CN105779420A - 一种耐高温酸性***呋喃糖苷酶AbfaHLB及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温酸性***呋喃糖苷酶AbfaHLB及其基因和应用。本发明提供了一种来源于栗褐芽孢杆菌Bacillusbadius HLB的***呋喃糖苷酶AbfaHLB，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述***呋喃糖苷酶的编码基因abfa HLB。本发明的***呋喃糖苷酶的具有以下性质：最适pH4.5，最适温度50℃，在80℃具有很好的热稳定性。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于饲料，食品、能源工业等。

Description

一种耐高温酸性***呋喃糖苷酶AbfaHLB及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温酸性***呋喃糖苷酶AbfaHLB及其基因、包含该基因的重组载体和应用。

背景技术

木聚糖的基本糖单元是D-吡喃木糖，它的主链由木糖以β-1,4糖苷键连接形成，侧链上被各种不同的取代基所修饰，同时，这些侧链取代基团通过化学键互相交联，形成复杂的结构。木聚糖是半纤维素中最丰富的一类多糖类物质，广泛存在于硬木(15-30％)、软木(7-10％)和草本类植物(少于30％)中。木聚糖的降解需要主链水解酶和支链水解酶的协同作用，主链水解酶包括β-1，4-木聚糖酶和β-木糖苷酶，侧链水解酶需要α-l-***呋喃糖苷酶，α-葡萄糖醛酸，乙酰木聚糖酯酶等辅酶。其中，***呋喃糖苷酶(α-l-arabinofuranosidase，EC3.2.1.55)能从含有***糖残基的多聚物如***聚糖、***木聚糖、***半乳聚糖等的非还原末端水解生成一个***糖分子。目前，人们已将细菌、真菌和植物来源的α-l-***呋喃糖苷酶进行分离纯化、或者通过基因克隆、异源表达之后，深入研究酶的各种性质。来源于微生物的***呋喃糖苷酶的最适反应pH为酸性至中性之间(pH3.0-7.0)，最适反应温度介于40-70℃之间。

***呋喃糖苷酶还被广泛应用于食品行业中，L-***糖做为一种低摄入量的甜味剂能代替传统的蔗糖，适于老年人和高血糖患者食用。***呋喃糖苷酶还能增加酿酒过程中萜烯醇的浓度，提高酒的香味。其还能增加果汁的澄清度，而被应用于果汁生产工业。作为半纤维素降解酶系之一，α-l-***呋喃糖苷酶参与低价的农产品残渣的再利用，产生可用于发酵生成燃料乙醇的单糖及其他副产品。在纤维素发酵生产燃料乙醇的过程中，有约70％的原材物将不能被完全降解生成单糖，适当的纤维素预处理过程可以加大纤维素的利用率。利用酶预处理的方法则减少了这些问题的发生。***呋喃糖酶是半纤维素的侧链降解酶，它能促进半纤维素的完全降解。另外，***糖呋喃糖苷酶作为一种饲料添加剂，去除了木聚糖上***糖侧链，促进木聚糖的降解，易于被动物消化吸收。因此，***呋喃糖苷酶的生产、纯化、性质特征及其在饲料加工、酿酒工业、果汁加工、以及能源等领域的应用正在不断深入。

工业生产需要酶进行短期高温处理，目前多数***呋喃糖苷酶最适温度在50度左右，但热稳定性差的性质不能满足饲料制粒，酿造加工等工业要求。因此获得热稳定性优良的酶能降低生产成本，满足不同工业对酶性质的要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用的耐高温酸性***呋喃糖苷酶。

本发明的再一目的是提供编码上述耐高温酸性***呋喃糖苷酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述耐高温***呋喃糖苷酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述耐高温***呋喃糖苷酶的应用。

本发明从栗褐芽孢杆菌BacillusbadiusHLB中分离得到一种新的耐高温***呋喃糖苷酶AbfaHLB。

本发明提供了一种耐高温酸性***呋喃糖苷酶AbfaHLB，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：

其中，该酶基因编码502个氨基酸，无信号肽序列。

本发明的***呋喃糖苷酶AbfaHLB在酸性和中性范围内具有较好的酶活力，并且具有很好的热稳定性。本发明筛选到栗褐芽孢杆菌BacillusbadiusHLB的***呋喃糖苷酶AbfaHLB具有以下性质：最适pH4.5，并在pH2.0-6.0范围内具有60％以上的酶活力，具有很好的pH稳定性，37℃下作用1h后，在pH2.0-8.0之间,剩余酶活性均在85％以上。最适温度50℃，60℃下仍具有60％以上的活性，良好的热稳定性，80℃都有较好的稳定性。

本发明提供了编码上述耐高温酸性***呋喃糖苷酶的基因AbfaHLB。具体地，该基因的基因组序列如SEQIDNO.2所示：

本发明通过PCR的方法分离克隆了***呋喃糖苷酶AbfaHLB的编码基因，DNA全序列分析结果表明，***呋喃糖苷酶的编码基因abfaHLB全长1509bp。

成熟蛋白理论分子量为56.6kDa，将***呋喃糖苷酶AbfaHLB的编码基因序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于Alicyclobacillushesperidum的***呋喃糖苷酶序列一致性为77％。说明AbfaHLB是一种新的***呋喃糖苷酶。

本发明还提供了包含上述***呋喃糖苷酶基因abfaHLB的重组载体，优选为pPIC9-abfaHLB。将本发明的***呋喃糖苷酶基因***到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的***呋喃糖苷酶基因***到质粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，得到重组酵母表达质粒pPIC9-abfaHLB。

本发明还提供了包含上述耐高温***呋喃糖苷基因abfaHLB的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，进一步优选为毕赤酵母菌，例如，重组菌株GS115/abfaHLB。

本发明还提供了一种制备耐高温酸性***呋喃糖苷酶AbfaHLB的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组***呋喃糖苷酶表达；

3)回收并纯化所表达的***呋喃糖苷酶AbfaHLB。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母，优选将重组表达质粒转化毕赤酵母GS115，得到重组菌株GS115/abfaHLB。

本发明还提供了上述***呋喃糖苷酶AbfaHLB的应用。优选地，提供上述***呋喃糖苷酶AbfaHLB在饲料和食品工业中的应用，进一步优选在饲料和食品工业中降解***木聚糖的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、酿酒、食品工业中应用新的***呋喃糖苷酶。本发明的***呋喃糖苷酶最适pH为4.5，在pH2.0-6.0都有较高的酶活性；pH稳定性好。其耐高温特性，可使其在需求高温环境的工业生产上应用。本***呋喃糖苷酶适用于饲料工业，可与木聚糖酶协同作用，有效消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。在酿酒工业中，可有效降解可溶性和不可溶性的***木聚糖，有效降低麦芽汁的粘度提高过滤效率澄清啤酒。另外，在白酒、清酒的酿造中有助于增加酿酒过程中萜烯醇的浓度，增加香味。因此，本***呋喃糖苷酶在食品工业中的应用显示出其巨大的潜力。

本发明中来源于栗褐芽孢杆菌BacillusbadiusHLB的***呋喃糖苷酶AbfaHLB具有以下性质：最适pH4.5，并在pH2.0-6.0范围内具有60％以上的酶活力，具有很好的pH稳定性，37℃下作用1h后，在pH2.0-8.0之间,剩余酶活性均在80％以上。最适温度50℃，60℃下仍具有60％以上的活性，良好的热稳定性，80℃都有较好的稳定性。良好的pH和热稳定性等特性使其在饲料，食品工业应用上具有很大的潜力。

附图说明

图1为本发明的重组耐高温酸性***呋喃糖苷酶的最适pH。

图2为本发明的重组耐高温酸性***呋喃糖苷酶的pH稳定性。

图3为本发明的重组耐高温酸性***呋喃糖苷酶的最适温度。

图4为本发明的重组耐高温酸性***呋喃糖苷酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体

毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂

酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。p-nitrophenyl-a-L-arabionfuranoside(pNPAf)购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基

(1)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH自然)。

(2)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。

(3)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH自然。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1栗褐芽孢杆菌BacillusbadiusHLB中***呋喃糖苷酶基因abfaHLB的克隆

提取栗褐芽孢杆菌BacillusbadiusHLB基因组DNA：

(1)取0.5-2mL培养菌液，10000rpm，离心30s，尽可能的吸取上清，收集菌体；

(2)EP管中加200μL缓冲液RB重悬，10000rpm离心30s，弃上清；

(3)对于革兰氏阳性菌：加入120μL溶菌酶，颠倒混匀，37℃水浴30-60min；

(4)12000rpm离心2min，弃上清后将细胞振荡或者吹打重悬于180μL缓冲液RB中；

(5)加RNaseA(25mg/mL)溶液20μL，振荡混匀，室温放置5-10min；

(6)加结合液CB800μL，再加入100μL异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能出现絮状沉淀；

(7)将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中，吸附柱放入收集管中，13000rpm离心30-60s，弃掉废液；

(8)加抑制物去除液IR500μL，12000rpm离心30s，弃废液；

(9)加入700μL漂洗液WB，12000rpm，离心30s，弃掉废液；

(10)加入500μL漂洗液WB，12000rpm，离心30s，弃掉废液；

(11)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，一面漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；

(12)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μL洗脱缓冲液EB，室温放置3-5min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min；

(13)得到的DNA于-20℃保存。

从NCBI基因数据库中获取芽孢杆菌来源***呋喃糖苷酶AbfaHLB基因序列进行序列比对分析，设计合成引物P1，P2：

P1:5'-ATGTCTATGGATGTAGATCCACGTTTA-3'；

P2:5'-TACATTTACACGTAAACGAATCCAAGA-3'。

以栗褐芽孢杆菌BacillusbadiusHLB总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环后72℃保温10min，获得一条约1500bp大小的片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体进行连接转化后送北京睿博新科生物技术有限公司测序。通过基因测序得到1509bp的基因片段，编码502个氨基酸和一个终止密码子。

实施例2***呋喃糖苷酶AbfaHLB的制备

根据获得的***呋喃糖苷酶AbfaHLB的基因序列设计合成表达引物：

P3:5'-GATGAATTCATGTCTATGGATGTAGATCCACGTTTA-3'；

P4:5'-GCTGCGGCCGCTACATTTACACGTAAACGAATCCAAGA-3'。

重新以栗褐芽孢杆菌BacillusbadiusHLB总DNA为模板进行PCR扩增，获得带有重组酶切位点的***呋喃糖苷酶AbfaHLB基因。将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoRI+NotI)，同时将编码***呋喃糖苷酶的基因abfaHLB双酶切(EcoRI+NotI)，酶切出编码成熟***呋喃糖苷酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有BacillusbadiusHLB***呋喃糖苷酶基因abfaHLB的重组质粒pPIC-abfaHLB并电击转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/abfaHLB。

将含有重组质粒的GS115菌株，接种于400mLBMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后利用200mLBMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定***呋喃糖苷酶的活力，重组***呋喃糖苷酶的表达量为60U/mL。

实施例3重组***呋喃糖苷酶AbfaHLB的活性分析

***呋喃糖苷酶活性的测定：在405nm下测定酶水解底物pNPAf生成的产物p-nitrophenol的量。反应步骤：250μL2mMpNPAf底物与150μL缓冲液混匀，加入100μL适当稀释的酶液，于40℃反应10min，加入1.5mL1MNa₂CO₃终止反应，于405nm处测定OD值。

实施例4重组***呋喃糖苷酶AbfaHLB的性质测定

1、重组***呋喃糖苷酶AbfaHLB的最适pH和pH稳定性的测定

将实施例3纯化的重组***呋喃糖苷酶AbfaHLB在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置，在37℃条件下进行***呋喃糖苷酶活力测定。结果(图1)表明，重组***呋喃糖苷酶的最适pH为4.5，在pH2.0-7.0有50％以上的相对酶活性。重组***呋喃糖苷酶在上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH4.5缓冲液体系中37℃条件下测定酶活性，以研究重组酶的pH稳定性。结果(图2)表明重组***呋喃糖苷酶在pH2.0-8.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在85％以上，这说明此酶pH耐受性较为宽泛。

2、重组***呋喃糖苷酶AbfaHLB的最适温度及热稳定性测定

重组***呋喃糖苷酶AbfaHLB的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为***呋喃糖苷酶AbfaHLB在不同温度下处理不同时间，然后在37℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为50℃，在20-65℃下均保持较高酶活。酶的热稳定性试验表明(图4)，重组***呋喃糖苷酶AbfaHLB具有良好的热稳定性，在70℃下温育2h，能保持90％以上的酶活性，而且在80℃下温育10min，能剩余80％以上的酶活性。

3、不同化学试剂对重组***呋喃糖苷酶AbfaHLB活性的影响

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1mmol/L。在50℃、pH4.5条件下测定酶活性。结果表明，大多数离子和化学试剂β-巯基乙醇和EDTA在浓度为1mmol时重组***呋喃糖苷酶的活力没有明显变化。但是Ag+、Hg2+几乎可以完全抑制其活力，而SDS也强烈抑制其活力。

4、重组***呋喃糖苷酶AbfaHLB的抗胰蛋白酶和胃蛋白酶能力检测

用pH2.0Gly-HCl缓冲液配置0.1mg/mL胃蛋白酶，pH7.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置0.1mg/mL胰蛋白酶。将纯化的***呋喃糖苷酶AbfaHLB与蛋白酶按10：1(w/w)比例在该蛋白酶缓冲液中处理120min后，不同的时间取样，按标准方法检测处理酶的剩余酶活。结果表明，***呋喃糖苷酶AbfaHLB用胃蛋白酶处理120min后，剩余相对酶活力为96.9％，用胰蛋白酶处理120min后，剩余相对酶活力94.7％。说明***呋喃糖苷酶AbfaHLB具有较好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的能力。

Claims (8)

1.一种耐高温酸性***呋喃糖苷酶AbfaHLB，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.一种耐高温酸性***呋喃糖苷酶基因abfaHLB，其特征在于，编码权利要求1所述的***呋喃糖苷酶AbfaHLB。

3.如权利要求2所述的耐高温酸性***呋喃糖苷酶基因abfaHLB，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNO.2所示。

4.包含权利要求2或3所述耐高温酸性***呋喃糖苷酶基因abfaHLB的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC9-abfaHLB。

6.包含权利要求2或3所述耐高温酸性***呋喃糖苷酶基因abfaHLB的重组菌株。

7.一种制备耐高温酸性***呋喃糖苷酶AbfaHLB的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4或5的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组***呋喃糖苷酶AbfaHLB表达；

3)回收并纯化所表达的***呋喃糖苷酶AbfaHLB。

8.权利要求1所述耐高温酸性***呋喃糖苷酶AbfaHLB的应用。