达、某些可定义的细胞群体上的异常SEZ6蛋白质表达或细胞生命循环中的不当时期或阶段时的异常SEZ6蛋白质表达。当然,应了解,SEZ6的基因型决定簇的类似表达模式(例如mRNA转录水平)亦可用于分类或检测SEZ6病症。
如本文中所用的术语“决定簇”或“SEZ6决定簇”应意指任何与特定的细胞、细胞群或组织可鉴别地关联的性状、特性、标记物或因子,任何在特定的细胞、细胞群或组织中或上被特异性发现的性状、特性、标记物或因子,包括在受SEZ6相关疾病或病症影响的组织、细胞或细胞群中或上被鉴别的性状、特性、标记物或因子。在选择的优选的实施方案中,SEZ6调节剂直接与SEZ6决定簇(例如,细胞表面SEZ6蛋白或SEZ6mRNA)相缔合、结合或反应,并由此改善该病症。更一般的是,决定簇可以具有形态的、功能的或生物化学的性质,且可以是基因型或表型的。在其他优选实施方案中,决定簇是由特定的细胞类型(例如,癌症干细胞),或由在特定条件下的细胞(例如,在特定生态位的细胞周期或细胞的具体点期间)差异或优先表达(或不表达)的细胞表面抗原或遗传分。在其他优选的实施方案中,决定簇可以包括,在特定的细胞或离散的细胞群中差异调节的(上调或下调的)基因或遗传实体,针对物理结构和化学组成进行差异修饰的基因,或与显示差异化学修饰的基因在物理上相关联的蛋白质或蛋白质的集合。本文所考虑的决定簇被专门认为是阳性或阴性的,并且通过它的存在(阳性)或不存在(阴性)可以表示细胞、细胞亚群或组织(例如,肿瘤)。
与此类似,本发明的“SEZ6调节剂”广义地包括识别、拮抗、结合、激动SEZ6变体或同工型(或其特定结构域、区域或表位)或其遗传组分,或者与SEZ6变体或同工型(或其特定结构域、区域或表位)或其遗传组分反应、竞争、相互作用或缔合的任何化合物或其遗传组分。通过这些相互作用,所述SEZ6调节剂可以有利地消除、减轻或缓和致瘤性细胞(例如,肿瘤永存细胞或癌症干细胞)的频率、活性、复发、转移或迁移率。本文所公开的示例性调节剂包括核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、肽或多肽。在某些优选的实施方案中,选择的调节剂将包括针对SEZ6蛋白同工型或其免疫反应性片段或衍生物的抗体。这种抗体可以具有拮抗性质或激动性质,并且可任选地缀合或缔合至治疗或诊断剂。此外,这样的抗体或抗体片段可包括消耗、中和或内化抗体。在其他实施方案中,本发明范围内的调节剂将构成SEZ6构建体,其包括SEZ6同工型或其活性片段。应当理解,这样的构建体可包括融合蛋白,并且可以包括来自其他多肽(诸如免疫球蛋白或生物应答调节剂)的反应结构域。在其他方面,所述SEZ6调节剂将包括核酸结构部分(例如miRNA,siRNA,shRNA,反义构建体,等等),所述核酸结构部分在基因组水平发挥期望的作用。与本文教导相容的其他调节剂将在下面详细讨论。
更一般地,本发明的SEZ6调节剂广泛地包括识别、拮抗、结合、激动SEZ6决定簇(基因型或表型)(包括细胞表面SEZ6蛋白),或者与SEZ6决定簇(基因型或表型)(包括细胞表面SEZ6蛋白)反应、竞争、相互作用或缔合的任何化合物。无论最终选择何种形式的调节剂,在被导入到个体之前,调节剂优选是在分离和纯化的状态。在这方面,术语“分离的SEZ6调节剂”或“分离的SEZ6抗体”应在广义上并按照标准药学实践被解释为意指,包括处于基本上不含不期望的污染物(生物或其他形式的)的状态的调节剂的任何制剂或组合物。此外,可使用各种本领域公认的技术,根据需要纯化和配制这些制剂。当然,应该理解,根据需要这样的“分离的”制剂可以有意地采用惰性或活性成分配制或与惰性或活性成分相结合,以提高成品的商业、制造或治疗方面,并且提供药物组合物。在更广泛的意义上,相同的一般的考虑可以适用于“分离的”SEZ6同工型或变体或编码“分离的”SEZ6同工型或变体的“分离的”核酸。
另外,已经令人惊讶地发现,与特定SEZ6结构域、基序或表位相互作用、缔合或结合的调节剂特别有效地消除致瘤性细胞和/或沉默或减弱癌干细胞对肿瘤生长或繁殖的效果。也就是说,虽然与接近细胞表面的结构域(例如,Sushi或CUB样结构域之一)反应或缔合的调节剂可有效地消耗或中和致瘤性细胞,但已经出乎意料地发现,与相对更远离细胞表面的结构域、基序或区域相缔合或结合的调节剂也有效地消除、中和、消耗或沉默致瘤性细胞。缀合的调节剂,诸如,例如,抗SEZ6抗体药物缀合物(包含细胞毒性剂)尤其如此。
虽然本发明明确地涵盖任何SEZ6调节剂在治疗任何SEZ6病症(包括任何类型的赘瘤形成)中的使用途,在特别优选的实施方案中,可以使用所公开的调节剂,以预防、治疗或诊断包含神经内分泌特征(基因型或表型)的肿瘤(包括神经内分泌肿瘤)。真性或“正则神经内分泌肿瘤”(NETs)源自分散的内分泌***,并且通常非常具有侵袭性。神经内分泌肿瘤存在于肾脏,泌尿生殖道(膀胱,***,卵巢,子宫颈和子宫内膜),胃肠道(胃,结肠),甲状腺(甲状腺髓样癌),和肺(小细胞肺癌,大细胞神经内分泌癌)。此外,所公开的调节剂可以有利地用于治疗、预防或诊断伪神经内分泌肿瘤(pNETs),所述伪神经内分泌肿瘤在基因型或表型方面模拟、包含、类似于或表现出与正则神经内分泌肿瘤共有的共同特点。“伪神经内分泌肿瘤”是从以下细胞产生的肿瘤:弥散神经内分泌***的细胞,或其中神经内分泌分化级联已在致癌过程被异常激活的细胞。这样的pNETs通常与传统定义的神经内分泌肿瘤共享某些基因型、表型或生化特性,包括生产生物活性胺、神经递质和肽类激素的子集的能力。因此,为了本发明的目的,短语“包含神经内分泌特征的肿瘤”或“展示神经内分泌特征的肿瘤”将始终包括神经内分泌肿瘤和伪神经内分泌肿瘤,除非上下文另有规定。
在优选的实施方案中,所公开的调节剂将可用于治疗小细胞肺癌,并且在特别优选的实施方案中,将可用于治疗有需要的个体中的对铂具有耐药性的小细胞肺癌。如本文所用和本领域已知,术语“对铂具有耐药性的小细胞肺癌”意指个体中存在对采用基于铂的护理剂(如卡铂、顺铂和/或奥沙利铂(oxalaplatin))标准的治疗具有耐药性或难治性的肿瘤或致瘤性小细胞肺癌细胞。使用标准的临床方法容易地诊断这样的病症,并且这样的病症的识别完全在本领域普通技术的临床医师的范围中。
除了与上文一般所讨论的与肿瘤的关联,也存在选择的肿瘤起始细胞(TIC)和SEZ6决定簇之间的表型或基因型的关联的指示(适应证)。在这方面,选择的TIC(例如癌症干细胞)可以相对于正常组织和非致瘤性细胞(NTG)(其一起典型地占实体瘤的许多)表达升高水平的SEZ6蛋白,这一起典型地包括许多实体瘤(这一起典型地被发现于许多实体瘤)。因此,SEZ6决定簇可以包括肿瘤相关标记物(或抗原或免疫原),并且由于在细胞表面或在肿瘤微环境中的蛋白质水平的改变,所公开的调节剂可为TIC和相关赘瘤形成的检测和抑制提供有效试剂。因此,SEZ6调节剂(包括与蛋白质相缔合、结合或反应的免疫反应拮抗剂和抗体)可以有效地减少肿瘤起始细胞的频率和可以适用于消除、消耗、减少、促进这些肿瘤起始细胞的分化,使这些肿瘤起始细胞不能分化,或以其他方式阻止或限制这些肿瘤起始细胞在患者中潜伏和/或继续刺激肿瘤生长、转移或复发的能力。在这方面,本领域技术人员将理解,本发明还提供SEZ6调节剂和它们在降低肿瘤起始细胞的频率中的用途。
II.SEZ6生理学
SEZ6(也称为发作相关6同系物)是最初从采用惊厥剂戊二烯四唑(pentylentetrazole)处理的小鼠大脑皮质衍生的细胞中克隆的I型跨膜蛋白(Shimizu-Nishikawa,1995;PMID:7723619)。代表性SEZ6蛋白直向同源物包括但不限于:人类(NP_849191;NP_001092105),黑猩猩(XP_511368,NP_001139913),小鼠(NP_067261),和大鼠(NP_001099224)。在人类中,SEZ6基因由位于染色体17q11.2上跨越51.1kBp的17个外显子构成。最后一个外显子内只相隔16个碱基对的交替剪接受***点产生两种加工转录物,一个大约4210个碱基(NM_178860;图1A),和一个大约4194个碱基(NM_001098635,图1B)。前一个转录物编码994个氨基酸蛋白(NP_849191;图1C),而后者编码993个氨基酸蛋白(NP_001092105;图1D)。SEZ6的这两种蛋白同工型在其细胞外结构域和它们的跨膜结构域之间共享总体100%同一性,仅不同于最后的十个氨基酸残基(图1E)。已报道,第三个剪接变体产生SEZ6的分泌形式(Shimizu-Nishikawa,1995;PMID:7723619),但是它没有被包括在NCBI数据库基因页面条目内关联的RefSeqs中。本发明的调节剂可以结合到任何剪接变体。
同工型的生物相关性是不明确的,虽然一项研究已经提示了,当膜与可溶性蛋白的表达在来自鼠SEZ6敲除小鼠的神经元中被恢复时,膜与可溶性蛋白的相反作用(Gunnersen等人,2007,PMID:18031681)。SEZ6蛋白的交叉物种蛋白序列同一性列于图2A。在人类基因组中,有两个密切相关的基因-发作相关6同系物样(SEZ6L)和发作相关6同系物样2(SEZ6L2),其每一个具有编码众多同工型的多个剪接变体(图2B)。人类中的该SEZ6样蛋白家族的每个成员的最长蛋白质同一性百分比示于图2C。为了本申请的目的,SEZ6、SEZ6L和SEZ6L2(包括它们的各种同工型)将被总称为SEZ6家族。本发明的SEZ6调节剂包括特异于SEZ6、SEZ6L或SEZ6L2中的每个的调节剂。或者,本发明的调节剂可以与SEZ6和SEZ6L和/或SEZ6L2的一个或两个交叉反应。
成熟SEZ6蛋白是由一系列结构域组成:胞质结构域,跨膜结构域和包含独特的N端结构域的胞外结构域,随后是两个交替的Sushi和CUB样结构域,和三个另外的串联Sushi结构域重复。存在SEZ6抗原的两种同工型,不同之处仅在极端的羧基端,胞浆结构域。
图1F提供SEZ6蛋白的胞外区的示意图,其示出了Sushi和CUB结构域的一般并列,N端结构域。一般地,结构域被认为存在于大约氨基酸残基336-395(Sushi结构域1),397-508(CUB结构域1),511-572(Sushi结构域2),574-685(CUB结构域2),690-748(Sushi结构域3),750-813(Sushi结构域4),817-878(Sushi结构域5),其中N端结构域在约氨基酸残基1-335,并且富含脯氨酸残基的组成偏差在约氨基酸残基71-169。
Sushi重复类似于在其他人类补体调节蛋白质中发现的短共有重复(即,补体C3b/C4b结合位点)。CUB样结构域是类似于在其他哺乳动物补体结合蛋白中发现的CUB结构域,所述CUB结构域与参与除补体激活之外的众多生物过程(包括但不限于模式形成、轴突导向、炎症和肿瘤抑制)的诸多蛋白质相关联(Bork和Beckman,1993,PMID:8510165)。Sushi和CUB结构域两者均意味着涉及其他蛋白胞外结合的SEZ6功能。含CUB结构域的蛋白质也已与细胞信号传导途径相关联,以及与此功能相一致的是,SEZ6C端胞质结构域包含Asn-Pro-Thr-Tyr基序(SEQIDNO:200),这是Src酪氨酸激酶家族成员磷酸化的潜在目标。如果属实,这将使SEZ6连接到导致Ras的活化的细胞信号转导途径,这表明SEZ6可以是神经营养受体。
需要注意的是,如本文所用的术语“成熟蛋白质”或“成熟多肽”是指,在没有在细胞表面表达之前可能被裂解的19个氨基酸的信号肽的情况下产生的SEZ6蛋白的形式(一个或多个)。除非另有说明,SEZ6氨基酸编号(对于结构域、区域、表位等等)将在没有先导序列的成熟蛋白的情况下。
SEZ6是在啮齿类动物的肾、肝、心脏、肺和胸腺中在以低水平通过RT-PCR可检测到的,尽管在脑中发现而强蛋白表达被发现在脑中,在睾丸中具有显著水平表达(Herbst和Nicklin,1997,PMID:9073173)。用SEZ6多克隆血清,在正在发育的小鼠前脑的第13天检测到蛋白的表达。在正在发育的皮层板和亚板的有丝***后,在成熟的神经元中检测到强染色。在成年大脑中此染色减少,在成年大脑中SEZ6表达可以在与正在进行的形态学可塑性相关联的其他脑区域(诸如海马、小脑和嗅球)和在视网膜和脊髓的神经元中被检测到(Gunnersen等人,2007年,PMID:18031681)。在具有最大浓度神经元细胞体的区域中发现最密集的信号。尽管SEZ6具有普遍的视网膜表达,但是在没有SEZ6的情况下视网膜功能未受影响(Gunnersen等人,2009,PMID:19662096)的。SEZ6染色模式与皮层层和海马的出现紧密联系在一起,并暗示该新基因在发育过程中这个新基因的前脑特异性定角色。在人类和小鼠中,发现SEZ6在新皮质的高度特异性区域中发现SEZ6被差异表达(Gunnersen等人,2007,同上)。
在人类SEZ6基因中的突变已与高热发作(febrileseizures)(FS),与体温上升相关的抽搐,儿童中癫痫发作最常见的类型相关联(Yu等人,2007,PMID:17086543)。FS可以被分类为简单或复杂的,这取决于受癫痫发作影响的机体的持续时间、复发和程度。在中国组群中,在15名健康对照者中没有发现SEZ6中的突变,但在60名FS患者中的21名中发现突变,其中最常见的突变类型是在cDNA位置1435的杂合的胞嘧啶***(移码突变)。突变发生率在具有复杂FS的患者中和在具有阳性家族史的患者中是显著更高的。由于具有复杂FS的孩子在以后的生活中将有80%的机会有癫痫发作,作者认为筛选SEZ6中的突变可能在预测FS复发或癫痫的发展中有价值(Yu等人,2007,参见上文)。后来的研究质疑该研究的发病率、相关性和能力是否具有足够力量来暗示因果关系,但确实支持SEZ6可能是可在癫痫病症中发挥作用的许多基因中的一个(Mulley等人,2011,PMID:21785725)。
SEZ6的具体分子功能仍不清楚。如上述讨论,通过同源性和序列分析鉴定的蛋白质的结构模块的分析表明在信号传导、细胞-细胞通信以及神经发育中的可能作用。形成构成大脑的回路的信号传导网络的神经元树突分枝和连接产生并且均由在神经细胞中的内在分子程序以及外在信号指定。在锥体神经元(在哺乳动物前脑中的主要神经元)中的树突的生长的过程产生具有独特形态的神经元-锥体细胞体,和两种不同的、复杂的树突树:一种从顶点产生,且另一种从该细胞体的基座产生。Gunnersen等人(2007,同上)已经表明SEZ6无效小鼠在这些神经元的树突树中显示出过量的短树突,但显示在整体树突区域(给定的神经元连接的神经元的范围)中没有增加。恢复在敲除神经元中膜结合的SEZ6同工型的表达导致抗分支作用。在行为测试中,SEZ6无效小鼠显示特定的探索、运动和认知缺陷。这些数据表明,SEZ6对于实现发育过程中复杂的树突轴的确立期间的树突伸长和分支之间必要的平衡而言是重要的。
综上所述,以上这些研究强烈表明SEZ6蛋白在神经发育的情况中是重要的,并且很可能在细胞-细胞通信和信号传导中具有一定的作用。通常在肿瘤中观测到发育信号传导途径的不当再活化或正常信号传导途径的失调(Harris等,等人,2012)。共享指示发育程序的部分活化的特征的一个肿瘤集合是具有神经内分泌表型的肿瘤(Yao2008;PMID:18565894),其中表达和/或分泌各种激素和内分泌标记物被表达和/或分泌,以及表达指示神经发生、神经承诺或向神经命运的分化的各种神经标记物被表达。具有神经内分泌特征的肿瘤通常罕有地产生于广泛范围的原发性位点,而且其详尽分类仍存在问题(Yao;PMID:18565894;Klimstra2010;PMID:20664470;2011;PMID:22005112),其可分类为四种主要类型:低级良性类癌瘤、具有恶性性质的低级分化良好的神经内分泌肿瘤、具有混合型神经内分泌及上皮特征的肿瘤及高级分化不良的神经内分泌癌瘤。在这些分类中,分化不良的神经内分泌癌瘤(其包括小细胞肺癌(SCLC)及非小细胞肺癌(NSCLC)的子集)为具有不良预后的癌症类型。已假设SCLC为支气管源起源的,部分由肺神经内分泌细胞产生(Galluzzo及Bocchetta,2011);PMID:21504320)。无论这些肿瘤的细胞来源如何,很显然,它们表现出不良分化的内分泌表型,往往具有高度增殖性和侵袭性,并经常是过表达的神经蛋白。同样,甲状腺髓样癌(MTC)(即源于甲状腺降钙素分泌滤泡旁C细胞的特殊神经内分泌肿瘤类型)显示神经内分泌表型,这与它们的成熟内分泌功能和它们从神经嵴组织的衍生相一致(Cook等,等人,2010;PMID:20182588)。尽管仅仅代表约3-5%的甲状腺癌,MTC导致所有甲状腺癌症死亡中的高达14%,对标准化疗或放射治疗不是非常响应的,甚至对较新的分子靶向酪氨酸激酶抑制剂如卡博替尼(cabozantinib)和凡德他尼(vandetanib)也不是非常响应,对单一疗法响应不好(Haddad,2013;PMID:24002516)。鉴于具有暗淡预后的肿瘤的这些实施例,在这些肿瘤中神经表达标记物(以其他方式可以被主要限制于神经***或显示发育期间有限表达)的所得提高(其中SEZ6可以是示例性的)因此可为具有神经内分泌表型的肿瘤提供独特的治疗目标。
III.癌症干细胞
如上文所提及,令人惊讶地发现,异常SEZ6表达(基因型及/或表型)与各种致瘤细胞亚群相关联。在此方面,本发明提供SEZ6调节剂,其可尤其适用于靶向这种细胞(尤其是肿瘤永存细胞),由此促进赘生性病症的治疗、控制或预防。因此,在优选实施方案中,根据本发明的教导,SEZ6决定簇的调节剂(表型或基因型)可有利地用于降低肿瘤起始细胞频率且由此促进增殖性病症的治疗或控制。
为了本申请的目的,术语“肿瘤起始细胞”(TIC)涵盖“肿瘤永存细胞”(TPC;即癌症干细胞或CSC)及高增殖性“肿瘤祖细胞”(称为TProg),其通常共同包含主体肿瘤(bulktumor)或肿瘤块的唯一亚群(即0.1%-40%)。为了本发明的目的,术语“肿瘤永存细胞”及“癌症干细胞”或“赘生性干细胞”为等效物且在本文中可互换地使用。TPC与TProg的不同之处在于TPC可完全概括存在于肿瘤内的肿瘤细胞的组成且具有无限自我更新能力,如由少数经分离细胞的连续移植(经由小鼠的两次或两次以上传代)所证明,而TProg不会显示无限自我更新能力。
本领域技术人员应了解,至少部分归因于使用合适细胞表面标记物的荧光活化细胞分选(FACS)区分单细胞与细胞簇(即双联体)的能力,使用合适细胞表面标记的荧光活化细胞分类(FACS)是分离高度富集的癌症干细胞亚群(例如纯度>99.5%)的可靠方法。使用这种技术已显示,当将低细胞数目的高度纯化TProg细胞移植于免疫减弱小鼠中时,所述高度纯化TProg细胞可刺激原发性移植物中肿瘤生长。然而,不同于经纯化的TPC亚群,TProg产生的肿瘤并不完全反映亲代肿瘤的表型细胞异质性,且在后续移植物中明确不足以重新引发连续肿瘤形成。相反,TPC亚群完全重构亲代肿瘤的细胞异质性且在连续分离及移植时可有效引发肿瘤。因此,本领域技术人员应认识到,尽管TPC与TProg皆可在原发性移植物中产生肿瘤,但两者之间的明确差异为TPC具有在以低细胞数目连续移植后持久刺激异源肿瘤生长的独特能力。表征TPC的其他常见方法涉及细胞表面标记的形态学及检查、转录谱及药物反应,但标记表达可随培养条件及体外细胞系传代而变。
因此,为了本发明的目的,肿瘤永存细胞(如支持正常组织中细胞分层(Hierarchies)的正常干细胞)优选是由其无限自我更新、同时能够保持多谱系分化的能力定义。因此,肿瘤永存细胞能够产生肿瘤形成子代(即肿瘤起始细胞:TPC及TProg)与非肿瘤形成(NTG)子代两者。如本文中所使用,非肿瘤形成细胞(NTG)是指由肿瘤起始细胞产生、但自身不能自我更新或产生构成肿瘤的肿瘤细胞异源谱系的肿瘤细胞。在实验上,即使以过量细胞数目移植,NTG细胞仍无法在小鼠中再现肿瘤形成。
如所描述,TProg亦根据其在小鼠中产生肿瘤的有限能力而被归类为肿瘤起始细胞(或TIC)。TProg为TPC的子代且通常能够进行有限次数的非自我更新细胞***。此外,TProg细胞可进一步分成早期肿瘤祖细胞(ETP)及晚期肿瘤祖细胞(LTP),其每一者可由表型(例如细胞表面标记物)及再现肿瘤细胞结构的不同能力来区分。尽管存在这种技术性差异,但ETP与LTP在功能上亦与TPC不同,不同之处在于,当以低细胞数目移植时ETP与LTP一般不太能够连续重构肿瘤且通常不反映亲代肿瘤的异质性。尽管存在上述区别,但亦已显示,各种TProg群体可在个别情况下获得通常归因于干细胞的自我更新能力且自身变成TPC(或CSC)。在任何情况下,两种类型的肿瘤起始细胞均可能在单一患者的典型肿瘤块中呈现且可使用如本文所公开的调节剂治疗。即,所公开的组合物在降低这种SEZ6阳性肿瘤起始细胞的频率或改变这种SEZ6阳性肿瘤起始细胞的化学敏感性中通常有效,而与肿瘤中所出现的特定实施方案或混合物无关。
在本发明的上下文中,与构成肿瘤块的TProg(ETP与LTP两者)、NTG细胞及浸润肿瘤的非TPC来源细胞(例如纤维母细胞/基质、内皮及造血细胞)相比,TPC更具肿瘤形成性,相对更静止且通常更具化学抗性。鉴于常规疗法及方案大部分已设计成使肿瘤减积且侵袭快速增殖细胞,与较快增殖的TProg及其他块状肿瘤细胞群体相比,TPC很可能对常规疗法及方案更具抗性。此外,TPC通常表现使其对常规疗法具有相对化学抗性的其他特征,诸如多重耐药性转运蛋白的表达增加、DNA修复机制增强及抗细胞凋亡蛋白。这些性质(每一者均造成TPC的耐药性)构成标准肿瘤学治疗方案无法确保大部分晚期赘瘤形成患者长期受益的关键原因;即无法适当地靶向及移除刺激持续肿瘤生长及复发的细胞(即TPC或CSC)的关键原因。
与许多先前治疗不同,无论选择调节剂的形式或特定目标(例如,遗传物质、SEZ6抗体或配体融合构建体)如何,本发明的新型组合物在施用至个体后优选降低肿瘤起始细胞的频率。如上文所述,肿瘤起始细胞频率的降低可因以下而出现:a)消除、耗尽、敏化、沉默或抑制肿瘤起始细胞;b)控制肿瘤起始细胞的生长、扩大或复发;c)中断肿瘤起始细胞的引发、繁殖、维持或增殖;或d)以其他方式阻碍肿瘤形成细胞的存活、再生及/或转移。在一些实施方案中,肿瘤起始细胞频率的降低因一个或多个生理学途径变化而出现。途径的变化(无论通过肿瘤起始细胞的降低或消除或者通过改良其潜力(例如诱导分化、微环境破坏)或以其他方式妨碍其影响肿瘤环境或其他细胞的能力引起)又可通过抑制肿瘤形成、肿瘤保持及/或转移及复发而实现SEZ6相关病症的更有效治疗。
本领域中公认的可用于评估肿瘤起始细胞的频率降低的方法包括体外或体内有限稀释分析,优选接着使用泊松分布统计进行计算,或评估预定的确定事件的频率,诸如体内产生或不产生肿瘤的能力。尽管该有限稀释分析包含计算肿瘤起始细胞频率降低的优选方法,但其他亦可使用其他的需求不高的方法有效地确定所需值(尽管精确度略低)且与本文中的教导完全相容。因此,如本领域技术人员将了解,亦可经由熟知的流动式细胞测量或免疫组织化学方法确定频率值的降低。关于所有上述方法,参见例如Dylla等人2008,PMID:18560594及Hoey等人2009,PMID:19664991;前述文献均以整体且尤其针对所公开的方法通过引用并入本文中。
关于有限稀释分析,肿瘤起始细胞频率的体外计算可由将分级或未分级的人类肿瘤细胞(例如分别来自经处理及未经处理的肿瘤)沉积于促进群落形成的体外生长条件中来完成。以这种方式,群落形成细胞可通过群落的简单计数及表征,或由例如将人类肿瘤细胞以连续稀释物形式沉积于板中且在铺板后至少10天对各孔进行评分(如对群落形成为阳性或阴性)组成的分析来计算。体内限制稀释实验或分析(一般其测定肿瘤起始细胞频率的能力更加精确)涵盖例如将来自未经处理的对照或经处理的群体的人类肿瘤细胞的连续稀释液移植于免疫减弱小鼠中,随后在移植后至少60天评定各小鼠为肿瘤形成阳性或阴性。通过体外或体内有限稀释分析推导细胞频率值优选通过以下来进行:将泊松分布统计应用于阳性及阴性事件的已知频率,由此得出满足阳性事件(在此情况下分别为群落或肿瘤形成)定义的事件的频率。
关于与本发明相容的可用于计算肿瘤起始细胞频率的其他方法,最常见方法包含可定量流动式细胞测量术及免疫组织化学染色程序。尽管不如上文刚刚描述的有限稀释分析技术精确,但这些程序的劳动密集性小得多且可在相对短的时间范围内提供合理的值。因此,应了解,本领域技术人员可使用流动式细胞测量细胞表面标记概况测定,其使用一种或多种结合于本领域中公认的已知针对肿瘤起始细胞富集的细胞表面蛋白质的抗体或试剂(例如PCT申请2012/031280中阐述的可能相容标记,其全部并入本文中)且由此测量来自各种样品的TIC含量。在另一个相容方法中,本领域技术人员可通过使用一种或多种能够结合据信可区分这些细胞的细胞表面蛋白质的抗体或试剂的免疫组织化学来计算原位(例如组织切片中)TIC频率。
本领域技术人员应认识到,多种标记物(或其不存在)与癌症干细胞的各种群体相关联且用于分离或表征肿瘤细胞亚群。在此方面,示例性癌症干细胞标记物包含OCT4、Nanog、STAT3、EPCAM、CD24、CD34、NB84、TrkA、GD2、CD133、CD20、CD56、CD29、B7H3、CD46、转铁蛋白受体、JAM3、羧肽酶M、ADAM9、抑瘤素M(oncostatinM)、Lgr5、Lgr6、CD324、CD325、巢蛋白(nestin)、Sox1、Bmi-1、eed、easyh1、easyh2、mf2、yy1、smarcA3、smarckA5、smarcD3、smarcE1、mllt3、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、WNT10B、WNT16、AXIN1、BCL9、MYC、(TCF4)SLC7A8、IL1RAP、TEM8、TMPRSS4、MUC16、GPRC5B、SLC6A14、SLC4A11、PPAP2C、CAV1、CAV2、PTPN3、EPHA1、EPHA2、SLC1A1、CX3CL1、ADORA2A、MPZL1、FLJ10052、C4.4A、EDG3、RARRES1、TMEPAI、PTS、CEACAM6、NID2、STEAP、ABCA3、CRIM1、IL1R1、OPN3、DAF、MUC1、MCP、CPD、NMA、ADAM9、GJA1、SLC19A2、ABCA1、PCDH7、ADCY9、SLC39A1、NPC1、ENPP1、N33、GPNMB、LY6E、CELSR1、LRP3、C20orf52、TMEPAI、FLVCR、PCDHA10、GPR54、TGFBR3、SEMA4B、PCDHB2、ABCG2、CD166、AFP、BMP-4、β-连环蛋白、CD2、CD3、CD9、CD14、CD31、CD38、CD44、CD45、CD74、CD90、CXCR4、核心蛋白多糖(decorin)、EGFR、CD105、CD64、CD16、CD16a、CD16b、GLI1、GLI2、CD49b及CD49f。参见例如Schulenburg等人,2010,PMID:20185329,U.S.P.N.7,632,678及U.S.P.N.2007/0292414、2008/0175870、2010/0275280、2010/0162416及2011/0020221,其均通过引用并入本文中。此外应了解,上述标记物中的每一者在本发明的双特异性或多特异性抗体的情形中亦可用作次要目标抗原。
类似地,与某些肿瘤类型的癌症干细胞相关联的细胞表面表型的非限制性实例包括CD44高CD24低、ALDH+、CD133+、CD123+、CD34+CD38-、CD44+CD24-、CD46高CD324+CD66c-、CD133+CD34+CD10-CD19-、CD138-CD34-CD19+、CD133+RC2+、CD44+α2β1 高CD133+、CD44+CD24+ESA+、CD271+、ABCB5+以及本领域中已知的其他癌症干细胞表面表型。参见例如Schulenburg等人,2010,见上文;Visvader等人,2008,PMID:18784658及U.S.P.N.2008/0138313,其均通过引用整体并入本文中。本领域技术人员应了解,诸如上文刚刚所例示的标记物表型可结合标准流动式细胞测量分析及细胞分选技术使用,以表征、分离、纯化或富集TIC及/或TPC细胞或细胞群体以供进一步分析。本发明所关注的是CD46、CD324及任选的CD66c在许多人类结肠直肠癌(“CR”)、乳癌(“BR”)、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、胰腺癌(“PA”)、黑色素瘤(“Mel”)、卵巢癌(“OV”)及头颈部癌(“HN”)肿瘤细胞的表面上高度或异质地表达,不管所分析的肿瘤试样为原发性患者肿瘤试样还是来源于患者的非传统异种移植物(NTX)肿瘤。
使用以上参考的方法中的任一种及本领域中已知的选择的标记,则可根据本文中的教导对由所公开的SEZ6调节剂(包括与细胞毒性剂缀合的调节剂)提供的TIC(或其中的TPC)的频率的降低进行定量。在一些情况下,本发明的化合物可使TIC或TPC降低(通过上文说明的多种机制,包括消除、诱导分化、生态位破坏、沉默等)10%、15%、20%、25%、30%或甚至35%。在其他实施方案中,TIC或TPC的频率可降低约40%、45%、50%、55%、60%或65%。在某些实施方案中,所公开的化合物可使TIC或TPC的频率降低70%、75%、80%、85%、90%或甚至95%。当然,应了解,TIC或TPC的频率的任何降低可导致赘瘤形成的致肿瘤性、持续性、复发及侵袭性的相应降低。
IV.SEZ6调节剂
在任何情况下,本发明涉及SEZ6调节剂(包括SEZ6拮抗剂)用于诊断、治疗诊断、治疗和/或预防各种病症(包括若干SEZ6相关的恶性肿瘤中的任一种)的用途。所公开的调节剂可单独使用或与多种抗癌化合物诸如化学治疗或免疫治疗剂(例如,治疗性抗体)或生物应答调节剂结合使用。在其他选择的实施方案中,两种或多种离散SEZ6调节剂可组合使用以提供增强的抗肿瘤作用,或者可以用于制造多特异性构建体。
在某些实施方案中,本发明的SEZ6调节剂将包括核苷酸,寡核苷酸,多核苷酸,肽或多肽。更具体地,本发明的示例性调节剂可包括抗体和其抗原结合片段或衍生物,蛋白质,肽,糖蛋白,糖肽,糖脂,多糖,寡糖,核酸,反义构建体,siRNA,miRNA,生物有机分子,肽模拟物,药理学剂及其代谢物,转录和翻译控制序列等。在某些实施方案中,调节剂将包括可溶性SEZ6(sSEZ6)或其形式,变体,衍生物或片段,包括例如,SEZ6融合构建体(例如,SEZ6-Fc,SEZ6靶向结构部分等)或SEZ6-缀合物(例如,SEZ6-PEG,SEZ6-细胞毒性剂,SEZ6-brm等)。还应当理解,在其他实施方案中,SEZ6调节剂包括抗体或其免疫反应性片段或衍生物。在特别优选的实施方案中,本发明的调节剂将包括中和抗体或其衍生物或片段。在其他实施方案中,SEZ6调节剂可以包括内化抗体或其片段。在仍然其他实施方案中,SEZ6调节剂可包括消耗抗体或其片段。此外,如同上述融合构建体,这些抗体调节剂可以缀合、连接或以其他方式缔合至选择的细胞毒性剂、聚合物、生物应答调节剂(BRM)等,以提供具有各种(和任选多种)作用机制的定向免疫治疗。如上文所述,这样的抗体可以是泛SEZ6抗体和与两种或更多种SEZ6家族成员(例如,如示于图11A种的SEZ6和SEZ6L)相缔合,或选择性地与SEZ6的一种或两种同工型反应的免疫特异性抗体。在其他实施方案中,调节剂可以在基因水平上操作,并且可以包括与SEZ6决定簇的基因型组分相互作用或相缔合的化合物如反义构建体,siRNA,miRNA等。
还应该理解的是,所公开的SEZ6调节剂可以通过各种机制(包括激动或拮抗所选途径或消除特定的细胞)耗尽、沉默、中和、消除或抑制肿瘤细胞(包括TPC)的生长、繁殖或存活,和/或相关联的赘瘤形成,这取决于,例如,SEZ6调节剂的形式,任何相关联的有效载荷或给药和递送方法。因此,虽然本文公开的优选的实施方案是涉及耗尽,抑制或沉默特定的肿瘤细胞亚群,诸如肿瘤永存细胞的耗尽、抑制或沉默或针对与特定表位或结构域相互作用的调节剂,但必须强调的是,这些实施方案只是说明性的而不在任何意义上是限制性的。相反,如所附权利要求中阐述,无论任何特定机制、结合区或目标肿瘤细胞群如何,本发明广泛地涉及SEZ6调节剂和它们在各种SEZ6相关的病症的治疗、控制或预防中的用途。
无论选择的调节剂的形式如何,可以理解,所选择的化合物在性质上可以是拮抗的。如本文中使用的“拮抗剂”是指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰特定或指定的目标(例如,SEZ6)的活性(包括受体与配体的结合或酶与底物的相互作用)的分子。在这方面,可以理解,本发明的SEZ6拮抗剂可包含识别、结合所述SEZ6蛋白或其片段、或与所述SEZ6蛋白或其片段反应、组合、竞争、缔合或以其他方式相互作用和消除、沉默、降低、抑制、阻碍、限制或控制肿瘤起始细胞或其他肿瘤细胞(包括大块肿瘤或NTG细胞)的生长的任何配体、多肽、肽、融合蛋白、抗体或其免疫活性片段或衍生物。相容拮抗剂还可以包括小分子抑制剂、适体、反义构建体、siRNA、miRNA等、受体或配体分子和其衍生物,其识别SEZ6基因型或表型决定簇或与SEZ6基因型或表型决定簇相缔合,由此改变表达模式或掩蔽其与底物、受体或配体的结合或相互作用。
如本文中使用的拮抗剂是指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰特定或指定的蛋白的活性(包括受体与配体的结合或酶与底物的相互作用)的分子。更一般地,本发明的拮抗剂可包含抗体和其抗原结合片段或衍生物、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、反义构建体、siRNA、miRNA、生物有机分子、肽模拟物、药理学试剂以及它们的代谢物、转录和翻译控制序列等。拮抗剂也可包括小分子抑制剂、融合蛋白、受体分子和衍生物(其特异性结合蛋白质,由此使掩蔽其与其底物目标的结合)、所述蛋白质的拮抗性变体、针对所述蛋白质的反义分子、RNA适体和针对所述蛋白的核酶。
如本文所使用并应用于两种或更多种分子或化合物,术语“识别”或“缔合”应被保持为意指,分子的共价或非共价反应、结合、特异性结合、组合、相互作用、连接、连锁、联合、聚结、合并或接合,由此一个分子对另一分子施加效应。
此外,如在本文实施例中证实(例如,参见图11),人SEZ6的一些调节剂可在某些情况下,与来自除人之外的其他物种(例如,大鼠或食蟹猴)的SEZ6交叉反应。在其他情况下,示例性调节剂可特异于人SEZ6的一种或多种同工型,不会表现出与来自其他物种的SEZ6直向同源物的交叉反应性。当然,通过结合本文教导,这样的实施方案可包含与来自单一物种的两种或更多种SEZ6家族成员缔合的泛SEZ6抗体或只与SEZ6缔合的抗体。
在任何情况下,并且如将在下面更详细地讨论,本领域技术人员将理解,所公开的调节剂可以缀合或非缀合形式使用。也就是说,调节剂可以与药物活性化合物、生物应答调节剂、抗癌药、细胞毒性剂或细胞生长抑制剂、诊断结构部分或生物相容的改性剂相缔合或缀合(例如共价或非共价)。在这方面,可以理解的是,这样的缀合物可以包含肽、多肽、蛋白、融合蛋白、核酸分子、小分子、模拟物剂、合成药物、无机分子、有机分子和放射性同位素。此外,如本文所描述的,所选缀合物可以是以各种摩尔比共价或非共价连接到SEZ6调节剂,这取决于,至少部分地取决于用于实现缀合的方法。
V.调节剂制造与供应
A.抗体调节剂
1.概述
如前面提到,本发明的特别优选的实施方案包括,优先与SEZ6的一种或多种同工型(以及任选可与其他SEZ6家族成员交叉反应)相缔合的抗体的形式的SEZ6调节剂。基于如在文献中所述的抗体,本领域普通技术人员将会理解良好发展的知识:例如,Abbas等人,CellularandMolecularImmunology,第6版,W.B.SaundersCompany(2010)或Murphey等人,Janeway’sImmunobiology,第8版,GarlandScience(2011),其各自通过引用整体并入本文。
术语“抗体”包含多无性繁殖系抗体(polyclonalantibody)、多克隆抗体(multiclonalantibody)、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化及灵长类动物化(primatized)抗体、人类抗体、以重组方式产生的抗体、细胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、抗个体基因型抗体、合成抗体(包括突变蛋白质及其变体)、抗体片段(诸如Fab片段、F(ab')片段)、单链片段FvFcs、单链片段Fvs;及其衍生物,包括Fc融合物及其他修饰,及任何其他免疫活性分子,只要它们呈现期望的生物活性(即,抗原缔合或结合)。此外,除非由上下文另有说明,该术语进一步包含所有类别的抗体(即IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)及所有同种型(即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2),以及其变型。对应于不同类别抗体的重链恒定结构域典型地分别由相应小写希腊字母α、δ、ε、γ及μ表示。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链可基于其恒定结构域的氨基酸序列而指定为两种明确相异类型(称为κ及λ)中的一种。
虽然所有此类抗体都在本发明的范围之内,但仅为了说明的目的,对包含IgG类的免疫球蛋白的优选实施方案进行一些详细的讨论。将理解的是,然而,这样的公开内容仅仅是示例性的组合物和实施本发明的方法,而不以任何方式限制本发明或所附权利要求的范围。
如众所周知,轻链(VL)和重链(VH)链部分两者的可变结构域确定抗原识别和特异性,轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予和调节重要的生物特性,诸如分泌、经胎盘的移动性、循环半衰期、补体结合等。
“可变”区包括,在轻链和重链可变结构域两者中、在三个一般称为互补决定区(CDR)的区段中表现自身的高变位点。CDR侧翼的可变结构域的更加高度保守的部分称为框架区(FR)。例如,在天然存在的单体免疫球蛋白G(IgG)抗体中,“Y”的每个臂上的六个CDR是专门定位以形成抗原结合位点的氨基酸的短的非连续序列,因为抗体在水性环境中采取它的三维结构。因此,每个天然存在的IgG抗体包含Y的每个臂的氨基末端的近端的两个相同的结合位点。
将理解的是,使用标准的技术,本领域普通技术人员可以容易地鉴定CDR的位置。本领域技术人员也熟悉在Kabat等人中描述的编号***(1991年,NIH出版物91-3242,国家技术信息服务,斯普林菲尔德,弗吉尼亚州(NationalTechnicalInformationService,Springfield,Va.))。在这方面,Kabat等人为可变结构域序列定义编号***,该***适用于任何抗体。本领域普通技术人员可以将此“Kabat编号”***明确分配给任何可变结构域序列,而不依赖于超出序列本身的任何实验数据。除非另外指明,对抗体中特定氨基酸残基位置的编号的提及根据Kabat编号***。
因此,根据Kabat,在VH中,残基31-35组成CDR1,残基50-65构成CDR2且95-102组成CDR3,而在VL中,残基24-34是CDR1,50-56组成CDR2,且89-97构成CDR3。对于上下文,在VH中,FR1对应于包括氨基酸1-30的可变区的结构域;FR2对应于包括氨基酸36-49的可变区的结构域;FR3对应于包括氨基酸66-94的可变区的结构域,且FR4对应于从氨基酸103到可变区的末端的可变区的结构域。轻链的FR也同样由每个轻链可变区的CDR分开。
注意的是,CDR随抗体的不同而变化(以及通过定义将不会表现出与Kabat共有序列的同源性)。此外,在任何给定的Kabat位点数目的某些个别残基的身份可以随抗体链的不同而改变,这是由于异种或等位基因发散(divergence)。替代编号阐述于Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)和MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),尽管如在Kabat中,FR边界由如上所述相应的CDR末端分开。也参见Chothia等人,Nature342,第877-883页(1989)和S.Dubel编辑,HandbookofTherapeuticAntibodies,第3版,WILEY-VCHVerlagGmbHandCo.(2007),其中当相互比较时定义包括氨基酸残基的重叠或子集。上述各参考文献通过引用整体并入本文,并且包含由每个如上引用的参考文献定义的结合区或CDR的氨基酸残基列于下表1中以进行比较。
表1
CDR定义
Kabat1 | Chothia2 | MacCallum3 | |
VH CDR1 | 31-35 | 26-32 | 30-35 |
VH CDR2 | 50-65 | 50-58 | 47-58 |
VH CDR3 | 95-102 | 95-102 | 93-101 |
VL CDR1 | 24-34 | 23-34 | 30-36 |
VL CDR2 | 50-56 | 50-56 | 46-55 |
VL CDR3 | 89-97 | 89-97 | 89-96 |
1残基编号遵循Kabat等人的命名法,同上
2残基编号遵循Chothia等人的命名法,同上
3残基编号遵循MacCallum等人的命名法,同上
抗体序列中更实际的可变区及CDR可(i)根据在本领域中已开发的一般规则诸如上述讨论的那些或(ii)通过将序列针对已知可变区的数据库比对来鉴别。用于鉴别这些区域的方法描述于Kontermann及Dubel编,AntibodyEngineering,Springer,NewYork,NY,2001及Dinarello等人,CurrentProtocolsinImmunology,JohnWileyandSonsInc.,Hoboken,NJ,2000中。抗体序列的示例性数据库描述于“Abysis”网站,www.bioinf.org.uk/abs(由A.C.Martin,DepartmentofBiochemistry&MolecularBiologyUniversityCollegeLondon,London,England维护)及VBASE2网站,www.vbase2.org(如Retter等人,Nucl.AcidsRes.,33(数据库问题):D671-D674(2005)中描述)中且可由前述网站获得。在这方面,在输入主题重链或轻链可变区核酸或氨基酸序列后,Abysis数据库网站将自动指定并注释CDR和框架区(根据任何常用的编号***)。此外,Abysis数据库网站还包括已开发用于容易鉴别可根据本文中的教导使用的CDR的一般规则。在本发明的上下文中,应当理解,按照本文教导,任何所公开的从如在图10A或图10B中所示的鼠可变区氨基酸序列衍生的轻链和重链CDR可被组合或重新排列,以提供优化的抗SEZ6(例如人源化、CDR移植的或嵌合抗hSEZ6)抗体。也就是说,从图10A中阐述的轻链可变区氨基酸序列(SEQIDNO:20-168,偶数)或图10B中阐述的重链可变区氨基酸序列(SEQIDNO:21-169,奇数)衍生的一种或多种CDR可以并入SEZ6调节剂,并且在特别优选的实施方案中,并入免疫特异性地与一种或多种SEZ6同工型相缔合的CDR移植的或人源化抗体。这种人源化调节剂的轻链(SEQIDNO:170-192,偶数)和重链(SEQIDNO:171-193,奇数和194-199)可变区的氨基酸序列的实例也列于图10A和10B。
注意,hSC17.200vL1(SEQIDNO:192)是人源化轻链构建hSC17.200(SEQIDNO:190)的变体,hSC17.155vH1-vH6(SEQIDNO:193-198)是衍生自SC17.90(SEQIDNO:127)的重链构建体hSC.155(SEQIDNO:184)的变体,并且hSC161vH1(SEQIDNO:199)是重链构建体hSC17.161(序列IDNO:189)的变体。如下更详细地讨论,构建和测试这些变体以最优化亲本抗体的一种或多种生化特性。示例性人源化抗体,hSC17.200和hSC17.200vL1的全长氨基酸序列作为SEQIDNO:400-402描述于图10C。人源化抗体变体hSC17.200vL1衍生自人源化抗体hSC17.200且与hSC17.200抗体共享共同的HC。因此hSC17.200的全长LC和HC分别对应于SEQIDNOS:400和401;且hSC17.200vL1的全长LC和HC分别对应于SEQIDNO:403和401。
综上所述,这些新型氨基酸序列描绘75个鼠和11个按照本发明的人源化的示例性调节剂(与报道的变体一起)。另外,在图10A和10B中阐述的75个示例性鼠调节剂和11个人源化调节剂和变体各自的对应核酸序列都包括在本申请的序列表中(SEQIDNO:220-399)。
在图10A和10B中,使用Kabat编号来定义注释的CDR。然而,如本文所讨论和下面实施例8中展示,针对图10A或图10B中阐述的每个相应重链和轻链序列,本领域技术人员可以容易地定义、鉴定、推导和/或列举由Chothia等人,MacCallum等人或网站数据库中的一个如Abysis或VBase2所定义的CDR。因此,每个主题CDR和包含由所有这种命名法定义的CDR的抗体明确地包括在本发明的范围之内。更广泛地说,术语“可变区CDR氨基酸残基”或更简单的“CDR”包括,使用如上所述的基于序列或结构的任何方法所鉴定的CDR中的氨基酸。
对于本申请中论述的任何重链恒定区氨基酸位置,编号是根据首先描述于Edelman等人,1969,Proc,Natl.Acad.Sci.USA63(1):78-85中的Eu索引进行,其描述据称为第一个测序的人类IgG1的骨髓瘤蛋白Eu的氨基酸序列。Edelman的Eu索引亦阐述于Kabat等人,1991(见上文)中。因此,重链的上下文中的术语“如Kabat中阐述的EU索引”或“Kabat的EU索引”是指基于如Kabat等人,1991(见上文)中阐述的Edelman等人的人类IgG1Eu抗体的残基编号***。用于轻链恒定区氨基酸序列的编号***类似地阐述于Kabat等人,1991中。与本发明相容的示例性κCL及IgG1重链恒定区氨基酸序列是如随附序列表中的SEQIDNO:403和404中所阐述。本领域技术人员应了解,可使用标准分子生物学技术使所公开的恒定区序列与所公开的重链及轻链可变区接合以产生全长抗体,其可并入本发明的SEZ6抗体和ADCs。
如以下实施例所阐述,本发明的所选实施方案包含免疫特异性结合于SEZ6的鼠抗体,其可视为“源”抗体或“参照”抗体。在其他实施方案中,本发明涵盖的抗体可经由源抗体的恒定区的任选的修饰或表位结合氨基酸序列的任选的修饰而自所述“源”或“参照”抗体获得。在一个实施方案中,若源抗体中的所选氨基酸是经由缺失、突变、置换、整合或组合而改变的,则抗体是自源抗体“衍生的”。在另一实施方案中,“衍生的”抗体为其中源抗体的片段(例如一个或多个CDR或整个可变区)与受体抗体序列组合或并入受体抗体序列中以提供衍生物抗体(例如嵌合、CDR移植或人源化抗体)的抗体。出于各种原因(例如改良对决定簇的亲和力;改良细胞培养物中的产量及产率;降低体内免疫原性;降低毒性;促进活性部分的缀合;或产生多特异性抗体),这些“衍生的”(例如人源化或CDR移植)抗体可使用标准分子生物学技术产生。所述抗体亦可通过化学方法或翻译后修饰经由成熟分子(例如糖基化作用模式或聚乙二醇化作用)的修饰而自源抗体衍生。本发明的“源”鼠抗体的实例是SC17.155、SC17.161和SC17.200,且从这样的源抗体衍生的抗体的实例是hSC17.155、hSC17.155vH1-vH5(从SC17.155衍生);hSC17.161vL1(从SC17.161衍生)和hSC17.200vL1(从hSC17.200衍生)。
2.抗体调节剂产生
a.多无性繁殖系抗体
在各种宿主动物(包括兔、小鼠、大鼠等)中产生多无性繁殖系的抗体在本领域中是公知的。在一些实施方案中,含有多无性繁殖系的抗-SEZ6抗体的血清是通过使动物出血或处死动物而获得。血清可以自动物获得的形式用于研究目的,或在替代例中,抗-SEZ6抗体可经部分或完全纯化以提供免疫球蛋白级分或均质性抗体制剂。
简言之,用SEZ6免疫原(例如可溶性SEZ6或sSEZ6)(其可例如包含所选同工型、结构域及/或肽)或表达SEZ6或其免疫反应性片段的活细胞或细胞制剂使所选动物免疫。视接种的物种而定,本领域中已知的可用于提高免疫学反应的佐剂包括(但不限于)弗氏(Freund's)(完全及不完全)佐剂、矿物质凝胶(诸如氢氧化铝)、表面活性物质(诸如溶血卵磷脂)、普朗尼克多元醇(pluronicpolyol)、聚阴离子、肽、油乳液、钥孔血蓝蛋白、二硝基酚及可能有效的人类佐剂,诸如BCG(卡介苗(bacilleCalmette-Guerin))及短小棒状杆菌菌苗(corynebacteriumparvum)。所述佐剂可保护抗原免于因在局部沉积中螯合而快速分散,或其可含有刺激宿主分泌针对巨噬细胞及免疫***的其他组分具有趋化性的因子的物质。免疫程序优选将涉及经预定时间周期进行的所选免疫原的两次或更多次施用。
可分析如图1C或1D中所示的SEZ6蛋白质的氨基酸序列以选择用于产生抗体的SEZ6蛋白质的特异性区域。例如,使用SEZ6氨基酸序列的疏水性及亲水性分析来鉴别SEZ6结构中的亲水性区域。SEZ6蛋白质中展示免疫原性结构的区域以及其他区域及结构域可使用本领域中已知的各种其他方法容易地鉴别,诸如舒-法斯曼(Chou-Fasman)、加尼尔-罗布森(Garnier-Robson)、凯特-杜立德(Kyte-Doolittle)、埃森伯格(Eisenberg)、卡普拉斯-舒尔茨(Karplus-Schultz)或詹姆士-沃夫(Jameson-Wolf)分析。平均柔性概况可使用BhaskaranR.,PonnuswamyP.K.,1988,Int.J.Pept.ProteinRes.32:242-255的方法产生。β-转角(Beta-turn)概况可使用Deleage,G.,RouxB.,1987,ProteinEngineering1:289-294的方法产生。因此,由这些程序或方法中的任一者鉴别的各SEZ6区域、结构域或基序均在本发明的范围内且可经分离或改造以提供免疫原,从而产生包含期望的性质的调节剂。用于产生SEZ6抗体的优选方法进一步由本文中提供的实施例说明。用于制备用作免疫原的蛋白质或多肽的方法在本领域中是公知的。本领域中亦公知用于制备蛋白质与载体(诸如BSA、KLH或其他载体蛋白)的免疫原性缀合物的方法。在一些情况下,使用直接缀合,其使用例如碳化二亚胺试剂;在其他情况下,连接试剂为有效的。如在本领域中理解,SEZ6免疫原的施用通常通过经合适时间周期的注射且使用合适佐剂进行。在免疫程序期间,可如以下实施例中所描述获得抗体的滴度以确定抗体形成的适当性。
b.单克隆抗体
此外,本发明涵盖单克隆抗体的应用。如本领域中已知,术语“单克隆抗体”(或mAb)是指自基本上均质性抗体的群体(即组成该群体的个别抗体除可能少量存在的可能突变(例如天然存在的突变)以外为相同的)获得的抗体。在某些实施方案中,该单克隆抗体包括包含与抗原结合或缔合的多肽序列的抗体,其中抗原结合多肽序列是通过包括自多个多肽序列选择单一目标结合多肽序列的方法获得。
更一般而言且如本文中的实施例6中所例举,单克隆抗体可使用本领域中已知的多种技术制备,已知的多种技术包括杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、转基因动物(例如)或其某些组合。例如,单克隆抗体可使用杂交瘤及本领域中公认的生物化学及遗传改造技术产生,诸如以下文献中更详细地描述的,其均通过引用整体并入本文中:An,Zhigiang(编)TherapeuticMonoclonalAntibodies:FromBenchtoClinic,JohnWiley和Sons,第1版2009;Shire等人(编)CurrentTrendsinMonoclonalAntibodyDevelopmentandManufacturing,SpringerScience+BusinessMediaLLC,第1版2010;Harlow等人,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,第2版1988;Hammerling等人,in:MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas563-681(Elsevier,N.Y.,1981)。应理解,可进一步改变所选结合序列例如以改良对目标的亲和力、人源化目标结合序列、改良其在细胞培养物中的产量、降低其体内免疫原性、产生多特异性抗体等,且包含经改变的目标结合序列的抗体亦为本发明的抗体。
c.嵌合抗体
在另一实施方案中,本发明的抗体可包含来源于共价接合蛋白质区段的嵌合抗体,所述共价接合蛋白质区段是来自至少两个不同物种或类型的抗体。如本领域中已知,术语“嵌合”抗体涉及关于满足以下条件的构建体:其中一部分重链及/或轻链与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及所述抗体的片段中的相应序列相同或同源,只要它们展现出期望的生物学活性即可(U.S.P.N.4,816,567;Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。
在一个实施方案中,根据本文教导的嵌合抗体可包含鼠VH及VL氨基酸序列以及来源于人类来源的恒定区。在其他相容的实施方案,本发明的嵌合抗体可以包含如下文描述的人源化抗体。在一些实施方案中,所谓“CDR移植”抗体,该抗体包含一个或多个来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的CDR,而抗体链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列一致或同源。对于在人类中使用,可将所选啮齿动物CDR移植至人类抗体中,置换人类抗体中一个或多个天然存在的可变区或CDR。这些构建体通常具有提供完全强度调节剂功能(例如CDC(补体依赖性细胞毒性)及ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)等)同时降低个体对抗体的不良免疫应答的优点。
d.人源化抗体
“人源化”抗体与CDR移植抗体类似。如本文中所用,非人类(例如鼠)抗体的“人源化”形式为嵌合抗体,其包含来源于一个或多个非人类免疫球蛋白的氨基酸序列的最小序列。在一个实施方案中,人源化抗体为具有期望的特异性、亲和力和或能力的人免疫球蛋白(受体或接受体抗体),其中来自受体的CDR的残基被置换为来自非人类物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物)的CDR的残基。在某些优选实施方案中,人免疫球蛋白的可变结构域中的一个或多个FR中的残基被置换为来自供体抗体的相应非人类残基,以便帮助保持移植CDR的适当三维构型且由此改良亲和力。此外,人源化抗体可包含未在受体抗体或供体抗体中发现的残基以例如进一步改进抗体效能。
CDR移植和人源化抗体描述于,例如,U.S.P.Ns.6,180,370和5,693,762。人源化抗体任选地也可包括免疫球蛋白Fc(通常是人免疫球蛋白的)的至少一部分。对于进一步详细信息,参见例如Jones等人,Nature321:522-525(1986);和U.S.P.Ns.6982321和7087409。另一种方法被称为“人类工程改造(humaneering)”,其描述于,例如,美国2005/0008625。此外,也可以通过人T细胞表位的特异性缺失或通过WO98/52976和WO00/34317中公开的方法的“去免疫”,修饰非人类抗体。上述各参考文献都以其整体并入本文。
还可以使用常规的分子生物学技术,如分离、操纵和表达编码来自重链或轻链中的至少一个的免疫球蛋白可变区的全部或部分的核酸序列,对人源化抗体进行生物工程改造。除了上面提到的这种核酸的来源,人种系序列是可获得的,如公开于,例如Tomlinson,I.A.等人(1992)J.Mol.Biol.227:776-798;Cook,G.P.等人(1995)Immunol.Today16:237-242;Chothia,D.等人(1992)J.Mol.Biol.227:799-817;及Tomlinson等人(1995)EMBOJ14:4628-4638。V-BASE目录(VBASE2-Retter等人,NucleicAcidRes.33;671-674,2005)提供人免疫球蛋白可变区序列的综合性目录(由Tomlinson,I.A.等人编译,MRCCentreforProteinEngineering,Cambridge,UK);也可以使用共有人FR,例如,如U.S.P.N.6,300,064中所描述。
在所选实施方案中且如以下实施例8中详述,至少60%、65%、70%、75%或80%的人源化抗体重链或轻链可变区氨基酸残基将与受体FR和CDR序列的重链或轻链可变区氨基酸残基相对应。在其他实施方案中,至少85%或90%人源化抗体可变区残基将与受体FR和CDR序列的可变区残基相对应。在另一优选实施方案中,超过95%的人源化抗体可变区残基将与受体FR和CDR序列的可变区残基相对应。
e.人类抗体
在另一实施方案中,抗体可包含完全人类抗体。术语“人类抗体”是指具有与由人类产生及/或使用任一种用于产生人类抗体的技术产生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。
人类抗体可使用本领域中已知的各种技术产生。一种技术为噬菌体展示,其中在噬菌体上合成(优选人类)抗体的文库,用相关抗原或其抗体结合部分筛选文库,且分离结合抗原的噬菌体,由此可获得免疫反应性片段。用于制备及筛选所述文库的方法在本领域中是公知的,且用于产生噬菌体展示文库的试剂盒是可商购的(例如Pharmacia重组型噬菌体抗体***,目录号27-9400-01;及StratageneSurfZAPTM噬菌体展示试剂盒,目录号240612)。亦存在其他可用于产生及筛选抗体呈现文库的方法及试剂(参见例如U.S.P.N.5,223,409;PCT公开第WO92/18619号、第WO91/17271号、第WO92/20791号、第WO92/15679号、第WO93/01288号、第WO92/01047号、第WO92/09690号;及Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7978-7982(1991))。
在一个实施方案中,可通过筛选如上制备的重组型组合抗体文库来分离重组型人类抗体。在一个实施方案中,文库为scFv噬菌体展示文库,其是使用人类VL及VHcDNA产生,所述人类VL及VHcDNA是由自B细胞分离的mRNA制备。
由未经处理的文库(天然或合成)产生的抗体可具有中等亲和力(Ka为约106至107M-1),但如本领域中所描述,亲和力成熟亦可通过自二级文库构筑及重新选择来体外模仿。例如,可通过使用易错聚合酶体外随机引入突变(Leung等人,Technique,1:11-15(1989)中报道)。此外,可通过例如用具有跨越所关注的CDR的随机序列的引物的PCR在所选个别Fv克隆中使一个或多个CDR随机突变且筛选较高亲和力克隆来进行亲和力成熟。WO9607754描述用于诱导免疫球蛋白轻链的CDR中的诱发突变以产生轻链基因的文库的方法。另一有效方法是将通过噬菌体展示所选择的VH结构域或VL结构域与获自未免疫供者的天然存在V结构域变体谱系重组且在若干轮链改组中针对较高亲和力进行筛选,如Marks等人,Biotechnol.,10:779-783(1992)所述。此技术允许产生解离常数KD(koff/kon)为约10-9M或更小的抗体及抗体片段。
在其他实施方案中,可使用包含在表面上表达结合对的真核细胞(例如酵母)的文库来使用类似程序。参见例如U.S.P.N.7,700,302及U.S.S.N.12/404,059。在一个实施方案中,人类抗体是选自噬菌体文库,其中该噬菌体文库表达人类抗体(Vaughan等人NatureBiotechnology14:309-314(1996);Sheets等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:6157-6162(1998))。在其他实施方案中,人类结合对可自诸如酵母的真核细胞中所产生的组合性抗体文库分离。参见例如U.S.P.N.7,700,302。所述技术有利地允许筛选大量候选调节剂且可相对容易地操作候选序列(例如通过亲和力成熟或重组型改组)。
人类抗体亦可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如小鼠)中来产生,所述转基因动物中的内源免疫球蛋白基因已部分或完全失活且已引入人免疫球蛋白基因。在攻击时,观察人类抗体产生,其在各方面均密切地类似于人类中所见,包括基因重排、组装及抗体谱系。此方法描述于例如与技术有关的U.S.P.N.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016以及U.S.P.N.6,075,181及6,150,584;以及Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)中。或者,人类抗体可经由使产生针对目标抗原的抗体的人类B淋巴细胞(所述B淋巴细胞可自罹患肿瘤性疾病的个体回收或可在体外进行免疫)永生化来制备。参见例如Cole等人,MonoclonalAntibodies和CancerTherapy,AlanR.Liss,第77页(1985);Boerner等人,J.Immunol,147(l):86-95(1991);及U.S.P.N.5,750,373。
3.进一步加工
针对所需特征,包括,例如,稳健生长、高抗体产生和,如下面更详细讨论,理想的抗体特征,可以选择、克隆和进一步筛选调节剂产生细胞(例如,杂交瘤,酵母菌落等)(无论是怎样获得的)。可以在体内在同系动物,缺乏免疫***的动物,例如裸小鼠,或在体外细胞培养物中,扩增杂交瘤。选择、克隆和扩增杂交瘤和/或集落的方法,其各自产生离散抗体种类,是本领域普通技术人员公知的。
B.重组调节剂生产
1.概述
一旦完善来源,就可以使用常规方法(例如通过使用寡核苷酸探针,其能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因)容易地分离编码所需SEZ6调节剂的DNA并对其进行测序。如果调节剂是抗体,则分离和亚克隆的杂交瘤细胞(或噬菌体或酵母来源的集落)可以充当这种DNA的优选来源。如果需要的话,可进一步如本文所述操作核酸,以生成试剂,其包括融合蛋白,或嵌合的、人源化或全人抗体。更具体地,分离的DNA(其可以被修饰)可用于克隆用于制造抗体的恒定和可变区序列。
因此,在示例性实施方案中,可使用常规方法(诸如Al-Rubeai;An,andShire等人所有同上,和SambrookJ.&RussellD.MolecularCloning:ALaboratoryManual,第三版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2000);Ausubel等人,ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley,John&Sons,Inc.(2002)中阐述的那些)重组产生抗体,在所述方法中,分离和亚克隆的杂交瘤细胞(或噬菌体或酵母来源的集落)充当核酸分子的优选来源。
如本文所用的术语“核酸分子”,意欲包括DNA分子和RNA分子和它们的人工变体(例如,肽核酸),无论是单链还是双链的。核酸可以编码本发明的抗体的一条或两条链,或其片段或衍生物。本发明的核酸分子也包括足以用作杂交探针的多核苷酸,用于鉴定、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸的PCR引物或测序引物;用于抑制多核苷酸的表达的反义核酸,以及互补序列。核酸可以是任何长度。它们可以是,例如,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,75,100,125,150,175,200,250,300,350,400,450,500,750,1000,1500,3000,5000或更多个核苷酸的长度,和/或可以包含一个或多个另外的序列,例如调节序列,和/或作为更大核酸(例如,载体)的一部分。应当理解,这样的核酸序列可以进一步操作以生成调节剂,包括嵌合的、人源化或完全人抗体。更具体地,分离的核酸分子(其可以被修饰)可用于克隆用于制造抗体的恒定和可变区序列,如U.S.P.N.7709611中所描述。
术语“分离的核酸”意指,该核酸是(i)例如,通过聚合酶链反应(PCR)在体外扩增,(ii)通过克隆重组产生的,(ⅲ)例如通过切割和凝胶-电泳分级分离纯化的,或(iv)例如通过化学合成合成的。分离的核酸是核酸,其可用于通过重组DNA技术操作。
无论编码抗体的所需的免疫反应部分的核酸的来源是否获自或衍生自噬菌体展示技术、酵母文库、基于杂交瘤的技术或合成获得或衍生,可以理解的是,本发明包括编码该抗体或其抗原结合片段或衍生物的核酸分子和序列。此外,本发明涉及包含这样的核酸分子的载体和宿主细胞。
一旦获得编码VH及VL区段的DNA片段,所述DNA片段可进一步通过标准重组DNA技术操作,例如以使所述可变区基因转化为全长抗体链基因,转化为Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中,使编码VL或VH的DNA片段可操作地连接至编码另一蛋白质的另一DNA片段,诸如抗体恒定区或柔性连接体。如上下文中所用的术语“可操作地连接”意指接合所述两个DNA片段以便使由两个DNA片段编码的氨基酸序列在框架中保留。
可通过将编码VH的DNA可操作地连接至另一编码重链恒定区(CH1、CH2及CH3)的DNA分子而将编码VH区的经分离DNA转化为全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列在本领域中已知(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版号91-3242)且涵盖所述区域的DNA片段可由标准PCR扩增获得。重链恒定区可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区,但最优选为IgG1或IgG4恒定区。如下文更详细论述,与本文中的教导相容的示例性IgG1恒定区作为SEQIDNO:6阐述于随附序列表中。对于Fab片段重链基因而言,可将编码VH的DNA可操作性连接至另一仅编码重链CH1恒定区的DNA分子。
可通过使VL编码DNA与编码轻链恒定区(CL)的另一DNA分子可操作地连接,将编码VL区的经分离DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列在本领域中已知(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版号91-3242)且涵盖这些区域的DNA片段可由标准PCR扩增获得。轻链恒定区可为κ或λ恒定区,但最优选为κ恒定区。在此方面,示例性相容κ轻链恒定区作为SEQIDNO:404阐述于随附序列表中。
2.杂交和序列同一性
正如所指出,本发明进一步提供了在特定杂交条件下与其他核酸杂交的核酸。更具体地,本发明包括,在中度或高度严格杂交条件下(例如,如下面所定义)与本发明的核酸分子杂交的核酸分子。用于杂交核酸的方法是本领域中公知的。如公知,中等严格杂交条件包括,含有5倍氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5%SDS、1.0mMEDTA(pH8.0)的预洗涤溶液,约50%甲酰胺、6×SSC的杂交缓冲液,和55℃的杂交温度(或其他类似的杂交溶液,例如含有大约50%甲酰胺的杂交溶液,并且杂交温度为42℃),在0.5xSSC,0.1%SDS中60℃的洗涤条件。通过比较,在高度严格杂交条件下的杂交包括在45℃用6×SSC洗涤,随后在68℃以0.1×SSC,0.2%SDS洗涤一次或多次。此外,本领域技术人员可以操作杂交和/或洗涤条件,以提高或降低杂交的严格性,使得包含彼此至少65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%或99%相同的核苷酸序列的核酸通常保持彼此杂交。
本发明还包括与所描述的核酸分子“基本上相同的”核酸分子。在一个实施方案中,在核酸序列方面,术语“基本上相同的”的含义可以被理解为表现出至少约65%,70%,75%,80%,85%,或90%序列同一性的核酸分子的序列。在其他实施方案中,核酸分子表现出与参考核酸序列的95%或98%序列同一性。
影响杂交条件的选择的基本参数和制定合适条件的指导阐述于,例如,Sambrook,Fritsch,和Maniatis(1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,第9和11章;和CurrentProtocolsinMolecularBiology,1995,Ausubel等人,编辑,JohnWiley&Sons,Inc.,章节2.10和6.3-6.4),并且可以由本领域普通技术人员基于例如,核酸的长度和/或碱基组成容易地确定。
通常使用序列分析软件测定多肽的序列相似性(其也被称为序列同一性)。蛋白质分析软件使用指定给各种置换、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸置换)的相似性的量度来匹配相似序列。例如,序列分析工具GCG(AccelrysSoftwareInc.)含有程序诸如“GAP”和“BEST-FIT”,其可以以缺省参数用于确定密切相关的多肽(诸如来自不同物种或生物体的同源多肽)之间或野生型蛋白和它们的突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。(参见,例如,GCG6.1版或Durbin等人,BiologicalSequenceAnalysis:Probabilisticmodelsofproteinsandnucleicacids.,CambridgePress(1998))。
也可以使用采用缺省或推荐参数的FASTA(GCG6.1版中的程序)比较多肽序列。FASTA(例如,FASTA2和FASTA3)提供了查询和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性(Pearson(2000)同上)。当将本发明的序列与包含大量来自不同生物体的序列的数据库进行比较时,另一个优选的算法是计算机程序BLAST,特别是blastp或tblastn,其使用缺省参数。参见,例如,AltsCHul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403410和Altschul等人(1997)NucleicAcidsRes.25:3389402,其各自通过引用并入本文。
在这方面,本发明也包括核酸分子,其编码在抗体可变区多肽序列(例如,供体轻链或重链可变区,受体轻链或重链可变区或所得人源化构建体)方面是“基本上相同的”多肽。当用于这样的多肽时,术语“实质性同一性”或“基本上相同”意指,两个肽序列,当诸如通过使用缺省空位权重的程序GAP或BEST-FIT进行最佳比对时,共有至少60%或65%序列同一性,优选至少70%、75%、80%、85%或90%序列同一性,甚至更优选至少93%、95%、98%或99%序列同一性。优选地,不相同的残基位置因保守氨基酸置换而不同。“保守性氨基酸置换”是其中氨基酸残基被置换为具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的具有侧链(R基团)的另一氨基酸残基。一般而言,保守性氨基酸置换将实质上不改变蛋白的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列的保守性置换彼此不同的情况下,可上调序列同一性百分比或相似度以校正置换的保守性质。
3.表达
重组表达,即,RNA或RNA和蛋白质/肽的生产,的不同方法是公知的,如阐述于例如:Berger和KimmelGuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymology第152卷,AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif.;Sambrook等人,MolecularCloning-ALaboratoryManual(第三版),1-3卷,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborN.Y.,(2000);CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubel等人,编,CurrentProtocols,ajointventurebetweenGreenePublishingAssociates,Inc.andJohnWiley&Sons,Inc.(2006年的增刊)。
某些感兴趣的方面包括“表达控制序列”,其包括启动子,核糖体结合位点,增强子和调节基因的转录或mRNA的翻译的其他控制元件。如众所周知,“启动子”或“启动子区域”涉及核酸序列,所述核酸序列通常位于所表达的核酸序列的上游(5')并且通过为RNA-聚合酶提供识别和结合位点而控制序列的表达。
根据本发明相容的示例性启动子包括,SP6、T3和T7聚合酶的启动子,人U6RNA启动子,CMV启动子,和其人工杂合启动子(例如CMV),其中一部分或多部分被融合至其他细胞蛋白质诸如例如人GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的基因的启动子的一部分或多部分,并且包括或不包括一个或多个额外的内含子。
在某些实施方案中,核酸分子当适当时可以与控制核酸的表达的启动子一起存在于载体中。众所周知的术语“载体”包括用于核酸的任何中间载体,其使所述核酸,例如,引入原核和/或真核细胞,并且在适当时被整合到基因组中。转化哺乳动物细胞的方法在本领域中是公知的。参见,例如,U.S.P.Ns.4,399,216,4912040,4740461,和4959455。所述载体可包括编码本发明抗体(例如,完整抗体,抗体的重链或轻链,抗体的VH或VL,或其部分,或重链或轻链CDR,单链Fv,或其片段或其变体)的核苷酸序列,其可操作地连接到启动子(参见,例如,PCT公开WO86/05807;PCT公开WO89/01036;和U.S.P.N.5,122,464)。
各种宿主-表达载体***是可商购的,且许多与本文的教导相容,并且可以用来表达本发明的调节剂。这种表达***包括,但不限于,用含有调节剂编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物,诸如细菌(例如大肠杆菌(E.coli),枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或链霉菌属(streptomyces));用含有调节剂编码序列的重组酵母表达载体转染的酵母(例如酵母属(Saccharomyces),毕赤酵母属(Pichia));用含有调节剂编码序列的重组病毒表达载体(例如,杆状病毒)感染的昆虫细胞***;用含有调节剂编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒;烟草花叶病毒)感染或用含有调节剂编码序列的重组质粒表达载体(例如,Ti质粒)感染的植物细胞***(例如,烟草,拟南芥属,浮萍,玉米,小麦,马铃薯等);或哺乳动物细胞***(例如COS、CHO、BHK、293、3T3细胞),其包含重组表达构建体,所述重组表达构建体含有来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如,金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子;痘苗病毒7.5K启动子)。
如本文所用,术语“宿主细胞”涵盖任何类型的可经工程改造以产生本发明的多肽和抗原结合分子的细胞***。在一个实施方案中,所述宿主细胞被工程改造以允许生产具有修饰的糖形的抗原结合分子。在优选的实施方案中,抗原结合分子或变体抗原结合分子是抗体、抗体片段或融合蛋白。在某些实施方案中,所述宿主细胞已进一步操作以表达增加水平的具有N-乙酰葡萄胺基转移酶III(GnTI11)活性的一种或多种多肽。相容的宿主细胞包括培养的细胞,例如哺乳动物培养的细胞,诸如CHO细胞,BHK细胞,NSO细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞,酵母细胞,昆虫细胞和植物细胞,仅举几个,而且包括转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。
为以长期高产率产生重组蛋白质,稳定表达为优选。因此,稳定表达所选调节剂的细胞系可使用本领域中认可的标准技术改造。宿主细胞可经受适当表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)调控的DNA及可选标记物转化,而非使用含有病毒复制起点的表达载体。可使用本领域中公知的任一种选择***,包括谷氨酰胺合酶基因表达***(GS***),其提供用于在某些条件下增强表达的有效方法。完全或部分结合EP专利0216846、0256055、0323997及0338841以及U.S.P.N.5,591,639及U.S.P.N.5,879,936论述GS***,前述文献各自通过引用并入本文。另一种优选的表达***FreedomTMCHO-S试剂盒由LifeTechnologies在商业上提供(目录号A13696-01),其也允许用于开发可用于调节剂生产的稳定细胞系。
这样的宿主表达***代表载体(通过所述载体,可以产生并随后纯化感兴趣的编码序列),而且还代表细胞,所述细胞,当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时,可以原位表达本发明的分子。可以用本发明的两种表达载体共转染宿主细胞,所述两种表达载体例如,编码重链衍生的多肽的第一载体和编码轻链衍生的多肽的第二载体。
因此,在某些实施方案中,本发明提供了重组宿主细胞,其允许抗体或其部分的表达。通过在这样的重组宿主细胞中的表达产生的抗体在本文中被称作重组抗体。本发明还提供了这样的宿主细胞的子代细胞,和由前述细胞产生的抗体。
C.化学合成
此外,可以使用本领域中已知的技术化学合成所述调节剂(例如,参见Creighton,1983,Proteins:StructuresandMolecularPrinciples,W.H.Freeman&Co.,N.Y.,和Hunkapiller,M.,等人,1984,Nature310:105-111)。此外,如果需要,可以引入非经典氨基酸或化学氨基酸类似物(诸如常见氨基酸2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸等的D-异构体)作为对多肽序列的置换或添加。
D.转基因***
在其他实施方案中,可以通过哺乳动物或植物的生成而转基因地产生调节剂,所述哺乳动物或植物对于重组分子(诸如免疫球蛋白重和轻链序列)是转基因的,且产生可回收形式的所需化合物。这包括,例如,在山羊、奶牛或其他哺乳动物的乳中生产蛋白调节剂(例如,抗体)且从其中回收。参见,例如,U.S.P.N.5827690,5756687,5750172,和5741957。在一些实施方案中,对包含人免疫球蛋白基因座的非人转基因动物进行免疫,以产生抗体。
其他转基因技术阐述于:Hogan等人ManipulatingtheMouseEmbryo:ALaboratoryManual第二版,ColdSpringHarborPress(1999);Jackson等人,MouseGeneticsandTransgenics:APracticalApproach,OxfordUniversityPress(2000);andPinkert,TransgenicAnimalTechnology:ALaboratoryHandbook,AcademicPress(1999)和U.S.P.N.6417429。在一些实施方案中、非人动物是小鼠、大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马,且所需产物在血液、奶、尿、唾液、眼泪、粘液和其他体液中产生,使用本领域公认的纯化技术,从血液、奶、尿、唾液、眼泪、粘液和其他体液可以容易获得所需产物。
其他相容的生产***包括用于在植物中制备抗体的方法,诸如描述于,例如,U.S.P.N.6046037和5959177,针对这种技术将前述文献并入本文。
E.分离/纯化
一旦本发明的调节剂已经通过重组表达或任何其他所公开的技术产生,它就可以通过本领域中已知用于纯化免疫球蛋白或蛋白质的任何方法进行纯化。在这方面,调节剂可以是“分离的”,这意味着它已经被鉴定并且从其天然环境的组分中分离和/或回收。其天然环境的污染性组分是,会干扰多肽的诊断或治疗用途的物质,并且可以包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性的溶质。分离的调节剂包括重组细胞内的原位调节剂,因为所述多肽的天然环境的至少一种组分不会存在。
如果细胞内产生期望的分子,作为第一步骤,可以例如通过离心或超滤,移除颗粒碎片,宿主细胞或裂解片段。当调节剂被分泌到培养基中时,通常首先使用商购可得的蛋白质浓缩滤器,例如,Amicon或Pellicon超滤单元(Millipore公司),浓缩来自这种表达***的上清液。一旦除去不溶性污染物,就可以使用标准技术(诸如,例如,羟基磷灰石色谱法,凝胶电泳,透析和亲和色谱法,特别感兴趣的是亲和色谱法)进一步纯化调节剂制备物。在这方面,蛋白A可用于纯化基于人IgG1、IgG2或IgG4重链的抗体(Lindmark等人,JImmunolMeth62:1(1983)),而蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型和用于人IgG3(Guss等人,EMBOJ5:1567(1986))。用于蛋白质纯化的其他技术诸如离子交换柱上的分级分离,乙醇沉淀,反相HPLC,硅胶上的色谱法,肝素上的色谱法,阴离子或阳离子交换树脂(诸如多聚天冬氨酸柱)上的琼脂糖色谱法,色谱聚焦,SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也是可用的,这取决于待回收的抗体。在特别优选的实施方案中,至少部分地使用蛋白A或蛋白G亲和色谱法纯化本发明的调节剂。
VI.SEZ6调节剂片段和衍生物
无论选择何种生成和生产方法,本发明的调节剂将与目标决定簇(例如,抗原)反应,结合,组合,复合,连接,附着,接合,相互作用或以其他方式缔合,从而提供所期望的结果。当调节剂包含抗体或其片段、构建体或衍生物时,这种缔合可以通过抗体上表达的一个或多个“结合位点”或“结合组分”,其中结合位点包含多肽的区域,所述多肽的区域负责选择性结合感兴趣的目标分子或抗原。结合结构域包含至少一个结合位点(例如,完整的IgG抗体将具有两个结合结构域和两个结合位点)。示例性结合结构域包括,抗体可变结构域,配体的受体结合结构域,受体的配体结合结构域或酶促结构域。
A.抗体
如上所指出,术语“抗体”意欲至少涵盖,多无性繁殖系抗体,多克隆抗体,嵌合抗体,CDR移植的抗体,人源化和灵长化抗体,人抗体,重组产生的抗体,胞内抗体,多特异性抗体,双特异性抗体,单价抗体,多价抗体,抗独特型抗体,以及合成抗体。
B.片段
无论选择何种形式的调节剂(例如嵌合、人源化等)实践本发明,应了解,均可根据本文中的教导使用其免疫反应性片段。“抗体片段”包含完整抗体的至少一部分。如本文中所用,术语抗体分子的“片段”包括抗体的抗原结合片段,且术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段,其免疫特异性结合所选抗原或其免疫原性决定簇或与所选抗原或其免疫原性决定簇反应或与衍生所述片段的完整抗体竞争结合特异性抗原。
示例性片段包括:VL、VH、scFv、F(ab')2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体片段、双功能抗体、线性抗体、单链抗体分子及由抗体片段形成的多特异性抗体。此外,活性片段包含一部分抗体,该部分抗体保留其与抗原/底物或受体相互作用且以与完整抗体类似的方式(尽管效率可能稍微较低)修饰抗原/底物或受体的能力。
在其他实施方案中,抗体片段为包含Fc区域且保留当以完整抗体形式存在时通常与Fc区域相关联的生物功能(诸如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能及补体结合)中的至少一种的片段。在一个实施方案中,抗体片段为单价抗体,其具有与完整抗体实质上类似的体内半衰期。例如,该抗体片段可包含连接至能够赋予片段体内稳定性的Fc序列的抗原结合臂。
如本领域技术人员将公认,可经由完整或完全抗体或抗体链的化学或酶促处理(诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)或通过重组型方法获得片段。关于抗体片段的更详细描述,参见例如FundamentalImmunology,W.E.Paul编,RavenPress,N.Y.(1999)。
C.衍生物
本发明进一步包括含有一种或多种修饰的免疫反应调节剂衍生物和抗原结合分子。
1.多价抗体
在一个实施方案中,本发明的调节剂可为单价或多价(例如二价、三价等)。如本文中所用,术语“效价”是指与抗体相关联的潜在目标结合位点的数目。各目标结合位点特异性结合一个目标分子或目标分子上的特定位置或基因座。当抗体为单价时,分子的各结合位点将特异性缀合于单一抗原位置或表位。当抗体包含一个以上目标结合位点(多价)时,各目标结合位点可特异性结合相同或不同分子(例如可结合于不同配体或不同抗原,或相同抗原上的不同表位或位置)。参见例如U.S.P.N.2009/0130105。在各种情况下,至少一个结合位点将包含与SEZ6同工型相关联的表位、基序或结构域。
在一个实施方案中,调节剂为双特异性抗体,其中两个链具有不同特异性,如Millstein等人,1983,Nature,305:537-539中所描述。其他实施方案包括具有其他特异性的抗体,诸如三特异性抗体。其他更复杂的相容多特异性构建体及其制造方法阐述于U.S.P.N.2009/0155255以及WO94/04690;Suresh等人,1986,MethodsinEnzymology,121:210;及WO96/27011中。
如上文所提及,多价抗体可免疫特异性结合于期望的目标分子的不同表位,或可免疫特异性结合于目标分子以及异源表位,诸如异源多肽或固体支持物质。尽管抗-SEZ6抗体的优选实施方案仅结合两种抗原(即双特异性抗体),但本发明亦涵盖具有其他特异性的抗体(诸如三特异性抗体)。双特异性抗体亦包括交联或“异缀合物”抗体。例如,异缀合物中的抗体中的一者可与抗生物素蛋白偶联,另一者与生物素偶联。例如,已提出所述抗体使免疫***细胞靶向不需要的细胞(U.S.P.N.4,676,980)及用于治疗HIV感染(WO91/00360、WO92/200373及EP03089)。异缀合物抗体可使用任何便利的交联方法制备。合适交联剂以及多种交联技术在本领域中是公知的,且公开于U.S.P.N.4,676,980中。
在其他实施方案中,使用一般本领域技术人员公知的方法使具有期望的结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列(诸如包含铰链、CH2及/或CH3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定结构域)融合。
2.Fc区修饰
除上文阐述的所公开的调节剂(例如,Fc-SEZ6或抗SEZ6抗体)的可变区或结合区的各种修饰、置换、添加或缺失以外,本领域技术人员应了解,本发明的所选实施方案亦可包含恒定区(即Fc区)的置换或修饰。更具体而言,预期本发明的SEZ6调节剂可尤其含有一种或多种附加的氨基酸残基置换、突变及/或修饰,其产生具有优选特征的化合物,所述特征包括(但不限于):药物动力学改变、血清半衰期延长、结合亲和力增加、免疫原性降低、产量增加、Fc配体与Fc受体(FcR)的结合改变、增强或降低的“ADCC”(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)或“CDC”(补体依赖性细胞毒性)活性、改变的糖基化作用及/或二硫键及经改良的结合特异性。在此方面,应了解,这些Fc变体可有利地用于增强所公开的调节剂的有效抗肿瘤性质。
为此,本发明的某些实施方案可包含Fc区的置换或修饰,例如添加一个或多个氨基酸残基、置换、突变及/或修饰以用于产生具有增强或优选Fc效应子功能的化合物。例如,与Fc结构域与Fc受体(例如FcγRI、FcγRIIA及B、FcγRIII及FcRn)之间的相互作用有关的氨基酸残基的变化可引起细胞毒性增加及/或药物动力学改变,诸如血清半衰期延长(参见例如Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991);Capel等人,Immunomethods4:25-34(1994);及deHaas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995),其均通过引用并入本文中)。
在所选实施方案中,可通过修饰(例如置换、缺失或添加)经鉴别与Fc结构域与FcRn受体之间的相互作用有关的氨基酸残基来产生体内半衰期延长的抗体(参见例如国际公开第WO97/34631号;第WO04/029207号;U.S.P.N.6,737,056及U.S.P.N.2003/0190311)。关于所述实施方案,Fc变体在哺乳动物(优选为人类)中的半衰期可大于5天、大于10天、大于15天、优选大于20天、大于25天、大于30天、大于35天、大于40天、大于45天、大于2个月、大于3个月、大于4个月或大于5个月。半衰期延长可引起较高血清效价,其因此降低抗体的施用频率及/或降低所施用的抗体的浓度。可在例如转基因小鼠或经转染的表达人类FcRn的人类细胞系中,或在施用具有变异型Fc区的多肽的灵长类动物中分析体内人类FcRn高亲和力结合多肽与人类FcRn的结合及人类FcRn高亲和力结合多肽的血清半衰期。WO2000/42072描述与FcRn的结合改良或减少的抗体变体。亦参见例如Shields等人J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
在其他实施方案中,Fc变化可引起ADCC或CDC活性增强或降低。如本领域中已知,CDC是指目标细胞在补体存在下的溶解,且ADCC是指细胞毒性的一种形式,其中结合于某些细胞毒素细胞(例如自然杀手细胞、嗜中性粒细胞及巨噬细胞)上的FcR上的所分泌的Ig使这些细胞毒素效应细胞能够特异性结合于载荷抗原的目标细胞且接着杀死具有细胞毒素的目标细胞。在本发明的情形中,抗体变体具有“改变”的FcR结合亲和力,其与亲本或未经修饰的抗体或包含天然序列FcR的抗体相比为增强或降低的结合。所述显示降低的结合的变体可具有极少或不具有可感知的结合,例如与FcR的结合为天然序列的0-20%,例如由本领域中公知的技术测定。在其他实施方案中,与天然免疫球蛋白Fc结构域相比,变体将呈现增强的结合。应了解,所述类型的Fc变体可有利地用于增强所公开的抗体的有效抗肿瘤性质。在其他实施方案中,所述变化引起结合亲和力增加、免疫原性降低、产量增加、糖基化作用改变及/或二硫键(例如对于缀合点)、改良的结合特异性、吞噬作用增加;及/或细胞表面受体(例如B细胞受体;BCR)的下调等。
3.糖基化作用改变
还有其他实施方案包含一种或多种经改造的糖形,即包含改变的糖基化作用模式或改变的碳水化合物组成的SEZ6调节剂,其共价连接至蛋白质(例如在Fc结构域中)。参见例如Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740。经改造的糖形可适用于多种目的,包括(但不限于)增强或降低效应子功能、增加调节剂对目标的亲和力或促进调节剂产生。在某些需要降低效应子功能的实施方案中,分子可经改造以表达糖基化形式。已公知可引起消除一个或多个可变区框架糖基化作用位点以由此消除该位点处的糖基化作用的置换(参见例如U.S.P.N.5,714,350及6,350,861)。相反,可通过在一个或多个附加糖基化作用位点处进行改造来赋予含有Fc的分子增强的效应子功能或改良的结合。
其他实施方案包括Fc变体,其具有改变的糖基化组成,诸如具有降低的岩藻糖基残基量的次岩藻糖基化抗体或具有增加的平分型GlcNAc结构的抗体。已证明所述改变的糖基化作用模式可增加抗体的ADCC能力。经改造的糖形可由本领域技术人员已知的任何方法产生,例如通过使用经改造或变异型表达品系、通过与一种或多种酶(例如N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTI11))共表达、通过在各种生物体或来自各种生物体的细胞系中表达包含Fc区的分子或通过在包含Fc区的分子经表达后修饰碳水化合物(参见例如WO2012/117002)。
4.其他处理
所述调节剂可在产生期间或产生后经不同修饰,例如通过糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用、酰胺化作用、由已知保护基/封端基团进行的衍生作用、蛋白水解***、与抗体分子或其他细胞配体连接等。多种化学修饰中的任一种均可通过已知技术进行,包括(但不限于)由溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4进行的特异性化学裂解;乙酰化作用;甲酰化作用;氧化;还原;在衣霉素存在下的代谢性合成等。
本发明亦涵盖各种翻译后修饰,所述修饰包括例如N-连接或O-连接的碳水化合物链、N端或C端的处理、化学部分与氨基酸主链的连接、N-连接或O-连接的碳水化合物链的化学修饰以及由原核宿主细胞表达引起的N端甲硫氨酸残基的添加或缺失。此外,调节剂亦可经可检测的标记(诸如酶、荧光、放射性同位素或亲和标记)修饰以允许检测及分离调节剂。
VII.调节剂特征
无论所述调节剂是以何种方式获得或其呈上述哪一种形式,所公开的调节剂的各个实施方案均可呈现某些特征。在所选实施方案中,可针对有利性质来选择、克隆及进一步筛选抗体产生细胞(例如杂交瘤或酵母群落),所述有利性质包括例如稳定生长、高调节剂产量及如下文更详细论述,期望的调节剂特征。在其他情况下,可通过针对动物的接种选择特定抗原(例如特异性SEZ6同工型或其片段)或目标抗原的免疫反应性片段来赋予或影响调节剂的特征。在还有其他实施方案中,所选调节剂可如上文所描述经改造以增强或改进免疫化学特征,诸如亲和力或药物动力学。
A.中和调节剂
在某些实施方案中,该调节剂将包含“中和”抗体或其衍生物或片段。即,本发明可包含抗体分子,其结合特定结构域、基序或表位且能够阻断、降低或抑制SEZ6的生物活性。更一般而言,术语“中和抗体”是指满足以下条件的抗体:其结合于目标分子或配体或与目标分子或配体相互作用且阻止目标分子与结合配偶体(诸如受体或底物)的结合或缔合,由此中断生物反应,否则该生物反应将由分子的相互作用引起。
应了解,可使用本领域中已知的竞争性结合分析法评估抗体或其免疫功能性片段或衍生物的结合及特异性。在本发明中,当过量的抗体使结合于SEZ6的结合配偶体的量降低至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多时(如例如由受损神经营养配体活性或在体外竞争性结合分析法中测量),本发明抗体或片段将保持抑制或降低SEZ6与结合配偶体或底物(例如,神经营养配体)的结合。在例如针对SEZ6的抗体的情况下,中和抗体或拮抗剂将优选使受体活性改变达至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多。应了解,此改良的活性可使用本领域中认可的技术直接测量或可由活性改变对下游的影响(例如肿瘤发生、细胞存活或通路激活)来测量。
B.内化调节剂
尽管证据表明SEZ6或其选定同工型可存在于可溶形式,至少一些SEZ6可能仍然与细胞表面相缔合,从而允许所公开的调节剂的内化。因此,本发明的抗SEZ6抗体可以,至少在一定程度上,由表达SEZ6的细胞内化。例如,结合于肿瘤起始细胞的表面上的SEZ6的抗SEZ6抗体可由肿瘤起始细胞内化。在特别优选的实施方案中,这样的抗SEZ6抗体可与抗癌剂(诸如在内化后杀死细胞的细胞毒性部分)缔合或缀合。在尤其优选实施方案中,所述调节剂将包含内化抗体药物缀合物。
如本文中所用,“内化”调节剂为在与相关抗原或受体结合时由细胞吸收(以及任何有效载荷)的调节剂。如将了解,在优选实施方案中,内化调节剂可包含抗体,其包括包括抗体片段及其衍生物以及抗体缀合物。内化作用可在体外或体内发生。对于治疗性应用,内化作用将优选在有需要的个体中在体内发生。内化的抗体分子的数目可充分或足以杀死表达抗原的细胞,尤其表达抗原的癌症干细胞。根据抗体或抗体缀合物的效能,在一些情况下,细胞中吸收单一抗体分子足以杀死抗体结合的目标细胞。例如,某些毒素的有效性很高,使得少量的与抗体缀合的毒素的分子的内化作用足以杀死肿瘤细胞。可通过本领域中认可的分析法(包括以下实施例(例如,实施例15,17和18)中描述的分析法)确定抗体在与哺乳动物细胞结合时是否内化。检测抗体是否内化于细胞中的方法亦描述于U.S.P.N.7,619,068中,其通过引用整体并入本文中。
C.消耗调节剂
在其他实施方案中,抗体将包含消耗抗体或其衍生物或片段。术语“消耗”抗体是指优选与细胞表面上或附近的抗原结合或缔合且诱导、促进或引起细胞的死亡或消除(例如通过CDC、ADCC或引入细胞毒性剂)的抗体。在一些实施方案中,所选消耗抗体将与细胞毒性剂缔合或缀合。
优选消耗抗体将能够移除、消除或杀死定义细胞群体中的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的表达DLL3的细胞或使定义细胞群体中的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的SEZ6致瘤细胞失能。在一些实施方案中,细胞群体可包含经浓缩、切分、纯化或分离的肿瘤永存细胞。在其他实施方案中,细胞群体可包含完全肿瘤样品或异源肿瘤提取物,其包含肿瘤永存细胞。本领域技术人员应了解,如以下实施例(例如实施例14和15)中所描述的标准生物化学技术可用于根据本文中的教导监测及定量致瘤细胞或肿瘤永存细胞的消耗。
D.分仓及表位作图
应进一步了解,所公开的抗SEZ6抗体调节剂将与由所选目标或其片段呈现的离散表位或免疫原性决定簇缔合或结合。在某些实施方案中,表位或免疫原性决定簇包括分子的化学活性表面分组,诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基,且在某些实施方案中,可具有特定三维结构特征及/或比电荷特征。因此,如本文中所用,术语“表位”包括任何能够特异性结合于免疫球蛋白或T细胞受体或以其他方式与分子相互作用的蛋白质决定簇。在某些实施方案中,当抗体优先识别蛋白质及/或巨分子的复杂混合物中的其目标抗原时,则认为抗体与抗原特异性缀合(或免疫特异性缀合或反应)。在优选实施方案中,当平衡解离常数(KD)小于或等于10-6M或小于或等于10-7M,更优选当平衡解离常数小于或等于10-8M,且甚至更优选当解离常数小于或等于10-9M时,认为抗体与抗原特异性缀合。
更直接的是,术语“表位”是以其常用生物化学含义使用且是指目标抗原中能够由特定抗体调节剂识别及特异性结合的部分。当抗原为多肽(诸如SEZ6)时,表位通常可由邻接氨基酸及由于蛋白质的三级折叠而相邻的非接触氨基酸形成(“构象表位”)。在所述构象表位中,存在跨越蛋白质上氨基酸残基的相互作用点,所述相互作用点彼此线性分离。由邻接氨基酸形成的表位(有时称为“线状”或“连续”表位)通常在蛋白质变性时保留,而由三级折叠形成的表位通常在蛋白质变性时损失。在任何情况下,抗体表位在唯一空间构象中典型地包括至少3个、且更通常至少5个或8-10个氨基酸。
在此方面,应了解,在某些实施方案中,表位可与SEZ6蛋白质的一个或多个区域、结构域或基序(例如成熟同工型1的氨基酸1-906)缔合或驻留于其中。如本文中更详细论述,SEZ6蛋白质的细胞外区域包含一系列通常经识别的结构域,其包括5个Sushi结构域及2个CUB以及N端结构域。为了本发明的目的,术语“结构域”将根据其公认含义使用且将始终指蛋白质内的可识别或可定义的保守性结构实体,其呈现独特的二级结构含量。在许多情况下,具有共同功能的同源结构域将通常展示序列相似性且可在多种不同蛋白质中发现(例如SUSHI结构域据称可在大量不同蛋白质中发现)。类似地,本领域中认可的术语“基序”将根据其常用含义使用且应通常指蛋白质的短的、保守性区域,其典型地具有十至二十个邻接氨基酸残基。如本文中所论述,所选实施方案包含调节剂,其与SEZ6的特定区域、结构域或基序内的表位缔合或结合。
在任何情况下,一旦确定抗原上的期望的表位,则可产生针对该表位的抗体,例如通过使用本发明中描述的技术用包含表位的肽进行免疫。或者,在发现过程期间,抗体的产生及表征可说明与位于特定结构域或基序中的期望的表位有关的信息。由此信息,则可针对与相同表位的结合来以竞争方式筛选出抗体。一种实现此目的的方法为进行竞争研究,从而发现彼此竞争性结合的抗体,即竞争结合抗原的抗体。用于基于抗体的交叉竞争而对抗体进行分仓的高通量过程描述于WO03/48731中。其他分仓或结构域水平或表位定位的方法(包含调节剂竞争或酵母上的抗原片段表达)阐述于以下实施例9和10中。
如本文中所用,术语“分仓(binning)”是指用于基于抗体的抗原结合特征及竞争而将抗体分组或分类的方法。尽管所述技术适用于对本发明的调节剂进行定义及分类,但分仓并非始终与表位直接相关且所述表位结合的初始测定可由本文中所描述的本领域中认可的其他方法改进及证实。然而,如以下实施例中论述及展示,凭经验将抗体调节剂分配至各个仓室可提供可指示所公开的调节剂的治疗潜力的信息。
更具体而言,可使用本领域中已知及本文中的实施例中阐述的方法确定所选参考抗体(或其片段)是否结合于相同表位或交叉竞争结合第二测试抗体(即处于相同仓室)。在一个实施方案中,参考抗体调节剂与SEZ6抗原在饱和条件下缔合,且接着使用标准免疫化学技术测定二级或测试抗体调节剂结合于SEZ6的能力。若测试抗体能够实质上与参考抗-SEZ6抗体同时结合于SEZ6,则与初级或参考抗体相比,二级或测试抗体结合于不同表位。然而,若测试抗体不能实质上同时结合于SEZ6,则测试抗体结合于相同表位、重叠表位或与由初级抗体结合的表位紧邻(至少位阻上)的表位。即,测试抗体就抗原结合进行竞争且与参考抗体处于同一仓室。
当在所公开的调节剂的情形中使用时,术语“竞争”或“竞争抗体”意指抗体之间的竞争,如由其中测试抗体或所测试的免疫功能性片段阻止或抑制参考抗体与共同抗原的特异性缀合的分析法所测定。通常,所述分析法涉及使用经纯化的结合于固体表面或载有这些物质中的任一者的抗原(例如SEZ6或其结构域或片段)、未经标记的测试免疫球蛋白及经标记的参考免疫球蛋白。通过在测试免疫球蛋白存在下测定结合于固体表面或细胞的标记量来测量竞争性抑制。通常,测试免疫球蛋白是以过量存在及/或允许首先结合。由竞争分析法鉴别的抗体(竞争抗体)包括与参考抗体结合于同一抗体表位的抗体,及与由参考抗体结合的抗体表位足够近的相邻抗体表位结合从而发生位阻的抗体。关于测定竞争性结合的方法的其他细节提供于本文实施例中。通常,当竞争抗体以过量存在时,其将抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合达至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些实施例中,结合受抑制达至少80%、85%、90%、95%或97%或更多。
相反,当参考抗体被结合时,其优选抑制随后添加的测试抗体(即SEZ6调节剂)的结合达至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些实施例中,测试抗体的结合受抑制达至少80%、85%、90%、95%或97%或更多。
在本发明中且如以下实施例9和10中所阐述,已测定(经由表面等离振子共振或生物层干涉测量术)SEZ6的细胞外结构域由竞争性结合定义至少7个仓室,其在本文中被称为“仓室A”至“仓室F”和仓室U。
在此方面,且如本领域中已知及以下实施例中详细描述,期望的分仓或竞争性结合数据可使用以下获得:固相直接或间接放射免疫分析法(RIA)、固相直接或间接酶免疫分析法(EIA或ELISA)、夹心竞争分析法、BiacoreTM2000***(即表面等离振子共振-GEHealthcare)、Analyzer(即生物层干涉测量术-ForteBio,Inc.)或流动式细胞测量方法。如本文中所用的术语“表面等离振子共振”是指允许通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度的变化来分析即时特定相互作用的光学现象。术语“生物层干涉测量术”是指光学分析技术,其分析自两个表面反射的白光的干涉图案:生物传感器尖端上固定的蛋白质的层,及内部参考层。结合于生物传感器尖端的分子数目的任何变化均引起干涉图案偏移,该偏移可即时测量。在尤其优选实施方案中,分析(无论表面等离振子共振、生物层干涉测量术或流动式细胞测量术)是使用Biacore或ForteBio器具或流式细胞仪(例如FACSAriaII)进行,如以下实施例中说明。
为了进一步表征与所公开的SEZ6抗体调节剂缔合或结合的表位,使用由Cochran等人(JImmunolMethods.287(1-2):147-158(2004)(其通过引用并入本文中)描述的方案的改良版本进行结构域水平表位作图。简言之,SEZ6中包含特定氨基酸序列的个别结构域表达于酵母表面上且经由流动式细胞测量术测定与各SEZ6抗体的结合。结果论述于以下实施例10中且展示于图14A和14B中。
其他相容表位定位技术包括丙氨酸扫描突变体、肽印迹法(Reineke(2004)MethodsMolBiol248:443-63)(本文中特定地通过引用整体并入)或肽裂解分析。此外,可使用诸如表位切除、表位提取及抗原的化学修饰的方法(Tomer(2000)ProteinScience9:487-496)(本文中特定地通过引用整体并入)。在其他实施方案中,修饰辅助探测(Modification-AssistedProfiling;MAP),亦称为基于抗原结构的抗体探测(AntigenStructure-basedAntibodyProfiling;ASAP)提供根据各抗体与经化学或酶促修饰的抗原表面的结合概况的相似性来将大量针对相同抗原的单克隆抗体(mAb)归类的方法(U.S.P.N.2004/0101920,其特定地通过引用整体并入本文中)。各类别可反映独特表位,其与由另一类别表示的表位明显不同或部分重叠。此技术允许快速过滤遗传一致抗体,使得表征可集中于遗传相异抗体。应了解,MAP可用于将本发明的hSEZ6抗体调节剂分选至结合不同表位的抗体群。
可用于改变固定的抗原的结构的试剂包括酶,诸如蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、胞内蛋白酶Glu-C、胞内蛋白酶Asp-N、胰凝乳蛋白酶等)。适用于改变固定的抗原的结构的试剂亦可为化学试剂,诸如丁二酰亚氨基酯及其衍生物、含有一级胺的化合物、肼及碳肼、游离氨基酸等。
抗原蛋白质可固定在生物传感器芯片表面或聚苯乙烯珠上。后者可经例如分析法处理,该分析法为诸如多工LUMINEXTM检测分析法(LuminexCorp.)。由于LUMINEX用至多100种不同类型的珠操作多工分析的能力,LUMINEX提供几乎无限的具有各种修饰的抗原表面,引起生物传感器分析法中抗体表位探测的改良的解析。
E.调节剂结合特征
除了表位特异性以外,所公开的抗体可使用物理特征(诸如结合亲和力)表征。在此方面,本发明进一步涵盖抗体的用途,所述抗体对一种或多种SEZ6同工型或在泛抗体情况下,对SEZ6家族中一个以上成员具有高结合亲和力。
如本文中所用,术语“KD”意指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。据称本发明的抗体在解离常数KD(koff/kon)≤10-7M时免疫特异性缀合其目标抗原。当KD≤5×10-9M时,抗体以高亲和力特异性结合抗原,且当KD≤5×10-10M时,以极高亲和力特异性结合抗原。在本发明的一个实施方案中,抗体的KD≤10-9M且解离速率为约1×10-4/秒。在本发明的一个实施方案中,解离速率<1×10-5/秒。在本发明的其他实施方案中,抗体将以介于约10-7M与10-10M之间的KD结合于SEZ6,且在另一实施方案中,其将以KD≤2×10-10M结合。本发明的其他所选实施方案包含解离常数或KD(koff/kon)满足以下条件的抗体:小于10-2M、小于5×10-2M、小于10-3M、小于5×10-3M、小于10-4M、小于5×10-4M、小于10-5M、小于5×10-5M、小于10-6M、小于5×10-6M、小于10-7M、小于5×10-7M、小于10-8M、小于5×10-8M、小于10-9M、小于5×10-9M、小于10-10M、小于5×10-10M、小于10-11M、小于5×10-11M、小于10-12M、小于5×10-12M、小于10-13M、小于5×10-13M、小于10-14M、小于5×10-14M、小于10-15M或小于5×10-15M。
在特定实施方案中,免疫特异性结合于SEZ6的本发明的抗体的缔合速率常数或kon(或ka)速率(SEZ6(Ab)+抗原(Ag)k on←Ab-Ag)为至少105M-ls-l、至少2×105M-ls-l、至少5×105M-ls-l、至少106M-ls-l、至少5×106M-ls-l、至少107M-ls-l、至少5×107M-ls-l或至少108M-ls-l。
在另一实施方案中,免疫特异性结合于SEZ6的本发明的抗体的解离速率常数或koff(或kd)速率(SEZ6(Ab)+抗原(Ag)k off←Ab-Ag)小于10-ls-1、小于5×10-ls-1、小于10-2s-1、小于5×10-2s-l、小于10-3s-1、小于5×10-3s-1、小于10-4s-1、小于5×10-4s-1、小于10-5s-1、小于5×10-5s-1、小于10-6s-1、小于5×10-6s-1、小于10-7s-1、小于5×10-7s-1、小于10-8s-1、小于5×10-8s-1、小于10-9s-1、小于5×10-9s-1或小于10-10s-l。
在本发明的其他所选实施方案中,抗-SEZ6抗体的亲合力常数或Ka(kon/koff)为至少102M-1、至少5×102M-1、至少103M-1、至少5×103M-1、至少104M-1、至少5×104M-1、至少105M-1、至少5×105M-1、至少106M-1、至少5×106M-1、至少107M-1、至少5×107M-1、至少108M-1、至少5×108M-1、至少109M-1、至少5×109M-1、至少1010M-1、至少5×1010M-1、至少1011M-1、至少5×1011M-1、至少1012M-1、至少5×1012M-1、至少1013M-1、至少5×1013M-1、至少1014M-1、至少5×1014M-1、至少1015M-1或至少5×1015M-1。
除上述调节剂特征以外,本发明的抗体可使用其他物理特征进一步表征,包括例如热稳定性(即熔融温度;Tm)及等电点(参见例如Bjellqvist等人,1993,Electrophoresis14:1023;Vermeer等人,2000,Biophys.J.78:394-404;Vermeer等人,2000,Biophys.J.79:2150-2154,其各自通过引用并入)。
VII.缀合的调节剂
A.概述
一旦已经根据本文的教导生成和/或制造和选择本发明的调节剂,则它们可与药物活性剂或诊断结构部分、治疗结构部分或生物相容的改性剂相连接、融合、缀合(例如,共价或非共价)或以其他方式相缔合。本发明的调节剂(例如抗体)可以直接或间接缀合到治疗结构部分。当在不使用连接抗体至治疗性结构部分或其他结构部分的连接体(连接体将在下面更详细描述)的情况下、这种抗体与这些结构部分相缔合、连接或融合时,抗体“直接缀合”到治疗结构部分或其他结构部分,例如,报道分子。当使用将抗体连接到治疗结构部分或其他结构部分(例如,报道分子)的连接体将抗体与这样结构部分相缔合、连接或融合时,抗体“间接缀合”至治疗结构部分或其他结构部分(例如,报道分子)。如本文所用的术语“缀合物”或“调节剂缀合物”或“抗体缀合物”将广义地使用,并保持为意指,与所公开的调节剂缔合的任何生物活性剂或可检测分子或药物,而无论缔合的方法如何。在这方面,可以理解的是,这样的缀合物可以,除了所公开的调节剂,包括肽,多肽,蛋白,在体内代谢为活性剂的前体药物,聚合物,核酸分子,小分子,结合剂,模拟物剂,合成药物,无机分子,有机分子和放射性同位素。此外,如上面所指示,所选择的缀合物可以与调节剂共价或非共价缔合或连接,且显示多种化学计量摩尔比,这取决于,至少部分地取决于用于实现缀合的方法。
本发明的特别优选的方面将包括可用于增殖性病症的诊断和/或治疗的抗体调节剂缀合物或抗体-药物缀合物。应当理解的是,除非上下文另有规定,术语“抗体-药物缀合物”或“ADC”或式M-[L-D]n应保持包括包含治疗和诊断结构部分两者的缀合物。在这样的实施方案中,抗体-药物缀合物化合物将包括SEZ6调节剂(典型的是抗SEZ6抗体)作为调节剂或细胞结合单元(本文缩写为CBA,M或Ab)中,治疗(例如,抗癌剂)或诊断结构部分(D),以及任选的连接体(L),其连接药物和抗原结合剂。对于本公开的目的,“n”应保持为是指从1至20的整数。在一个优选的实施方案中,调节剂是SEZ6mAb,其包含来自如上所述的重链和轻链可变区的至少一个CDR。
本领域技术人员将理解,许多不同的反应可用于治疗或诊断结构部分和/或连接体至结合剂的附着或缔合。在选定的实施方案中,这可以通过所述结合剂(例如,抗体分子)的氨基酸残基的反应来完成,所述氨基酸残基包括赖氨酸的胺基团,谷氨酸和天冬氨酸的游离羧酸基团,半胱氨酸的巯基和芳香族氨基酸的多种结构部分。共价连接的最常用的非特异性方法之一是碳二亚胺反应,其用于连接化合物的羧基(或氨基)基团与抗体的氨基(或羧基)。此外,双官能剂诸如二醛或亚氨酸酯已用于化合物的氨基与抗体分子的氨基酸的连接。也可用于药物与结合剂的连接的是席夫碱反应。此方法涉及包含(乙)二醇或羟基基团的药物的高碘酸盐氧化,从而形成醛,所述醛然后与结合剂反应。通过与结合剂的氨基形成席夫碱,发生连接。异硫氰酸酯和吖内酯也可以用作用于将药物共价连接至结合剂的偶联剂。
在其他实施方案中,本发明所公开的调节剂可以缀合或缔合至赋予选定特征(例如,生物毒素,生物标记物,纯化标签,等等)的蛋白质、多肽或肽。在某些优选的实施方案中,本发明包括使用重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)到异源蛋白或肽的调节剂或它们的片段,其中所述蛋白质或肽包含至少10个,至少20个,至少30,至少40,至少50,至少60,至少70,至少80,至少90或至少100个氨基酸。构建体不一定需要直接连接,也可以通过氨基酸连接体序列进行。例如,通过将本发明的调节剂融合或缀合至特异于特定细胞表面受体的抗体以提供双特异性构建体,抗体可用于将异源多肽靶向至表达SEZ6的特定细胞类型,无论是在体外或在体内。此外,融合或缀合到异源多肽的调节剂也可在体外免疫测定中使用,并且可以与本领域中已知的纯化方法(例如,his-标签)特别相容。参见例如,国际公开号WO93/21232;欧洲专利号EP439095;Naramura等人,1994,Immunol.Lett.39:91-99;美国专利号5474981;Gillies等人,1992,PNAS89:1428至1432;和Fell等人,1991,J.Immunol.146:2446至2452。
B.连接体
除了上述肽连接体或间隔基以外,将可以理解,其他几个种类或类型的连接体也可用于缔合所公开的调节剂与药学活性剂或诊断结构部分或生物相容的改性剂。在一些实施方案中,所述连接体在细胞内条件下是可裂解的,使得连接体的裂解在细胞内环境中从抗体释放药物单元。在其他实施方案中,所述连接体单元不可裂解且例如通过抗体降解释放药物。
ADC的连接体优选在细胞外稳定、防止ADC分子的聚集及保持ADC可自由地可溶于水性介质中且处于单体状态。在传送转运或递送至细胞中之前,抗体-药物缀合物(ADC)优选为稳定的且保持完整,即抗体保持连接至药物结构部分。连接体在目标细胞外部稳定,并且可以在细胞内以某一特定有效速率裂解。有效连接体将:(i)维持保持抗体的特异性结合性质;(ii)允许缀合物或药物结构部分的细胞内递送;(iii)维持保持稳定及完整,即不裂解,直至缀合物递送或转运传送至其目标靶向位点;及(iv)维持保持PBD药物结构部分的细胞毒性、细胞杀死作用或细胞抑制作用。ADC的稳定性可由标准分析技术测量,所述标准分析技术诸如质谱分析、HPLC及分离/分析技术LC/MS。抗体与药物部分的共价连接需要连接体具有两个反应性官能基,即在反应性含义意义上为二价。已知可适用于连接两个或更多个功能性或生物学活性结构部分(诸如肽、核酸、药物、毒素、抗体、半抗原及报道基团)的二价连接体试剂是已知的,且已经描述了方法及所得缀合物(Hermanson,G.T.(1996)BioconjugateTecChniques;AcademicPress:NewYork,第234-242页)。
为此,本发明的某些实施方案包含使用通过细胞内环境(例如,在溶酶体或内体或胞膜窖)中存在的裂解剂可裂解的连接体。所述连接体可以是,例如,由细胞内肽酶或蛋白酶(包括,但不限于,溶酶体或内体蛋白酶)裂解的肽基连接体。在一些实施方案中,所述肽基连接体是至少两个氨基酸长,或至少三个氨基酸长。裂解剂可包括组织蛋白酶B和D以及纤溶酶,已知其各自水解二肽药物衍生物,导致活性药物在目标细胞内的释放。可通过硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶B裂解的示例性肽基连接体是包含Phe-Leu的肽,因为已经发现组织蛋白酶-B在癌组织中高度表达。此类连接体的其他实例描述于,例如,U.S.P.N.6,214,345和U.S.P.N.2012/0078028中,其各自通过引用整体并入本文。在一个特定优选的实施方案中,可由细胞内蛋白酶裂解的肽基连接体是Val-Cit连接体、Ala-Val连接体或Phe-Lys连接体,如U.S.P.N.6,214,345中所述。使用治疗剂的细胞内蛋白水解释放的一个优点是,所述药剂当缀合时通常减弱,且所述缀合物的血清稳定性通常高。
在其他实施方案中,可裂解的连接体是pH敏感的,即,在特定pH值对水解是敏感的。通常,pH敏感的连接体在酸性条件下是可水解的。例如,可使用在溶酶体中可水解的酸不稳定连接体(例如,腙,肟,缩氨基脲,缩氨基硫脲,顺式乌头酰胺,原酸酯,缩醛,缩酮,等)(例如,见U.S.P.N.5,122,368;5,824,805;5,622,929)。此类连接体在中性pH条件(诸如在血液中的条件)下是相对稳定的,但在低于pH5.5或5.0,溶酶体的近似pH是不稳定的。
在还有其他实施方案中,连接体在还原条件下是可裂解的(例如,二硫化物连接体)。多种二硫化物连接体在本领域中是已知的,包括,例如,可使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯),SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯),SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)来形成的二硫化物连接体。在还有其他具体实施方案中,连接体是丙二酸酯连接体(Johnson等人,1995,AnticancerRes.15:1387-93),马来酰亚胺基苯甲酰基连接体(Lau等人,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1299-1304),或3'-N-酰胺类似物(Lau等人,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。在其他实施方案中,连接体单元不可裂解,药物是通过抗体降解释放。(参见美国公开号2005/0238649,针对所有目的、通过引用将所述文献整体并入本文)。
更具体地,在优选的实施方案(如在U.S.P.N.2011/0256157所述,通过引用将所述文献整体并入本文)中,相容的连接体将包含:
其中星号表示与细胞毒性剂的连接点,CBA是细胞结合剂/调节剂,L1是连接体,A是将L1连接到细胞结合剂的连接基团,L2是共价键或连同-OC(=O)-形成自脱落连接体,和L1或L2是可裂解的连接体。
L1优选为可裂解连接体,并且可以被称为用于裂解的激活的触发器。
L1和L2(当存在时)的性质可以广泛地变化。这些基团基于它们的裂解特性进行选择,这可以通过在被递送缀合物的位点的条件来决定。通过酶的作用裂解的那些连接体是优选的,虽然也可以使用通过pH的变化(例如,酸或碱不稳定的)、温度或照射后(例如光不稳定的)可裂解的连接体。在还原或氧化条件下可裂解的连接体也可以用于本发明。
L1可以包含氨基酸的连续序列。氨基酸序列可以是用于酶促裂解的目标底物,从而允许从N10位置释放R10。
在一个实施方案中,L1是通过酶的作用可裂解的。在一个实施方案中,酶是酯酶或肽酶。
在一个实施方案中,L2存在并与-C(=O)O-一起形成自脱落连接体。在一个实施方案中,L2是酶促活性的底物,从而允许从N10位置释放R10。
在一个实施方案中,当L1是通过酶的作用可裂解并且L2存在时,酶裂解L1和L2之间的键。
L1和L2,当存在时,可以通过选自以下的键连接:
-C(=O)NH-,-C(=O)O-,-NHC(=O)-,-OC(=O)-,-O-C(=O)O-,-NH-C(=O)O-,-OC(=O)NH-和-NHC(=O)NH-。
连接到L2的L1的氨基可以是氨基酸的N-末端,或者可以从氨基酸侧链,例如赖氨酸氨基酸侧链的氨基衍生。
连接到L2的L1的羧基可以是氨基酸的C-末端,或者可以从氨基酸侧链,例如谷氨酸氨基酸侧链的羧基衍生。
连接到L2的L1的羟基可以由氨基酸侧链,例如丝氨酸氨基酸侧链的羟基衍生。
术语“氨基酸侧链”包括在以下中发现的那些基团:(i)天然存在的氨基酸,诸如丙氨酸,精氨酸,天冬酰胺,天冬氨酸,半胱氨酸,谷氨酰胺,谷氨酸,甘氨酸,组氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,赖氨酸,甲硫氨酸,苯丙氨酸,脯氨酸,丝氨酸,苏氨酸,色氨酸,酪氨酸,和缬氨酸;(ii)次要氨基酸诸如鸟氨酸和瓜氨酸;(iii)非天然氨基酸,β-氨基酸,天然存在的氨基酸的合成的类似物和衍生物;和(iv)前述物质的所有对映体,非对映体,异构体富集的,同位素标记的(例如2H,3H,14C,15N),受保护的形式,以及外消旋混合物。
在一个实施方案中,-C(=O)O-和L2一起形成以下基团:
其中星号表示与药物或细胞毒剂位置的连接点,波浪线表示与连接体L1的连接点,Y为-N(H)-,-O-,-C(=O)N(H)-或-C(=O)O-,并且n为0至3。亚苯基环任选被一个,两个或三个如本文中所描述的取代基取代。在一个实施方案中,亚苯基任选被卤代,NO2,R或OR取代。
在一个实施方案中,Y是NH。
在一个实施方案中,n是0或1。优选的是,n为0。
当Y是NH且n是0时,自脱落连接体可被称为对氨基苄基羰基连接体(PABC)。
在远端位点活化时,自脱落连接体将允许受保护化合物的释放,其沿以下展示的路线进行(对于n=0):
其中L*为连接体的剩余部分的活化形式。这些基团具有从受保护的化合物中分离活化的位点的优点。如以上所述,亚苯基可以任选取代。
在本文中所描述的一个实施方案中,基团L*是如本文所描述的连接体L1,其可以包括二肽基。
在另一个实施方案中,-C(=O)O-和L2一起形成选自以下的基团:
其中星号、波浪线、Y和n如上所定义。每个亚苯基环任选被一个、两个或三个如本文所描述的取代基取代。在一个实施方案中,具有Y取代基的亚苯基环任选取代,而不具有Y取代基的亚苯基环未被取代。在一个实施方案中,具有Y取代基的亚苯基环是未取代的,并且不具有Y取代基的亚苯基环是任选取代的。
在另一个实施方案中,-C(=O)O-和L2一起形成选自以下的基团:
其中星号、波浪线、Y和n如上所定义,E是O、S或NR,D是N、CH或CR,且F是N、CH或CR。
在一个实施方案中,D是N。
在一个实施方案中,D是CH。
在一个实施方案中,E是O或S。
在一个实施方案中,F是CH。
在一个优选的实施方案中,连接体是组织蛋白酶不稳定连接体。
在一个实施方案中,L1包含二肽。二肽可以被表示为-NH-X1-X2-CO-,其中-NH-和-CO-分别表示氨基酸基团X1和X2的N-和C-末端。二肽中的氨基酸可以是天然氨基酸的任何组合。当连接体是组织蛋白酶不稳定的连接体时,二肽可以是组织蛋白酶介导的裂解的作用位点。
另外,对于具有羧基或氨基侧链官能团的那些氨基酸基团,分别例如Glu和Lys,CO和NH可表示侧链官能团。
在一个实施方案中,二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自:
-Phe-Lys-,-Val-Ala-,-Val-Lys-,-Ala-Lys-,-Val-Cit-,-Phe-Cit-,-Leu-Cit-,-Ile-Cit-,-Phe-Arg-和-Trp-Cit-,其中Cit为瓜氨酸。
优选的是,二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自:
-Phe-Lys-,-Val-Ala-,-Val-Lys-,-Ala-Lys-和-Val-Cit-。
最优选的是,二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-是-Phe-Lys-或-Val-Ala-。
可以使用其他二肽组合,包括由DubowChik等人,BioconjugateChemistry,2002,13,855-869描述的那些,其通过引用并入本文。
在一个实施方案中,在适当情况下,所述氨基酸侧链被衍生化。例如,氨基酸侧链的氨基或羧基基团可以被衍生化。
在一个实施方案中,侧链氨基酸诸如赖氨酸的氨基NH2,是选自NHR和NRR'的衍生化形式。
在一个实施方案中,侧链氨基酸诸如天冬氨酸的羧基COOH,是选自COOR、CONH2、CONHR和CONRR'的衍生化形式。
在一个实施方案中,在适当情况下,所述氨基酸侧链被化学保护。侧链保护基可以是如下面关于基团RL讨论的基团。受保护的氨基酸序列可被酶裂解的。例如,已经确定,包含Boc侧链保护的Lys残基的二肽序列是通过组织蛋白酶可裂解的。
氨基酸的侧链的保护基团在本领域中是公知的,并在NovabioChem目录中描述。额外的保护基团策略记载于ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,GreeneandWuts。
针对具有反应性侧链官能团的那些氨基酸,可能的侧链保护基团如下所示:
Arg:Z,Mtr,Tos;
Asn:Trt,Xan;
Asp:Bzl,t-Bu;
Cys:Acm,Bzl,Bzl-OMe,Bzl-Me,Trt;
Glu:Bzl,t-Bu;
Gln:Trt,Xan;
His:Boc,Dnp,Tos,Trt;
Lys:Boc,Z-Cl,Fmoc,Z,Alloc;
Ser:Bzl,TBDMS,TBDPS;
Thr:Bz;
Trp:Boc;
Tyr:Bzl,Z,Z-Br。
在一个实施方案中,选择侧链保护以与作为封端基团(当存在时)或作为其一部分提供的基团正交。因此,除去侧链保护基团不除去封端基团,或者作为封端基团的一部分的任何保护基团官能团。
在本发明的其他实施方案中,所选择的氨基酸是不具有反应性侧链官能团的氨基酸。例如,所述氨基酸可以选自:Ala,Gly,Ile,Leu,Met,Phe,Pro和Val。
在一个实施方案中,二肽与自脱落连接体组合使用。自脱落连接体可以连接到-X2-。
当自脱落连接体存在时,-X2-直接连接到自脱落连接体。优选基团-X2-CO-连接到Y,其中Y为NH,由此形成基团-X2-CO-NH-。
-NH-X1-直接连接到A。A可以包含官能团-CO-,从而形成具有-X1-的酰胺连接。
在一个实施方案中,L1和L2与-OC(=O)一起组成基团NH-X1-X2-CO-PABC-。PABC基团直接连接到细胞毒性剂。优选的是,自脱落连接体和二肽一起形成基团-NH-Phe-Lys-CO-NH-PABC,其如下所示:
其中星号表示与所选择的细胞毒性结构部分的连接点,且波浪线表示与连接体L1的剩余部分的连接点或与A的连接点。优选的是,波浪线表示与A的连接点。例如,用Boc、Fmoc或Alloc,可保护Lys氨基酸的侧链,如上所述。
或者,自脱落连接体和二肽一起形成基团-NH-Val-Ala-CO-NH-PABC,其如下所示:
其中星号和波纹线如上述所定义。
或者,自脱落连接体和二肽一起形成基团-NH-Val-Cit-CO-NH-PABC,其如下所示:
其中星号和波纹线与上述定义相同。
在本发明的一些实施方案中,可以优选的是,如果药物部分包含未受保护的亚胺键,例如如果结构部分B存在,则连接体不包含游离氨基(H2N-)基团。因此,如果连接体具有结构-A-L1-L2-,那么这将优选不含有游离的氨基。当连接体含有二肽,例如为L1时,这种偏好是特别相关的;在这种实施方案中,将优选的是,两个氨基酸中的一个不选自赖氨酸。
不希望受理论的束缚,药物部分中的未受保护的亚胺键和连接体中的游离氨基的组合可导致药物-连接体结构部分的二聚化,这可干扰这种药物-连接体结构部分与抗体的缀合。在游离氨基以铵离子(H3N+)形式存在的情况下,如,当强酸(例如TFA)已被用于脱保护游离氨基时,可能加速这些基团的交叉反应。
在一个实施方案中,A为共价键。因此,L1与细胞结合剂直接相连。例如,当L1包含连续氨基酸序列时,序列的N端可以直接连接到细胞结合剂。
因此,当A是共价键时,所述细胞结合剂和L1之间的连接可以选自:
-C(=O)NH-,-C(=O)O-,-NHC(=O)-,-OC(=O)-,-OC(=O)O-,-NHC(=O)O-,-OC(=O)NH-,-NHC(=O)NH-,-C(=O)NHC(=O)-,-S-,-S-S-,-CH2C(=O)-和=N-NH-。
连接到SEZ6调节剂的L1的氨基可以是氨基酸的N端,或者可以衍生自氨基酸侧链例如赖氨酸氨基酸侧链的氨基。
连接到调节剂的L1的羧基可以是氨基酸的C端,或者可以衍生自氨基酸侧链例如谷氨酸氨基酸侧链的羧基。
连接到细胞结合剂的L1的羟基可以衍生自氨基酸侧链例如丝氨酸氨基酸侧链的羟基。
连接到调节剂试剂L1的硫醇基团可衍生自氨基酸侧链例如丝氨酸氨基酸侧链的硫醇基。
上述关于L1的氨基、羧基、羟基和硫醇基团的描述也适用于细胞结合剂。
在一个实施方案中,L2连同-OC(=O)-代表:
其中星号表示与N10位置的连接点,波浪线表示与L1的连接点,n是0到3,Y是共价键或官能团,且E是可活化的基团,例如由酶促作用或光可活化的基团,从而产生自脱落单元。亚苯基环任选进一步被一个、两个或三个如本文所述的取代基取代。在一个实施方案中,亚苯基任选进一步被卤素、NO2、R或OR取代。优选n是0或1,最优选0。
选择E,使得基团是易于活化的,例如通过光或通过酶的作用活化。E可以是-NO2或葡糖醛酸。前者可容易经受硝基还原酶的作用,后者可容易经受β-葡萄糖醛酸酶的作用。
在本实施方案中,当E被激活时,将允许自脱落连接体释放被保护的化合物,其沿着下面所示的路线进行(对于n=0):
其中星号表示与N10位置的连接点,E*为E的活化形式,并且Y是如上文所述。这些基团具有从受保护的化合物中分离活化的位点的优点。如上所述,亚苯基可以任选进一步被取代。
基团Y可以是到L1的共价键。
基团Y可以是选自以下的官能团:
-C(=O)-,NH-,O,-C(=O)NH-,-C(=O)O-,-NHC(=O)-,-OC(=O)-,-OC(=O)O-,-NHC(=O)O-,-OC(=O)NH-,-NHC(=O)NH-,-NHC(=O)NH-,-C(=O)NHC(=O)-和-S-。
当L1是二肽时,优选的是Y为-NH-或-C(=O)-,从而形成L1和Y之间的酰胺键。在该实施方案中,二肽序列不需要是酶促活性的底物。
在另一个实施方案中,A是间隔基团。因此,L1与细胞结合剂被间接地连接。
L1和A可以通过选自以下的键连接:
-C(=O)NH-,-C(=O)O-,-NHC(=O)-,-OC(=O)-,-OC(=O)O-,-NHC(=O)O-,-OC(=O)NH-和-NHC(=O)NH-。
优选的是,连接体含有亲电官能团,其用于与在调节剂上的亲核官能团反应。抗体上的亲核基团包括,但不限于:(i)N末端胺基团,(ii)侧链胺基团,例如赖氨酸,(iii)侧链硫醇基团,例如半胱氨酸,和(iv)当抗体被糖基化时的糖羟基或氨基。胺、硫醇和羟基基团是亲核的,并且能够反应以便与包括以下的连接体结构部分和连接体试剂上的亲电基团形成共价键:(i)马来酰亚胺基团,(ii)活化的二硫化物,(iii)活性酯,诸如NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)酯,HOBt(N-羟基苯并***)酯,卤代甲酸酯,和酰卤;(iv)烷基和苯甲基卤化物,诸如卤代乙酰胺;及(v)醛类,酮类,羧基,且,其中的一些示例如下:
某些抗体具有可还原的链间二硫键,即半胱氨酸桥。可通过用还原剂(诸如DTT(二硫苏糖醇))处理使抗体具有与连接体试剂缀合的反应性。理论上,各半胱氨酸桥将因此形成两种反应性硫醇亲核试剂。可经由赖氨酸与2-亚氨基硫杂环戊烷(特劳特试剂(Traut'sreagent))的反应将其他亲核基团引入抗体中,引起胺转化为硫醇。可通过引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基(例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变型抗体),将反应性硫醇基引入抗体(或其片段)中。US7521541教导了通过引入反应性半胱氨酸氨基酸工程改造抗体。
在一些实施方案中,连接体具有反应性的亲核基团,其可与存在于抗体上的亲电子基团反应。抗体上的有用的亲电子基团包括,但不限于,醛和酮羰基。连接体的亲核基团的杂原子可以与抗体上的亲电子基团反应而形成与抗体单元的共价键。连接体上的有用的亲核基团包括,但不限于,酰肼,肟,氨基,羟基,肼,缩氨基硫脲,羧酸肼,和芳基酰肼。抗体上的亲电子基团提供了用于连接到连接体的便利位点。
在一个实施方案中,基团A是:
其中星号表示与L1的连接点,波浪线表示与细胞结合剂的连接点,且n为0至6。在一个实施方案中,n为5。
在一个实施方案中,基团A是:
其中星号表示与L1的点,波浪线表示与细胞结合剂的连接点,且n为0至6。在一个实施方案中,n为5。
在一个实施方案中,基团A是:
其中星号表示与L1的连接点,波浪线表示与细胞结合剂的连接点,n是0或1,且m为0至30。在一个优选的实施方案中,n是1,m是0至10,1至8,优选4至8,最优选4或8。在另一个实施方案中,m是10至30,并优选为20至30。或者,m为0至50。在该实施方案中,m优选10-40且n是1。
在一个实施方案中,基团A是:
其中星号表示与L1的连接点,波浪线表示与细胞结合剂的连接点,n是0或1,且m为0至30。在一个优选的实施方案中,n是1且m是0至10,1至8,优选4至8,最优选4或8。在另一个实施方案中,m是10至30,且优选为20至30。或者,m为0至50。在该实施方案中,m优选10-40且n是1。
在一个实施方案中,细胞结合剂和A之间的连接是通过细胞结合剂的硫醇残基和A的马来酰亚胺基团。
在一个实施方案中,细胞结合剂和A之间的连接是:
其中星号表示与A的剩余部分的连接点,波浪线表示与细胞结合剂的剩余部分的连接点。在该实施方案中,S原子通常衍生自调节剂。
在上述各实施方案中,替代官能团可以用于代替下面所示的马来酰亚胺衍生的基团:
其中波浪线表示与细胞结合剂的连接点,如前所述,而星号表示至A基团的剩余部分的键。
在一个实施方案中,马来酰亚胺衍生的基团被替换为以下基团:
其中波浪线表示与细胞结合剂的连接点,并且所述星号表示到A基团的剩余部分的键。
在一个实施方案中,马来酰亚胺衍生的基团被替换为选自以下的基团(其任选地与细胞结合剂一起):
-C(=O)NH-,-C(=O)O-,-NHC(=O)-,-OC(=O)-,-OC(=O)O-,-NHC(=O)O-,-OC(=O)NH-,-NHC(=O)NH-,-NHC(=O)NH-,-C(=O)NHC(=O)-,-S-,-S-S-,-CH2C(=O)-,-C(=O)CH2-,=N-NH和-NH-N=。
在一个实施方案中,马来酰亚胺衍生的基团被替换为选自以下的基团(其任选地与细胞结合剂一起):
其中波浪线表示与细胞结合剂的连接点,或与A基团的剩余部分的键,而星号表示到细胞结合剂的其他连接点或与A基团剩余部分的键。
适合于将L1连接到所选择的调节剂的其他基团在WO2005/082023中描述。
在另一个优选的实施方案中,本发明的调节剂可与包含药物连接体单元的生物相容性聚合物相缔合。在这方面,一个这样的类型的相容聚合物包括聚合物(MersanaTherapeutics)。这样的聚合物据报道是可生物降解的,良好耐受的,已被临床验证的。此外,这样的聚合物与多种可定制的连接体技术和允许药物动力学的控制、药物释放的局部化和改善生物分布的化学法相容。
所选调节剂也可直接缀合放射性同位素,或者可以包含可用于缀合放射性离子的大环螯合剂(如本文所述)。在某些实施方案中,大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环癸烷-N,N',N”,N”'-四乙酸(DOTA),其可通过连接体分子连接到抗体。这样的连接体分子在本领域中是公知的且描述于Denardo等人,1998,ClinCancerRes.4:2483;Peterson等人,1999,Bioconjug.Chem.10:553;和Zimmerman等人,1999,Nucl.Med.Biol.26:943。
更一般地,用于将治疗性结构部分或细胞毒性剂缀合至调节剂的技术是众所周知的。如上述讨论,结构部分可通过任何本领域公认的方法缀合至调节剂,所述方法包括但不限于醛/希夫连接,巯基连接,酸不稳定的连接,顺乌头多糖基(aconityl)连接,腙连接,酶可降解的连接(通常参见Garnett,2002年,AdvDrugDelivRev53:171)。另参见,例如,Amon等人,"MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy",MonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeld等人(编辑),pp.243-56(AlanR.Liss,Inc.1985);Hellstrom等人,"AntibodiesForDrugDelivery",ControlledDrugDelivery(第二版),Robinson等人(编辑),pp.623-53(MarcelDekker,Inc.1987);Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview",MonoclonalAntibodies'84:BiologicalAndClinicalApplications,Pinchera等人(编辑),pp.475-506(1985);"Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy",MonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy,Baldwin等人(编辑),pp.303-16(AcademicPress1985),和Thorpe等人,1982,Immunol.Rev.62:119。在优选的实施方案中,缀合至治疗性结构部分或细胞毒性剂的SEZ6调节剂可以在结合到与细胞表面缔合的SEZ6分子后被细胞内化,从而递送治疗性有效载荷。
C.生物相容性改性剂
在选定的实施方案中,本发明的调节剂可以缀合至或以其他方式缔合至生物相容性改性剂,所述生物相容性改性剂可用于根据需要调整、改变、提高或缓和调节剂特性。例如,通过连接相对高的分子量聚合物分子,诸如可商购的聚乙二醇(PEG)或类似的生物相容的聚合物,可以产生具有增加的体内半衰期的抗体或融合构建体。本领域技术人员将理解,PEG可以以可以选择以赋予抗体分子特定性质(例如,可以定制半衰期)的许多不同的分子量和构型来获得。在采用或不采用多功能连接体的情况下,通过PEG与所述抗体或抗体片段的N端或C端的位点特异性缀合,或通过赖氨酸残基上存在的ε-氨基,可以将PEG连接到调节剂或抗体片段或衍生物。可以使用,导致生物活性损失最小的线性或分支聚合物衍生化。缀合程度可以通过SDS-PAGE和质谱密切监测,以确保PEG分子最佳缀合到抗体分子。未反应的PEG可以从抗体-PEG缀合物通过例如大小排阻或离子交换色谱法分离。以类似的方式,所公开的调节剂可以缀合到白蛋白,以使抗体或抗体片段在体内更稳定或具有更长的体内半衰期。所述技术在本领域中是公知的,参见例如,国际公开号WO93/15199,WO93/15200,和WO01/77137;和欧洲专利号0413622。其他生物相容的缀合物对于普通技术人员是明显的,并且可以容易地根据本文的教导来鉴定。
D.诊断或检测剂
在其他优选的实施方案中,将本发明的调节剂或其片段或衍生物缀合至诊断或检测试剂、标记物或报道分子,其可以是,例如,生物分子(例如,肽或核苷酸),小分子,荧光团或放射性同位素。标记的调节剂可以用于监测过度增殖性病症的发展或进展,或可以用作临床测试方法的一部分来确定包括所公开的调节剂(即治疗诊断剂)的特定治疗的效力或确定治疗的未来进程。这样的标记物或报道分子也可以用于纯化所选调节剂,调节剂分析(例如,表位结合或抗体分仓),分开或分离TIC或临床前程序或毒理学研究。
这样的诊断分析和/或检测可以通过将调节剂偶联至可检测的物质来实现,所述可检测的物质包括,但不限于,各种酶例如,包括例如辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶,β-半乳糖苷酶,或乙酰胆碱酯酶的各种酶;辅基,诸例如但不限于链霉菌抗生物素蛋白/核糖霉素生物素(streptavidinlbiotin)和抗生物素蛋白/生物素;荧光材料,诸例如但不限于伞形酮,荧光素,异硫氰酸荧光素,罗丹明,二氯三嗪基胺荧光素,丹磺酰氯或藻红蛋白;发光材料,诸例如但不限于鲁米诺;生物发光物质,诸例如但不限于,荧光素酶,萤荧光素和水母发光蛋白;放射性物质,诸例如但不限于碘(131I,125I,123I,121I,),碳(14C),硫(35S),氚(3H),铟(115In,113In,112In,111In),和锝(99Tc),铊(201Ti),镓(68Ga,67Ga),钯(103Pd),钼(99Mo),氙(133Xe),氟(18F),153Sm,177Lu,159Gd,149Pm,140La,175Yb,166Ho,90Y,47Sc,186Re,188Re,142Pr,105Rh,97Ru,68Ge,57Co,65Zn,85Sr,32P,153Gd,169Yb,51Cr,54Mn,75Se,113Sn及117Tin;正电子发射金属,其使用各种正电子发射体层摄影术,非放射性(noradioactive)顺磁离子,和是放射性标记的或缀合到特定放射性同位素的分子。在这样的实施方案中,合适的检测方法是本领域中众所周知的,并且可容易地从许多商业来源获得。
如上所述,在其他实施方案中,所述调节剂或其片段可融合或缀合至标记物序列或化合物,诸如肽或荧光团,以促进纯化或诊断或分析程序,诸如免疫组织化学,生物层干涉测量,表面等离子体共振,流式细胞术,竞争性ELISA,FACs等。在优选的实施方案中,标记物包括his-标签诸如由pQE载体(Qiagen)提供的his-标签,在其中,其中许多是可商购的。可用于纯化的其他肽标签包括,但不限于,血细胞凝集素“HA”标签,其对应于源自流感血细胞凝集素蛋白质的表位(Wilson等人,1984,Cell37:767)和“flag”标记(U.S.P.N.4703004)。
E.治疗结构部分
如前面提到,所述调节剂或其片段或衍生物也可缀合、连接或融合到或以其他方式缔合至“治疗结构部分”或“药物”,诸如抗增殖或抗癌剂,包括但不限于,细胞毒性剂,细胞生长抑制剂,抗血管生成剂,减积剂,化疗剂,放射疗法和放射治疗剂,靶向抗癌剂,BRMs,治疗性抗体,癌症疫苗,细胞因子,激素疗法,放射疗法和抗转移剂和免疫治疗药物。
优选的示例性抗癌剂包括细胞松弛素B,短杆菌肽D,溴化乙锭,吐根碱,丝裂霉素,依托泊苷,替尼泊苷,长春新碱,长春碱,秋水仙碱,多柔比星,柔红霉素,二羟基炭疽菌,美坦生类化合物(maytansinoids)诸如DM-1和DM-4(Immunogen,Inc.),二酮,米托蒽醌,光辉霉素,放线菌素D,1-去氢睾酮,糖皮质激素,普鲁卡因,丁卡因,利多卡因,***,嘌呤霉素,表多柔比星,和环磷酰胺及其类似物或同系物。额外的相容的细胞毒素包括多拉司他汀类和阿里他汀类(auristatins),包括单甲基阿里他汀E(MMAE)和单甲基阿里他汀F(MMAF)(SeattleGenetics,Inc.),鹅膏蕈碱类诸如α-鹅膏蕈碱,β-鹅膏蕈碱,γ-鹅膏蕈碱或ε-鹅膏蕈碱(HeidelbergPharmaAG),DNA小沟结合剂,诸如多卡米星衍生物(Syntarga,B.V.)和改性吡咯并苯并二氮杂二聚体(Spirogen,Ltd.),剪接抑制剂诸如meayamycin类似物或衍生物(例如,FR901464,如在U.S.P.N.7825267中所述),管状结合剂,如埃博霉素类似物和紫杉醇和DNA损伤剂诸如刺孢霉素和埃斯波霉素。此外,在某些实施方案中,本发明的SEZ6调节剂可与抗CD3结合分子缔合,以招募细胞毒性T细胞,并让它们靶向肿瘤起始细胞(BiTEtechnology;参见例如,Fuhrmann,S.等AnnualMeetingofAACR摘要号5625(2010),其通过引用并入本文)。
还有额外的相容的抗癌剂包括,但不限于,抗代谢物(例如,甲氨蝶呤,6-巯基嘌呤,6-硫鸟嘌呤,阿糖胞苷,5-氟尿嘧啶达卡巴),烷化剂(例如,氮芥,thioepa,苯丁酸氮芥,美法仑,卡莫司汀(BCNU)和洛莫司汀(CCNU),白消安,二溴甘露醇,链脲霉素,和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂),蒽环类抗生素(例如,柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔比星),抗生素(例如,更生霉素(以前称为放线菌素),博来霉素,和氨茴霉素(AMC)),以及抗有丝***剂(例如长春新碱和长春碱)。治疗部分的更广泛列表可见PCT公开WO03/075957和U.S.P.N.2009/0155255,其各自通过引用并入本文。
如上所述,本发明的选定实施方案涉及缀合的SEZ6调节剂,诸如抗SEZ6抗体药物缀合物,其包含吡咯并苯并二氮杂(PBD)作为细胞毒性剂。可以理解的是,PBD是烷基化剂,其通过在小沟共价结合DNA和抑制核酸合成而发挥抗肿瘤活性。在这方面,PBD已显示出具有有效的抗肿瘤性质,同时显示出最小的骨髓抑制。可以使用几种连接体(例如,包含具有游离巯基的马来酰亚胺基部分的肽基连接体)中的任一种,将与本发明相容的PBD连接至所述SEZ6调节剂,并且在某些实施方案中,本发明相容的PBD为二聚体的形式(即,PBD二聚体)。可缀合于所公开的调节剂的相容的PBD(和任选的连接体)描述于,例如,U.S.P.N.6362331,7049311,7189710,7429658,7407951,7741319,7557099,8034808,8163736U.S.P.N.2011/0256157和PCT申请WO2011/130613,WO2011/128650和WO2011/130616,其各自通过引用并入本文。因此,在特别优选的实施方案中,调节剂将包含缀合或缔合至一种或多种PBD二聚体(即,SEZ6-PBDADC)的抗SEZ6抗体。
在特别优选的实施方案中,可以缀合至所公开的调节剂的相容的PBD描述于U.S.P.N.2011/0256157中。在本公开中,PBD二聚体,即,包含两个PBD部分的那些,可以是优选的。因此,本发明的优选的缀合物是具有通式(AB)或(AC)的缀合物:
其中:
虚线表示C1和C2或C2和C3之间的双键的任选存在;
R2独立地选自H,OH,=O,=CH2,CN,R,OR,=CH-RD,=C(RD)2,O-SO2-R,CO2R和COR,且任选地进一步选自卤代或二卤代;
其中,RD独立地选自R,CO2R,COR,CHO,CO2H,和卤代;
R6和R9独立地选自H,R,OH,OR,SH,SR,NH2,NHR,NRR',NO2,Me3Sn和卤代;
R7独立地选自H,R,OH,OR,SH,SR,NH2,NHR,NRR',NO2,Me3Sn和卤代;
R10是连接至调节剂或其片段或衍生物的连接体,如以上所描述;
Q独立地选自O,S和NH;
R11是H,或R,或其中Q是O,SO3M,其中M是金属阳离子;
R和R'各自独立地选自任选取代的C1-12烷基,C3-20杂环基和C5-20芳基,和任选地关于基团NRR',R和R'与它们所连接的氮原子一起形成任选取代的4,5,6或7元杂环;且
其中R2”,R6”,R7”,R9”,X”,Q”和R11”和根据R2,R6,R7,R9,X,Q和R11分别进行定义,且RC是封端基团。
双键
在一个实施方案中,C1和C2之间,和C2和C3之间不存在双键。
在一个实施方案中,所述虚线表示C2和C3之间任选存在双键,如下所示:
在一个实施方案中,当R2是C5-20芳基或C1-12烷基时,双键存在于C2和C3之间。
在一个实施方案中,所述虚线表示C1和C2之间任选存在双键,如下所示:
在一个实施方案中,当R2是C5-20芳基或C1-12烷基时,双键存在于C1和C2之间。
R
2
在一个实施方案中,R2独立地选自H,OH,=O,=CH2,CN,R,OR,=CH-RD,=C(RD)2,O-SO2-R,CO2R和COR,且任选进一步选自卤代或二卤代。
在一个实施方案中,R2独立地选自H,OH,=O,=CH2,CN,R,OR,=CH-RD,=C(RD)2,O-SO2-R,CO2R和COR。
在一个实施方案中,R2独立地选自H,=O,=CH2,R,=CH-RD和=C(RD)2。
在一个实施方案中,R2独立地是H。
在一个实施方案中,R2独立地是=O。
在一个实施方案中,R2独立地是=CH2。
在一个实施方案中,R2独立地是=CH-RD。在PBD化合物内,基团=CH-RD可以具有如下所示的构型:
在一个实施方案中,构型是构型(Ⅰ)。
在一个实施方案中,R2独立地是=C(RD)2。
在一个实施方案中,R2独立地是=CF2。
在一个实施方案中,R2独立地是R。
在一个实施方案中,R2独立地是任选取代的C5-20芳基。
在一个实施方案中,R2独立地是任选取代的C1-12烷基。
在一个实施方案中,R2独立地是任选取代的C5-20芳基。
在一个实施方案中,R2独立地是任选取代的C5-7芳基。
在一个实施方案中,R2独立地是任选取代的C8-10芳基。
在一个实施方案中,R2独立地是任选取代的苯基。
在一个实施方案中,R2独立地是任选取代的萘基。
在一个实施方案中,R2独立地是任选取代的吡啶基。
在一个实施方案中,R2独立地是任选取代的喹啉基和异喹啉基。
在一个实施方案中,R2携带一至三个取代基,其中1和2个取代基是更优选的,并且单一取代的基团是最优选的。所述取代基可以是在任何位置。
当R2是C5-7芳基时,单一取代基优选在与所述化合物其余部分连接的键不相邻的环原子上,即,优选的是,所述单一取代基在与所述化合物其余部分连接的键的β或γ位。因此,当C5-7芳基是苯基时,取代基优选在间位或对位,并且更优选在对位。
在一个实施方案中,R2选自:
其中星号表示连接点。
当R2为C8-10芳基(例如喹啉基或异喹啉基)时,它可以在喹啉或异喹啉环的任意位置携带任何数目的取代基。在一些实施方案中,它携带一个、两个或三个取代基,且这些可以是在近端和远端环或两者上(如果有多于一个取代基)。
在一个实施方案中,当R2被任选取代时,取代基选自下面的取代基部分中给出的那些取代基。
当R被任选取代时,取代基优选选自:
卤代,羟基,醚,甲酰基,酰基,羧基,酯,酰氧基,氨基,酰氨基,酰基酰氨基,氨基羰基氧基,脲基,硝基,氰基和硫醚。
在一个实施方案中,当R或R2被任选取代时,取代基选自R,OR,SR,NRR’,NO2,卤代,CO2R,COR,CONH2,CONHR,和CONRR'。
当R2是C1-12烷基时,任选的取代基可另外包括C3-20杂环基和C5-20芳基。
当R2是C3-20杂环基时,任选的取代基可以另外包括C1-12烷基和C5-20芳基。
当R2是C5-20芳基时,任选的取代基可另外包括C3-20杂环基和C1-12烷基。
可以理解的是,术语“烷基”包括亚类烯基和炔基以及环烷基。因此,当R2是任选取代的C1-12烷基时,可以理解的是,该烷基任选含有一个或多个碳-碳双键或三键,其可以形成缀合***的一部分。在一个实施方案中,任选取代的C1-12烷基含有至少一个碳-碳双键或三键,并且该键与C1和C2之间或C2和C3之间存在的双键缀合。在一个实施方案中,C1-12烷基是选自饱和的C1-12烷基、C2-12烯基、C2-12炔基和C3-12环烷基的基团。
如果在R2上的取代基是卤代,它优选为F或Cl,更优选Cl。
如果在R2上的取代基是醚,它可在一些实施方案中是烷氧基,例如,C1-7烷氧基(例如甲氧基,乙氧基),或者它可在一些实施方案中是C5-7芳氧基(例如苯氧基,吡啶基氧基,呋喃基氧基)。
如果在R2上的取代基是C1-7烷基,它可优选为C1-4烷基(例如甲基,乙基,丙基,丁基)。
如果在R2上的取代基是C3-7杂环基,它可在一些实施方案中是C6含氮杂环基团,例如吗啉代,硫代吗啉代,哌啶基,哌嗪基。这些基团可以经由氮原子结合到PBD结构部分的其余部分。这些基团可以进一步被取代,例如被C1-4烷基取代。
如果在R2上的取代基是双-氧基-C1-3亚烷基,这优选是双-氧基-亚甲基或双-氧基-亚乙基。
特别优选的R2的取代基包括甲氧基,乙氧基,氟,氯,氰基,双-氧基-亚甲基,甲基-哌嗪基,吗啉代和甲基-噻吩基。
尤其优选的被取代的R2基团包括但不限于4-甲氧基-苯基,3-甲氧基苯基,4-乙氧基-苯基,3-乙氧基-苯基,4-氟-苯基,4-氯-苯基,3,4--双氧基亚甲基-苯基,4-甲基噻吩基,4-氰基苯基,4-苯氧基苯基,喹啉-3-基和喹啉-6-基,异喹啉-3-基和异喹啉-6-基,2-噻吩基,2-呋喃基,甲氧基萘基和萘基。
在一个实施方案中,R2是卤代或二卤代。在一个实施方案中,R2是-F或-F2,其取代基分别如下显示为(III)和(IV):
R
D
在一个实施方案中,RD独立地选自R,CO2R,COR,CHO,CO2H,和卤代。
在一个实施方案中,RD独立地是R。
在一个实施方案中,RD独立地是卤代。
R
6
在一个实施方案中,R6独立地选自H,R,OH,OR,SH,SR,NH2,NHR,NRR',NO2,Me3Sn-和卤代。
在一个实施方案中,R6独立地选自H,OH,OR,SH,NH2,NO2和卤代。
在一个实施方案中,R6独立地选自H和卤代。
在一个实施方案中,R6独立地是H.
在一个实施方案中,R6和R7一起形成基团-O-(CH2)p-O-,其中p是1或2。
R
7
R7独立地选自H,R,OH,OR,SH,SR,NH2,NHR,NRR',NO2,Me3Sn和卤代。
在一个实施方案中,R7独立地是OR。
在一个实施方案中,R7独立地是OR7A,其中R7A独立地是任选取代的C1-6烷基。
在一个实施方案中,R7A独立地是任选取代的饱和的C1-6烷基。
在一个实施方案中,R7A独立地是任选取代的C2-4烯基。
在一个实施方案中,R7A独立地是Me。
在一个实施方案中,R7A独立地是CH2Ph。
在一个实施方案中,R7A独立地是烯丙基。
在一个实施方案中,所述化合物是二聚体,其中每个单体的R7基团一起形成具有式X-R”-X的二聚体桥,其连接单体。
R
8
在一个实施方案中,所述化合物是二聚体,其中每个单体的R8基团一起形成具有式X-R”-X的二聚体桥,其连接单体。
在一个实施方案中,R8独立地是OR8A,其中R8A独立地是任选取代的C1-4烷基。
在一个实施方案中,R8A独立地是任选取代的饱和的C1-6烷基或任选取代的C2-4烯基。
在一个实施方案中,R8A独立地是Me。
在一个实施方案中,R8A独立地是CH2Ph。
在一个实施方案中,R8A独立地是烯丙基。
在一个实施方案中,R8和R7一起形成基团-O-(CH2)p-O-,其中p是1或2。
在一个实施方案中,R8和R9一起形成基团-O-(CH2)p-O-,其中p是1或2。
R
9
在一个实施方案中,R9独立地选自H,R,OH,OR,SH,SR,NH2,NHR,NRR',NO2,Me3Sn-和卤代。
在一个实施方案中,R9独立地是H。
在一个实施方案中,R9独立地是R或OR。
R和R'
在一个实施方案中,R独立地选自任选取代的C1-12烷基,C3-20杂环基和C5-20芳基。这些基团将在下面的取代基部分中各自定义。
在一个实施方案中,R独立地是任选取代的C1-12烷基。
在一个实施方案中,R独立地是任选取代的C3-20杂环基。
在一个实施方案中,R独立地是任选取代的C5-20芳基。
在一个实施方案中,R独立地是任选取代的C1-12烷基。
与R2相关的上述内容是与优选的烷基和芳基和任选取代基的身份和数目相关的各个实施方案。为R2当应用于R时阐述的优选方案,在适当情况下,适用于所有其他基团R,例如,当R6,R7,R8或R9为R时。
R的优选方案也适用于R'。
在本发明的一些实施方案中,提供了具有取代基-NRR'的化合物。在一个实施方案中,R和R'与它们所连接的氮原子一起形成任选取代的4,5,6或7元杂环。该环可以含有其他杂原子,例如N,O或S.
在一个实施方案中,杂环本身被基团R取代。当额外的N杂原子存在时,取代基可以是在N杂原子上。
R”
R”为C3-12亚烷基,其链可以被一个或多个杂原子(例如O,S,N(H),NMe)和/或芳香环(例如苯或吡啶)中断,所述环被任选取代。
在一个实施方案中,R”为C3-12亚烷基,其链可以被一个或多个杂原子和/或芳香环(例如苯或吡啶)中断。
在一个实施方案中,该亚烷基任选地被一个或多个选自O、S和NMe的杂原子和/或芳香环中断,所述环被任选取代。
在一个实施方案中,芳香环为C5-20亚芳基,其中亚芳基属于二价结构部分,其通过从芳香化合物的两个芳香环原子除去两个氢原子而得到,所述结构部分具有5至20个环原子。
在一个实施方案中,R”为C3-12亚烷基,其链可以被一个或多个杂原子(例如O,S,N(H),NMe)和/或芳香环(例如苯或吡啶)中断,所述环被NH2任选取代。
在一个实施方案中,R”为C3-12亚烷基。
在一个实施方案中,R”选自C3,C5,C7,C9和C11亚烷基。
在一个实施方案中,R”选自C3,C5和C7亚烷基。
在一个实施方案中,R”选自C3和C5亚烷基。
在一个实施方案中,R”是C3亚烷基。
在一个实施方案中,R”是C5亚烷基。
上面列出的亚烷基可以任选地被一个或多个杂原子和/或芳香环(例如苯或吡啶)中断,所述环被任选取代。
上面列出的亚烷基可以任选地被一个或多个杂原子和/或芳香环(例如苯或吡啶)中断。
上面列出的亚烷基可以是未取代直链脂族亚烷基。
X
在一个实施方案中,X选自O,S或N(H)。
优选的是,X为O。
R
10
优选地,相容的连接体诸如上述那些通过在R10位置(即,N10)的一个或多个共价键将SEZ6调节剂(CBA/Ab/M)连接至PBD药物结构部分D。连接体是可用于连接一个或多个药物结构部分(D)和调节剂(优选抗体)以形成抗体-药物缀合物(ADC)的双官能或多官能结构部分。连接体(L)可以在细胞之外,即细胞外是稳定的,或它可以是可由酶促活性、水解或其他代谢条件裂解。可使用具有用于结合于药物结构部分和抗体的反应性官能团的连接体方便地制备抗体-药物缀合物(ADC)。抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇或胺,例如N端或氨基酸侧链诸如赖氨酸,可与连接体或间隔试剂、PBD药物结构部分(D)或药物-连接体试剂(D-L)的官能团形成键。
连接于PBD部分的N10位置的连接体上的许多官能团可以用于与细胞结合剂反应。例如,可以从连接体-PBD药物中间体和细胞结合剂的反应而形成酯、硫酯、酰胺、硫代酰胺、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、尿素、硫脲、醚、硫醚或二硫键。
在另一个实施方案中,连接体可以被调节聚集、溶解性或反应性的基团取代。例如,磺酸酯取代基可以增加试剂的水溶性,并且有利于连接体试剂与抗体或药物结构部分的偶联反应,或有利于Ab-L与D的偶联反应,或者D-L与Ab的偶联反应,这取决于用于制备ADC的合成路线。
在一个优选的实施方案中,R10是基团:
其中星号表示与N10位置的连接点,CBA是细胞结合剂/调节剂,L1是连接体,A是将L1连接到细胞结合剂的连接基团,L2是共价键或与-OC(=O)-一起形成自脱落(self-immolative)连接体,并且L1或L2是可裂解的连接体。
L1优选为可裂解的连接体,并且可以被称为用于针对裂解活化连接体的触发器。
如上述连接体部分所讨论,L1和L2(当存在时)的性质可以广泛地变化。这些基团基于它们的裂解特性进行选择,这可以通过在被递送缀合物的位点的条件来决定。通过酶的作用裂解的那些连接体是优选的,虽然也可以使用通过pH(例如,酸或碱不稳定的)、温度或照射时(例如光不稳定的)的变化可裂解的连接体。在还原或氧化条件下可裂解的连接体也可以用于本发明。
L1可以包含氨基酸的连续序列。氨基酸序列可以是用于酶促裂解的目标底物,从而允许从N10位置释放R10。
在一个实施方案中,L1是通过酶的作用可裂解的。在一个实施方案中,酶是酯酶或肽酶。
在一个实施方案中,L2存在并与-C(=O)O-一起形成自脱落连接体。在一个实施方案中,L2是酶促活性的底物,从而允许从N10位置释放R10。
在一个实施方案中,当L1是通过酶的作用可裂解并且L2存在时,酶裂解L1和L2之间的键。
关于将所选择的连接体连接到选定的PBD,基团RC可从某些PBD结构部分的N10位置移除,以留下N10-C11亚胺键,甲醇胺,取代的甲醇胺,当QR11是OSO3M时,亚硫酸氢盐加合物,硫代甲醇胺,取代的硫代甲醇胺,或取代的甲醇丙氨酸(carbinalamine)。
在一个实施方案中,RC可以是保护基团,其可移除,以留下N10-C11亚胺键,甲醇胺,取代的甲醇胺,或,当QR11是OSO3M时,亚硫酸氢盐加合物。在一个实施方案中,RC是保护基团,其可移除的以留下10-C11亚胺键。
基团RC意欲在与用于移除基团R10需要的条件相同的条件下可移除,例如以产生N10-C11亚胺键,甲醇胺等。封端基团充当在N10位置的预期官能团的保护基。封端基团C意欲不对细胞结合剂反应。例如,RC不同于RL。
具有封端基团的化合物可以在具有亚胺单体的二聚体的合成中用作中间体。或者,具有封端基团的化合物可以用作缀合物,其中封端基团在目标位置被移除,以得到亚胺、甲醇胺、取代的甲醇胺等。因此,在该实施方案中,封端基团可以被称为治疗可移除的氮保护基团,如WO00/12507中定义。
在一个实施方案中,基团RC在裂解基团R10的连接体RL的条件下是可移除的。因此,在一个实施方案中,封端基团是通过酶的作用可裂解的。
在一个替代实施方案中,封端基团在将连接体RL连接到调节剂之前是可移除的。在该实施方案中,封端基团在不裂解连接体RL的条件下是可移除的。
当化合物包括官能团G1以形成与细胞结合剂的连接时,封端基团在添加或揭露G1之前是可移除的。
封端基团可以用作保护基团策略的一部分,以确保二聚体中的单体单元中的只有一个连接到细胞结合剂。
封端基团可用作用于N10-C11亚胺键的遮蔽物。在诸如化合物中需要亚胺功能时,该封端基团可以被移除。该封端基团也为甲醇胺、取代的甲醇胺和亚硫酸氢盐加合物的遮蔽物,如上所述。
在一个实施方案中,RC是氨基甲酸酯保护基团。
在一个实施方案中,所述氨基甲酸酯保护基团选自:
Alloc,Fmoc,Boc,Troc,Teoc,Psec,Cbz和PNZ。
任选地,所述氨基甲酸酯保护基团进一步选自Moc。
在一个实施方案中,RC是缺乏用于连接到细胞结合剂的官能团的连接基团RL。
本申请与作为氨基甲酸酯类的那些RC基团相关。
在一个实施方案中,RC是以下基团:
其中星号表示与N10位置的连接点,G2是端基,L3是共价键或可裂解连接体L1,L2是共价键或与OC(=O)一起形成自脱落连接体。
当L3和L2均为共价键时,G2和OC(=O)一起形成氨基甲酸酯保护基团,如上述定义。
L1如上面关于R10所定义。
L2如上面关于R10所定义。
各种端基如下所述,包括基于公知的保护基团的端基。
在一个实施方案中,L3是可裂解连接体L1,且L2,与OC(=O)一起形成自脱落连接体。在该实施方案中,G2是Ac(乙酰基)或Moc,或选自以下的氨基甲酸酯保护基团:Alloc,Fmoc,Boc,Troc,Teoc,Psec,Cbz和PNZ。任选地,所述氨基甲酸酯保护基团进一步选自Moc。
在另一个实施方案中,G2是酰基-C(=O)G3,其中G3选自烷基(包括环烷基、烯基和烷基),杂烷基,杂环基和芳基(包括杂芳基和芳基羰基)。这些基团可任选取代。酰基与L3或L2的氨基一起,在适当情况下,可形成酰胺键。酰基与L3或L2的羟基一起,在适当情况下,可以形成酯键。
在一个实施方案中,G3是杂烷基。杂烷基可以包含聚乙二醇。杂烷基可以具有与酰基相邻的杂原子,诸如O或N,在适当情况下,由此形成氨基甲酸酯或碳酸酯基团,在适当情况下,与存在于基团L3或L2中的杂原子形成氨基甲酸酯或碳酸酯基团。
在一个实施方案中,G3选自NH2,NHR和NRR'。优选地,G3是NRR'。
在一个实施方案中,G2是以下基团:
其中星号表示与L3的连接点,n是0至6,且G4选自OH,OR,SH,SR,COOR,CONH2,CONHR,CONRR',NH2,NHR,NRR',NO2,和卤代。基团OH,SH,NH2和NHR被保护。在一个实施方案中,n是1至6,优选n是5。在一个实施方案中,G4是OR,SR,COOR,CONH2,CONHR,CONRR',和NRR'。在一个实施方案中,G4是OR,SR,和NRR'。优选地,G4选自OR和NRR’,最优选地,G4是OR。最优选地,G4是OMe。
在一个实施方案中,基团G2是:
其中星号表示与L3的连接点,且n和G4如上所定义。
在一个实施方案中,基团G2是:
其中星号表示与L3的连接点,n是0或1,m为0至50,且G4选自OH,OR,SH,SR,COOR,CONH2,CONHR,CONRR',NH2,NHR,NRR',NO2和卤代。在优选的实施方案中,n是1,且m是0至10,1至2,优选4至8,最优选4或8。在另一个实施方案中,n为1,且m为10至50,优选20至40。基团OH,SH,NH2和NHR被保护。在一个实施方案中,G4是OR,SR,COOR,CONH2,CONHR,CONRR',和NRR'。在一个实施方案中,G4是OR,SR,和NRR'。优选地,G4选自OR和NRR’,最优选地,G4是OR。优选地,G4是OMe。
在一个实施方案中,基团G2是:
其中星号表示与L3的连接点,且n、m和G4如上述所定义。
在一个实施方案中,基团G2是:
其中n是1-20,m是0-6,且G4选自OH,OR,SH,SR,COOR,CONH2,CONHR,CONRR',NH2,NHR,NRR',NO2和卤代。在一个实施方案中,n是1-10。在另一个实施方案中,n是10至50,优选20至40。在一个实施方案中,n是1。在一个实施方案中,m是1。基团OH,SH,NH2和NHR被保护。在一个实施方案中,G4是OR,SR,COOR,CONH2,CONHR,CONRR',和NRR'。在一个实施方案中,G4是OR,SR,和NRR'。优选地,G4选自OR和NRR’,最优选地,G4是OR。优选地,G4是OMe。
在一个实施方案中,基团G2是:
其中星号表示与L3的连接点,且n、m和G4如上述所定义。
在上述每个实施方案中,G4可以是OH,SH,NH2和NHR。这些基团优选被保护。
在一个实施方案中,OH被BzL、TBDMS或TBDMS保护。
在一个实施方案中,SH被Acm、Bzl、Bzl-OMe、Bzl-Me或Trt保护。
在一个实施方案中,NH2或NHR被Boc、Moc、Z-Cl、Fmoc、Z或Alloc保护。
在一个实施方案中,基团G2与基团L3(所述基团是二肽)组合存在。
封端基团不意欲用于连接调节剂。因此,存在于二聚体的其他单体充当通过连接体连接到调节剂的点。因此,优选的是,存在于封端基团中的官能团不可用于与调节剂的反应。因此,优选避免反应性官能团诸如OH、SH、NH2、COOH。然而,如果如上述受保护,这样的官能团可存在于封端基团。
因此,根据本文的教导,本发明的一个实施方案包括包含以下化合物的缀合物:
其中CBA是细胞结合剂/调节剂,且n为0或1。L1如前所定义,且RE和RE”各自独立地选自H或RD。
在另一个实施方案中,所述缀合物包含化合物:
其中CBA是细胞结合剂/调节剂,L1如前所定义,Ar1和Ar2各自独立地是任选取代的C5-20芳基,且n是0或1。
本领域技术人员将认识到,其他对称和非对称PBD二聚体和连接体是与本发明相容的,并且基于本文和现有技术的教导,不经由过度实验即可选择。
本发明的另一个方面包括包含放射性同位素的ADC。可与这样的实施方案相容的示例性放射性同位素包括,但不限于,碘(131I,125I,123I,121I,),碳(14C),铜(62Cu,64Cu,67Cu),硫(35S),氚(3H),铟(115In,113In,112In,111In,),铋(212Bi,213Bi),锝(99Tc),铊(201Ti),镓(68Ga,67Ga),钯(103Pd),钼(99Mo),氙(133Xe),氟(18F),153Sm,177Lu,159Gd,149Pm,140La,175Yb,166Ho,90Y,47Sc,186Re,188Re,142Pr,105Rh,97Ru,68Ge,57Co,65Zn,85Sr,32P,153Gd,169Yb,51Cr,54Mn,75Se,113Sn,117Sn,225Ac,76Br和211At。其他放射性核素也可用作诊断和治疗剂,尤其是60至4000千电子伏的能量范围内的放射性核素。根据待治疗的病况和所需治疗概况,本领域技术人员可以容易地选择与所公开的调节剂一同使用的适当的放射性同位素。
本发明的SEZ6调节剂也可以缀合到改变给定的生物学应答的治疗结构部分或药物(例如,生物应答调节剂或BRM)。也就是说,与本发明相容的治疗剂或结构部分不应解释为限于经典的化疗剂。例如,在特别优选的实施方案中,药物结构部分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽或其片段。这样的蛋白质可包括,例如,毒素诸如相思豆毒蛋白,蓖麻毒蛋白A,豹蛙酶(Onconase)(或其他细胞毒性核糖核酸酶),假单胞菌外毒素,霍乱毒素,或白喉毒素;蛋白质诸如肿瘤坏死因子,α-干扰素,β-干扰素,神经生长因子,血小板衍生的生长因子,组织纤维蛋白溶酶原活化剂,凋亡剂,例如TNF-α,TNF-β,AIMI(参见国际公开号WO97/33899),AIMII(参见国际公开号WO97/34911),Fas配体(Takahashi等人,1994,J.Immunol.,6:1567),和VEGI(参见国际公开号WO99/23105),血栓形成剂或抗血管生成剂,例如血管抑素或内皮抑素;或者,生物应答调节剂,诸如,例如,淋巴因子(例如,白介素-1(“IL-1”),白介素-2(“IL-2”),白介素-6(“IL-6”),粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)),或生长因子(例如,生长激素(“GH”))。如上所述,用于将调节剂融合或缀合到多肽结构部分的方法在本领域中是已知的。除了先前公开的主题文献,参见,例如,U.S.P.N.5336603;5,622,929;5359046;5349053;5447851和5112946;EP307434;EP367166;PCT公开WO96/04388和WO91/06570;Ashkenazi等人,1991,PNASUSA88:10535;Zheng等人,1995,J.Immunol.154:5590;和Vil等人,1992,PNASUSA89:11337,其各自通过引用并入本文。另外,如上文所述,调节剂与这样的结构部分的缔合不一定需要是直接的,也可以通过连接体序列发生。如前面提到,这样的连接体分子是本领域通常已知的,并且描述于Denardo等人,1998,临床癌症研究(ClinCancerRes)4:2483;Peterson等人,1999,BioconjugChem10:553;Zimmerman等人,1999,NuclMedBiol26:943;Garnett,2002,AdvDrugDelivRev53:171,其各自并入本文。
IX.诊断和筛选
A.诊断
在还有其他实施方案中,本发明提供用于检测、诊断或监测增殖性病症的体外或体内方法,和从患者筛选细胞以鉴定致瘤性细胞(包括CSCs)的方法。这样的方法包括鉴定具有癌症的个体用于治疗癌症或监测癌症的进展的方法,包括使患者或从患者获得的样品(即在体内或体外)与如本文所述的调节剂接触,并检测调节剂与样品中结合或游离的目标分子的缔合的存在或不存在或水平。在特别优选的实施方案中,所述调节剂将包含如本文所述的可检测的标记物或报道分子。
在一些实施方案中,所述调节剂(例如抗体)与样品中的特定细胞的缔合可能表示该样品可以含有CSCs,从而表明,可以用如本文所述的调节剂有效治疗具有癌症的个体。该方法还可以包括将结合水平与对照比较的步骤。相反,当调节剂为Fc-构建体时,当与样品接触时,可以利用和监测(直接或间接地,在体内或体外)结合特性,以提供所需的信息。
示例性相容测定方法包括放射免疫测定,酶免疫测定,竞争性结合测定法,荧光免疫测定法,免疫印迹测定法,Western印迹分析,流式细胞术测定法,以及ELISA测定法。体内相容的治疗诊断或诊断可包括本领域公认的成像或监测技术诸如磁共振成像,计算机断层扫描(例如CAT扫描),正电子断层扫描(例如,PET扫描)射线照相,超声波等,所述治疗诊断或诊断均是本领域技术人员已知的。
在另一个实施方案中,本发明提供在体内分析癌症进展和/或发病机制的方法。在另一个实施方案中,在体内分析癌症进展和/或发病机制包括确定肿瘤进展的程度。在另一个实施方案中,分析包括肿瘤的鉴定。在另一个实施方案中,对原发性肿瘤进行肿瘤进展的分析。在另一个实施方案中,取决于本领域技术人员已知的癌症的类型,随着时间推移进行分析。在另一个实施方案中,在体内分析源自原发性肿瘤的转移性细胞的继发性肿瘤的进一步分析。在另一个实施方案中,分析继发性肿瘤的大小和形状。在一些实施方案中,进行进一步离体分析。
在另一个实施方案中,本发明提供在体内分析癌症进展和/或发病机制的方法,包括确定细胞转移,或检测和定量循环肿瘤细胞的水平。在又另一个实施方案中,细胞转移的分析包括在远离原发性肿瘤的不连续位点测定细胞的进行性生长。在另一个实施方案中,细胞转移分析的位点包含赘生性扩散的途径。在一些实施方案中,细胞可以通过血液脉管***,***,体腔内或它们的组合分散。在另一个实施方案中,鉴于细胞迁移、传播、外渗、增殖或它们的组合,进行细胞转移分析。
因此,在一个特别优选的实施方案中,可以使用本发明的调节剂以检测和定量患者样品(例如,血浆或血液)中的SEZ6水平,其可以进而,可用于检测、诊断或监测SEZ6相关的病症,包括增殖性病症。在相关的实施方案中,可以使用本发明的调节剂以在体内或体外检测、监测和/或定量循环肿瘤细胞(参见,例如WO2012/0128801,其通过引用并入本文)。在还有其他优选实施方案中,循环肿瘤细胞可包含癌干细胞。
在某些实施方案中,可以在治疗或方案之前使用所公开的调节剂评估或表征个体或来自个体的样品中的致瘤性细胞,以建立基线。在其他实施方案中,样品衍生自所治疗的个体。在一些实例中,在个体开始或终止治疗后至少约1、2、4、6、7、8、10、12、14、15、16、18、20、30、60、90天、6个月、9个月、12个月或>12个月,从个体取样。在某些实例中,特定数量的剂量之后(例如,2、5、10、20、30个或更多剂量的治疗之后),评估或表征致瘤性细胞。在其他实例中,在接受一次或多次治疗后1周、2周、1个月、2个月、1年、2年、3年、4年或更久之后,表征和评估致瘤性细胞。
在另一个方面,并且如下面更详细讨论,本发明提供试剂盒,其用于检测、监测或诊断增殖性病症,鉴定具有这样的病症的个体用于可能治疗或监测患者中的疾病的进展(或消退),其中所述试剂盒包括如本文所述的调节剂,和用于检测所述调节剂对样品的影响的试剂。
然而本发明的另一个方面包括,标记的SEZ6用于免疫组织化学(IHC)的用途。在这方面,SEZ6IHC可以用作诊断工具以辅助各种增殖性病症的诊断和监测对治疗(包括SEZ6调节剂治疗)的潜在响应。可对已经化学固定(包括但不限于:甲醛、戊二醛、四氧化锇、重铬酸钾、乙酸、醇类、锌盐、氯化汞、四氧化铬和苦味酸)和包埋(包括但不限于:甲基丙烯酸乙二醇酯、石蜡和树脂)或通过冷冻保存的组织进行相容诊断测定。如下面更详细讨论,这样的测定可用于指导治疗决定,并确定给药方案和时机。
在一个优选的实施方案中,本发明涉及诊断对铂具有耐药性的小细胞肺癌的方法,其包括以下步骤:(a)提供来自个体的小细胞肺癌肿瘤样品;(b)使肿瘤样品暴露于用报道分子标记的抗SEZ6抗体,其中所述抗SEZ6抗体与肿瘤样品缔合;和(c)检测与肿瘤样品缔合的报道分子。在一个优选的实施方案中,可以使用体外诊断方法(例如IHC,原位杂交或流式细胞术)来检测这种报道分子。在一些实施方案中,提供肿瘤样品的步骤可以与将肿瘤样品暴露于抗SEZ6抗体的步骤或检测与肿瘤样品缔合的报道分子的步骤分开进行。
在另一个实施方案中,本发明涉及诊断甲状腺髓样癌的方法,其包括以下步骤:(a)提供来自个体的甲状腺髓样肿瘤样品;(b)使肿瘤样品暴露于用报道分子标记的抗SEZ6抗体,其中所述抗SEZ6抗体与肿瘤样品缔合;和(c)检测与肿瘤样品缔合的报道分子。在一个优选的实施方案中,可以使用体外诊断方法(例如IHC,原位杂交或流式细胞术)来检测这种报道分子。在一些实施方案中,提供肿瘤样品的步骤可以与将肿瘤样品暴露于抗SEZ6抗体的步骤或检测与肿瘤样品缔合的报道分子的步骤分开进行。
B.筛选
在某些实施方案中,所述调节剂也可用于通过与抗原(例如,其基因型或表型组分)相互作用来筛选或鉴定改变致瘤性细胞或其子代的功能或活性的化合物或试剂(例如,药物)。这样的化合物和试剂可以是例如被筛选用于增殖性病症的治疗的药物候选物。在一个实施方案中,***或方法包括包含SEZ6的致瘤性细胞和化合物或试剂(例如,药物),其中所述细胞与化合物或试剂相互接触。在这样的实施方案中,可以使用所公开的调节剂鉴定、监测和/或富集个体细胞。
在又另一个实施方案中,方法包括使致瘤性细胞或其子代与测试剂或化合物直接或间接地接触,且确定所述测试剂或化合物是否调节抗原相关致瘤性细胞的活性或功能。直接相互作用的一个实例是物理相互作用,而间接相互作用包括组合物对中间分子作用,所述中间分子进而作用于引用的实体(例如,细胞或细胞培养物)。可调节的示例性活性或功能包括,细胞形态或活力、标记物的表达、分化或去分化、细胞呼吸、线粒体活性、膜完整性、成熟、增殖、活力、凋亡或细胞死亡中的变化。
筛选和鉴定试剂和化合物的方法包括,适合于高通量筛选的方法,其包括任选定位或放置在预先确定的位置或地址的细胞的阵列(例如,微阵列)。例如,细胞可被定位或放置(预接种)在培养皿、管、烧瓶、滚瓶或板(例如,单一多孔板或平皿诸如8、16、32、64、96、384和1536多孔板或平皿)上。高通量机器人或手动处理方法可以在短时段内探测化学相互作用,并确定许多基因的表达水平。已经开发出利用分子信号(例如,通过荧光)和以非常快的速度处理信息的自动分析的技术(例如,参见Pinhasov等人,Comb.Chem.HighThroughputScreen.7:133(2004))。例如,微阵列技术已经广泛用于一次探测数千种基因的相互作用,同时提供特定基因的信息(参见,例如,Mocellin和Rossi,Adv.Exp.Med.Biol.593:19(2007))。
可以筛选的文库包括,例如,小分子文库,噬菌体展示文库,全人抗体酵母展示文库(Adimab,LLC),siRNA文库和腺病毒转染载体。
X.医药制剂及治疗性用途
A.制剂及施用途径
视所选调节剂连同任何任选缀合物的形式、所欲递送模式、所治疗或监测的疾病及多种其他变量而定,可视需要使用本领域中认可的技术配制本发明的组合物。在一些实施方案中,本发明的治疗性组合物可以纯施用或以含有最少量其他组分的形式施用,而其他组合物可任选经配制以含有合适的在本领域中公知的药学上可接受的载体,其包含赋形剂及助剂(参见例如Gennaro,Remington:TheScienceandPracticeofPharmacywithFactsandComparisons:DrugfactsPlus,第20版(2003);Ansel等人,PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,第7版,LippencottWilliams和Wilkins(2004);Kibbe等人,HandbookofPharmaceuticalExcipients,第3版,PharmaceuticalPress(2000))。各种药学上可接受的载体(包括媒介物、佐剂及稀释剂)容易购自多种商业来源。此外,多种药学上可接受的辅助物质(诸如pH调节剂及缓冲液、张力调节剂、稳定剂、湿润剂及其类似物)亦可购得。某些非限制性示例性载体包括生理食盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。
更具体而言,应了解,在一些实施方案中,本发明的治疗组合物可以纯形式施用或以含有最少量其他组分的形式施用。相反,本发明的SEZ6调节剂可任选经配制以含有合适的药学上可接受的载体(包含赋形剂及助剂),所述载体为本领域中公知且为相对惰性物质,其有助于调节剂的施用或帮助将活性化合物加工成经医药学上最佳化以递送至作用位点的制剂。例如,赋形剂可提供形成或同一性或充当稀释剂以改良调节剂的药物动力学或稳定性。合适赋形剂或添加剂包括(但不限于)稳定剂、湿润剂及乳化剂、用于改变摩尔渗透压浓度的盐、囊封剂、缓冲液及皮肤渗透增强剂。在某些优选实施方案中,药物组合物可以冻干形式提供及在施用之前在例如缓冲盐水中重构。
所公开的用于全身施用的调节剂可经配制以用于经肠、非经肠或局部施用。实际上,所有三种类型的制剂可同时使用以实现活性成分的全身施用。用于非经肠及非注射药物递送的赋形剂以及制剂阐述于Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy第20版MackPublishing(2000)中。适用于非经肠施用的制剂包括呈水可溶形式的活性化合物(例如水可溶盐)的水溶液。此外,可施用活性化合物的悬浮液,如适用于油性注射悬浮液。合适亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油,例如经己基取代的聚(丙交酯)、芝麻油或合成脂肪酸酯,例如油酸乙酯或三酸甘油酯。水性注射悬浮液可含有提高悬浮液的黏度的物质且所述物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇及/或聚葡萄糖。悬浮液亦可任选含有稳定剂。脂质体亦可用于封装用于递送至细胞中的试剂。
适用于经肠施用的制剂包括硬明胶胶囊或软明胶胶囊、丸剂、片剂(包括包衣片剂)、酏剂、悬浮液、糖浆或吸入剂及其控制释放形式。
通常,本发明的化合物及组合物(包含SEZ6调节剂)可通过各种途径体内施用于有需要的个体,包括(但不限于)经口、静脉内、动脉内、皮下、非经肠、鼻内、肌肉内、颅内、心内、心室内、气管内、经颊、经直肠、腹膜内、皮内、局部、经皮及鞘内腔施用,或通过植入或吸入以其他方式施用。主题组合物可配制成呈固体、半固体、液体或气态形式的制剂;包括(但不限于)片剂、胶囊、散剂、粒剂、软膏剂、溶液、栓剂、灌肠剂、注射剂、吸入剂及喷雾剂。适当制剂及施用途径可根据所欲应用及治疗方案来选择。
B.剂量
类似地,特定给药方案(即剂量、时序及重复)将视特定个体及个体的病史以及经验上的考虑因素(诸如药物动力学(例如半衰期、清除率等))而定。施用频率可根据疗程确定及调节,且是基于降低增殖性或致瘤细胞的数目、保持所述赘生性细胞减少、降低赘生性细胞的增殖或延缓转移发生。在其他实施方案中,可调节或降低所施用的剂量以控制潜在副作用及/或毒性。或者,主题治疗性组合物的持续连续释放制剂可适用。
通常,本发明的调节剂可以各种范围施用。这些范围包括每剂量每千克体重约10微克至每剂量每千克体重约100毫克;每剂量每千克体重约50微克至每剂量每千克体重约5毫克;每剂量每千克体重约100微克至每剂量每千克体重约10毫克。其他范围包括每剂量每千克体重约100微克至每剂量每千克体重约20毫克及每剂量每千克体重约0.5毫克至每剂量每千克体重约20毫克。在某些实施方案中,剂量为每千克体重至少约100微克、每千克体重至少约250微克、每千克体重至少约750微克、每千克体重至少约3毫克、每千克体重至少约5毫克、每千克体重至少约10毫克。
在所选实施方案中,所述调节剂将以每剂量每千克体重约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100微克施用。其他实施方案将包含以每剂量每千克体重200、300、400、500、600、700、800或900微克施用所述调节剂。在其他优选实施方案中,所公开的调节剂将以1、2、3、4、5、6、7、8、9或10毫克/千克施用。在还有其他实施方案中,所述调节剂可以每剂量每千克体重12、14、16、18或20毫克施用。在还有其他实施方案中,所述调节剂可以每剂量每千克体重25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90或100毫克施用。根据本文的教导,可以理解的是,上述的剂量也适用于非缀合调节剂和缀合至细胞毒性剂的调节剂两者。本领域技术人员可基于临床前动物研究、临床观测以及标准医药及生物化学技术及测量容易地确定各种缀合和非缀合调节剂的合适剂量。
关于缀合调节剂,特别优选的实施方案将包括约50μg/kg至约5mg/kg体重每剂量的剂量。在这方面,缀合调节剂可以50、75或100μg/kg或以0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1mg/kg体重每剂量施用。在其他优选的实施方案中、本发明的缀合调节剂可以在1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4.5、4.75或5mg/kg体重每剂量施用。在尤其优选实施方案中,所述缀合的调节剂剂量将在一段时间内静脉内施用。此外,所述剂量可在预定疗程内分多次施用。
其他给药方案可基于体表面积(BodySurfaceArea;BSA)计算,如U.S.P.N.7,744,877中所公开。如所公知,使用患者身高及体重计算BSA且BSA提供个体尺寸的量度,如由其身体的表面积表示。在某些实施方案中,所述调节剂可以10mg/m2至800mg/m2、50mg/m2至500mg/m2的剂量及以100mg/m2、150mg/m2、200mg/m2、250mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2或450mg/m2的剂量施用。亦应了解,可使用本领域中认可及经验上的技术确定合适剂量。
亦应了解,可使用本领域中认可及经验上的技术确定用于缀合的调节剂(即,ADC)的合适剂量。
在任何情况下,SEZ6调节剂(缀合和非缀合的)优选视需要施用有需要的个体。施用频率可由本领域技术人员(诸如主治医师)基于所治疗的病况、所治疗的个体的年龄、所治疗的病况的严重性、所治疗的个体的一般健康状况及其类似因素等考虑因素决定。通常,SEZ6调节剂的有效剂量以一或多次施用于个体。更具体而言,调节剂的有效剂量是以每月一次、每月一次以上或小于每月一次被施用于个体。在某些实施方案中,SEZ6调节剂的有效剂量可分多次施用,包括持续至少一个月、至少六个月、至少一年、至少两年或若干年。在其他实施方案中,所公开的调节剂的施用可持续若干天(2、3、4、5、6或7)、若干周(1、2、3、4、5、6、7或8)或若干个月(1、2、3、4、5、6、7或8))或甚至一年或若干年。
在某些优选实施方案中,涉及缀合的调节剂的疗程将包含所选药物产品(即,ADC)在数周或数月时间内的多次给药。更具体而言,本发明的缀合的调节剂可以每天一次、每两天一次、每四天一次、每周一次、每十天一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每六周一次、每两个月一次、每十周一次或每三个月一次施用。在此方面,应了解,可基于患者反应及临床实践改变剂量或调节时间间隔。
亦可凭经验确定已接受一或多次施用的个体中所公开的治疗性组合物的剂量及方案。例如,可向个体施用增加的剂量的如本文中所描述制备的治疗性组合物。在所选实施方案中,剂量可分别基于凭经验确定或观测的副作用或毒性而逐渐增加或降低或减少。为评估所选组合物的功效,可如先前描述追踪特定疾病、病症或病况的标记。在其中个体具有癌症的实施方案中,这些标记包括经由触诊或目测直接测量肿瘤尺寸、通过x射线或其他成像技术间接测量肿瘤尺寸;如由直接肿瘤活组织检验及肿瘤样品的显微镜检验评估的改良;根据本文中所描述的方法鉴别的间接肿瘤标记(例如PSA(对于***癌))或抗原的测量、疼痛或麻痹降低;语言、视觉、呼吸或其他与肿瘤相关的失能得到改良;食欲增加;或生活品质提高,如由经认可的测试或存活期延长所测量。本领域技术人员将显而易见,剂量将视个体、赘生性病况的类型、赘生性病况的阶段、赘生性病况是否开始转移至个体中的其他位置以及曾经使用的治疗及并行治疗而定。
C.组合疗法
组合疗法可尤其有效地降低或抑制不需要的赘生性细胞增殖、降低癌症发生、降低或预防癌症复发或降低或预防癌症的扩散或转移。在所述情况下,本发明的调节剂通过移除CSC(否则CSC将支援肿瘤块及使肿瘤块永存)及由此实现现有护理减积或抗癌剂标准的更有效使用而可充当敏化剂或化学敏化剂。如本文使用的“组合疗法”是指包括至少一种SEZ6调节剂和至少一种治疗性结构部分(例如,抗癌剂或SCLC)的组合的施用,其中所述组合优选与(i)单独使用的SEZ6调节剂,或(ii)单独使用的治疗性结构部分,或(iii)与另一治疗性结构部分组合使用治疗性结构部分(不加入SEZ6调节剂)相比具有癌症(例如,甲状腺髓样癌或小细胞肺癌)的治疗的治疗性协同作用或改善癌症(例如,甲状腺髓样癌或小细胞肺癌)的治疗的可测量的治疗效果。如本文所使用的术语“治疗性协同作用”意指,SEZ6调节剂和一个或多个治疗性结构部分的组合,其具有比SEZ6调节剂和所述一个或多个治疗性结构部分的组合的累加效应更高的治疗效果。
在本发明中的“组合疗法”的情形中,治疗性结构部分可包括一种或多种抗癌剂的施用,所述抗癌剂包括(但不限于)细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、抗血管生成剂、减积剂、化学治疗剂、放射疗法及放射治疗剂、靶向抗癌剂(包括单克隆抗体及小分子实体)、BRM、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、辐射疗法以及抗转移剂及免疫治疗剂,包括特异性及非特异性方法。
通过与对照或基线测量比较定量公开的组合所期望的结果。如本文中所使用,相对的术语诸如“提高”、“增加”或“减少”分别表示相对于对照的值,所述对照诸如在开始本文所述的治疗之前在同一个体中的测量值,或在不存在本文中所述的SEZ6调节剂、但存在其他治疗性结构部分(诸如护理治疗的标准)的情况下的对照个体(或多个对照个体)中的测量值。代表性对照个体是患有与所治疗的个体相同形式的癌症的个体,其与所治疗的个体的年龄约相同(以确保治疗的个体和对照个体的疾病的分期是相当的。)
对治疗的响应的变化或改进一般都是统计学显著的。如本文所用,术语“显著性”或者“显著的”涉及在两种或多种实体之间存在非随机关联性的概率的统计分析。为了确定关系是否为“显著的”或具有“显著性”,可以计算“p值”。低于用户定义的截止点的p值被认为是显著的。小于或等于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005、或小于0.001的p值可被视为显著的。
协同治疗效果可以是由单一治疗性结构部分或SEZ6调节剂引起的治疗效果,或由给定组合的SEZ6调节剂或单一治疗性结构部分引起的治疗效果的总和的至少约2倍、或至少约五倍、或至少约十倍、或至少约二十倍、或至少约五十倍、或至少约一百倍的效果。协同治疗效果也可观察为,与单一治疗性结构部分或SEZ6调节剂引起的治疗效果,或由给定组合的SEZ6调节剂或单一治疗性结构部分引起的治疗效果的总和相比,治疗效果增加至少10%或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少100%或更多。协同效果还是允许在组合使用治疗剂时减少治疗剂的给药的效果。
在实践组合疗法时,可以单一组合物形式或以两种或更多种使用相同或不同施用途经的不同组合物形式,将调节剂及抗癌剂同时施用于个体。或者,可在抗癌剂治疗之前或之后例如数分钟至数周范围内的时间间隔施用调节剂。各次递送之间的时间周期使抗癌剂及调节剂能够对肿瘤发挥组合作用。在至少一个实施方案中,抗癌剂及调节剂是彼此在约5分钟至约两周内施用。在其他实施方案中,施用调节剂与抗癌剂之间可间隔若干天(2、3、4、5、6或7)、若干周(1、2、3、4、5、6、7或8)或若干个月(1、2、3、4、5、6、7或8)。
组合疗法可施用一次、两次或至少一段时间直至病况得到治疗、减轻或治愈。在一些实施方案中,组合疗法是分多次施用,例如每天三次至每六个月一次。可根据诸如每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每六个月一次的时间表进行施用,或可经由微型真空泵连续施用。如上文说明,组合疗法可经由任何途径施用。组合疗法可施用在远离肿瘤位点的位点。
在一个实施方案中,调节剂是与一种或多种用于短治疗周期的抗癌剂组合而施用于有需要的个体。本发明亦涵盖不连续施用或分成若干部分施用的每日给药。调节剂及抗癌剂可在交替的天或周交替施用;或可进行一系列抗体治疗,接着进行抗癌剂疗法的一种或多种治疗。在任何情况下,如一般本领域技术人员将理解,化学治疗剂的合适剂量将通常与临床疗法(其中化学疗法是单独或与其他化学疗法组合施用)中已使用的剂量类似。
在另一优选实施方案中,本发明的SEZ6调节剂可用于维持疗法中以降低或消除疾病初始呈现后肿瘤复发概率。优选的是,病症将得到治疗且初始肿瘤块得以消除、减少或以其他方式改善,因此患者无症状或得到缓解。此时可向个体施用医药学上有效量的所公开的调节剂一次或多次,尽管使用标准诊断程序发现存在极少或不存在疾病的适应症。在一些实施方案中,调节剂将在一段时间内按规则时间表施用,诸如每周一次、每两周一次、每月一次、每六周一次、每两个月一次、每三个月一次、每六个月一次或每年一次。根据本文中的教导,本领域技术人员可容易地确定有利于降低疾病复发可能性的剂量及给药方案。此外,视患者反应及临床与诊断参数而定,所述治疗可持续数周、数月、数年的时段或甚至无限期地持续。
在又另一优选实施方案中,本发明的调节剂可预防性使用或作为佐剂疗法使用以预防或降低减积过程后肿瘤转移的可能性。如本发明中所使用,“减积过程”广泛定义且应意指消除、减少、治疗或改善肿瘤或肿瘤增殖的任何程序、技术或方法。示例性减积过程包括(但不限于)手术、辐射治疗(即束辐射)、化学疗法、免疫疗法或切除术。鉴于本发明公开内容,在本领域技术人员可容易确定的合适时间,可如临床、诊断或治疗诊断程序所提示,施用所公开的调节剂以降低肿瘤转移。调节剂可以医药学上有效剂量(如使用标准技术确定)施用一或多次。优选给药方案将由可对其进行改良的合适诊断或监测技术实现。
本发明的还有其他实施方案包含向无症状但具有发展增殖性病症的风险的个体施用所公开的调节剂。即,本发明的调节剂可以实际上预防意义使用且施用经检验或测试且具有一种或多种所述风险因素(例如基因组适应症、家族史、体内或体外测试结果等)但未发展赘瘤形成的患者。在所述情况下,本领域技术人员将能够经由经验观测或经由经认可的临床实践确定有效给药方案。
在一些实施方案中,所述SEZ6调节剂可以与多种第一线SCLC治疗诸如基于铂的药剂(例如卡铂,顺铂和/奥沙利铂)组合使用。在一个实施方案中,组合治疗包括使用SEZ6调节剂和基于铂的药剂(例如卡铂,顺铂和/或奥沙利铂)和任选的一种或多种其他治疗性结构部分。在另一个实施方案中,所述SEZ6调节剂可以与环磷酰胺和任选的多柔比星和/或长春新碱组合使用。在又另一个实施方案中,所述SEZ6调节剂可以与依托泊苷组合使用。在进一步实施方案中,所述SEZ6调节剂可以与托泊替康或紫杉醇组合使用。
在其他实施方案中,所述SEZ6调节剂可与各种第一线髓样甲状腺治疗诸如卡博替尼(cabozantinib)或凡德他尼组合使用。在一个实施方案中,组合治疗包括使用SEZ6调节剂和卡博替尼(cabozantinib)和任选的一种或多种其他治疗性结构部分。在另一个实施方案中,组合治疗包括使用SEZ6调节剂和凡德他尼和任选的一种或多种其他治疗性结构部分。
组合疗法可以包括与另一种治疗性结构部分组合的SEZ6调节剂,所述另一种治疗性结构部分对包含突变或异常表达的基因或蛋白质的髓样甲状腺肿瘤有效(例如RET)。
本发明还提供了SEZ6调节剂与放疗的组合。在其他实施方案中,SEZ6调节剂可以与一种或多种下述的抗癌剂组合使用。
D.抗癌剂
术语“抗癌剂”或“抗增殖性剂(抗增殖剂)”意指任何可用于治疗细胞增殖性病症(诸如癌症)的试剂,且包括(但不限于)细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、抗血管生成剂、减积剂、化学治疗剂、放射疗法及放射治疗剂、靶向抗癌剂、BRM、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、辐射疗法以及抗转移剂及免疫治疗剂。应当理解的是,在如以上所讨论的选定的实施方案中,这样的抗癌剂可以包含缀合物,并且可在施用前与调节剂缔合。在某些实施方案中,将所公开的抗癌剂与SEZ6调节剂连接,以提供如本文所述的ADC。
如本文中所用,术语“细胞毒性剂”意指对细胞具有毒性且可降低或抑制细胞功能及/或引起细胞破坏的物质。通常,该物质为来源于活生物体的天然存在的分子。细胞毒性剂的实施例包括(但不限于)细菌(例如白喉毒素(Diptheriatoxin)、假单胞菌(Pseudomonas)内毒素及外毒素、葡萄球菌肠毒素A(StaphylococcalenterotoxinA))、真菌(例如α-帚曲菌素(α-sarcin)、局限曲菌素(restrictocin))、植物(例如相思豆毒素、蓖麻毒素、蒴莲根毒素(modeccin)、槲寄生素(viscumin)、商陆抗病毒蛋白质(pokeweedanti-viralprotein)、沙泊宁(saporin)、白树毒素(gelonin)、地肤子皂苷(momoridin)、天花粉蛋白(trichosanthin)、大麦毒素、油桐蛋白质(Aleuritesfordiiprotein)、石竹素蛋白质(dianthinprotein)、商陆大蠊蛋白质(PhytolaccaMericanaprotein)(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制剂(Momordicacharantiainhibitor)、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草抑制剂(saponariaofficinalisinhibitor)、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitegellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、新霉素(neomycin)及霉菌毒素(tricothecene))或动物(例如细胞毒性RNase,诸如细胞外胰脏RNase;DNaseI,包括其片段及/或变体)的小分子毒素或酶促活性毒素。
为了本发明的目的,“化学治疗剂”包含非特异性降低或抑制癌细胞的生长、增殖及/或存活的化合物(例如细胞毒性剂或细胞生长抑制剂)。所述化学试剂通常针对细胞生长或***所必需的细胞内过程,且因此对癌性细胞(其通常快速生长及***)尤其有效。例如,长春新碱(vincristine)使微管脱聚合,且因此抑制细胞进入有丝***。通常,化学治疗剂可包括任何抑制或经设计以抑制癌性细胞或可能变为癌性或产生致瘤后代的细胞(例如TIC)的化学试剂。所述试剂通常组合施用且通常在以组合形式时最有效,例如在诸如CHOP或FOLFIRI的方案中。再次,在选定的实施方案中,所述化疗剂可缀合于所公开的调节剂。
可与本发明的调节剂组合(或缀合)使用的抗癌剂的实例包括(但不限于)烷化剂、烷基磺酸盐(或酯)、氮丙啶、乙烯亚胺及甲基阿美胺(methylamelamine)、多聚乙酰(acetogenin)、喜树碱(camptothecin)、苔藓抑素(bryostatin)、卡利士他汀(callystatin)、CC-1065、克瑞托欣(cryptophycins)、多拉司他汀(dolastatin)、多卡米星(duocarmycin)、艾榴素(eleutherobin)、水鬼蕉碱(pancratistatin)、沙克迪因(sarcodictyin)、海绵素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔抗生素、烯二炔蒽环类抗生素(dynemicin)、双膦酸盐(或酯)、埃斯波霉素(esperamicin)、色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C、卡拉宾辛(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素类(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正白氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、博地霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物、埃罗替尼(erlotinib)、威罗菲尼(vemurafenib)、克唑替尼(crizotinib)、索拉非尼(sorafenib)、依鲁替尼(ibrutinib)、恩杂鲁胺(enzalutamide)、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗肾上腺素、叶酸补充剂(诸如弗林酸(frolinicacid))、醋葡醛内酯(aceglatone)、醛磷酰胺醣苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、贝斯布希(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依达曲沙(edatraxate)、迪夫法明(defofamine)、秋水仙胺(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、艾夫尼辛(elfornithine)、依利醋铵(elliptiniumacetate)、爱波喜龙(epothilone)、依托格鲁(etoglucid)、硝酸镓、羟基脲、香菇多醣(lentinan)、氯尼达明(lonidainine)、美坦生类化合物(maytansinoids)、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫丹摩尔(mopidanmol)、尼特林(nitraerine)、喷司他汀(pentostatin)、蛋胺氮芥(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索蒽醌(losoxantrone)、足叶草酸(podophyllinicacid)、2-乙基肼、丙卡巴肼、多醣复合物(polysaccharidecomplex)(JHSNaturalProducts,Eugene,OR)、丙亚胺;根霉素(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);锗螺胺(spirogermanium);细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid);三亚胺醌;2,2',2"-三氯三乙基胺;单端孢霉烯类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、维拉库林A(verracurinA)、杆孢菌素A(roridinA)及蛇形菌素(anguidine));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine);达卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥;二溴甘露醇;二溴卫矛醇(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);卡西托欣(gacytosine);***糖苷(arabinoside)(“Ara-C”);环磷酰胺;噻替派(thiotepa);紫杉烷(taxoids)、苯丁酸氮芥(chloranbucil);吉西他滨(gemcitabine);6-硫鸟嘌呤;巯嘌呤;甲氨喋呤;铂类似物、长春碱(vinblastine);铂;依托泊苷(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺;米托蒽醌(mitoxantrone);长春新碱(vincristine);长春瑞滨(vinorelbine);诺消灵(novantrone);替尼泊苷(teniposide);依达曲沙(edatrexate);柔红霉素;氨基喋呤;希罗达(xeloda);伊班膦酸盐(或酯)(ibandronate);伊立替康(irinotecan)(Camptosar,CPT-11)、拓扑异构酶抑制剂RFS2000;二氟甲基鸟氨酸;类视色素;卡培他滨(capecitabine);考布他汀(combretastatin);甲酰四氢叶酸(leucovorin);草酸铂;PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR及VEGF-A的抑制剂(其降低细胞增殖)及以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。此定义中亦包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂,诸如抗***及选择性***受体调节剂、抑制调节肾上腺中的***产生的芳香酶的芳香酶抑制剂及抗雄激素;以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物);反义寡核苷酸;核糖核酸酶,诸如VEGF表达抑制剂及HER2表达抑制剂;疫苗、rIL-2;拓扑异构酶1抑制剂;rmRH;长春瑞宾及埃斯波霉素(Esperamicin),及以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在其他实施方案中,本发明的调节剂可与当前处于临床试验或市售的多种抗体(或免疫治疗剂)中的任一者组合使用。为此,所公开的调节剂可与选自由以下组成的组的抗体组合使用:阿巴伏单抗(abagovomab)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿托珠单抗(afutuzumab)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、阿妥莫单抗(altumomab)、阿玛图单抗(amatuximab)、阿纳图单抗(anatumomab)、阿西莫单抗(arcitumomab)、巴维昔单抗(bavituximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、比伐珠单抗(bivatuzumab)、兰妥莫单抗(blinatumomab)、贝土西单抗(brentuximab)、坎土珠单抗(cantuzumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、西妥昔单抗(cetuximab)、西他珠单抗(citatuzumab)、西妥木单抗(cixutumumab)、西瓦图单抗(clivatuzumab)、可那木单抗(conatumumab)、达雷木单抗(daratumumab)、多兹图单抗(drozitumab)、杜利图单抗(duligotumab)、杜斯图单抗(dusigitumab)、地莫单抗(detumomab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达洛图单抗(dalotuzumab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依洛珠单抗(elotuzumab)、恩斯图单抗(ensituximab)、厄马索单抗(ertumaxomab)、埃达珠单抗(etaracizumab)、法利珠单抗(farletuzumab)、非拉珠单抗(ficlatuzumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、福沃图单抗(flanvotumab)、福图西单抗(futuximab)、盖尼图单抗(ganitumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、吉瑞昔单抗(girentuximab)、吉乐木单抗(glembatumumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、伊戈伏单抗(igovomab)、伊加图单抗(imgatuzumab)、因达西单抗(indatuximab)、依珠单抗(inotuzumab)、英妥木单抗(intetumumab)、伊匹木单抗(ipilimumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、洛沃图单抗(lorvotuzumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫西图单抗(moxetumomab)、拉纳图单抗(narnatumab)、那图莫单抗(naptumomab)、奈昔木单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、诺非图单抗(诺莫单抗)(nofetumomabn)、奥卡拉单抗(ocaratuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉珠单抗(olaratumab)、奥纳珠单抗(onartuzumab)、奥珀珠单抗(oportuzumab)、奥戈伏单抗(oregovomab)、帕木单抗(panitumumab)、帕撒图单抗(parsatuzumab)、帕瑞图单抗(patritumab)、派图单抗(pemtumomab)、培妥珠单抗(pertuzumab)、平妥单抗(pintumomab)、普立木单抗(pritumumab)、雷妥莫单抗(racotumomab)、拉德瑞单抗(radretumab)、利妥木单抗(rilotumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、罗妥木单抗(robatumumab)、沙妥莫单抗(satumomab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、斯图珠单抗(simtuzumab)、索利托单抗(solitomab)、塔卡珠单抗(tacatuzumab)、他普莫单抗(taplitumomab)、替妥莫单抗(tenatumomab)、替妥木单抗(teprotumumab)、替加珠单抗(tigatuzumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、图土珠单抗(tucotuzumab)、乌利昔单抗(ublituximab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、沃瑟珠单抗(vorsetuzumab)、伏妥莫单抗(votumumab)、扎芦木单抗(zalutumumab)、CC49、3F8及其组合。
其他尤其优选实施方案将包括使用认可用于癌症疗法的抗体,包括(但不限于)利妥昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumabozogamcin)、阿仑单抗、替坦异贝莫单抗(ibritumomabtiuxetan)、托西莫单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、帕木单抗、奥法木单抗、伊匹木单抗及维汀贝土西单抗(brentuximabvedotin)。本领域技术人员将能够容易地鉴别其他与本文中的教导相容的抗癌剂。
E.放射疗法
本发明亦提供调节剂与放射疗法(即任何用于诱导肿瘤细胞内局部DNA损害的机制,诸如γ辐射、X射线、UV辐射、微波、电子发射及其类似物)的组合。亦涵盖使用放射性同位素至肿瘤细胞的定向递送的组合疗法,且可与靶向抗癌剂或其他靶向手段结合使用。通常,放射疗法经约1周至约2周的时段以脉冲形式施用。放射疗法可施用于患有头颈癌的个体,持续约6周至7周。任选地,放射疗法可以单次剂量或以多次连续剂量施用。
XI.适应症
应了解,本发明的调节剂可用于诊断、治疗或抑制任何SEZ6相关病症的发生或复发。因此,无论单独施用或与抗癌剂或放射疗法以组合形式施用,本发明的调节剂尤其适用于通常治疗患者或个体中的赘生性病况,其包括良性或恶性肿瘤(例如肾上腺、肝脏、肾、膀胱、乳腺、胃、卵巢、结肠直肠的、***、胰脏、肺、甲状腺、肝、子宫颈、子宫内膜、食道及子宫癌瘤;肉瘤;神经胶母细胞瘤;及各种头颈肿瘤);白血病及淋巴恶性肿瘤;其他病症,诸如神经元、神经胶质、星形细胞、下丘脑及其他腺、巨噬细胞、上皮、基质及囊胚腔病症;以及发炎性、血管生成、免疫病症及由病原体引起的病症。具体而言,关键治疗目标为赘生性病况,包含实体肿瘤,虽然本发明的范围涵盖血液恶性肿瘤。优选地,待治疗的“个体”或“患者”将是人,虽然如本文中所用,该术语明确地保持包含任何哺乳动物物种。
更具体而言,根据本发明经受治疗的赘生性病况可选自包括(但不限于)以下的组:肾上腺肿瘤、AIDS相关癌症、腺泡状软组织肉瘤、星形细胞肿瘤、膀胱癌(鳞状细胞癌及移行细胞癌)、骨癌(釉质瘤、动脉瘤样骨囊肿、骨软骨瘤、骨肉瘤)、脑癌及脊髓癌、转移性脑肿瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、子***、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色细胞型肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤良性纤维性组织细胞瘤、促***增殖性小圆形细胞肿瘤、室管膜瘤、尤因氏瘤(Ewing'stumor)、骨外黏液样软骨肉瘤、骨纤维生成不良、骨纤维性结构不良、胆囊癌及胆管癌、妊娠期滋养层疾病、生殖细胞肿瘤、头颈癌、胰岛细胞瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi'sSarcoma)、肾癌(肾母细胞瘤、***状肾细胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤肿瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤肿瘤、肝癌(肝母细胞瘤、肝细胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小细胞癌、腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌等)、神经管母细胞瘤、黑色素瘤、脊膜瘤、多发性内分泌瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良综合征、神经母细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、***状甲状腺癌、甲状旁腺肿瘤、儿童癌症、周边神经鞘肿瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、***癌、后葡萄膜黑色素瘤(posteriousunvealmelanoma)、罕见血液病症、转移性肾癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、转移性甲状腺癌及子宫癌(子***、子宫内膜癌及平滑肌瘤)。
在某些优选实施方案中,增殖性病症将包含实体肿瘤,包括(但不限于)肾上腺、肝脏、肾、膀胱、***、胃、卵巢、子宫颈、子宫、食道、结肠直肠、***、胰脏、肺(小细胞及非小细胞)、甲状腺、癌瘤、肉瘤、神经胶母细胞瘤及各种头颈肿瘤。在其他优选实施方案中,且如以下实施例中所示,所公开的调节剂可尤其有效治疗小细胞肺癌(SCLC)及非小细胞肺癌(NSCLC)(例如鳞状细胞非小细胞肺癌或鳞状细胞小细胞肺癌)。
在一个实施方案中,所述小细胞或非小细胞肺癌为紫杉烷(例如多西他赛、紫杉酚(paclitaxel)、拉罗他赛(larotaxel)或卡巴他赛(cabazitaxel))及/或以铂为基础的药剂基于铂的药剂(例如卡铂、顺铂、草酸铂、拓扑替康(topotecan)等)顽抗难治性、复发性或对其具有抗性。至于关于基于铂的试剂基于铂的药剂,用于SCLC的主要标准的护理化疗是组合的与顺铂和依托泊苷组合。治疗的过程之后,许多患者对基于铂的试剂基于铂的药剂产生变得耐药性(Stewart,2004;PMID:20047843)。存在对基于铂的药物的耐药性的多种机制,包括膜组成的分更改改变,增加的缺氧,降低的铜转运蛋白基因的表达,和增加的多药耐药基因的表达,等其他机制。鉴于将首先采用标准的护理治疗对大多数SCLC患者进行治疗,在本发明的一些实施方案中,本文公开的抗体可用于治疗没有反应响应或复发的患者。初始铂响应性高,但大多数癌症患者最终将复发,伴有顺铂耐药的疾病。在特别优选的实施方案中,所公开的调节剂可以在缀合形式中被用于治疗小细胞肺癌。在其他优选的实施方案中,所公开的调节剂可以在缀合形式中被用于在有需要的个体中治疗对铂具有耐药性的小细胞肺癌。关于小细胞肺癌,特别优选的实施方案将包括施用缀合的调节剂(ADC)。在所选实施方案中,缀合的调节剂将施用于呈现局限期(limitedstage)疾病的患者。在其他实施方案中,所公开的调节剂将施用于呈现扩散期(extensivestage)疾病的患者。在其他优选实施方案中,所公开的缀合调节剂将施用于顽抗难治性患者(即在初始疗程期间或在初始疗程完成之后不久复发的患者)。还有其他实施方案包含向敏感患者(即在基本疗法后超过2-3个月复发的患者)施用所公开的调节剂。在各种情况下,应了解,根据所选给药方案及临床诊断,相容的缀合物可以是缀合或未缀合状态。
如上文所论述,所公开的调节剂可进一步用于预防、治疗或诊断具有神经内分泌特征的肿瘤或包括神经内分泌肿瘤的表型。由扩散的内分泌***引起的真性或正则(canonical)神经内分泌肿瘤(NET)相对罕见,其发病率为每100,000人中2-5名,但具有高侵袭性。神经内分泌肿瘤在肾、泌尿生殖道(膀胱、***、卵巢、子宫颈及子宫内膜)、胃肠道(结肠、胃)、甲状腺(骨髓甲状腺癌)及肺(小细胞肺癌瘤及大细胞神经内分泌癌瘤)中发生。这些肿瘤可分泌若干种激素,其包括血清素及/或嗜铬粒蛋白A,其可引起衰竭性症状,称为类癌瘤综合征。所述肿瘤可由阳性免疫组织化学标记(诸如神经元特异性烯醇酶(NSE,亦称为γ烯醇酶,基因符号=ENO2)、CD56(或NCAM1)、嗜铬粒蛋白A(CHGA)及突触素(SYP))或已知呈现升高的表达的基因(诸如ASCL1)表示。不幸的是,常规化学疗法通常无法尤其有效地治疗NET及肝脏转移。
在本发明的一些实施方案中,包含直接或间接缀合至治疗性结构部分的抗体的抗体药物缀合物(其中该抗体特异性结合SEZ6)可用于治疗患有癌症(例如,甲状腺髓样癌)的个体。在优选的实施方案中,用于治疗癌症(例如甲状腺髓样癌)的抗体药物缀合物将包含抗SEZ6抗体,其包含含有如在图10A所述的三个CDR的轻链可变区,和含有如图10B所述的三个CDR的重链可变区。在其他实施方案中,用于治疗患有癌症(例如,甲状腺髓样癌)的个体的抗体药物缀合物可与包含在图10A和10B所列的轻链和重链可变区的抗SEZ6抗体竞争。在又另一个实施方案中,用于治疗患有癌症(例如,甲状腺髓样癌)的个体的抗体药物缀合物可包含人源化抗SEZ6抗体,例如,hSC17.16、hSC17.17、hSC17.24、hSC17.28、hSC17.34、hSC17.46、hSC17.151、hSC17.155、hSC17.156、hSC17.161和hSC17.200(如在图10A和10B中所述)和与这种人源化抗体竞争的任何抗体。在本发明的其他实施方案中,包含直接或间接缀合至治疗性结构部分的抗体药物缀合物(其中该抗体特异性结合SEZ6的抗体)可用于治疗患有小细胞肺癌(例如,对铂具有耐药性的小细胞肺癌)的个体。在优选的实施方案中,用于治疗患有小细胞肺癌(例如对铂具有耐药性的小细胞肺癌)的个体的抗体药物缀合物可包含人源化抗SEZ6抗体,例如,hSC17.16、hSC17.17、hSC17.24、hSC17.28、hSC17.34、hSC17.46、hSC17.151、hSC17.155、hSC17.156、hSC17.161和hSC17.200(如图10A和10B中所述)和与这种人源化抗体竞争的任何抗体。在优选的实施方案中,先前已经采用基于铂的药剂治疗患有小细胞肺癌的个体。
尽管所公开的调节剂可有利地用于治疗神经内分泌肿瘤,但其亦可用于治疗、预防或诊断伪神经内分泌肿瘤(pNET),所述伪神经内分泌肿瘤以基因型方式或以表型方式模仿、类似或呈现与正则神经内分泌肿瘤的共有特性。伪神经内分泌肿瘤或具有神经内分泌特征的肿瘤为由弥漫性神经内分泌***的细胞或其中神经内分泌分化级联在致癌过程期间异常再活化的细胞引起的肿瘤。所述pNET通常与常规定义的神经内分泌肿瘤共有某些表型或生物化学特征,包括产生生物学活性胺、神经传递素及肽激素的子集的能力。组织学上,所述肿瘤(NET及pNET)共有共同外观,其通常展示密集连接的具有最小细胞质(无刺激细胞病理学(blandcytopathology))及圆形至椭圆形点状细胞核的小细胞。为了本发明的目的,可用于定义神经内分泌及伪神经内分泌肿瘤的通常表达的组织学标记或遗传标记包括(但不限于)嗜铬粒蛋白A、CD56、突触素、PGP9.5、ASCL1及神经元特异性烯醇酶(NSE)。
因此,本发明的调节剂可有利地用于治疗伪神经内分泌肿瘤及正则神经内分泌肿瘤。在此方面,调节剂可如本文中所描述用于治疗肾、泌尿生殖道(膀胱、***、卵巢、子宫颈及子宫内膜)、胃肠道(结肠、胃)、甲状腺(髓性甲状腺癌)及肺(小细胞肺癌瘤及大细胞神经内分泌癌瘤)中产生的神经内分泌肿瘤(NET及pNET)。此外,本发明的调节剂可用于治疗表达一种或多种选自由NSE、CD56、突触素、嗜铬粒蛋白A、ASCL1及PGP9.5(UCHL1)组成的组的标记的肿瘤。即,本发明可用于治疗罹患肿瘤(其为NSE+或CD56+或PGP9.5+或ASCL1+或SYP+或CHGA+或其一些组合)的个体。
关于血液恶性疾病,应进一步了解,本发明的化合物及方法可尤其有效治疗各种B细胞淋巴瘤,包括低度/NHL滤泡性细胞淋巴瘤(FCC)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中度/滤泡性NHL、中度弥漫性NHL、高度免疫母细胞性NHL、高度淋巴母细胞性NHL、高度小无核裂细胞NHL、巨瘤性疾病(bulkydisease)NHL、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'sMacroglobulinemia)、淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、伯基特淋巴瘤(Burkitt'slymphoma;BL)、AIDS相关淋巴瘤、单核细胞性B细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴腺病、小淋巴细胞性、滤泡性、弥漫性大细胞、弥漫性小核裂细胞、大细胞免疫母细胞性淋巴母细胞瘤、小无核裂性伯基特与非伯基特滤泡性、主要大细胞淋巴瘤;滤泡性、主要小核裂细胞淋巴瘤;及滤泡性、混合小核裂细胞与大细胞淋巴瘤。参见Gaidono等人,“Lymphomas”,INCANCER:PRINCIPLES&PRACTICEOFONCOLOGY,第2卷:2131-2145(DeVita等人编,第5期增刊1997)。本领域技术人员应了解,由于改变分类***,故这些淋巴瘤通常将具有不同名称,且具有归类为不同名称的淋巴瘤的患者亦可受益于本发明的组合治疗方案。
本发明亦提供呈现良性或癌前肿瘤的个体的预防性或防范性治疗。除SEZ6相关病症外,相信使用本发明的治疗亦不应排除任何特定类型的肿瘤或增殖性病症。然而,肿瘤细胞的类型可与本发明与第二治疗剂、尤其化学治疗剂及靶向抗癌剂的组合的使用有关。
VII.研究试剂
本发明的其他优选实施方案也利用所公开的调节剂作为工具的性质,所述工具可用于通过方法(诸如流式细胞术,荧光激活细胞分选(FACS),磁性活化细胞分选(MACS)或激光介导的切片)鉴定、监测、分离、切分或富集肿瘤起始细胞群或亚群。本领域技术人员将理解,所述调节剂可用于表征和操作TIC(包括癌症干细胞)的几种相容技术(例如,参见USSN12/686359,12/669136和12/757649,其各自通过引用整体并入本文)。
VIII.制品
亦提供包含一个或多个容器的医药包装及试剂盒,该一个或多个容器包含一种或多种剂量的SEZ6调节剂。在某些实施方案中,提供单位剂量,其中单位剂量含有预定量的包含例如抗-SEZ6缀合物的组合物(具有或不具有一种或多种其他试剂)。对于其他实施方案,该单位剂量供应于用于注射的单一用途预填充注射器中。在其他实施方案中,单位剂量中所含的组合物可包含生理食盐水、蔗糖或其类似物;缓冲液,诸如磷酸盐或其类似物;及/或配制在稳定且有效的pH值范围内。或者,在某些实施方案中,组合物可以冻干粉末形式提供,其可在添加合适液体(例如无菌水)时重构。在某些优选实施方案中,组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质,其包括(但不限于)蔗糖及精氨酸。容器上或与容器相关的任何标记均指示密封的组合物是用于诊断或治疗所选疾病病况。
本发明亦提供用于产生SEZ6调节剂及任选的一种或多种抗癌剂的单剂量或多剂量施用单元的试剂盒。试剂盒包含容器及容器上或与容器相关的标记或包装插页。合适容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由多种材料(诸如玻璃或塑胶)形成且含有医药学上有效量的呈缀合或未缀合形式的所公开的调节剂。在其他优选实施方案中,容器包含无菌进入孔(例如容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的阻塞物的小瓶)。所述试剂盒将通常在合适容器中含有SEZ6调节剂的药学上可接受的制剂及相同或不同容器中的任选的一种或多种抗癌剂。试剂盒亦可含有用于诊断或组合疗法的其他药学上可接受的制剂。例如,除本发明的SEZ6调节剂外,所述试剂盒可含有多种抗癌剂中的任一种或多种,抗癌剂诸如化学疗法或放射治疗药物;抗血管生成剂;抗转移剂;靶向抗癌剂;细胞毒性剂;及/或其他抗癌剂。此类试剂盒也可提供适当的试剂以缀合SEZ6调节剂与抗癌剂或诊断剂(例如,参见U.S.P.N.7,422,739,其通过引用整体并入本文中)。
更具体而言,试剂盒可具有单一容器,该单一容器含有SEZ6调节剂且具有或不具有其他组分,或其可具有用于各种期望的试剂的不同容器。当提供组合治疗剂进行缀合时,可将单一溶液以摩尔当量组合形式或以一种组分超过其他组分形式预混合。或者,试剂盒中的SEZ6调节剂及任何任选的抗癌剂可在施用于患者之前在不同容器内单独保存。试剂盒亦可包含用于含有药学上可接受的无菌缓冲液或其他稀释剂的第二/第三容器构件,该缓冲液或稀释剂为诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)、林格氏溶液及右旋糖溶液。
当试剂盒的组分是以一种或多种液体溶液形式提供时,液体溶液优选为水溶液,其中尤其优选为无菌水溶液。然而,试剂盒的组分可以干粉形式提供。当试剂或组分以干粉形式提供时,该粉末可通过添加合适溶剂来重构。预想该溶剂亦可提供于另一容器中。
如上文简要说明,试剂盒亦可含有用于将抗体及任何任选的组分施用于动物或患者的构件,例如一种或多种针或注射器或甚至点眼药器、吸管或其他该类设备,所述设备可用于将制剂注入或引入动物中或施用于身体的患病区域。本发明的试剂盒亦通常包括用于含有小瓶或诸如此类的构件,及市售的其他密闭组分,例如置放及保存期望的小瓶及其他设备的射出成形或吹塑成形塑料容器。任何标记或包装插页均指示SEZ6调节剂组合物用于治疗癌症,例如小细胞肺癌。
在其他优选实施方案中,本发明的调节剂可与适用于诊断或治疗增殖性病症的诊断或治疗性装置结合使用或包含所述装置。例如,在一个优选实施方案中,本发明的化合物及组合物可与某些诊断装置或器具组合,所述诊断装置或器具可用于检测、监测、定量或探测与增殖性病症的病源学或显现有关的细胞或标记化合物。对于所选实施方案,标记化合物可包含NSE、CD56、突触素、嗜铬粒蛋白A及PGP9.5。
在尤其优选实施方案中,装置可用于体内或体外检测、监测及/或定量循环肿瘤细胞(参见例如WO2012/0128801,其通过引用并入本文中)。在其他优选实施方案中且如上文所论述,循环肿瘤细胞可包含癌症干细胞。
XIV.其他内容
除非本文另有定义,否则与本发明结合使用的科学及技术术语应具有由普通本领域技术人员所通常理解的含义。此外,除非上下文另有所需,否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。更具体而言,除非上下文另外明确指示,否则如本说明书及随附权利要求中所使用,单数形式“一”及“该”包括复数个指示物。因此,例如,提及“蛋白质”包括复数个蛋白质;提及“细胞”包括细胞混合物及其类似物。此外,说明书及随附权利要求中所提供的范围包括端点及端点之间的所有点。因此,2.0至3.0的范围包括2.0、3.0及2.0与3.0之间的所有点。
通常,与本文所述的细胞及组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质及核酸化学及杂交结合使用的命名法及其技术为本领域中公知且常用的命名法及技术。除非另有指示,否则本发明的方法及技术通常根据本领域中公知的常规方法且如本说明书中通篇引用及论述的各种一般及更特定参考文献中所述来进行。参见例如Abbas等人,Cellular和MolecularImmunology,第6版,W.B.SaundersCompany(2010);SambrookJ.及RussellD.MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2000);Ausubel等人,ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley,John&Sons,Inc.(2002);Harlow及Lane,UsingAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1998);及Coligan等人,ShortProtocolsinProteinScience,Wiley,John&Sons,Inc.(2003)。酶促反应及纯化技术是根据制造商的说明书,如本领域中通常所实现或如本文中所述执行。关于本文中所描述的分析化学、合成有机化学以及医药及药物化学使用的命名法及所述学科的实验方法及技术为本领域中公知及常用的。此外,本文中所使用的任何章节标题是仅用于组织目的且不应视为限制所描述的主题。
XV.SEZ6参考文献
本说明书中公开或引用的所有参考文献或文件(没有限制)通过引用整体并入本文。此外,本文所用的任何部分标题仅用于组织的目的,而不应被解释为限制所描述的主题。
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XVI.序列表概述
本申请附有包含多种核酸及氨基酸序列的序列表。以下表2提供所包括的序列的概述。
表2
XVII.本发明的选择的实施方案
除了本文的公开内容,本发明涉及紧接下面具体阐述的选择的实施方案。
实施例
通过参考以下实施例(其通过举例说明的方式提供,并且不意欲限制本发明),从而一般地描述的本发明将更容易地被理解。实施例并不旨在表示以下实验是进行的全部或唯一的实验。除非另外指示,否则份数为重量份,分子量为重量平均分子量,温度以摄氏度计,且压力为大气压或近大气压。
实施例1
鉴定具有神经内分泌特征的肿瘤和采用全转录组测序分析标记物的表达
源于分散的内分泌***的神经内分泌肿瘤(NETs)是罕见的,具有2-5人每10万人的发病率,但是非常侵袭性。神经内分泌肿瘤存在于肾上腺,肾,泌尿生殖道(膀胱,***,卵巢,子宫颈和子宫内膜),胰腺,胃肠道(胃和结肠),甲状腺(髓样甲状腺癌),和肺(小细胞肺癌,大细胞神经内分泌癌,和类癌)。这些肿瘤可分泌几种激素,包括5-羟色胺和/或嗜铬粒蛋白A,其可导致称为类癌综合征的衰弱症状。这些肿瘤可以由阳性免疫组织化学标记物,如神经元特异性烯醇化酶(NSE,也被称为伽马烯醇化酶,基因符号=ENO2)、CD56/NCAM1、和突触素表示。传统的化学疗法都没有成功治疗NETs,且由于转移扩散的死亡率是常见的结果。不幸的是,在大多数情况下,手术是唯一可能治愈性治疗,条件是它发生早期检测之后和肿瘤转移之前。在这种情况下,进行研究以鉴定与包含神经内分泌特征的肿瘤相关新型治疗目标。
为了鉴定和表征这样的肿瘤(当它们在癌症患者中存在时),利用本领域公认的技术,开发和维持大量非传统的异种移植(NTX)肿瘤库。通过多次传代异质肿瘤细胞,在免疫功能低下的小鼠中,增殖包含相当数量的离散肿瘤细胞系的NTX肿瘤库,所述异质肿瘤细胞最初获自受各种实体瘤恶性肿瘤影响的众多癌症患者。(注意,在本文一些实施例和图中,所测试样品的传代数由附加到样品名称的p0-p#指示,其中p0指示直接从患者肿瘤获得的未传代样品,且p#指示测试前肿瘤已通过小鼠传代的次数。)大量具有良好定义的谱系的离散早代NTX肿瘤细胞系的持续可用性大大促进从细胞系纯化的细胞的鉴定和表征。在这样的工作中,使用最少传代的NTX细胞系简化体内实验,并提供可容易核查的结果。此外,早代NTX肿瘤响应于治疗剂,如伊立替康(即)和顺铂/依托泊苷方案,它为驱动肿瘤生长、对现有治疗的抗性和肿瘤复发的根本机制提供临床相关见解。
因为NTX肿瘤细胞系得到建立,以各种检查全局基因表达(globalgeneexpression)的方式表征它们的表型。为了鉴定库中哪些NTX系可能是NETs,通过全转录组测序和/或微阵列分析产生基因表达概况。具体地,检查数据,以鉴定表达高水平已知在NETs中升高或用作神经内分泌分化的组织化学标记物(例如,ASCL1,NCAM1,CHGA)的特定基因的肿瘤,以及表示NOTCH信号传导的抑制的NOTCH途径基因中的变化(例如,减少水平的NOTCH受体,和配体和效应分子的改变)的肿瘤。
更具体地,在如通常在严重免疫缺陷小鼠中为人肿瘤建立的各种NTX肿瘤细胞系后,将在肿瘤达到800-2000立方毫米后将肿瘤切除,并使用本领域公认的酶促消化技术将细胞解离和分散到悬浮液中(参见,例如,U.S.P.N.2007/0292414,其并入本文)。然后采用鼠细胞耗尽从这些NTX系离解的细胞制备物,且然后进一步通过荧光激活细胞分选分离人肿瘤细胞亚群,并将其在RLTplusRNA裂解缓冲液(Qiagen)中裂解。然后将这些裂解物贮存在-80℃,直到使用。解冻后,遵循供应商的说明用RNeasy分离试剂盒(Qiagen)提取总RNA,且再次使用制造商的方案和建议的仪器设置在NanoDrop分光光度计(ThermoScientific)和生物分析仪2100(AgilentTechnologies)上进行定量。所得总RNA制剂适合于基因测序和基因表达分析。
对来自NTX系的RNA样品,进行用AppliedBiosystems(ABI)SOLiD(边寡核苷酸连接/检测边测序)4.5或SOLiD5500xl新一代测序***(LifeTechnologies)的全转录组测序。使用来自ABI的被设计用于低输入总RNA的改良的全转录组(WT)方案,或OvationRNA-Seq***V2TM(NuGENTechnologiesInc.),从总RNA样品产生cDNA。改良的低输入WT方案使用1.0纳克总RNA以扩增在3'末端的mRNA,这导致绘图基因表达的重3'偏差,而NuGen的***允许在整个转录物更一致的扩增,并且包括采用随机六聚体的mRNA和非多聚腺苷酸化转录物cDNA的扩增。cDNA文库是片段化的,并加入条形码适配子以允许合并来自不同样品的片段文库。
ABI的SOLiD4.5以及SOLiD5500xl新一代测序平台实现来自多个NTX系和分选群的转录组的平行测序。从片段化且标有条形码的每个RNA样品构建cDNA文库。在每个片段文库上的条形码允许多个样品以相等浓度合并,并一起运行,同时确保样品特异性。使用ABI的SOLiDTMEZ珠子TM机器人***(该***确保样品一致性)通过乳液PCR采样。针对存在于合并物中单珠上的各克隆扩增片段,配对末端测序在5'到3'方向产生50个碱基读数和3'至5'的方向产生25个碱基。在5500xl平台的情况下,对于在上述的方法中合并的每个组8个样品,珠粒均匀沉积入在单个芯片上的6个单通道泳道。这将平均为8个样品中的每个生成5千万个50碱基读数和5千万个25碱基读数,并在肿瘤细胞中产生mRNA转录水平的非常精确的代表。由SOLiD平台产生的数据绘制到使用公布的人类基因组的NCBI版本hg19.2的RefSeq版本47注释的34609个基因,并且在大多数样品中提供RNA水平的可验证的测量。
SOLiD平台不仅能够捕获表达,而且能够捕获SNPs,已知和未知的替代剪接事件,小的非编码RNA,以及仅仅依据读数覆盖度的潜在的新外显子发现(唯一绘制到以前没有注释的基因组位置的读数)。因此,与专有数据分析和可视化软件配合的新一代测序平台的使用从而允许发现差异转录物表达以及表达的mRNA转录物的特定剪接变体的差异和/或偏好。使用度量RPM(每百万次读取)和RPKM(每百万次每千碱基读取),将来自SOLiD平台的测序数据名义上表示为转录物表达值,从而实现如标准做法的基本的差异表达分析。
四个小细胞肺癌(SCLC)肿瘤(LU73,LU64,LU86和LU95),一个卵巢肿瘤(OV26)和大细胞神经内分泌癌(LCNEC;LU37)的全转录组测序导致确定通常发现于NET的基因表达模式(图6A)。更具体地,这些肿瘤具有几个NET标记物的高表达(ASCL1,NCAM1,CHGA),以及刻缺蛋白受体和效应分子(例如,HES1,HEY1)的减少的水平和刻缺蛋白抑制的升高的标记物(例如,DLL3和HES6)。与此相反,4种正常肺样品,3种肺腺癌肿瘤(LU137,LU146和LU153)和3种鳞状细胞肺癌(LU49,LU70和LU76)都具有多种刻缺蛋白受体和效应分子的表达,并没有显示出刻缺蛋白抑制剂(如HES6和DLL3)的升高的表达。
此外,如在图6B中所示,将正常组织样品与具有神经内分泌特征的各种肺NTX群体进行比较的全转录组数据的分析表明,与测试的正常组织中极低或无转录表达相比,在具有神经内分泌特征的4种肺癌群体(LU73,LU64,LU86和LU95)中在mRNA转录水平上调SEZ6。这些结果表明,SEZ6可在特定癌症(包括具有神经内分泌特征的肺癌)的肿瘤发生和维持中起重要作用。在此基础上,SEZ6作为潜在的免疫治疗目标被选择用于进一步分析。
实施例2
在具有神经内分泌特征的选定NTX肿瘤中基因表达的微阵列和RT-PCR分析
为了鉴定在上述NTX库中的其他NETs(除了存在SOLiD全转录组数据的那些以外),使用微阵列分析研究更大组的NTX系。具体地,使用微阵列平台(PhalanxBiotechGroup)(其包含29187个探针,所述探针被设计为针对人类基因组中的19,380个基因),对来源于46个NTX系的整个肿瘤或2个正常组织的2-6μg的总RNA样品进行了分析。更具体地,RNA样品获自(如实施例1中所述)46个患者来源的全NTX肿瘤,其包含结肠直肠癌(CR),黑素瘤(SK),肾癌(KD),肺癌(LU),卵巢癌(OV),子宫内膜癌(EM),乳腺癌(BR),肝癌(LIV)或胰腺癌(PA)。正常结肠直肠(NormCR)和正常胰腺(NormPA)组织用作对照。还更具体地,肺肿瘤被进一步细分为小细胞肺癌(SCLC),鳞状细胞癌(SCC),或大细胞神经内分泌癌(LCNEC)。使用制造商的方案以一式三份运行RNA样品,并使用用于归一化和转化为每个样品中的主题基因获得的测量强度值的标准行业实践,对所得到的数据进行分析。名为hclust.2的R/BioConductor的套件包中不偏的PearsonSpearman分级聚类算法(unbiasedPearsonSpearmanhierarchicalclusteringalgorithm)被用来为这些48个样品创建标准的微阵列树状图。如在本领域中已知,R/BioConductor是学术界、金融和医药行业中广泛用于数据分析的开源的统计编程语言。一般来说,将肿瘤根据基因表达模式、表达强度等排列和簇集。
如图7A中所示,源自48个样品且跨所有19380个基因的树状图基于其肿瘤类型或源组织将NTX系簇集在一起。通常与神经内分泌表型相关的几种肿瘤一同簇集在由(1)表示的分支上;这些包括皮肤癌,若干肺癌和其他NETs。有趣的是,由(2)表示的亚分支,显示具有神经内分泌特征的两种大细胞肺癌(LU50.LCNEC和LU37.LCNEC)和小细胞肺癌(LU102.SCLC)与卵巢(OV26)和肾(KD66)肿瘤(簇C)一起簇集,这暗示这些后面的肿瘤也具有神经内分泌表型。此外,图7A显示由3个额外的SCLC肿瘤组成的簇D,并在它的右边是包含额外的SCLC肿瘤(LU100)和神经内分泌子宫内膜肿瘤(EM6)的小型簇(簇E)。基于学术文献和临床病理经验,簇D和E中所有的肿瘤一般被理解为具有一些神经内分泌特征。包含SCC的簇G可以在图7A的树状图的完全不同的分支上找到的事实表明该簇集不是完全由肿瘤起源器官驱动。
与NETs相关的基因标记物的集合(图7B)的更仔细检查表明,它们在包含簇C和D的肿瘤中强烈表达,而它们在簇G中的肿瘤(肺的鳞状细胞癌)中最低限度地表达,这提示簇C和D表示具有神经内分泌表型的NETs或肿瘤。更具体地,簇CNETs高度表达ASCL1,CALCA,CHGA,SST和NKX2-1,而簇DNETs高度表达CHGA,ENO2,和NCAM1,而正是这些神经内分泌表型基因的表达部分地负责这些肿瘤的簇集。一个有趣的特征是簇D中KIT的强表达,偶尔报道基因KIT与神经内分泌肿瘤有关,但显然在其他情况下与肿瘤发生相关。与这形成对比的是,簇G中的SCC肿瘤缺少任何这些基因的强表达(图7B)。
在簇C中的肿瘤显示与刻缺蛋白信号传导的减少一致的表型:缺乏任何刻缺蛋白受体的表达,相对缺乏JAG1和HES1表达,和强劲水平的ASCL1表达(图7C)。有趣的是,簇D显示HES6(可通过形成异源二聚体而拮抗HES1活性以支持ASCL1活性的转录因子)的高表达。
鉴于上述结果,用AppliedBiosystems7900HT机器(LifeTechnologies),从各种NTX系和正常组织检查HES6的mRNA表达,以按照制造商的方案,执行Taqman实时定量RT-PCR(qRT-PCR)。RNA如上所述进行分离和检查,以确保质量适于基因表达分析。来自正常组织的RNA是购买的(AgilentTechnologies和LifeTechnologies)。200纳克RNA用于使用cDNA档案试剂盒(LifeTechnologies)的cDNA合成。cDNA用于在Taqman低密度阵列(TLDA;LifeTechnologies)(其包含了HES6Taqman分析来测量HES6的mRNA水平)上的qRT-PCR分析。
归一化至内源对照后,针对各NTX系或正常组织样品显示了HES6mRNA水平(图上的单点)。归一化值相对于在毒性关注的正常组织(NormTox)的平均表达作图。这种技术允许通过HES6和其他相关标记物的测量从NTX肿瘤库快速鉴定和表征具有神经内分泌特征的肿瘤。图7D示出了,与正常组织(乳腺,结肠,肝)和其他选定的肿瘤相比,在具有神经内分泌特征的采样的肿瘤中HES6的一般过表达(例如,LU-SCLC,LU-LCNEC)。显著的是,这些微阵列和qPCR数据表明,至少一些子宫内膜、肾和卵巢肿瘤可以表现出神经内分泌肿瘤特征(图7A和图7D)。
如上所述所产生的微阵列数据不仅显示,簇C、D和E中的肿瘤表现出各种神经内分泌标记物,而且还显示,在那些簇中的肿瘤表达指示神经发生、神经承诺或朝神经命运的分化的标记物(图7E)。特别感兴趣的是,簇D中的肿瘤经常显示出许多这些标记物的更强大和更一致的上调(例如,BEX1和BEX4,CD56,NRCAM,SEMA受体,SOX和ZIC因子),和相对于其他簇的经常减少的激素上调,这表明更神经的表型。值得注意的是,那些相同簇中的肿瘤也显示出高水平的SEZ6转录物,这表明SEZ6与具有神经内分泌和神经特征的肿瘤相关联(图7F)。
实施例3
SEZ6mRNA在具有神经内分泌和神经特征的肿瘤中的表达
各种技术被用来鉴定表现出神经内分泌特征的肿瘤,包括全转录组测序(实施例1)和微阵列和qRT-PCR(实施例2)。对这样产生的数据进行进一步分析,以找到与非神经内分泌肿瘤和正常组织相比在神经内分泌肿瘤中高表达的潜在治疗目标。如实施例1中所讨论,发现SEZ6(即主要表达于正常脑的单次跨膜蛋白)在许多神经内分泌肿瘤中具有高表达(图6B)。
实施例2中所产生的微阵列数据表明,位于簇C、D和E中的肿瘤表达神经内分泌标记物(图7B)和神经标记物(图7E)。在那些相同簇中的肿瘤也显示出高水平的SEZ6转录物,这表明SEZ6与具有神经内分泌和神经特征的肿瘤相关联(图7F)。这与SEZ6在出生后前脑发育和在成体中海马特定区域中持续表达的已知作用相一致。SEZ6被认为在细胞-细胞识别和信号传导中发挥重要作用。经常,发育途径在肿瘤中不适当地表达。
为了确定在各种样品NTX肿瘤系中SEZ6mRNA表达水平,基本上如上述实施例2中所描述使用SEZ6Taqman分析进行qRT-PCR。图8A示出了相对于正常组织的平均表达并且针对内源性对照基因ALAS1的表达均一化的SEZ6表达。与正常组织相比,SEZ6基因表达在神经内分泌NTX群体中升高多于10,000,000倍。图8A中所示的SCLCNTX系中的五个是从最初活检样品(p0)直接提取的mRNA样品。SEZ6在这些未传代肿瘤中的表达表明SEZ6表达不是小鼠中正在生长的人类肿瘤导致的人为现象。NSCLC的三种亚型也表示在图8A中:LU25是梭形细胞癌,LU50是大细胞神经内分泌癌(LCNEC)且LU85是鳞状细胞癌(SCC)。KDY66和OV26,肾和卵巢肿瘤,分别与SCLC和LCNEC肿瘤(图7A)簇集在微阵列上,这表明它们也有神经内分泌特征。
为了将SEZ6表达的分析扩展到更广泛的肿瘤标本,采用FluidigmBioMarkTMHD***进行qRT-PCR。简言之,使用cDNA档案试剂盒(LifeTechnologies),将1纳克如实施例1所述制备的RNA转化为cDNA。用SEZ6特异性Taqman分析将cDNA预扩增,然后将其用于执行qRT-PCR。在正常组织(NormTox或Norm)中的表达与在以下NTX系中的表达相比,其中在括号中的数字表示测试的独特NTX系的数目:BR(13),CR(24),KDY(10),OV(35),PA(21),肺腺癌(LU-腺)(23),LU-CAR(1),LU-LCC(8),SCC(12),SCLC(30)和甲状腺髓样癌(THY)(1)(图8B)。SCLC、THYLU-CAR和LC-LCCNTX显示SEZ6的最高表达,虽然与正常组织样品相比SEZ6的一些表达也见于OV,PA,BR,CR和LU-腺NTX系。
“NormTox”代表正常组织的下列样品:一个肾上腺,四个结肠,四个肾,四个肝,三个肺,三个胰腺,三个心脏,三个食道,一个骨骼肌,一个皮肤,二个真皮成纤维细胞,二个角化细胞,三个小肠,一个脾,二个胃,和两个气管样品。另一组指定为“Norm”的正常组织代表正常组织的下列样品:脂肪细胞,B细胞,膀胱,脑,乳腺,宫颈,黑素细胞,单核细胞,NK细胞,卵巢,外周血单核细胞,胎盘,***,唾液腺,T细胞,睾丸,胸腺和甲状腺。大多数正常组织没有SEZ6的表达,而低表达见于胰腺、结肠、肝和肺中,且高表达见于脑中。对各种NTX肿瘤系进行不同的SEZ6特异性Taqman分析(使用基本上与上述相同的方法)。为每种类型的肿瘤测试的肿瘤系的数目被表示为分母,而表达的SEZ6的肿瘤的数目被表示为分子:2/6CR,2/4GA,1/1GB(成胶质细胞瘤),1/1KDY,2/6SK,2/5LU-腺,4/4LCNEC,2/7LU-SCC,SCLC9/9和1/2OV(数据未显示)。
总之,这些数据表明,SEZ6在表现出神经内分泌和神经特征的肿瘤中上调,表明它可作为治疗目标用于治疗这些类型的肿瘤。
实施例4
使用QRT-PCR的SEZ6mRA在多种肿瘤及正常组织标本中的表达
为了将SEZ6表达的分析扩展到更广泛的肿瘤标本,基本上如先前实施例中所述,在TissueScanTMqPCR(OrigeneTechnologies)384孔阵列上,执行TaqmanqRT-PCR。该阵列能够跨越18个不同实体瘤类型比较基因表达,每个肿瘤采用多个患者来源的样品,且来自正常的邻近组织。
在这方面,图9A和9B分别显示,来自具有十八种不同实体瘤类型之一的患者的整个肿瘤标本(灰色点)或正常相邻组织(NAT;白点)中的SEZ6的绝对和相对基因表达水平。更具体地,图9A示出了各种全肿瘤标本或匹配的正常相邻组织中SEZ6的绝对mRNA表达水平。图9B示出针对β-肌动蛋白归一化且相对于分析的每个肿瘤类型的正常附近组织中的表达进行绘图的SEZ6的表达水平。在其中没有检测出SEZ6的标本被分配为50的Ct值,其表示在实验方案中扩增的最后一个循环。每个点代表单个组织标本,几何平均值表示为黑线。
使用这种Origene阵列,SEZ6的过表达发现于肾上腺、肝、肺、卵巢和胰腺癌的子集,其中许多可代表神经内分泌肿瘤或具有低分化神经内分泌表型的肿瘤。这包括在1/1甲状腺髓样癌和1/3甲状腺滤泡变体的***状癌,8/8神经内分泌胰腺肿瘤,4/4胰岛细胞瘤,1/2大细胞神经内分泌肺癌,和3/3肺类癌肿瘤中的高表达。如由图9A中的绝对基因表达所示,正常睾丸和胰腺是具有SEZ6高表达的唯一正常组织。这表明SEZ6可在多种肿瘤(包括但不限于具有神经内分泌和神经特征的肿瘤)中的肿瘤发生和/或肿瘤进展中发挥作用。
实施例5
重组SEZ6蛋白的克隆和表达
人类SEZ6(hSEZ6)
SEZ6同工型1和SEZ6同工型2(SEQIDNO:4)蛋白质的氨基酸序列(SEQIDNO:3)分别描述于图1C和1D。每个SEZ6同工型的胞外结构域是相同的。在图1C和1D中,前导序列(包含19个氨基酸)是黑体且加下划线的。SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的每个的氨基酸残基的剩余部分包含成熟SEZ6蛋白。为了产生和开发本发明中所要求的涉及人SEZ6的所有分子和细胞材料,如下生成编码完整成熟的人SEZ6蛋白(图3B,SEQIDNO:6)的cDNA(图3A;SEQIDNO:5)。商业人类SEZ6cDNA购自OpenBiosystems,其中该cDNA序列对应于NCBI登录BC146292。序列比对显示出由BC146292编码的蛋白质与编码内源人SEZ6蛋白的RefSeqNP_849191编码的蛋白质不同之处在于几个残基(见残基414、415和417,图3C)。PCR用于从BC146292克隆扩增两个单独的cDNA片段,其中使用的引物在重叠PCR的过程中将所需变化引入cDNA的残基414-417处,以生成编码成熟SEZ6蛋白的cDNA,所述成熟SEZ6蛋白与NM_178860编码的蛋白具有相同的序列,所述NM_178860是编码内源人SEZ6蛋白的mRNA序列。修复的cDNA克隆,称为hSEZ6(图3A),被用于表达成熟人SEZ6蛋白或其片段的构建体的所有后续工程改造。
为了产生针对SEZ6分子具有免疫反应性或免疫特异性调节剂,产生嵌合融合基因,其中人SEZ6蛋白的ECD部分融合到人类IgG2Fc结构域(图4A,SEQIDNO:8)。这如下完成:使用标准的分子技术,从hSEZ6cDNA克隆PCR扩增编码SEZ6的ECD的cDNA(图3A),且该PCR产物随后被同框亚克隆到IgK信号肽序列下游和人IgG2FccDNA的上游的CMV驱动的表达载体。编码hSEZ6-Fc融合蛋白的cDNA序列(称为hSEZ6-FcORF)示于图4A;通过hSEZ6-FcORF所编码的相应蛋白质序列示于图4B(SEQIDNO:9)。序列的下划线区域对应于人类IgG2Fc。粗体下划线区域对应于IgK信号肽,且粗体序列对应于由SEZ6ECD侧翼克隆限制性位点编码的融合蛋白的部分。
为了产生重组hSEZ6ECD蛋白,使用了类似的基于PCR的策略。编码SEZ6的ECD的cDNA片段从hSEZ6cDNA克隆扩增并亚克隆到IgK信号肽序列的同框下游和编码9组氨酸表位标签的序列的同框上游的CMV驱动的表达载体中(SEQIDNO:201)。
该CMV驱动的表达载体允许在HEK-293T和/或CHO-S细胞中高水平瞬时表达。使用聚乙烯亚胺聚合物作为转染试剂,HEK-293T细胞的悬浮液或贴壁培养物,或CHO-S细胞悬浮液用编码hSEZ6ECD-Fc或hSEZ6-ECD-His蛋白质的表达构建体转染。转染后三到五天,分别使用AKTAExplorer和MabSelectSuReTM蛋白A(GEHealthcareLifeSciences)或镍-EDTA(Qiagen)柱从澄清细胞上清液纯化hSEZ6ECD-Fc或hSEZ6-ECD-His蛋白质。
如下用转导HEK-293T细胞的慢病毒载体构建过表达重组人SEZ6的稳定细胞系:利用人SEZ6克隆作为模板,进行PCR扩增,以产生编码成熟人类SEZ6蛋白的cDNA片段。使用标准的分子克隆技术,将生成的片段亚克隆至,在pCDH-EF1-MCS-T2A-GFP(SystemBiosciences)的多克隆位点上游先前工程改造的编码DDK表位标签和IgK信号肽的序列同框下游。所得双顺反子慢病毒载体用于工程改造过表达人类SEZ6-T2A肽-GFP多肽的细胞系。T2A序列促进肽键缩合的核糖体跳跃,导致两个独立的蛋白质,在这种情况下是SEZ6和GFP。
小鼠SEZ6(mSEZ6)
基本上如上文对重组人SEZ6所述,对过表达重组小鼠SEZ6的稳定细胞系进行工程改造。用表达鼠SEZ6的慢病毒载体转导HEK-293T细胞。基本上如下工程改造该载体。编码在NCBI数据库中列为RefSeqNM_021286的成熟小鼠SEZ6蛋白(图5B;SEQIDNO:11)的cDNA片段(图5A;SEQIDNO:10)通过PCR扩增从商业小鼠SEZ6cDNA获得(Origene;#MC203634),并且使用标准的分子克隆技术亚克隆至pCDH-EF1-MCS-IRES-RFP(SystemBiosciences)的多克隆位点的上游先前工程改造的编码IgK信号肽序列和DDK表位标签序列的下游。这样得到用于产生过表达小鼠SEZ6和RFP的HEK-293T细胞系的双顺反子慢病毒载体。
大鼠SEZ6(rSEZ6)
为了产生和开发本发明中所要求的涉及大鼠SEZ6蛋白的所有分子和细胞材料,如下获得编码完整成熟大鼠SEZ6蛋白(图5D,SEQIDNO:13)的cDNA(图5C,SEQIDNO:12)。编码全长成熟大鼠蛋白(即,全长蛋白质减去野生型信号肽)的cDNA从大鼠脑marathon即用cDNA(Clontech#639412)扩增。序列比对显示,编码的蛋白质的ECD与在NCBI数据库中作为RefSeqNP_001099224列出的内源性大鼠SEZ6蛋白是同源的。这种cDNA克隆(称为rSEZ6)(图5D)用于表达大鼠SEZ6蛋白片段的构建体的后续工程改造。
食蟹猴SEZ6(cSEZ6)
为了产生和开发本发明中所要求的涉及食蟹猴SEZ6蛋白的所有分子和细胞材料,如下获得编码食蟹猴SEZ6蛋白(图5F,SEQIDNO:15)的cDNA(图5E,SEQIDNO:14):以下列方式通过生物信息学分析,组装预测的食蟹猴SEZ6ORF序列:人类SEZ6基因的ORF是从NCBI登录号NM_178860获得,并使用BLAST算法与NCBI数据库中的全基因组鸟枪法测序重叠群进行比较。然后,BLAST结果用来组装假定的食蟹猴SEZ6ORF。从这个BLAST衍生序列中移除编码食蟹猴SEZ6的预测的野生型信号肽的序列,并将其替换为编码IgK信号肽序列的序列。为了在哺乳动物细胞中生产优化密码子后,这个完整的杂交ORF序列被命名为合成基因(GeneWiz)。这种优化的cDNA克隆(称为cSEZ6)(图5E)用于表达食蟹猴SEZ6蛋白片段的构建体的后续工程改造。
人类SEZ6L和SEZ6L2
在人类基因组中,有两种与SEZ6-发作相关6同系物样(SEZ6L)和发作相关6同系物样2(SEZ6L2)密切相关的基因。虽然三种蛋白质之间的整体同一性百分比是相对低的(~42%),但是所述蛋白质的配对或所有三种之间也有完美同一性的较小延伸。为了研究抗SEZ6调节剂与人SEZ6L和SEZ6L2蛋白的任何可能的交叉反应性,对编码人SEZ6L蛋白(NP_0066938)和人SEZ6L2蛋白(NP_001230261)的ECD的开放阅读框架进行密码子优化并合成(GeneWiz)。这些优化的编码人SEZ6L或SEZ6L2蛋白质的ECD的cDNA序列示于图5G和5I。
用于交叉反应性研究的材料
为了研究本发明的SEZ6调节剂是否与大鼠和/或食蟹猴SEZ6同系物交叉反应,或与密切相关的人类SEZ6L和SEZ6L2蛋白质交叉反应,生成材料。设计嵌合融合基因,其中大鼠或食蟹猴SEZ6蛋白的ECD部分(在图5D和5F中分别加下划线)融合到9-组氨酸表位标签(SEQIDNO:201)。使用PCR,编码大鼠或食蟹猴SEZ6的ECD的cDNA片段分别从rSEZ6或cSEZ6扩增,并亚克隆到IgK信号肽序列的同框下游和编码9组氨酸表位标签的序列的同框上游的CMV驱动的表达载体(SEQIDNO:201)。同样,设计嵌合融合基因,其中编码人SEZ6L或SEZ6L2蛋白的ECD部分的开放读框被亚克隆入IgK信号肽序列的同框下游和编码9组氨酸表位标签的序列的同框上游的CMV驱动的表达载体(SEQIDNO:201)。这些融合蛋白的所得的编码的蛋白质序列分别示于图5H和5J,带下划线的序列代表考虑的特定蛋白的ECD。
以上产生的大鼠和食蟹猴SEZ6ECD-His载体,分别如下用于生产和纯化重组rSEZ6-ECD-His蛋白和cSEZ6-ECD-His蛋白:使用本领域公认的技术,采用编码rSEZ6-ECD-His或cSEZ6-ECD-His蛋白的表达载体转染HEK-293T细胞的悬浮液或粘附培养物或CHO-S细胞悬浮液。聚乙烯亚胺聚合物用作转染试剂。转染后三到五天,使用AKTAExplorer和Nickel-EDTA(Qiagen)柱从澄清的细胞上清液纯化所述rSEZ6-ECD-His或cSEZ6-ECD-His蛋白。类似地,人SEZ6L和SEZ6L2ECD-His载体用于生产和纯化重组人SEZ6L和人类SEZ6L2ECD-His蛋白,如针对大鼠和食蟹猴同系物所述。
实施例6
抗SEZ6小鼠调节剂的生成
根据本发明的教导,通过用人SEZ6-Fc接种,制造在鼠抗体形式的SEZ6调节剂。在这方面,三种小鼠品系用来产生高亲和力鼠单克隆抗体调节剂,其可用于与SEZ6缔合和/或抑制SEZ6作用,以预防和/或治疗各种增殖性病症。具体地,用人类重组SEZ6-Fc免疫Balb/c,CD-1和FVB小鼠品系,并将其用于产生杂交瘤。
由如实施例5所述的过表达构建体SEZ6-Fc的CHO-S细胞的上清液纯化SEZ6-Fc抗原(图4A和4B)。10微克SEZ6-Fc免疫原用于第一次免疫,随后分别为5微克和2.5微克SEZ6-Fc免疫原,其用于随后的三次免疫和五次免疫。用通过等体积Gold(CytRx公司)或明矾佐剂乳化的免疫原进行所有免疫。通过针对所有注射通过脚垫途径免疫6只雌性小鼠(每种两只:Balb/c,CD-1,FVB)生成鼠源抗体。
固相ELISA分析法用于筛选用于对人类SEZ6特异性的小鼠IgG抗体的小鼠血清。高于背景的阳性信号指示对SEZ6特异性的抗体。简言之,用重组型SEZ6-His(在ELISA包被缓冲液中0.5μg/ml)包被96孔板(VWRInternational,目录号610744)过夜。用含有0.02%(v/v)Tween20的PBS洗涤后,在室温(RT)下用含3%(w/v)BSA的PBS(200微升/孔)封闭各孔1小时。将小鼠血清滴定(1:100、1:200、1:400及1:800)且以50微升/孔添加至经SEZ6包被的板中且在室温下孵育1小时。洗涤板且接着将其与50微升/孔经HRP标记的山羊抗小鼠IgG(在3%BSA-PBS或含2%FCS的PBS中1:10,000稀释)一起在室温下孵育1小时。再次洗涤板且在室温下添加40微升/孔TMB底物溶液(ThermoScientific34028),持续15分钟。在显色后,添加等体积2NH2SO4以停止底物显色且通过分光光度计在OD450下分析各板。
将血清阳性免疫的小鼠处死并解剖出引流***(腘部和腹股沟部,和内侧髂部(如果扩大))并用作抗体产生细胞的来源。通过电融合以1:1的比率将B细胞的单细胞悬浮液(228.9x106个细胞)与非分泌P3x63Ag8.653骨髓瘤细胞(ATCC#CRL-1580)融合。使用BTXHybrimmuneTM***(BTX哈佛仪器)按照制造商的说明进行电融合。融合过程后,将细胞重新悬浮在杂交瘤选择培养基中,所述杂交瘤选择培养基补充有重氮乙酰丝氨酸(Sigma#A9666),具有丙酮酸钠(Cellgro目录号15-017-CM)的高葡萄糖DMEM培养基,其含有15%胎克隆I血清(Hyclone),10%BMCondimed(罗氏应用科学),4mML-谷氨酰胺,100IU青霉素-链霉素和50μM2-巯基乙醇,然后在三个T225烧瓶中在每烧瓶90毫升选择培养基中铺板。然后将烧瓶置于含有5%CO2和95%空气的加湿37℃培养箱中,持续6-7天。
生长六到七天后,用AriaI细胞分选仪,以每孔1个细胞,将由在T225s中大量生长的细胞组成的文库铺板在Falcon96孔U型底板中。然后将选定的杂交瘤在200微升培养基中生长,所述培养基含有15%胎克隆I血清(Hyclone),10%BM-Condimed(罗氏应用科学),1mM丙酮酸钠,4mML-谷氨酰胺,100IU青霉素-链霉素,50μM2-巯基乙醇,和100μM次黄嘌呤。任何剩余的未使用的杂交瘤库细胞被冷冻用于将来文库测试。生长十至十一天后,通过ELISA和FACS测定,针对对SEZ6反应的抗体,对来自铺板的细胞的每个孔中的上清液进行了测定。
为了通过ELISA筛选,在4℃下用在PBS中的0.3微克/毫升SEZ6-Fc包被96孔板过夜。将板洗涤并在37℃用PBS/吐温中的3%BSA封闭一小时,并立即使用或保存在4℃。未稀释的杂交瘤上清液在RT在板上孵育一小时。将板洗涤并在RT用HRP标记的山羊抗小鼠IgG(在3%BSA-PBS中1:10,000稀释)探测一小时。然后如上所述将所述板与底物溶液孵育,并且在OD450读取。转移并扩增含优先结合人SEZ6的免疫球蛋白的孔(如通过高于背景的信号所确定)。
用工程改造以过表达在前面实施例中制造的选定抗原或构建体的293细胞,用基于流式细胞术的测定,也针对人类SEZ6特异性和食蟹猴、大鼠和鼠SEZ6交叉反应性,筛选选择的分泌鼠免疫球蛋白的生长阳性杂交瘤的孔。
对于流式细胞术分析,将分别用人、食蟹猴、大鼠或鼠SEZ6转导的50x104个h293细胞与25-100微升杂交瘤上清液孵育30分钟。用PBS,2%FCS洗涤细胞两次,然后与50微升缀合至DyLight649的山羊抗小鼠IgGFc片段特异性二抗(在PBS/2%FCS中1:200稀释)孵育。孵育15分钟后,将细胞用PBS,2%FCS洗涤两次,并重新悬浮在含有DAPI的相同的缓冲液中并通过流式细胞术使用FACSCantoII按照制造商的说明进行分析。转移并扩增含优先结合SEZ6+GFP+细胞的免疫球蛋白的孔。所得hSEZ6特异性克隆杂交瘤在CS-10冷冻介质(BiolifeSolution)中冷冻保存并储存在液氮中。与人、食蟹猴、大鼠或鼠SEZ6细胞结合的抗体被标注为交叉反应性的(参见图11A)。
ELISA和流式细胞仪分析确认,来自这些杂交瘤中的大部分或所有的纯化的抗体以浓度依赖性方式结合SEZ6。转移并扩增包含结合SEZ6GFP细胞的免疫球蛋白的孔。所得克隆杂交瘤在CS-10冷冻介质(BiolifeSolution)中冷冻保存并储存在液氮中。
进行一次融合,并接种在48板(4608个孔,以大约40%克隆效率)。初始筛选产生了63个与人SEZ6缔合的鼠抗体。随后进行第二次筛选,并获得了134个与人类SEZ6缔合的抗体。
实施例7
SEZ6调节剂的测序
基于上述内容,选择多种以显著高亲和力结合固定的人类SEZ6或h293-hSEZ6细胞的示例性相异单克隆抗体,用于测序及进一步分析。如图10A及图10B中以表格方式所示,来自实施例6中产生的所选单克隆抗体的轻链可变区(图10A)及重链可变区(图10B)的序列分析证实,许多序列具有新型互补决定区且通常显示新型VDJ排列。应注意,图10A及图10B中阐述的互补决定区是根据Kabat等人(见上文)定义。
作为在测序示例性调节剂中的第一步骤,将所选杂交瘤细胞溶解于试剂(PlusRNAPurificationSystem,LifeTechnologies)中以制备RNA。在这方面,将104个至105个细胞再悬浮于1mLTrizol中且在添加200μL氯仿后剧烈摇动。样品接着在4℃下离心10分钟且将水相转移至新的微量离心管,其中添加等体积的异丙醇。将管再次剧烈振摇并在室温孵育10分钟,然后在4℃下离心10分钟。所得的RNA沉淀用1mL的70%乙醇洗涤一次,并在室温短暂干燥,然后悬浮在40微升DEPC处理过的水中。通过在1%琼脂糖凝胶中部分分离3μL来测定RNA制剂的质量,随后在-80℃下储存直至使用。
使用5'引物混合物扩增各杂交瘤的Ig重链的可变区,该5'引物混合物包含32个小鼠特异性前导序列引物(经设计以靶向完全小鼠VH所有组成成分)与3'小鼠Cγ引物(对所有小鼠Ig同种型特异性)的组合。使用相同的PCR引物从两端测序VH的400bpPCR片段。类似地,三十二个5'Vκ前导序列引物(经设计以扩增Vκ小鼠家族中的每一者)的混合物与单一反向引物(对小鼠κ恒定区特异性)的组合用于扩增和测序κ轻链。使用逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)从100ng总RNA扩增VH和VL转录物。
对各杂交瘤进行总共八次RT-PCR反应:四次反应针对Vκ轻链且四次反应针对Vγ重链(γ1)。一步法RT-PCR试剂盒用于扩增(Qiagen)。该试剂盒提供Sensiscript和Omniscript逆转录酶、HotStarTaqDNA聚合酶、dNTP混合物、缓冲液和Q-Solution(一种新型添加剂,其实现“困难的”(例如,富含GC)模板的有效扩增)的共混物。制备PCR反应混合物,其包括3μLRNA、0.5μL100μM重链或κ轻链引物(由IDT定制合成)、5μL5×RT-PCR缓冲液、1μLdNTPs、1μL酶混合物(含有逆转录酶及DNA聚合酶)以及0.4μL核糖核酸酶抑制剂RNasin(1单位)。反应混合物含有逆转录和PCR所需的全部两种试剂。热循环程序设定为室温步骤50℃持续30分钟,95℃持续15分钟,接着30个循环的PCR(95℃持续30秒,48℃持续30秒,72℃持续1分钟)。接着在72℃下最终孵育10分钟。
为了制备用于直接DNA测序的PCR产物,其使用QIAquickTMPCR纯化试剂盒(Qiagen)根据制造商方案纯化。DNA使用50μL无菌水自旋转柱洗脱且接着直接从两条链测序。使用特异性V区引物,对所提取的PCR产物直接进行测序。使用IMGT分析核苷酸序列以鉴定具有最高序列同源性的种系V、D及J基因成员。通过使用VBASE2(Retter等人,同上)和将VH及VL基因与小鼠种系数据库比对来进一步比较衍生的序列与IgV区及IgJ区的已知种系DNA序列,以协助如下所述制造人源化构建体。
更具体而言,图10A描绘,来自抗SEZ6抗体的74种独特新型鼠轻链可变区(SEQIDNO:20-168,偶数)及来源于代表性鼠轻链的11个人源化轻链可变区(SEQIDNO:170-192,偶数)的连续氨基酸序列。类似地,图10B描绘来自相同抗SEZ6抗体的74个新型鼠重链可变区(SEQIDNO:21-169,奇数)及来源于相同的提供人源化轻链的鼠抗体的11个体源化重链可变区((SEQIDNO:171-193,奇数)的连续氨基酸序列。因此,图10A和10B一起提供74种独特的可操作的鼠抗SEZ6抗体的注释序列(称为SC17.1,SC17.2,SC17.3,SC17.4,SC17.8,SC17.9,SC17.10,SC17.11,SC17.14,SC17.15,SC17.16(SC17.6的副本),SC17.17,SC17.18,SC17.19,SC17.22,SC17.24(SC17.2的副本序列),SC17.27,SC17.28,SC17.29,SC17.30,SC17.32,SC17.34,SC17.35,SC17.36,SC17.38,SC17.39,SC17.40,SC17.41,SC17.42,SC17.45,SC17.46,SC17.47,SC17.49,SC17.50,SC17.53,SC17.54,SC17.56,SC17.57,SC17.59,SC17.61,SC17.63,SC17.71,SC17.72,SC17.74,SC17.76,SC17.77,SC17.79,SC17.81,SC17.82,SC17.84,SC17.85,SC17.87,SC17.89,SC17.90,SC17.91,SC17.93,SC17.95,SC17.97,SC17.99,SC17.102,SC17.114,SC17.115,SC17.120,SC17.121,SC17.122,SC17.140,SC17.151,SC17.156,SC17.161,SC17.166,SC17.187,SC17.191,SC17.193,SC17.199和SC17.200)和11种人源化抗体(称为hSC17.16,hSC17.17,hSC17.24,hSC17.28,hSC17.34,hSC17.46,hSC17.151,hSC17.155,hSC17.156,hSC17.161和hSC17.200)。应注意,这些相同名称可指产生主题抗体的克隆,且因此任何特定名称的使用应在周围公开内容的情形下加以解释。
此外,hSC17.200vL1(SEQIDNO:192)是人源化轻链构建体hSC17.200的变体(SEQIDNO:190),hSC17.155vH1-hSC17.155vH6(SEQIDNO:193-198)是重链构建体hSC.155的变体(SEQIDNO:184),其由SC17.90(SEQIDNO:127)衍生,并且hSC161vH1(SEQIDNO:199)是重链构建体hSC17.161的变体(SEQIDNO:189)。如下将更详细地讨论,构建和测试这些变体以最优化亲本抗体的一种或多种生化特性。
另外,在图10A和10B中阐述的七十四种示例性鼠调节剂和11种人源化调节剂和变体中的每个的相应核酸序列都包括在本申请的序列表中(SEQIDNO:220-399)。
为了本申请的目的,各特定抗体的SEQIDNO为连续的。因此,mAbSC17.1包含分别用于轻链及重链可变区的SEQIDNO:20及SEQIDNO:21。在此方面,SC17.2包含SEQIDNO:22及SEQIDNO:23,SC17.9包含SEQIDNO:24及SEQIDNO:25等。在图10A和10B中的每个抗体氨基酸序列的相应核酸序列在序列表中给出。在序列表中,包括的核酸序列包含SEQIDNO,其比相应的氨基酸序列(轻链或重链)大二百。因此,编码mAbSC17.1的轻链和重链可变区氨基酸序列(即,SEQIDNO:20和21)的核酸序列包含SEQIDNO:220和221。在这方面,编码所有公开的轻链和重链可变区氨基酸序列的核酸序列(包括编码人源化构建体和它们的变体的核酸序列)进行类似地编号,并且包含SEQIDNO:220-399。
实施例8
嵌合的和人源化抗SEZ6调节剂的生成
如上面提到,使用互补性决定区(CDR)移植将来自实施例7中的鼠抗体中的十一个人源化。根据在功能人种系基因方面的序列和结构相似性,选择重链和轻链的人框架。在这方面,通过将小鼠正则CDR结构与具有与Chothia等人(同上)中描述的相同正则结构的人类候选物进行比较,评价结构相似性。
更具体地,使用计算机辅助CDR移植方法(Abysis数据库,UCL商业PLc)和标准分子工程改造技术,将11种鼠抗体SC17.16,SC17.17,SC17.24,SC17.28,SC17.34,SC17.46,SC17.151,SC17.155(SC17.90的副本),SC17.156,SC17.161和SC17.200人源化,来提供hSC17.16,hSC17.17,hSC17.24,hSC17.28,hSC17.34,hSC17.46,hSC17.151,hSC17.155,hSC17.156,hSC17.161和hSC17.200调节剂。可变区的人框架区基于它们与主题小鼠框架序列和它的正则结构的最高序列同源性进行选择。为了人源化分析的目的,根据Kabat等人编号(同上)将氨基酸分配至每个CDR结构域。
分子工程程序使用本领域公认的技术进行。为此,如紧挨上文实施例7中所述从杂交瘤中提取总mRNA并扩增。
从核苷酸序列信息,得到关于主题鼠抗体重链和轻链的V、D和J基因片段的数据。基于所述序列数据,设计将特异于抗体的IgVH和VK轻链的前导序列的新引物组用于克隆重组单克隆抗体。随后,将V-(D)-J序列与小鼠Ig种系序列进行比对。11种人源化构建体中的每个的所得遗传排列示于紧随下面的表3。
表3
在表3中所列人源化的抗体对应于图10A和3B中所列注释的轻链和重链序列(SEQIDNO:170-191)。轻链和重链可变区的相应核酸序列阐述于所附序列表中。表3进一步表明,非常少框架改变是保持结合调节剂的有利特性所必要的。在这方面,只在重链可变区中的三个中进行框架改变或回复突变,且在轻链可变区中进行只有两个框架修饰。
需要注意的是,对于一些人源化轻链和重链可变区,将氨基酸突变引入FR或CDR,以提高稳定性,同时保持抗原结合。在SC17.155的情况下,生产6种变体,被称为hSC17.155vH1-hSC17.155vH6。在每个这些变体中,对hSC17.155的重链可变区的FR或CDR进行变化,而轻链可变区保持不变。在hSC17.155vH1和hSC17.155vH2的情况下,将点突变引入hSC17.155的重链可变区的FR1(SEQIDNO:471和472)。在hSC17.155vH3的情况下,将点突变引入所述hSC17.155重链可变区的CDRH1(SEQIDNO:473)。在hSC17.155vH4-hSC17.155vH6的情况下,将点突变引入hSC17.155重链可变区的CDRH2(分别为SEQIDNO:474、475和476)。在hSC17.161的情况下,改变重链可变区的FR1(SEQIDNO:477);FR2(SEQIDNO:478)和FR3(SEQIDNO:479)中的某些氨基酸,而轻链可变区没有修饰。最后,在hSC200vL1的情况下,将点突变引入hSC17.200轻链可变区CDRL1(SEQIDNO:480),重链可变区没有修饰。在每一种情况下,发现具有修饰的CDRs或FRs的抗体的结合亲和力等效于相应的嵌合或鼠抗体。九种示例性人源化变体链(轻链和重链)的序列列于图10A和10B(SEQIDNO:192-199)的末尾,其中它们保持人源化亲本链的指定,伴有符号以指示它们已被改变(例如hSC17.200vL1、hSC17.155vH1-6和hSC17.161vH1)。示例性人源化抗体hSC17.200和hSC17.200vL1的全长氨基酸序列作为SEQIDNO:400-402描述于图10C。人源化抗体变体hSC17.200vL1衍生自人源化抗体hSC17.200且与hSC17.200抗体共享共同的HC。因此,hSC17.200的全长LC和HC分别对应于SEQIDNO:400和401;hSC17.200vL1的全长LC和HC分别对应于SEQIDNO:403和401。通过CDR移植将所有选定的抗体人源化后,分析得到的轻链和重链可变区氨基酸序列,以确定它们关于鼠供体和人受体轻链和重链可变区的同源性。结果示于下表4,表明与鼠供体序列相比,人源化构建体一致地表现出关于人受体序列的较高同源性。更具体地,与人源化可变区序列和供体杂交瘤蛋白质序列的同源性(74%-89%)相比,人源化重链和轻链可变区通常显示出与人类种系基因最接近的匹配的较高的百分比同源性(84%-95%)。
表4
经过测试,并且如将实施例9中讨论,每个人源化构建体表现出与鼠亲本抗体所示的结合特性大致相当的良好的结合特性(数据未示出)。
无论人源化的还是鼠的,一旦确定可变区的核酸序列,则可使用本领域公认的技术表达并分离本发明的抗体。为此,将所选择的重链(人源化或鼠)可变区的合成DNA片段克隆到人IgG1表达载体中。类似地,可变区轻链DNA片段(再次人源化或鼠)克隆到人轻链表达载体。然后通过将衍生的重和轻链核酸构建体共转染入CHO细胞中,表达选择的抗体。
更具体地,一种相容的抗体产生的方法包括将鼠或人源化可变区基因(使用PCR扩增)定向克隆入选定的人免疫球蛋白表达载体。在Ig基因特异性的PCR中使用的所有引物都包括允许直接克隆入含有人IgG1重链和轻链恒定区的表达载体的限制性位点。简言之,PCR产物用QiaquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化,接着分别用AgeI和XhoI(对于重链)和XmaI和DraIII(对于轻链)消化。纯化消化的PCR产物中,然后连接到表达载体中。连接反应在总体积10μL中进行,其采用200UT4-DNA连接酶(NewEnglandBiolabs),7.5微升的消化和纯化的基因特异性PCR产物和25ng线性载体DNA。于42℃下用3微升连接产物通过热休克转化感受态大肠杆菌DH10B菌(LifeTechnologies),并将其铺板于氨苄青霉素平板(100微克/毫升)。然后将VH区的AgeI-EcoRI片段***pEE6.4HuIgG1表达载体的相同位点,而将合成的XmaI-DraIIIVK***物克隆入各自pEE12.4Hu-κ表达载体的XmaI-DraIII位点。
使用293fectin,通过用合适的质粒转染HEK293细胞,生成产生选定抗体的细胞。在这方面,质粒DNA用QIAprep离心柱(Qiagen)纯化。人胚胎肾(HEK)293T(ATCC编号CRL-11268)细胞在150毫米平板(Falcon,BectonDickinson)中在标准条件下在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养,所述Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)补充有10%热灭活的FCS,100微克/mL链霉素,100U/mL青霉素G(所有都来自LifeTechnologies)。
为了瞬时转染,细胞生长至80%汇合。将等量IgH和相应的IgL链载体DNA(每个12.5微克)加入到1.5毫升Opti-MEM(混合有1.5毫升opti-MEM中的50μL的HEK293转染试剂)中。将该混合物在室温下孵育30分钟,并均匀地分布在培养板上。转染后三天收获上清液,替换为20毫升新鲜的补充有10%FBS的DMEM,转染后第6天再次收获。通过以800×g离心10分钟,从培养物上清液清除细胞碎片,并将上清液储存在4℃。用蛋白G珠(GEHealthcare)纯化重组嵌合和人源化抗体,并在合适条件下储存。
实施例9
SEZ6调节剂的特征
使用各种方法来分析如上文所阐述产生的所选SEZ6调节剂的结合及免疫化学特征。特定地,通过本领域公认的方法(包括流式细胞术)根据关于人类、食蟹猴、大鼠及小鼠SEZ6抗原连同SEZ6L和SEZ6L2蛋白质的亲和力、分仓及交叉反应性来表征多种抗体调节剂。使用ForteBioRED(ForteBio,Inc.)上的生物层干涉测量分析或使用Biacore2000的表面等离振子共振(各自根据制造商的说明)测量所选调节剂的亲和力及动力学常数kon及koff。
表征结果以表格形式阐述于图11A中,其中可见所选调节剂通常呈现纳摩尔范围内的相对高亲和力且在许多情况下,与一种或多种SEZ6直向同源物交叉反应。图11A进一步列出了经验确定的由主题调节剂占用的仓室。总之,这些数据证明所公开的调节剂的不同的结合特性,以及基于其在动物模型中的反应性的用于药物开发的潜在适用性。
在这方面,使用FACSCantoII按照制造商的说明进行流式细胞术,以确认所选SC17抗体调节剂可与人类SEZ6免疫特异性缔合,且确定相同的调节剂是否与食蟹猴、大鼠和/或鼠SEZ6(除了SEZ6L和SEZ6L2)交叉反应。更具体地,通过流式细胞术分别对表达小鼠SEZ6和大鼠SEZ6的Neuro2a(ATCC目录号CCL131)和RIN-m5F(ATCC目录号CRL-11605)细胞系,测试调节剂与小鼠SEZ6和大鼠SEZ6的交叉反应性。为了检查与食蟹猴SEZ6的交叉反应性,展示食蟹猴SEZ6(Boder等人,1997)的胞外结构域的酵母用于流式细胞分析。
简言之,每孔1×105个细胞的Neuro2a、RIN-5mF或展示食蟹猴SEZ6的酵母细胞与50微升含有5微克/毫升抗体的PBS(2%FCS)缓冲液孵育30分钟。细胞用相同的缓冲液洗涤两次,然后用每样品50μL的DyLight649标记的山羊抗小鼠IgG,Fc片段特异性二抗(在PBS缓冲液中1:200稀释)孵育。孵育15分钟后,细胞用PBS缓冲液洗涤两次,且在含有DAPI的PBS缓冲液中重悬浮以用于Neuro2a和Rin-m5F的流式细胞术分析,或在不含DAPI的缓冲液中重悬浮以用于具有cSEZ6的酵母细胞的流式细胞术分析。结合到Neuro2a或RIN-m5F细胞系或展示食蟹猴SEZ6的酵母的抗体被认为分别与鼠SEZ6、大鼠SEZ6或食蟹猴SEZ6交叉反应。图11A示出了交叉反应性结果。六种抗体对人类和小鼠SEZ6具有交叉反应性(SC17.6(SC17.16的副本),SC17.7,SC17.19,SC17.24,SC17.26和SC17.42);六种对人类和小鼠SEZ6具有交叉反应性(SC17.6,SC17.17,SC17.19,SC17.26,SC17.28,SC17.34和SC17.42);六种对人类和食蟹猴SEZ6具有交叉反应性(SC17.17,SC17.24,SC17.26,SC17.34,SC17.36和SC17.45)。注意,SC17.6是SC17.16的副本且表现出相同的结合特征。
为了验证大鼠SEZ6的以上交叉反应性数据并确定所选择的效应物的亲和力和动力学常数Kon和Koff,进行ForteBioRED(ForteBio,Inc.)上的生物层干涉分析,或Biacore2000(GEHealthcare)上的表面等离子共振。对实施例5中生成的人类重组SEZ6-His和大鼠重组SEZ6-His测定亲和力。如在图11A所见,多种测试的抗体与大鼠SEZ6交叉反应。所选调节剂显示出对大鼠和人SEZ6在纳摩尔范围内的相对高的亲和力。
为了确定与家族成员蛋白SEZ6L和SEZ6L2的交叉反应性,使用基于ELISA的测定法。用0.2微克/毫升PBS中的SEZ6、SEZ6L或SEZ6L2蛋白质包被板过夜。用含有0.05%(v/v)吐温20的PBS(PBST)洗涤后,在室温下用2%(w/v)在PBS中的BSA(PBSA)(100μL/孔)封闭孔1小时。然后在室温下将抗体以1微克/毫升加入100微升PBSA,持续1小时。用PBST洗涤后,在室温下添加100微升/孔HRP标记的山羊抗-小鼠IgG(在PBSA中1:2000稀释),持续1小时。将板洗涤并在室温下加入100μL/孔的TMB底物溶液(ThermoScientific34028),持续15分钟。显色后,加入等体积的2MH2SO4停止底物显色,且在OD450由分光光度计进行分析。图11A表明,一种抗体与SEZ6L交叉反应(SC17.7)和五种与SEZ6L2交叉反应(SC17.6,SC17.7,SC17.19,SC17.26和SC17.28)。如上所讨论,这样的泛SEZ6抗体与本文的教导相相容,并且可以与所公开的方法组合使用。
对来自实施例8的以下人源化构建体(hSC17.16,hSC17.17,hSC17.24,hSC17.28,hSC17.34和hSC17.46)的结合特性进行分析,以确定CDR移植过程是否已明显改变它们的结合特征。人源化构建体(CDR移植)与“传统”嵌合抗体比较,所述“传统”嵌合抗体含有鼠亲本(或供体)重链和轻链可变结构域和基本上等同于人源化构建体中使用的人恒定区。用这些构建体,使用Biacore2000(GEHealthcare)进行表面等离子体共振,以鉴定由人源化过程所带来的速率常数的任何细微变化。在所有情况下,人源化抗体具有与相应的鼠抗体相当的结合亲和力或比相应的鼠抗体更好的结合亲和力(数据未示出)。
对各种SEZ6调节剂确定抗体分仓,如图11A所示。按照制造商的说明书使用ForteBioRED,以鉴定结合于相同或不同的仓室的竞争抗体。简言之,将参考抗体(Ab1)捕获于抗小鼠捕获芯片上,接着使用高浓度非结合抗体以封闭芯片且收集基线。接着通过特异性抗体(Ab1)捕获单体、重组人类SEZ6(在实施例5中描述),且将尖端浸入具有作为对照的相同抗体(Ab1)的孔或具有不同测试抗体(Ab2)的孔中。若观测到与新抗体的其他结合,则确定Ab1及Ab2处于不同仓室。若未发生其他结合(如通过与对照Ab1比较结合水平确定),则确定Ab2处于相同仓室。如本领域中已知,可扩展此方法以使用代表96孔板中的独特仓室的一整列抗体筛选独特抗体的大型文库。在当前的情况下,这个分仓过程显示,筛选的抗体结合至SEZ6蛋白上至少七个不同的仓室。仓室A-F是独特的仓室和包含在每个这些仓室中的抗体彼此(但不与来自其他定义仓室的抗体)竞争结合SEZ6蛋白。仓室U包含不与仓室A-F中的抗体竞争,但是可以彼此竞争结合的抗体。图11B示出了结合特定表位的抗体和那些组的抗体杀死过表达SEZ6的HEK-293T细胞的能力之间的相关性(紧接下文实施例10中更详细地描述)。
实施例10
SEZ6调节剂的表位作图
为了表征所公开的SEZ6抗体调节剂缔合或缀合的表位,使用由Cochran等人(JImmunolMethods.)287(1-2):147-158(2004)),其通过引用并入本文)描述的方案的改进版本进行结构域水平表位作图。酵母的表面上表达SEZ6的各个结构域,并通过流式细胞术检测各SEZ6抗体的结合。
为下列构建体的表达产生展示质粒构建体的酵母:SEZ6细胞外结构域(氨基酸1-904);Sushi结构域1(氨基酸336-395),CUB结构域1(氨基酸297-508),Sushi结构域2(氨基酸511-572),CUB结构域2(氨基酸574-685),Sushi结构域3(氨基酸690-748),Sushi结构域4(氨基酸750-813),Sushi结构域5(氨基酸817-878),和Sushi结构域5+C端(氨基酸817-904)。另外,该N端结构域(氨基酸1-335)分成称为N1(氨基酸1-70)、N2(氨基酸71-169)和N3(氨基酸169-335)的3个片段,其每一个被克隆到酵母展示质粒。氨基酸编号不包括19氨基酸前导肽。对于结构域信息,一般见UniProtKB/Swiss-Prot数据库条目Q53EL9。将这些质粒转化入酵母,其接着如Cochran等人所描述生长及诱导。注意,所有氨基酸编号都基于没有19氨基酸前导序列的成熟SEZ6蛋白。
为了测试与特定构建体的结合,200,000个诱导的表达所需构建体的酵母细胞在PBS+1mg/mLBSA(PBSA)中洗涤两次,且在50μLPBSA中与鸡抗c-myc(LifeTechnologies)(0.1μg/mL)及50nM纯化的抗体或来自培养7天的杂交瘤的未纯化的上清液的1:2稀释物一起孵育。细胞在冰上孵育90分钟,接着在PBSA中洗涤2次。细胞接着在具有适当二抗的50μLPBSA中孵育:对于鼠抗体,Alexa488缀合的抗-鸡及Alexa647缀合的山羊抗小鼠(均来自LifeTechnologies)各以1μg/mL添加,且对于人源化或嵌合抗体,Alexa647缀合的抗-鸡(LifeTechnologies)及R-藻红素缀合的山羊抗人类(JacksonImmunoresearch)各以1μg/mL添加。在冰上孵育二十分钟后,细胞用PBSA洗涤两次且在FACSCantoII上分析。
所有调节剂都独特结合到在酵母细胞上表达的单个结构域。在一些情况下,抗体克隆特异性结合表达Sushi结构域5+C末端的酵母,而不特异性结合表达Sushi结构域5的酵母。得出的结论是,这些抗体克隆仅结合到C末端区域(氨基酸879-904)。
将表位分类为构象(例如非连续)或线型。展示SEZ6ECD构建体的酵母在80℃下热处理30分钟以变性抗原,在冰冷的PBSA中洗涤两次,然后经受与如上文所描述相同的染色方案及流式细胞术分析。结合于变性及天然酵母的抗体归类为结合于线型表位,而结合天然酵母但不结合变性酵母的抗体归类为构象特异性。
测试的抗体的结构域水平表位作图数据的概要示于表5。结合线性表位的抗体加下划线,并且结合SEZ6家族成员SEZ6L和SEZ6L2的抗体分别用星号和/或剑号指定。
表5
当使用在本实施例10所述的结构域作图的SEZ6抗体调节剂进行体外细胞杀死测定法时,观察到有趣的和令人惊讶的趋势。基本上如以下实施例14描述进行的体外杀死测定法确定特定抗体内化和杀死HEK-293细胞的能力。图11B是测试抗体相比于它们所结合的结构域的效能的曲线图。结合某些结构域(包括:N1,N3,Sushi结构域1,Sushi结构域4)的抗体展示增强的体外杀死。与Sushi结构域4相缔合的抗体(它们在内化和杀死细胞中非常有效)显示出与IGHV1-34和IKV4-59鼠种系框架区的很强的相关性。
在选定的抗体上进一步进行精细表位作图,以确定它们结合的特定的氨基酸。用Ph.D-12噬菌体展示肽文库试剂盒(NewEnglandBiolabsE8110S)对结合于线性表位的抗体作图。将选择用于表位作图的抗体(在50微克/毫升在3mL0.1M碳酸氢钠溶液(pH8)中)包被到NuncMaxiSorp管(Nunc),并孵育过夜。该管用含3%BSA溶液的碳酸氢盐溶液封闭。接着,使含1011个输入噬菌体的PBS+0.1%Tween-20结合,接着采用0.1%Tween-20进行十次连续洗涤以洗去未结合的噬菌体。剩余噬菌体在室温下随温和搅拌用1mL0.2M甘氨酸洗脱10分钟,接着用150μL1MTris-HCl(pH9)中和。扩增洗脱的噬菌体且再次用1011个输入噬菌体淘选,在洗涤步骤期间使用0.5%Tween-20以增加选择严格度。来自第二轮的洗脱噬菌体的24个斑块的DNA使用QiaprepM13Spin试剂盒(Qiagen)分离及测序。使用ELISA分析法确认克隆噬菌体的结合,其中将经作图的抗体或对照抗体包被于ELISA板上,封闭且暴露于各克隆噬菌体。使用辣根过氧化酶缀合的抗M13抗体(GEHealthcare)及1步型TurboTMBELISA溶液(Pierce)检测噬菌体结合。使用VectorNTI(LifeTechnologies)将来自特异性结合噬菌体的噬菌体肽序列与抗原ECD肽序列比对以确定结合的表位。
结合于非连续表位的选择的抗体使用由Chao等人(2007)描述的技术作图。通过易错PCR使用用于每克隆一个氨基酸突变的目标突变诱发速率的核苷酸类似物8-氧代-2'-脱氧鸟苷-5'-三磷酸盐及2'-去氧-p-核苷-5'-三磷酸盐(均来自TriLinkBio)产生SEZ6ECD突变体的文库。这些文库转化为酵母展示格式。使用上文关于结构域水平作图描述的技术,在50nM下针对c-myc及抗体结合对文库进行染色。使用FACSAria(BD),分选与野生型SEZ6ECD相比呈现结合损失的克隆。这些克隆再生长,且经受另一轮针对与目标抗体的结合损失的FACS分选。使用ZymoprepYeastPlasmidMiniprep试剂盒(ZymoResearch)对个别ECD克隆进行分离及测序。必要时,使用Quikchange定向诱变试剂盒(Agilent)将突变重新格式化成单一突变型ECD克隆。
接着筛选个别ECD克隆以确定结合损失是否由表位的突变或引起错误折叠的突变引起。涉及半胱氨酸、脯氨酸及终止密码子的突变由于高度的错误折叠突变的可能性而自动丢弃。接着筛选剩余ECD克隆与非竞争性、构象特异性抗体的结合。推断出损失与非竞争性、构象特异性抗体的结合的ECD克隆含有错误折叠突变,而推断出保留与野生型SEZ6ECD等效的结合的ECD克隆适当折叠。推断出后一组中的ECD克隆中的突变在表位中。还使用MODELLER构建分离的结构域的同源性模型,以确认鉴定为在表位中的残基:1)在折叠同源性模型中彼此靠近定位,和2)具有溶剂暴露、而不被包埋的侧链,因为包埋的残基会具有造成错误折叠的较高机会,并且将不可能是结合表位的一部分。抗体与它们的表位的总结示于表6中。发现最显著有助于表位的结构的残基加下划线。
表6
NR指示,没有指定SEQIDNO,因为表位是不连续的。
对于SC17.34、SC17.36、SC17.200和SC17.46的精细表位作图的目的,在分离的结构域Sushi结构域1中构建点突变,所述结构域通过结构域水平表位作图被确定为结合的结构域。在一些情况下,独立于酵母展示的文库确定用于筛选的候选突变。例如,在SC17.46的情况下,在基于文库的筛选中没有鉴定出用于筛选的候选突变;相反,它们基于以下确定:结构域作图、缺乏对食蟹猴SEZ6ECD和大鼠SEZ6ECD的交叉反应,和用于鉴定物种的一级序列的差异的不同物种的序列比对。在SC17.102,SC17.121,SC17.140,SC17.156,SC17.166,SC17.191,和17.200的情况下,用丙氨酸扫描以及结构域结合分析的组合来鉴定候选残基。在所有情况下,候选的突变进行了与其他抗体(其候选突变通过基于文库的方法鉴定)相同的分析。
本发明涉及结合于SEZ6蛋白(包括,例如,SEQIDNO:3或4的SEZ6蛋白)上的表位的抗SEZ6抗体和抗体药物缀合物,其中所述表位包含氨基酸残基,其选自(i)残基Q12,P14,I16,E17,E18;(ii)残基R762,L764,Q777,I779,D781,Q782;(iii)残基L73,P74,F75,Q76,P77,D78,P79;(iv)残基T352,S353,H375;(v)残基T352,S353,H375,S359;(vi)残基R342,K389;(vii)残基R762,L764,Q777,I779,D781,Q782;或(viii)残基R807,K810。在一个实施方案中,本发明涉及结合于SEZ6蛋白质(包括,例如,SEQIDNO:3或4的SEZ6蛋白)上的表位的抗SEZ6抗体和抗体药物缀合物,其中所述表位包含氨基酸残基,其选自(i)残基Q12,P14,I16,E17,E18;(ii)残基R762,L764,Q777,I779,D781,Q782;(iii)残基L73,P74,F75,Q76,P77,D78,P79;(iv)残基T352,S353,H375;(v)残基T352,S353,H375,S359;(vi)残基R342,K389;(vii)残基R762,L764,Q777,I779,D781,Q782;或(viii)残基R807,K810。在另一个实施方案中,本发明涉及结合于SEZ6蛋白质(包括,例如,SEQIDNO:3或4的SEZ6蛋白)上的相同表位的抗SEZ6抗体或抗体药物缀合物,为以下抗体中的任一种:SC17.4,SC17.17,SC17.24,SC17.34,SC17.36,SC17.46,SC17.102,SC17.121,SC17.140,SC17.156,SC17.166,SC17.191和SC17.200。
实施例11
通过流式细胞术的SEZ6表面表达的检测
流式细胞术用于评估抗SEZ6抗体的特异性,所述抗SEZ6抗体经生成以检测工程改造的HEK-293T细胞系(如实施例5中所述构建)的表面上存在人SEZ6蛋白。同种型染色和荧光减一(FMO)对照用来确认染色特异性。简言之,用本领域公认的酶促消化技术(见,例如,U.S.P.N.2007/0292414,其并入本文),解离用人类SEZ6和GFP转导的HEK-293T(见实施例5)或收获的NTX肿瘤样品,并分散到悬浮液中,与抗SEZ6抗体孵育30分钟。细胞在PBS(2%FCS)中洗涤两次,然后与每样品50μlDyLight649标记的山羊抗小鼠IgG,Fc片段特异性二抗(在PBS缓冲液中1:200稀释)孵育。孵育15分钟后,将细胞用PBS洗涤两次,并在含有DAPI的PBS中再悬浮,且如前所讨论通过流式细胞术分析。
如在图12A为SC17.33所示的代表性的数据所表明,SEZ6调节剂强烈识别HEK-293T-HuSEZ6细胞。这些数据表明,生产了调节剂,其特异性识别细胞表面上表达的人类SEZ6。
通过流式细胞术使用几种示例性SC17抗体评估所选NTX肿瘤的表面上的人类SEZ6蛋白表达。使用SC17.6(SC17.16的副本)测试LU37、LU86和KDY66中SEZ6的表达,而分别使用SC17.10、SC17.42和SC17.28抗体测试LU50、LU100和LU73中SEZ6的表达。结果列于图13A。收获NTX肿瘤,解离,并用市售的抗小鼠CD45、抗小鼠H-2Kd、抗人EpCAM和一种上述小鼠抗人SEZ6抗体共染色。使用未针对上述抗小鼠抗体阳性染色、但针对抗人EpCAM阳性染色的细胞产生图13A中所示的数据。类似于以上描述的HEK-293T-染色实验,同种型染色和荧光减一(FMO)对照用来确认染色特异性。如图13A中所见,对于肺NTX肿瘤LU37、LU50和LU86和肾脏NTX肿瘤KDY66,抗SEZ6染色在所有人类NTX肿瘤细胞中比FMO更高,如荧光轮廓右移所指示,并如平均荧光强度(MFI)值的变化所指示。这些数据表明,SEZ6蛋白表达于各种NTX肿瘤的表面上,因此,适合使用抗SEZ6抗体来调节。
实施例12
SEZ6蛋白在多种肿瘤中的表达
鉴于与各种肿瘤相关的升高的SEZ6mRNA转录物水平,进行研究以证明SEZ6蛋白在NTX肿瘤中的表达的相应增加。采用以下检测SEZ6蛋白表达:(i)使用MSD发现平台(MesoScaleDiscovery,LLC)的电化学发光SEZ6夹心ELISA法;和(ii)免疫组织化学染色。
NTX肿瘤从小鼠切出并在干冰/乙醇上快速冷冻。将蛋白提取缓冲液(BiochainInstitute,Inc.)加入到解冻肿瘤片并使用TissueLyser***(Qiagen)粉碎肿瘤。裂解物通过离心(20000g,20分钟,4℃)澄清并使用二辛可宁酸定量每个裂解物中的总蛋白质浓度。蛋白质裂解物贮存在-80℃直至测定。正常组织裂解物从商业来源购买。
裂解物样品的SEZ6蛋白浓度通过内插来自使用纯化的重组SEZ6蛋白产生的标准蛋白质浓度曲线(实施例5)的值来确定。所述SEZ6蛋白标准曲线和蛋白定量测定如下进行:
在4℃用30微升的2微克/毫升在PBS中的SC17.17抗体包被MSD标准板过夜。将板在PBST中洗涤,并于150微升MSD3%封闭剂溶液A中封闭一小时。将板在PBST中再次洗涤。还将25微升在MSD1%封闭剂A中的10倍稀释的裂解物或在含有10%蛋白质提取缓冲液的MSD1%封闭剂A中的系列稀释的重组SEZ6标准品加入到孔中并孵育2小时。将板在PBST中洗涤。然后将SC17.36抗体缀合到MSD磺基标签,并将25微升标记的SC17.36(0.5微克/毫升,在MSD1%封闭剂A中)加入到洗涤的板。将含有表面活性剂的MSD阅读缓冲液在水中稀释至1倍,并将150微升添加至各孔。在MSDSectorImager上使用集成的软件分析程序读取板以通过从标准曲线内插以导出NTX样品中的SEZ6浓度。然后将值除以总蛋白质浓度,以产生每毫克总裂解物蛋白的SEZ6的纳克数。所得的浓度在图12B中阐述,其中每个点代表源于单个NTX肿瘤系的SEZ6蛋白浓度。虽然每个点源于单个NTX系,但在大多数情况下,从同一NTX系测试多个生物样品,对值进行平均化以提供数据点。
图12B示出了,与正常组织裂解物相比,选择的肾、卵巢和LCNEC肿瘤样品显示出中等SEZ6蛋白表达,而最高SEZ6蛋白表达在SCLC肿瘤中可见。所有正常组织裂解物对于SEZ6蛋白表达是阴性的,除了正常人脑和眼裂解物。
对PDX肿瘤进行免疫组织化学(IHC)来确认SEZ6在某些PDX肿瘤的表面上表达;并且为了确定SEZ6蛋白质在肿瘤架构中的位置。使用间接检测方法对***固定的石蜡包埋(FFPE)组织切片进行IHC,所述间接检测方法包括针对SEZ6的鼠单克隆一抗(SC17.140),小鼠特异性的生物素缀合的二抗,与辣根过氧化物酶偶联的亲和素/生物素复合物,以及DAB检测(NakenePK1968;16:557-60)。验证SC17.140,并且通过以下证实SC17.140适于IHC:与如实施例5中所述制备的未处理的HEK-293T细胞沉淀相比,过表达SEZ6的HEK-293T细胞沉淀的FFPE切片上显示特异性染色。通过在过表达人SEZ6的HEK-293T细胞和通过IHC证明表达SEZ6(数据未示出)的NTX肿瘤上与5摩尔过量纯化的重组SEZ6的竞争信号,进一步证实特异性。
在SCLCNTX肿瘤中通过IHC测量SEZ6表达,其中,14个测试的SCLCNTX肿瘤中的13个表达SEZ6(图16A)。对使用从SCLC患者切除的174个人肿瘤的核心切片(VanderbiltUniversity,MemorialSloanKetteringCancerCenterandBiomax,Inc.)产生的5个组织微阵列(TMA)进行额外IHC分析。图16B显示通过IHC在那五个TMA中包括的174个原发性患者SCLC肿瘤中测量的SEZ6表达,其中174个SCLC样品中的122个,3个SCLC/腺癌样品中的2个,和1个SCLC/梭形细胞样品中的1个均显示表达SEZ6。与此相反,测试的正常肺组织样品不表达SEZ6(图16B)。用自动图像分析软件包(LeicaBiosystems)分析在图16A和16B中所示的IHC结果,所述自动图像分析软件包定量细胞表面染色的强度,并提供最后的“H-评分”,其反映了在各个强度水平染色的肿瘤细胞的百分比(0表示无染色和3表示强染色)。该H-评分如下计算:(在0的%)*0+(在1+的%)*1+(在2+的%)*2+(在3+的%)*3。因此,该H-如下产生范围从0至300的连续变量。
也对来自甲状腺髓样癌患者的FFPE切片进行IHC。所有测试的患者样品显示表达SEZ6(图16C)。对甲状腺癌样品进行手动评分,其中(-)表示不表达,且(+,++或+++)表示渐增染色强度。FFPE切片中估计表达SEZ6的肿瘤细胞的百分比也示于图16C。
RNA原位杂交(ISH)用于验证通过上面刚刚描述的IHC测定的SEZ6表达的结果。使用2.0试剂盒手动进行ISH(AdvancedCellDiagnostics;Wang等人,2012,PMID:22166544)。使用的RNAscope探针是特异于SEZ6的ECD。采用特异于肽基脯氨酰异构酶B(PPIB)的RNAscope探针,针对RNA完整性,对每个样品进行质量控制,所述肽基脯氨酰异构酶B是位于所有细胞的内质网中的环孢菌素结合蛋白。使用特异于二氨基庚二酸(dapB)RNA的探针,测定背景染色。简言之,将来自在图16B中使用的SCLC肿瘤微阵列中的3个的5微米FFPE组织切片用热和蛋白酶预处理,然后与SEZ6RNA寡核苷酸探针杂交之前。然后使前扩增剂,扩增剂和HRP标记的寡核苷酸顺序杂交,随后是用采用3,3'-二氨基联苯胺的发色沉淀物显色。特异性RNA染色信号被鉴定为棕色点状点。样品用吉尔苏木精(Gill’sHematoxylin)复染。在光学显微镜下分析FFPE切片且在0至4的标度上对染色进行手动评分,采用,其中0=没有染色或每10个细胞少于1个点;1=每细胞1-3个点;2=每细胞4-10个点;3=每细胞多于10个点,并在簇中发现少于10%的点。另外,如果,例如,样品中的细胞的5-30%具有1的评分且细胞的70%以上具有0的评分,则给予0.5的评分。在测试的肿瘤样品中,5/32(16%)不表达SEZ6;17/32(53%)具有1的评分;8/32(25%)具有2的评分,且2/32(6%)具有3的评分。组织微阵列中的原发性患者SCLC样品的总体84%在一定程度上表达SEZ6RNA。这在很大程度上是与获自IHC的结果一致的。
所述数据,与实施例4中所述针对SEZ6表达的mRNA转录数据和实施例11中所述SEZ6的细胞表面蛋白表达组合,强烈强化了SEZ6决定簇为治疗干预提供有吸引力的目标的主题。
实施例13
肿瘤起始细胞群的富集
肿瘤细胞可广泛分为两种类型的细胞亚群:非致瘤性细胞(NTG)和肿瘤起始细胞(TICs)。TICs具有当植入免疫功能低下小鼠时形成肿瘤的能力。癌症干细胞(CSCs)是TIC的一个子集,并能够无限自我复制,同时保持多谱系分化的能力。为了确定SEZ6表达是否可与增强的致瘤性相关,进行全转录组测序、流式细胞术和致瘤性测定,所有这些在下面描述。
如实施例1中所述进行各种肿瘤样品中SEZ6表达的全转录组分析。在CD324表达的基础上鉴定CSCs,CD324已显示是各种肿瘤中的干细胞的标记物(参见PCT申请2012/031280)。图6B中的结果表明,与从两个SCLCNTX肿瘤系(LU86和LU95)中分离的NTG细胞相比,SEZ6mRNA表达在CSC中是升高的。
基本上如实施例11中所述,对来自NTX肺肿瘤的细胞进行流式细胞术。将LU86、LU117和LU64细胞分别用CD324(CSC群体的标记物(参见PCT申请2012/031280))和抗SEZ6抗体SC17.10、SC17.28或SC17.42共染色,以确定SEZ6是否在这些群体上差异表达。如图13B中所示,与仅对SEZ6染色阳性的细胞相比(黑色虚线),对CD324和SEZ6两者染色阳性的LU86、LU117和LU64细胞(黑色实线)进一步向右移,表明与NTG细胞群相比,SEZ6在CSCs上更高度表达。大群体同种型对照显示为灰色填充的直方图(MOPC=IgG1)。
为了确定细胞表面SEZ6表达是否与产生肿瘤的增强能力相关,进行致瘤性研究。使用本领域公认的酶促消化技术(参见,例如,U.S.P.N.2007/0292414,其并入本文),将NTX肿瘤样品解离,并将分散到悬浮液中。用荧光缀合的抗体克隆SC17.42染色从这些NTX系解离的细胞制备物,所述荧光缀合的抗体特异性识别鼠CD45,H2kD,人类CD324和人类SEZ6。使用FACSAriaTM流式细胞仪(BDBiosciences)分离人类细胞的两个子集,两者均基于用鼠CD45或H2kD染色(用于耗尽鼠细胞的细胞制备物)的不存在而鉴定)。基于CD324和SEZ6共表达分离一个子集,而基于CD324+SEZ6-表型分离另一子集。通过以每只小鼠大约50个细胞的剂量皮下注射入乳腺脂肪垫,将独特标记物富集的细胞亚群随后移植入雌性NOD/SCID免疫功能低下的小鼠。
图14A和14B示出了,使用衍生自从患者获得的NSCLC肿瘤的代表性NTX细胞系进行这样的实验的结果。图14A是散点图(使用CD324和SEZ6门控),其表示亲本肿瘤的mCD45-H2kD-子集和分选的推定致瘤性细胞的分布。图14B图示显示测量的由分选的细胞亚群移植入免疫功能低下小鼠引起的肿瘤体积。括号中的数值表示每个移植小鼠产生的肿瘤的数目。
显著的是,来自图14的数据表明,致瘤性一致地与表达SEZ6的细胞以及高水平CD324的亚群有关。相反地,这些相同的数据表明,不表达或者表达低水平SEZ6的肿瘤细胞比它们的高或阳性对应物具有少得多的致瘤性。基于所生成的数据,令人惊讶地发现,表达CD324+SEZ6+表型的肿瘤细胞的亚群通常含有绝大多数致瘤能力,并暗示SEZ6可为致瘤细胞调节提供有效治疗目标。
实施例14
SEZ6调节剂促进将细胞毒性剂递送至表达SEZ6的HEK-293T细胞
为了证明本发明的SEZ6调节剂能够介导细胞毒性剂至活细胞的递送,用结合于皂草素毒素的选择的SEZ6抗体调节剂进行体外细胞杀死测定法。皂草素通过在细胞质中使核糖体失活而杀死细胞。因此,使用以下测定法的细胞死亡指示SEZ6抗体能够内化和将细胞毒性剂递送至目标细胞的细胞质中。
共价连接到皂草素的抗小鼠IgGFab片段(“Fab-皂草素”)(AdvancedTargetingSystems),#IT-48)与未标记的SEZ6抗体合并,并与表达人SEZ6的HEK-293T细胞孵育(参见实施实施例5)。通过测量细胞活力,在72小时后测量所得皂草素复合物内化和杀死细胞的能力。
具体地,将补充有10%胎牛血清的DMEM中的每孔500个细胞铺板于96孔组织培养处理板,一天后加入抗体和毒素。采用100、50或10PM的浓度的对照(IgG1,IgG2a或IgG2b)或纯化的鼠SEZ6调节剂连同2nMFab-皂草素处理表达人SEZ6的HEK-293T细胞。将所述细胞培养三天,在这之后,按照制造商的说明,用CellTiter (Promega)计数活细胞数目。使用含有细胞与皂草素Fab片段的培养物的原始发光单位(RLU)被设定为100%参考值,并相应地计算所有其他计数(称为归一化的RLU或“%活细胞”)。图15A显示,许多测试的SEZ6调节剂以浓度依赖性的方式介导HEK-293T细胞的杀死。同种型对照(IgG2a、IgG2b和IgG1)不影响细胞计数,如通过图15A的前三行的结果所示(ND=未测定)。
该测定表明,在SEZ6特异性抗体与细胞表面结合后,可发生内化,而不需要另外的交联或二聚化。
实施例15
SEZ6调节剂体外介导肺肿瘤细胞中的细胞毒作用
为了证实实施例14的结果,并确定SEZ6调节剂是否可以介导毒素内化和人肿瘤细胞的细胞杀死(相对于工程改造的细胞),将小鼠谱系耗竭的NTX细胞铺板,并随后暴露于抗SEZ6抗体和Fab-皂草素。
如本领域中已知,将NTX肿瘤解离成单细胞悬浮液,并铺板于PrimariaTM板(BDBiosciences)上的补充生长因子且无血清的培养基中。在37℃/5%CO2/5%O2中培养细胞一天后,用对照(IgG1,IgG2a或IgG2b)或鼠SEZ6调节剂和Fab-皂草素处理所述细胞,如实施例14所述。七天后,通过使用CellTiterGlo定量活细胞的剩余数,评估调节剂介导的皂草素细胞毒性。
如图15B中所见,当LU37(NSCLC肿瘤)和LU80(SCLC肿瘤)暴露于SC17.6(SC17.16的副本序列)和SC17.33SEZ6调节剂时,肿瘤细胞的数量的减少是明显的。类似地,当LU100(SCLC肿瘤)暴露于四种SEZ6调节剂(SC17.6,SC17.19,SC17.33和SC17.34)时,在50和500pM,实现肿瘤细胞的减少。相反,同种型对照抗体不影响治疗后活细胞的数量。
不仅该数据表明本文描述的示例性抗体能够将SEZ6抗原结合在细胞表面上并促进细胞毒性有效负载的递送、导致细胞死亡,而且上面的数据也表明,多种抗SEZ6抗体可介导各种NTX肿瘤细胞的杀死。
实施例16
SEZ6抗体-药物缀合物的制备
基于实施例14和15中采用皂草素的体外杀死测定法和为了进一步说明本发明的多样性,制备具有如上述的M-[L-D]结构的抗SEZ6抗体药物缀合物。即,用共价连接的细胞毒性剂制备抗SEZ6抗体药物缀合物(SEZ6-ADC)。更具体地,制备SEZ6-ADC,其包含如本文所述的或在紧接下面参考文献中所述的连接体,和共价连接于所公开的调节剂的选定吡咯并苯并二氮杂(PBD)二聚体(见,例如,U.S.P.N.2011/0256157和2012/0078028和U.S.P.N.6,214,345,其各自通过引用整体并入本文)。
鉴于引用的参考文献使用本领域公认的技术,合成和纯化PBD药物-连接体组合进行。虽然各种PBD二聚体和连接体用于制造所选择的药物-连接体组合,但每个连接体单元包含具有游离巯基的末端马来酰亚胺基结构部分。使用这些连接体,通过以下制备缀合物:用三(2-羧乙基)-膦(TCEP)部分还原mAb,接着是还原的Cys残基与马来酰亚胺基-连接体有效载荷反应。
更具体地,在37℃在25mMTrisHClpH7.5和5mMEDTA缓冲液中,用每摩尔mAb1.3摩尔的TCEP还原所选择的SEZ6抗体调节剂2小时。将反应物冷却至15℃,并以2.7摩尔/摩尔mAb的比例添加在DMSO中的连接体有效载荷,随后添加额外量的DMSO至6%的终浓度(v/v)。使反应进行1小时。通过加入过量的N-乙酰半胱氨酸将未反应的药物-连接体加帽。然后通过使用AKTAExplorerFPLC***(G.E.Healthcare)的离子交换柱纯化所述SEZ6-ADC(或SC17-ADC),以移除聚集的高分子量抗体、共溶剂和小分子。然后通过切向流过滤(TFF)而使洗脱的ADC进行缓冲液交换到制剂缓冲液,随后调整浓度并加入洗涤剂。分析最终ADC的蛋白质浓度(通过测量UV),聚集(SEC),药物抗体比(DAR)(通过反相(RP)HPLC),未缀合的抗体的存在(通过疏水相互作用色谱法(HIC)HPLC),非蛋白质物质(通过RPHPLC)和体外细胞毒性(使用SEZ6表达细胞系)。
使用前述方法,或基本相似的方法,生成包含各种SEZ6调节剂和PBD二聚体的一些ADCs(即,M-[L-D]n),并在各种体内和体外模型中进行测试。为了这些实施例和本公开内容的目的,这样的ADC一般可称为SEZ6-ADCs或SC17-ADCs。离散ADC将根据抗体(例如,SC17.17)和特定的连接体-细胞毒剂指定ADC1、ADC2等进行命名。因此,与本发明相容的示例性调节剂可包含SC17.17-ADC1或SC17.24-ADC2,其中ADC1和ADC2代表个别的PBD二聚体细胞毒性剂(和任选的连接体)。
作为初始基准,当暴露于过表达SEZ6的HEK293细胞时在11nM的IC50测定到hSC17.17-ADC1的体外细胞毒性(数据未显示)。
实施例17
缀合的SEZ6调节剂体外介导肺癌和卵巢肿瘤中的细胞毒性
测试上述实施例16中产生的ADC,以确定它们是否能够体外介导原发性人肿瘤细胞的毒素内化和细胞杀死。
用与实施例15所述同样的方法,将小鼠谱系耗竭的NTX肿瘤细胞暴露于抗SEZ6ADC或小鼠同种型对照(msIgG1),除了不加入Fab-皂草素。当用抗SEZ6ADCs(SC17.24-ADC2,SC17.28-ADC2和SC17.34-ADC2)处理LU64(SCLC肿瘤)和OV26(NET卵巢肿瘤)时,观察到的是,与对照msIgG1相比,活细胞百分比的减少得到增加(图17A)。尽管msIgG1在高浓度对细胞可以是细胞毒性的,但所有三种测试的抗SEZ6ADC是更有效的,这表明对SEZ6的免疫特异性应答,而不是对PBD细胞毒素的一般应答。
实施例18
缀合的SEZ6调节剂体内抑制肿瘤生长
测试上面实施例16中产生的ADCs,以证明它们的减少和抑制免疫缺陷小鼠中人体NTX肿瘤生长的能力。
使用本领域公认的技术,在雌性NOD/SCID受体小鼠的侧腹皮下生长患者来源的NTX肿瘤。每周两次监测肿瘤体积和小鼠重量。当肿瘤体积达到150-250mm3时,将小鼠随机分配至治疗组,并且采用SC17-ADC1或对照MsIgG1-ADC1进行腹膜内注射。在七天的时段中,对小鼠给予1mg/kg的三次注射(由图17B中的垂直线表示)。治疗后,监测肿瘤体积和小鼠重量,直到肿瘤超过800mm3或小鼠生病。
图17B显示了,鼠抗SEZ6ADC能够在小鼠中抑制SCLC肿瘤(例如LU86)和LCNEC肿瘤(例如LU50)的体内生长。在LU86的情况下,五种测试的ADC(SC17.3-ADC1,SC17.24-ADC1,SC17.26-ADC1,SC17.28-ADC1和SC17.34-ADC1)产生持久的缓解,在一些情况下,所述缓解在治疗后120天后依然持续。特别是,SC17.34-ADC1治疗在该剂量在研究的持续时间内抑制肿瘤生长,而SC17.24-ADC1在多于50天的进展时间内导致显著的肿瘤生长抑制。类似地,用五种示例性ADC(SC17.3-ADC1,SC17.17-ADC1,SC17.24-ADC1,SC17.34-ADC1和SC17.46-ADC1)处理LU50导致了肿瘤生长抑制,所述抑制用SC17.46持续长达35天。此外,采用SC17-ADC1治疗的小鼠未显示出超出通常见于免疫缺陷、荷瘤NOD/SCID小鼠中的不利健康影响的不利健康影响。这些结果表明,所公开的ADC可用于有效地抑制肿瘤生长且SC17调节剂结合的细节可对体内功效产生影响。
更直接的是,各种缀合的调节剂在延长的时间内体内急剧延迟或抑制肿瘤生长的能力进一步验证SEZ6作为用于治疗增殖性病症的治疗目标的用途。
实施例19
人源化缀合SEZ6调节剂抑制肿瘤生长
鉴于采用鼠抗SEZ6ADC调节剂所获得的令人印象深刻的结果,进行另外的实验,以证明示例性人源化抗SEZ6ADC调节剂在治疗体外和体内甲状腺癌细胞系和体内SCLC肿瘤中的功效。
甲状腺癌细胞系是购买的(ATCC,CRL-1803),并在37℃以每孔500个细胞铺板在96孔板中的补充有10%胎牛血清(FBS)的F-12K培养基(ATCC;目录#30-2004)中。将5nM的hSC17.200-ADC1(如实施例16中所述制备),或对照IgG1-ADC1加入到细胞中。8天之后,用CellTiter(Promega)中按照生产商的说明计数活细胞数。使用Raw发光单位(RLU)测量功效,其中,未经处理的细胞的RLU被设定为100%参考值,且相对于参考值计算所有其他RLU值(称为归一化的RLU)。图18A中的结果显示,与人IgG1-ADC1对照相比,抗SEZ6抗体药物缀合物hSC17.200-ADC1更显著地抑制甲状腺癌细胞的生长。
还测试人源化抗SEZ6ADC体内减少髓样甲状腺肿瘤体积的能力。在37℃,在96孔板中,以每孔500个细胞,在补充有10%FBS的F-12K培养基中,培养甲状腺细胞系(ATCC,CRL-1803)。收获细胞,并在五个NOD/SCID小鼠中皮下移植。一旦小鼠中的肿瘤达到的200立方毫米的平均值,将2毫克/千克hSC17.200-ADC1的单次剂量经腹膜内注射施用。功效通过每周的肿瘤体积测量来监测,将平均肿瘤体积和标准误差平均值(SEM)相对于时间(天)作图。施用hSC17.200-ADC1后,观察到肿瘤体积的显著减少(图18B)。
还测试人源化抗SEZ6ADC减少SCLC肿瘤体积的能力。将抗SEZ6ADCs(hSC17.17,hSC17.24,hSC17.34和hSC17.46)和人IgG1同种型对照ADC(huIgG1)施用于携带多种患者来源的NTX肿瘤的免疫缺陷小鼠。在七天的时段内,对小鼠给予1mg/kg的三次注射(由在图18C和18D中的垂直线所示)。治疗后,监测肿瘤体积和小鼠重量,直到肿瘤超过800立方毫米或小鼠生病。这些实验的结果示于图18C和18D。在四个SCLC肿瘤中,通过施用人源化抗SEZ6ADC,实现了肿瘤块的完全和持久消除。图18C表示,hSC17.17-ADC1和hSC17.46-ADC1减小LU80肿瘤;且hSC17.17-ADC1,hSC17.34-ADC1和hSC17.46-ADC1消除LU64肿瘤。图18D显示,hSC17.17-ADC1和hSC17.46-ADC1减小LU117肿瘤;且hSC17.34-ADC1和hSC17.46-ADC1减小LU111肿瘤。
这些结果表明了,各种人源化SEZ6调节剂有效地延缓不同肿瘤的生长的令人惊讶的适用性。
实施例20
化疗耐药PDX细胞系的生成
生成化疗耐药SCLC系以测试在已经经历第一线的化疗治疗的肿瘤中的SEZ6的表达。从SCLC患者来源的异种移植(PDX)肿瘤细胞系开发所述化疗耐药细胞系,所述异种移植(PDX)肿瘤细胞系获自使用本领域公认的技术生成和维持的PDX肿瘤库。PDX肿瘤库包含众多离散的肿瘤细胞系,所述离散的肿瘤细胞系在免疫功能低下小鼠中通过异质肿瘤细胞的多次传代增殖,所述异质肿瘤细胞最初获自患有各种实体瘤的恶性肿瘤的大量癌症患者。测试样品的代数由p0-p#指示,其中p0表示从患者肿瘤直接获得的未传代样品,p#表示测试前肿瘤已通过小鼠传代的次数。早代PDX肿瘤响应于治疗药剂,诸如伊立替康(即)和顺铂/依托泊苷方案,为驱动肿瘤生长的基础机制、对当前治疗的耐受性和肿瘤复发提供临床相关见解。
顺铂和其衍生物(包括奥沙利铂)是用于SCLC的护理的化疗标准。由于担心顺铂可能在组织培养基中不稳定,开发对奥沙利铂具有耐药性的SCLCPDX系(Schuldes等人,1997,pMID:9128988)。通过分离来自LU124p2的人细胞产生对奥沙利铂具有耐药性的SCLC系,所述LU124p2是已通过NOD.SCID小鼠经皮下传代两次的SCLCPDX系。LU124p2肿瘤在达到800-2000mm3后从小鼠切除,使用本领域公认的酶促消化技术(参见,例如,US2007/0292414),将其解离成单细胞悬浮液,且耗竭鼠细胞。然后将细胞洗涤并将其在5%氧和无血清培养基中培养,并立即用1μM奥沙利铂治疗。暴露于奥沙利铂七天后,洗涤细胞,并使其在标准无血清培养基中恢复两周,每周两次更换新鲜培养基。恢复期后,将细胞洗涤并重新接种到含有1μM奥沙利铂的新烧瓶中,持续七天,接着是最终洗涤和两周恢复期。所得细胞系命名为LU124OXAHIp2。使用Versene(Invitrogen)生成单细胞悬浮液。将一些细胞注射到小鼠中以繁殖LU124OXAHIp2细胞系,而其他细胞在体外培养,以测试对奥沙利铂的敏感性。
如下测试LU124OXAHIp2的奥沙利铂敏感性:将LU124OXAHIp2细胞接种到96孔板上,并按照本领域的标准采用无血清培养基中的奥沙利铂的滴定液处理所述细胞。在培养七天后,使用CellTiter(Promega),按照制造商的说明收获细胞,且获得剂量响应曲线。与亲本细胞系(LU124p2)(IC50=0.036μM)相比,LU124OXAHIp2对较高剂量的奥沙利铂具有更大的耐药性(IC50=2-2.5μM)(图19)。为了确定耐药性是否是稳定的,通过免疫功能低下的小鼠再次传代LU124OXAHIp2细胞,以产生称为LU124OXAHIp3的细胞系。在LU124OXAHIp3中维持耐药性,这表明,甚至在不存在选择压力,即即使当奥沙利铂不存在时,细胞系的耐药性得到维持。
实施例21
使用微阵列在化疗耐药肿瘤细胞中的SEZ6表达
微阵列表达分析用来鉴定化学-敏感亲本系在LU124OXAHIp3上上调的潜在细胞表面目标。在用于测定法的准备中,切出来自LU124p3和LU124OXAHIp3PDX系的肿瘤,解离成单细胞悬浮液,并如实施例1中所描述,耗尽鼠细胞。按照制造商的说明,在RLTplusRNA裂解缓冲液中裂解细胞,将细胞存储在-80℃并将其解冻以用于mRNA提取。解冻后,使用RNeasy分离试剂盒(Qiagen)提取总mRNA,并使用NanoDrop分光光度计(ThermoScientific)和/或生物分析仪2100(AgilentTechnologies)使用制造商的方案和推荐的仪器设置定量总mRNA。评估所得总mRNA制备物用于基因测序和基因表达分析的适用性。
使用AgilentSurePrintGE人8x60v2微阵列平台(其含有针对人类基因组中的27958个基因和7419个lncRNA设计的50599个生物探针)分析1-2微克全肿瘤总mRNA样品。规范行业实践用来将强度值均一化和转化以定量每个样品的基因表达。与匹配亲本系(LU124p3)和还有来自早期鼠代的亲本系(LU124p1)相比,SEZ6mRNA(Agilent探针ID:A_23_P49849)被鉴定为在LU124OXAHIp3中上调(图20)。
实施例22
在化疗耐药肿瘤细胞系中的SEZ6蛋白表达
鉴于与如实施例1中所述产生的对奥沙利铂具有耐药性的细胞系相关联的升高的SEZ6mRNA转录物水平,进行研究以测试SEZ6蛋白表达是否也在该细胞系中升高。为了检测和定量SEZ6蛋白表达,使用MSD发现平台(MesoScaleDiscovery)开发电化学发光SEZ6夹心ELISA测定法。
将LU124p3细胞和LU124OXAHIp3细胞快速冷冻于干冰/乙醇上。将蛋白提取缓冲液(Biochain研究所)加入到解冻细胞,裂解物通过离心(20000g,20分钟,4℃)进行澄清并使用二辛可宁酸定量每个裂解物的总蛋白质浓度。蛋白质裂解物贮存在-80℃直至测定。来自裂解物样品的SEZ6蛋白浓度通过从使用纯化的重组SEZ6蛋白产生的标准蛋白质浓度曲线内插值来确定。所述SEZ6蛋白标准曲线和蛋白定量测定如下进行:
在4℃用30微升的1微克/毫升在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的抗SEZ6抗体SC17.17包被MSD标准板过夜。将板在PBST中洗涤,并于150微升MSD3%封闭剂A溶液中封闭一小时,同时摇动。将板在PBST中再次洗涤。还将25微升在含有10%蛋白质提取缓冲液的MSD1%封闭剂A中的10倍稀释的裂解物(或系列稀释的重组SEZ6标准品)加入到孔中并孵育2小时,同时摇动。将板在PBST中再次洗涤。将含有表面活性剂的MSD阅读缓冲液T在水中稀释至1倍,并将150微升添加至各孔。在MSDSectorImager上使用集成的软件分析程序读取板以通过从标准曲线内插以导出PDX样品中的SEZ6浓度。然后将值除以总蛋白质浓度,以产生每毫克总裂解物蛋白的SEZ6的纳克数。所得的浓度在图21中阐述,其中条形图表示源于LU124p3和LU124OXAHIp3细胞系的SEZ6蛋白浓度。LU124细胞裂解物中的SEZ6的表达是每毫克总蛋白5.8纳克,而LU124对奥沙利铂具有耐药性的系是每毫克总蛋白14.6纳克。图21显示与亲本LU124p3细胞相比,对奥沙利铂具有耐药性的LU124OXAHIp3细胞系表现出高SEZ6蛋白表达。这些数据,与上述实施例中所述针对SEZ6表达的mRNA转录数据组合,强烈强化了SEZ6蛋白表达在表现出化疗耐药性的肿瘤中上调的主题。
本领域技术人员将进一步理解的是,本发明可以以其他特定形式而不脱离其精神或中心特征的前提下进行实施。因为本发明的前面的描述仅仅公开了其示例性实施方案,所以应当理解的是,考虑其他变型在本发明的范围之内。因此,本发明并不限于已在本文中详细描述的具体实施方案。相反,应该参考所附权利要求书,所附权利要求书指示本发明的内容和范围。
Claims (19)
1.特异性结合SEZ6蛋白上的表位的分离的抗体,其中所述表位包含选自以下的氨基酸残基:(i)残基R762、L764、Q777、I779、D781和Q782;(ii)残基R342和K389和(iii)残基T352、S353和H375。
2.包含直接或间接缀合至治疗性结构部分的抗体的抗体-药物缀合物,其中所述抗体特异性结合于SEZ6蛋白上的表位,其中所述表位包含选自以下的氨基酸残基:(i)残基R762、L764、Q777、I779、D781和Q782;(ii)残基R342和K389和(iii)残基T352、S353和H375。
3.权利要求2的抗体药物缀合物,其中所述治疗性结构部分选自阿里他汀类、鹅膏蕈碱类和吡咯并苯并二氮杂类。
4.治疗患有癌症的个体的方法,包括施用治疗有效量的抗体药物缀合物,所述抗体药物缀合物包含直接或间接缀合至治疗性结构部分的抗体,其中所述抗体特异性结合于SEZ6蛋白上的表位,其中所述表位包含选自以下的氨基酸残基:(i)残基R762、L764、Q777、I779、D781和Q782;(ii)残基R342和K389和(iii)残基T352、S353和H375。
5.权利要求4的方法,其中所述治疗性结构部分选自阿里他汀类、鹅膏蕈碱类和吡咯并苯并二氮杂类。
6.权利要求4的方法,其中所述个体先前已用基于铂的药剂进行治疗。
7.治疗患有对铂具有耐药性的小细胞肺癌的个体的方法,包括施用治疗有效量的抗体药物缀合物,所述抗体药物缀合物包含直接或间接缀合至治疗性结构部分的抗体,其中所述抗体特异性结合SEZ6蛋白上的表位,其中所述表位包含选自以下的氨基酸残基:(i)残基R762、L764、Q777、I779、D781和Q782;(ii)残基R342和K389和(iii)残基T352、S353和H375。
8.权利要求7的方法,其中所述治疗性结构部分选自阿里他汀类,鹅膏蕈碱和吡咯并苯并二氮杂
9.治疗患有甲状腺髓样癌的患者的方法,包括施用治疗有效量的抗体药物缀合物,所述抗体药物缀合物包括直接或间接缀合至治疗性结构部分的抗体,其中所述抗体特异性结合于SEZ6蛋白上的表位。
10.权利要求9的方法,其中所述表位包含选自以下的氨基酸残基:(i)残基R762、L764、Q777、I779、D781和Q782;(ii)残基R342和K389和(iii)残基T352、S353和H375。
11.权利要求9的方法,其中所述治疗性结构部分选自阿里他汀类、鹅膏蕈碱类和吡咯并苯并二氮杂类。
12.诊断对铂具有耐药性的小细胞肺癌的方法,包括以下步骤:
a.提供来自个体的对铂具有耐药性的小细胞肺癌肿瘤样品;
b.将所述肿瘤样品暴露于用报道分子标记的抗SEZ6抗体,其中所述抗SEZ6抗体与所述肿瘤样品缔合;和
c.检测与所述肿瘤样品缔合的报道分子。
13.权利要求12的方法,其中在体外检测报道分子。
14.权利要求12的方法,其中利用免疫组织化学检测报道分子。
15.权利要求12至14中的任一项的方法,其中所述抗SEZ6抗体结合SEZ6蛋白上的表位,其中所述表位包含氨基酸残基R762、L764、Q777、I779、D781和Q782。
16.诊断甲状腺髓样癌的方法,包括以下步骤:
a.提供来自个体的甲状腺髓样肿瘤样品;
b.将所述肿瘤样品暴露于用报道分子标记的抗SEZ6抗体,其中所述抗SEZ6抗体与所述肿瘤样品缔合;和
c.检测与所述肿瘤样品缔合的报道分子。
17.权利要求16的方法,其中在体外检测报道分子。
18.权利要求16的方法,其中利用免疫组织化学检测报道分子。
19.权利要求16至18中的任一项的方法,其中所述抗SEZ6抗体结合SEZ6蛋白上的表位,其中所述表位包含氨基酸残基R762、L764、Q777、I779、D781和Q782。
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