CN111484988A

CN111484988A - 一种具有木聚糖酶和阿魏酸酯酶活性的双功能酶及其编码基因和应用

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Publication number: CN111484988A
Application number: CN201910088638.8A
Authority: CN
Inventors: 袁红莉; 王若楠; 杨金水; 李宝珍
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: Beijing Siliang Technology Co ltd
Priority date: 2019-01-29
Filing date: 2019-01-29
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2039-01-29
Also published as: CN111484988B

Abstract

本发明公开了一种具有木聚糖酶和阿魏酸酯酶活性的双功能酶及其编码基因和应用。所述双功能酶是如下所述的蛋白质：a)氨基酸序列是序列1第29‑1030位所示的蛋白质；b)氨基酸序列是序列1所示的蛋白质；c)含有序列1第29‑423位所示的木聚糖酶结构域和序列1第577‑936位所示的阿魏酸酯酶结构域的蛋白质；d)上述氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；e)将上述氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；f)与上述氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。本发明的双功能酶具有木聚糖酶和阿魏酸酯酶的活性，可用于水解含有木聚糖和阿魏酸酯键的物质。

Description

一种具有木聚糖酶和阿魏酸酯酶活性的双功能酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新型的具有木聚糖酶和阿魏酸酯酶活性的双功能酶及其编码基因和应用。

背景技术

木聚糖(xylan)是植物细胞壁的主要成分之一，含量仅次于纤维素。木聚糖是一种杂聚多糖，主链由多个吡喃木糖基通过β-1，4-糖苷键相连，侧链上有多种不同基团的取代，如***糖基、乙酰基团、葡糖醛酸残基等，这些侧链基团修饰提高了植物细胞壁的抗降解性，极大地阻碍了生物质的转化利用。其中木聚糖侧连上的***糖基可以进一步和阿魏酸或者香豆酸等羟基肉桂酸相连，使木聚糖与木质素之间共价交联，降低底物的可及性，限制生物质的高值转化。

由于木聚糖的异质性，它的完全转化需要多种酶共同参与。木聚糖酶是将木聚糖降解成低聚糖和木糖的酶的总称。β-1，4-内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)作用于木聚糖主链，随机切开木聚糖内部的木糖苷键，将其分解为低聚木糖。阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)属于羧酯酶类，能够催化阿魏酸与低聚糖或多糖间酯键的断裂，释放阿魏酸，辅助木聚糖酶提高生物质的降解效率。这两种酶广泛应用于食品、饲料、造纸和生物能源领域(Basit A,Liu J,Rahim K,et al.Thermophilic xylanases:from bench to bottle[J].Critical Reviewsin Biotechnology,2018:1.；Gopalan N,Rodríguez-Duran L V,Saucedo-Castaneda G,etal.Review on technological and scientific aspects of feruloyl esterases:Aversatile enzyme for biorefining of biomass[J].Bioresource Technology,2015,193:534-544.)，因此关于这两种酶的研究越来越受到关注。在食品工业中，木聚糖酶和阿魏酸酯酶共同作用于麸皮等农业废弃物，释放的反式阿魏酸/香豆酸和低聚木糖都是重要的功能性食品基料，且低聚木糖可以用于生产木糖醇和燃料乙醇。在饲料工业中，阿魏酸和低聚木糖的释放可以提高饲料养分利用率，利于牲畜的消化吸收。此外，阿魏酸具有抗氧化和抗炎症反应等多种生物学活性，也是香料香兰素的合成前体，因此广泛应用于制药、食品和化妆品工业，是麸皮、秸秆等生物质转化利用过程中一种高附加值的产物。

木聚糖酶和阿魏酸酯酶广泛存在于微生物、植物和动物中。在以往的研究中，已有来自真菌、细菌和放线菌的多个木聚糖酶和阿魏酸酯酶被报道。除热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)纤维小体的关键组分XynY和XynZ之外，目前关于自然进化的同时具有木聚糖酶活性和阿魏酸酯酶活性的双功能酶的报道只有1例(Blum D L,Kataeva I A,Li X L,et al.Feruloyl Esterase Activity of the Clostridium thermocellum CellulosomeCan Be Attributed to Previously Unknown Domains of XynY and XynZ[J].Journalof Bacteriology,2000,182(5):1346-1351.；Kabel M A,Yeoman C J,Han Y,etal.Biochemical Characterization and Relative Expression Levels of MultipleCarbohydrate Esterases of the Xylanolytic Rumen Bacterium Prevotellaruminicola 23 Grown on an Ester-Enriched Substrate[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology,2011,77(16):5671-81)，但未有该酶能降解天然底物同时产生阿魏酸和香豆酸的报道。因此，尚未有能降解天然木质纤维素产生木寡糖，同时产生阿魏酸和香豆酸的木聚糖酶/阿魏酸酯酶双功能酶的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的具备木聚糖酶和阿魏酸酯酶活性的双功能酶及其编码基因和应用。

本发明首先保护具有木聚糖酶和阿魏酸酯酶活性的双功能酶，是如下a)或b)或c)或d)或e)或f)所示的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列1第29-1030位所示的蛋白质；

b)氨基酸序列是序列1所示的蛋白质；

c)含有序列1第29-423位所示的木聚糖酶结构域和序列1第577-936位所示的阿魏酸酯酶结构域的蛋白质；

d)在a)或b)或c)所示的氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

e)将a)或b)或c)或d)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

f)与a)或b)或c)或d)或e)所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

上述a)或b)或c)或d)或e)或f)所述的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质具体为氨基酸序列依次由序列1第29-423位氨基酸残基、Glu氨基酸残基、Leu氨基酸残基和序列1第577-936位氨基酸残基组成的蛋白质。

为了使上述d)中的蛋白质便于纯化，可在上述蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6个(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10个(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagⅡ	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述e)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述f)中的蛋白质，所述具有75％或75％以上的同源性可为具有75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。

本发明还保护与上述蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：

A1)编码上述蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)或5)所示的基因：

1)其编码序列是序列2第85-3093位所示的DNA分子；

2)其编码序列是序列2所示的DNA分子；

3)其编码序列是序列8所示的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的DNA分子；

5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码上述蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码上述蛋白质的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动上述蛋白质编码基因转录的启动子，还可包括终止上述蛋白质编码基因转录的终止子。进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列等调节序列。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒可为pET-30a(+)。在本发明的一个具体实施例中，所述重组载体具体为pET30a-Xyn10/Fae1。所述pET30a-Xyn10/Fae1为将序列2第85-3093位所示的DNA分子替换pET-30a(+)载体的BamHI和SalI酶切位点间的小片段后得到的载体。在本发明的另一个具体实施例中，所述重组载体具体为pET30a-Xyn10+Fae1。所述pET30a-Xyn10+Fae1为将序列8所示的DNA分子替换pET-30a(+)载体的BamHI和SalI酶切位点间的小片段后得到的载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。在本发明的具体实施例中，所述重组微生物为重组大肠杆菌；所述重组大肠杆菌具体为含有pET30a-Xyn10/Fae1或pET30a-Xyn10+Fae1的E.coli BL21(DE3)。

本发明还保护如下S1)-S7)中任一种应用：

S1)上述蛋白质在作为木聚糖酶和/或阿魏酸酯酶中的应用；

S2)上述蛋白质或上述生物材料在制备木聚糖酶和/或阿魏酸酯酶中的应用；

S3)上述蛋白质或上述生物材料在制备羟基化肉桂酸或低聚木糖中的应用；

S4)上述蛋白质或上述生物材料在降解木聚糖和/或羟基化肉桂酸酯类化合物中的应用；

S5)上述蛋白质或上述生物材料在水解含有木聚糖和羟基化肉桂酸酯键的物质中的应用；

S6)上述蛋白质或上述生物材料在催化木聚糖内部的木糖苷键断裂中的应用；

S7)上述蛋白质或上述生物材料在催化羟基化肉桂酸与低聚糖或多糖间酯键的断裂中的应用。

上述应用中，所述羟基化肉桂酸酯类化合物可为羟基化肉桂酸甲酯或羟基化肉桂酸乙酯。

所述羟基化肉桂酸包括阿魏酸、香豆酸、咖啡酸和芥子酸。

本发明最后保护上述蛋白质的制备方法。

本发明保护的上述蛋白质的制备方法包括如下步骤：发酵培养含有上述蛋白质的编码基因的重组微生物，使上述蛋白质的编码基因表达，得到含有上述蛋白质的重组微生物培养物，纯化所述重组微生物培养物，得到上述蛋白质。

上述方法中，所述含有上述蛋白质的编码基因的重组微生物是将上述蛋白质的编码基因导入受体微生物中得到的。

进一步的，所述蛋白质的编码基因通过重组载体导入所述受体微生物。所述重组载体为在表达载体的多克隆位点***上述蛋白质的编码基因得到的载体。

更进一步的，所述蛋白质的编码基因为序列2第85-3093位所示DNA分子或序列8所示的DNA分子。

所述表达载体可为pET-30a(+)载体。所述受体微生物可为大肠杆菌BL21(DE3)。

上述方法中，所述发酵培养的方法可按照如下步骤进行：将重组大肠杆菌菌液接种于LB液体培养基(含卡那霉素)中进行培养，培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0时加入IPTG诱导剂，(16-37)℃诱导培养(3-24)h。

进一步的，所述发酵培养的方法为将重组大肠杆菌菌液以1:100的体积比接种于LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中进行培养，37℃、200rpm恒温摇床中培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0时加入IPTG诱导剂(终浓度为0.5mM)，37℃诱导培养3h。

更进一步的，采用Ni柱亲和层析法进行纯化。

扩增上述任一基因全长或任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述引物对具体可为由序列3所示的正向引物F和序列4所示的反向引物R组成的引物对。

通过实验证明，本发明制备得到的双功能酶在(40-50)℃的温度范围内都具有高的酶活性，最适作用温度均为50℃；该酶具有很好的温度稳定性，在40℃保温1h，酶活仍保持在100％以上；反应pH可为5-8，木聚糖酶和阿魏酸酯酶最适pH分别为6.0和7.0；该酶具有极佳的pH稳定性，其中木聚糖酶在pH(3-12)的条件下保温1h，酶活均能保持在74.4％以上，阿魏酸酯酶在pH(4-10)的条件下保温1h，酶活能保持在96.7％以上。此外，该酶作用于蒸汽***玉米芯能够释放木寡糖，同时释放阿魏酸及香豆酸。

本发明提供了一个新型的同时具有木聚糖酶和阿魏酸酯酶活性的双功能酶，该酶具有较好的pH稳定性，能够作用于天然木质纤维素同时释放木寡糖、阿魏酸及香豆酸。本发明提供的双功能酶可满足饲料、食品等工业中对木聚糖酶和阿魏酸酯酶pH稳定性的要求，具有广泛的工业应用潜力，不仅为进一步工业化高产工程菌株的构建提供了材料，也为稳定的木聚糖酶和阿魏酸酯酶提供可比对的序列和可参考的性质，所以本发明提供的双功能酶具有非常好的研究前景和商业应用价值。

附图说明

图1为木聚糖酶和阿魏酸酯酶双功能酶基因的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为蛋白纯化的SDS电泳结果。

图3为木聚糖酶和阿魏酸酯酶的性质。

图4为木聚糖酶和阿魏酸酯酶双功能酶水解蒸汽***玉米芯液相色谱检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中使用的基因组DNA提取自山东诸城密州街道大王门村的农家肥，已完成宏基因组测序。

大肠杆菌(E.coli)DH5α：Biomed公司，产品编号：BC116-02。

大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)：Biomed公司，产品编号：BC201-02。

pET-30a(+)载体：Novagen公司，产品编号：69909。

镍柱Ni

6 Fast Flow：Sigma公司，产品编号：GE17-5318-06。

榉木木聚糖：购自Megazyme公司，产品编号：P-XYLNBE-10G。

阿魏酸甲酯：购自Alfa Aesar，产品编号：B22657。

木糖：购自北京华菁科技有限公司，产品编号：X1500-500G。

阿魏酸：购自北京华菁科技有限公司，产品编号：46278-1g。

LB培养基配方如下：胰蛋白胨1％(w/v)，酵母提取物0.5％(w/v)，NaCl 1％(w/v)，pH＝7.0；121℃灭菌20min。

蒸汽***玉米芯的制备方法如下：将玉米芯(收集自河南省洛阳市农田)粉碎后过50目筛，1.5MPa压力下，保压300s，然后突然释放压力，进行***处理，处理后样品4度保存备用。

实施例1、重组蛋白Xyn10/Fae1的制备

一、Xyn10/Fae1基因的克隆

1、引物的设计

根据宏基因组中Xyn10/Fae1基因序列，设计正向引物F及反向引物R，正向引物加上BamHI酶切位点及其保护碱基，反向引物加上SalI酶切位点及其保护碱基，引物序列如下：

正向引物F：5'-CGGATCCGCAGTGCCAGGTAATG-3’(序列3)；

反向引物R：5'-GCGTCGACTTATTTTACAACCATATTAG-3’(序列4)。

2、PCR扩增

以基因组DNA为模板，采用步骤1中的正向引物F及反向引物R进行PCR扩增，得到PCR产物。该PCR产物即为Xyn10/Fae1基因，其核苷酸序列如序列2所示。

扩增体系：按照

超保真DNA聚合酶(NEB)说明书配制25μL反应体系。

扩增条件：98℃30s 1个循环，98℃10s，52℃10s，72℃1min30s，30个循环，72℃10min一个循环。

PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳进行切胶回收，回收约3.1kb的DNA片段(如图1所示)，回收方法参照胶回收试剂盒(TIANGEN)说明书进行。

二、重组表达载体及重组菌的构建

1、重组表达载体的构建

将步骤一获得的PCR产物经BamHI和SalI双酶切，切胶回收后，与经BamHI和SalI双酶切的pET-30a(+)载体连接，转入E.coli DH5α感受态细胞，涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上，37℃培养12h，采用正向引物F及反向引物R进行菌落PCR鉴定，得到阳性克隆。

2、测序验证

将菌落PCR鉴定正确的阳性克隆接入含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养，提取质粒，送往北京华大基因公司测序，并将测序正确的质粒命名为pET30a-Xyn10/Fae1。

测序结果表明：pET30a-Xyn10/Fae1为将序列2第85-3093位所示的DNA分子替换pET-30a(+)载体的BamHI和SalI酶切位点间的小片段后得到的载体。序列2自5’末端第85-3093位核苷酸所示的DNA编码序列1自N末端第29-1030位氨基酸残基，即去除信号肽的Xyn10/Fae1蛋白。序列1所示的蛋白质为含有信号肽序列的Xyn10/Fae1蛋白。

3、重组菌的构建

将测序正确的质粒pET30a-Xyn10/Fae1转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上，37℃培养12h，采用正向引物F及反向引物R进行菌落PCR鉴定，得到重组菌株BL21(DE3)/pET30a-Xyn10/Fae1。

将空载体pET-30a(+)转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上，37℃培养12h，得到空载体对照菌株BL21(DE3)/pET30a。

三、重组菌的诱导培养及重组蛋白Xyn10/Fae1的纯化

1、重组菌的诱导培养

挑取步骤二构建的重组菌株BL21(DE3)/pET30a-Xyn10/Fae1单菌落，接种于5mL的含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm过夜培养。第二天按照1％接种量转接至含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，培养至菌液浓度OD₆₀₀＝0.8-1.0时，加入IPTG诱导剂(终浓度为0.5mM)，37℃诱导培养3h，离心收集菌体。用20mM pH＝8.0Tris-HCl缓冲液重悬细胞，通过超声破碎离心取上清(超声破碎参数：工作时间2s，间歇时间4s，总时间10min，功率200W；离心条件：4℃，10000rpm，15min)，得到重组菌株BL21(DE3)/pET30a-Xyn10/Fae1的胞内上清液。

按照上述培养方法将BL21(DE3)/pET30a-Xyn10/Fae1替换为空载体对照菌株BL21(DE3)/pET30a，其他步骤不变，得到空载体胞内上清。

2、重组蛋白Xyn10/Fae1的纯化

采用Ni柱亲和层析法对BL21(DE3)/pET30a-Xyn10/Fae1胞内上清液进行纯化，得到重组蛋白Xyn10/Fae1。具体步骤如下：破胞后的粗酶液中的Xyn10/Fae1用Ni柱亲和层析纯化(镍柱Ni

6 Fast Flow)，分别用15mL洗脱液1和10mL洗脱液2和15mL洗脱液3进行洗脱，其中洗脱液1由终浓度为20mmol/L的Tris-Cl缓冲液、终浓度为500mmol/L的氯化钠和终浓度为20mmol/L咪唑组成，洗脱液2由终浓度为20mmol/L的Tris-Cl缓冲液、终浓度为500mmol/L的氯化钠和终浓度为60mmol/L咪唑组成，洗脱液3由终浓度为20mmol/L的Tris-Cl缓冲液、终浓度为500mmol/L的氯化钠和终浓度为300mmol/L咪唑组成，洗脱液的pH为8.0。利用12.5％SDS-PAGE检测不同洗脱液中的蛋白质，将含有目的蛋白的洗脱液记为Xyn10/Fae1溶液。

Xyn10/Fae1溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结果表明，Xyn10/Fae1溶液中含有单一条带的目的蛋白，目的蛋白的大小为118kDa(如图2所示)，该目的蛋白即为重组蛋白Xyn10/Fae1。

实施例2、重组蛋白Xyn10/Fae1作为木聚糖酶和阿魏酸酯酶的酶活测定

一、重组蛋白Xyn10/Fae1在模式底物榉木木聚糖(BWX)上的酶活

酶活检测方法如下(所用缓冲液均为50mM pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液)：

1、榉木木聚糖溶于缓冲液中，使其终浓度为10mg/mL，即为BWX溶液。

2、将100μL的稀释后的重组蛋白Xyn10/Fae1溶液(浓度为0.007mg/mL)与100μL的BWX溶液混合均匀，50℃温育10min后加入150μL DNS混合均匀，沸水浴5min，立即置于冰水终止反应，加入350μL H₂O，检测OD_540nm处的吸光值。同时以等体积缓冲液代替酶液作为阴性对照。

3、将不同浓度的木糖溶于缓冲液，得到不同浓度标准品溶液，检测不同浓度的标准品溶液在OD_540nm处的吸光值，以木糖浓度为横坐标，OD_540nm为纵坐标制作标准曲线，用于酶活测定。

以每分钟释放1μmol木糖需要的蛋白量定义为重组蛋白Xyn10/Fae1的木聚糖酶酶活(U/mg)。

按照上述酶活检测方法，将Xyn10/Fae1溶液替换为空载体胞内上清作为对照。

实验结果表明，空载体上清没有检测到木聚糖酶酶活。在上述条件下，重组蛋白Xyn10/Fae1的木聚糖酶酶活为37.51U/mg。

二、重组蛋白Xyn10/Fae1在模式底物阿魏酸甲酯(MFA)上的酶活

酶活检测方法如下(所用缓冲液均为50mM pH7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液)：

1、阿魏酸甲酯溶于甲醇中，使其终浓度为100mM，用缓冲液稀释100倍制成1mM的MFA溶液。

2、将10μL的稀释后的重组蛋白Xyn10/Fae1溶液(浓度为0.07mg/mL)与190μL的MFA溶液混合均匀，50℃温育10min后加入100μL乙腈终止反应。同时以等体积缓冲液代替酶液作为阴性对照，HPLC检测阿魏酸的峰面积。

3、将阿魏酸溶于甲醇中，用缓冲液稀释制备不同浓度的阿魏酸溶液，利用HPLC检测不同浓度的阿魏酸对应的峰面积，以阿魏酸浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标制作标准曲线，用于测定重组蛋白Xyn10/Fae1对MFA的水解能力。

以每分钟释放1μmol阿魏酸需要的蛋白量定义为重组蛋白Xyn10/Fae1的阿魏酸酯酶酶活(U/mg)。

上述HPLC分析条件如下：高效液相色谱：SHIMADZU LC-15C；分析柱：ACE Excel 5C18-Amide(250mm×4.6mm)；流动相：水：乙腈：甲酸＝4:6:0.01；流速：1.0mL/min；检测器：SHNIMADZU SPD-15C；检测波长：322nm；柱温：40℃；进样量：20μL。

实验结果表明，空载体上清没有检测到阿魏酸酯酶酶活。在上述条件下，重组蛋白Xyn10/Fae1的阿魏酸酯酶酶活为11.19U/mg。

实施例3、重组蛋白Xyn10/Fae1的性质

一、最适pH测定

酶活测定方法同实施例2中的步骤，以实施例1中制备的重组蛋白Xyn10/Fae1作为待测溶液。区别在于采用如下缓冲液(浓度均为50mM)：磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH5.0)、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 6.0)、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 7.0)、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 8.0)。

重组蛋白Xyn10/Fae1在pH 6.0的缓冲液中木聚糖酶活性最高，在pH 7.0的缓冲液中阿魏酸酯酶活性最高，将该最高酶活作为100％，计算其他pH下的相对酶活。

二、pH稳定性测定

利用如下不同pH的缓冲液(浓度均为50mM)处理重组蛋白Xyn10/Fae1(控制蛋白浓度为0.7mg/mL)：甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.2)、甘氨酸-盐酸缓冲液(pH3.0)、醋酸钠缓冲液(pH 4.0)、醋酸钠缓冲液(pH 5.0)、NaHPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(pH 6.0)、NaHPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(pH 7.0)、NaHPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(pH 8.0)、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0)、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 10.0)、NaH₂PO₄-NaOH缓冲液(pH 11.0)、NaH₂PO₄-NaOH缓冲液(pH 12.0)。4℃处理1h后，按实施例2中的步骤测定酶活。

将未处理的重组蛋白Xyn10/Fae1的酶活作为100％，计算重组蛋白Xyn10/Fae1经不同pH处理后的相对酶活，结果见图3(a)。该酶具有极佳的pH稳定性，其中木聚糖酶在pH3-12的条件下保温1h，酶活均能保持在74.4％以上，阿魏酸酯酶在pH 4-10的条件下保温1h，酶活能保持在96.7％以上。

三、最适反应温度

酶活测定方法同实施例2中的步骤，以实施例1中制备的重组蛋白Xyn10/Fae1作为待测溶液。区别在于分别采用如下反应温度：20℃、30℃、40℃、50℃和60℃。结果表明，重组蛋白Xyn10/Fae1在50℃条件下活性最高，并将该最高酶活记为100％，计算其他反应温度下的相对酶活。

四、温度稳定性测定

将重组蛋白Xyn10/Fae1分别在4℃、30℃、40℃、50℃、60℃和70℃条件下温育1h后，冰浴10min作为待测溶液，控制蛋白浓度为0.7mg/mL，按实施例2中的步骤测定酶活。

将未处理的重组蛋白Xyn10/Fae1的酶活作为100％，计算重组蛋白Xyn10/Fae1经不同温度处理后的相对酶活，结果见图3(b)。该酶具有很好的温度稳定性，在40℃保温1h，酶活仍保持在100％以上。

实施例4、重组蛋白Xyn10/Fae1水解蒸汽***玉米芯

1、水解反应体系的制备

将底物蒸汽***玉米芯、重组蛋白Xyn10/Fae1、50mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 6.0)混匀，得到水解反应体系(总体积为1mL)。其中玉米芯在体系中的质量分数为2％，重组蛋白Xyn10/Fae1在体系中的终浓度为400nM。

同时将沸水浴30min的失活重组蛋白Xyn10/Fae1作为底物对照。

2、水解反应

将水解反应体系先在40℃摇床200rpm条件下反应48h，然后沸水浴10min，再12000rpm高速离心10min，去除沉淀，上清过滤后作为待测样品。

3、HPLC检测水解产物

取上清液经0.22μm滤器过滤后按实施例2中方法测定阿魏酸及香豆酸。

HPLC分析条件如下：高效液相色谱：SHIMADZU LC-15C；分析柱：ACE Excel 5 C18-Amide(250mm×4.6mm)；流动相：水：乙腈：甲酸＝4:6:0.01；流速：1.0mL/min；检测器：SHNIMADZU SPD-15C；检测波长：322nm；柱温：40℃；进样量：20μL。

结果见图4。从图中可以看出，重组蛋白Xyn10/Fae1能有效水解蒸汽***玉米芯中的阿魏酸和香豆酸酯键，生成阿魏酸和香豆酸。

实施例5、重组蛋白Xyn10+Fae1的制备及其酶活测定

一、重组蛋白Xyn10+Fae1的制备

1、Xyn10+Fae1基因的克隆

1)引物的设计

根据Xyn10/Fae1基因序列，除实施例1中引物F外，设计融合蛋白Xyn10+Fae1正向引物F’、反向引物R’-1(引物加上SacI酶切位点及其保护碱基)，及反向引物R’-2引物(引物加上SalI酶切位点及其保护碱基)，引物序列如下：

正向引物F’：5'-CGAGCTCCCTGCTACAACTTCAGTTCC-3’(序列5)；

反向引物R’-1：5'-CGAGCTCTTCTATTTTTCCAGTTGTAG-3’(序列6)；

反向引物R’-2：5'-GCGTCGACTTATACACCTGTTTGAGA-3’(序列7)。

2)PCR扩增

以基因组DNA为模板，进行两轮独立PCR。一轮采用实施例1步骤1中的正向引物F及反向引物R’-1进行PCR扩增，另一轮采用正向引物F’及反向引物R’-2进行PCR扩增，得到PCR产物。

扩增体系：按照

超保真DNA聚合酶(NEB)说明书配制25μL反应体系。

扩增条件：98℃30s 1个循环，98℃10s，55℃10s，72℃45s，30个循环，72℃10min一个循环。

PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳进行切胶回收，回收约1.2kb和1.1kb的DNA片段，回收方法参照胶回收试剂盒(TIANGEN)说明书进行。

2、重组表达载体及鉴定

1)重组表达载体构建

将步骤一获得的约1.2kb PCR产物经BamHI和SacI双酶切，获得的约1.1kb PCR产物经SacI和SalI双酶切，切胶回收后，与经BamHI和SalI双酶切的pET-30a(+)载体连接，转入E.coli DH5α感受态细胞，涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上，37℃培养12h，采用正向引物F及反向引物R’-2进行菌落PCR鉴定，得到阳性克隆。

2)测序验证

将菌落PCR鉴定正确的阳性克隆接入含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养，提取质粒，送往北京华大基因公司测序，并将测序正确的质粒命名为pET30a-Xyn10+Fae1。

测序结果表明：pET30a-Xyn10+Fae1为将序列8所示的DNA分子甲替换pET-30a(+)骨架载体的BamHI和SalI酶切位点之间的小片段后得到的载体。DNA分子甲依次由序列2自5’末端第85-1269位所示的DNA分子、SacI酶切位点GAGCTC、序列2自5’末端第1729-2808位所示的DNA分子和终止密码子TAA组成。

DNA分子甲编码的重组蛋白Xyn10+Fae1的氨基酸序列依次由序列1自N末端第29-423位氨基酸残基、Glu氨基酸残基、Leu氨基酸残基和序列1自N末端第577-936位氨基酸残基组成。

3、重组菌的构建

重组菌的构建方法同实施例1步骤二中的3。

4、重组菌的诱导培养及重组蛋白Xyn10+Fae1的纯化

重组菌的诱导培养及重组蛋白Xyn10+Fae1的纯化方法同实施例1步骤三。

二、重组蛋白Xyn10+Fae1作为木聚糖酶和阿魏酸酯酶的酶活测定

重组蛋白Xyn10+Fae1作为木聚糖酶和阿魏酸酯酶的酶活测定方法同实施例2。

重组蛋白Xyn10+Fae1的木聚糖酶酶活为147.81U/mg，阿魏酸酯酶酶活为22.13U/mg。

三、重组蛋白Xyn10+Fae1水解蒸汽***玉米芯

重组蛋白Xyn10+Fae1水解蒸汽***玉米芯的方法同实施例4。

结果见图4。从图中可以看出，重组蛋白Xyn10+Fae1能有效水解蒸汽***玉米芯中的阿魏酸和香豆酸酯键，生成阿魏酸和香豆酸。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种具有木聚糖酶和阿魏酸酯酶活性的双功能酶及其编码基因和应用

<160>8

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1030

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

Met Lys Lys Ile Leu Ser Ala Phe Leu Ser Leu Ala Leu Val Leu Ser

1 5 10 15

Leu Ile Thr Ile Ala Pro Ala Ala Lys Val Glu Ala Ala Val Pro Gly

20 25 30

Asn Ala Asn Leu Leu Asn Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Gly His Ile Gly

35 40 45

Thr Cys Val Thr Pro Tyr Gln Trp Asn Asp Ser Asn Thr Arg Asn Phe

50 55 60

Ile Lys Gly Glu Tyr Asn Ser Ile Thr Met Glu Asn Glu Met Lys Pro

65 70 75 80

Asp Ala Val Leu Asn Ser Ser Thr Met Ser Val Ala Gln Ala Lys Gln

85 90 95

Gln Gly Tyr Tyr Ile Pro Ser Ser Tyr Thr Glu Ser Thr Val Pro Lys

100 105 110

Leu Asn Phe Ser Thr Ile Asp Ser Met Met Lys Asn Ala Tyr Asp Asn

115 120 125

Gly Leu Gln Ile Arg Tyr His Thr Leu Val Trp His Ser Gln Thr Pro

130 135 140

Asp Trp Tyr Phe Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Asn Gly Gly Tyr Val Ser

145 150 155 160

Lys Ser Gln Met Asn Ala Arg Met Glu Phe Tyr Ile Lys Ser Val Met

165 170 175

Asn His Val Tyr Ser Ser Gln Tyr Ala Ser Thr Val Tyr Cys Trp Asp

180 185 190

Val Val Asn Glu Tyr Met His Ala Thr Asn Ser Gly Trp Gln Lys Ile

195 200 205

Tyr Gly Ala Val Asn Thr Arg Pro Asp Phe Val Lys Leu Ala Phe Gln

210 215 220

Tyr Ala Tyr Glu Thr Leu Glu Tyr Phe Asn Leu Glu Asn Ser Val Ser

225 230 235 240

Leu Phe Tyr Asn Asp Tyr Asn Thr Tyr Ile Asp Cys Asp Lys Ile Ile

245 250 255

Ser Met Ile Asn Tyr Ile Asn Ala Glu Lys Lys Ile Cys Ser Gly Val

260 265 270

Gly Met Gln Ser His Leu Ser Ser Thr Tyr Pro Ser Val Ser Tyr Tyr

275 280 285

Lys Ala Ala Leu Asp Lys Phe Ile Lys Gln Gly Tyr Glu Val Gln Ile

290 295 300

Thr Glu Leu Asp Ala Lys Gly Asn Asn Asn Ser Asp Gln Ala Asn Tyr

305 310 315 320

Cys Lys Gln Ile Met Ala Ala Ile Leu Ser Ala Lys Lys Ala Gly Gly

325 330 335

Asn Ile Thr Ala Ile Thr Trp Trp Gly Leu His Asp Gly Ala Ser Trp

340 345 350

Arg Arg Gly Asp Asn Pro Leu Leu Phe Ser Ser Leu Gly Val Lys Lys

355 360 365

Gln Ser Tyr Thr Ser Val Leu Glu Ala Tyr Tyr Glu Ala Gly Phe Pro

370 375 380

Ile Ser Pro Val Thr Pro Thr Ala Ser Ile Lys Pro Ser Val Asn Pro

385 390 395 400

Ser Thr Ala Pro Ser Asn Asn Pro Ser Thr Val Pro Thr Gln Ser Val

405 410 415

Ala Thr Thr Gly Lys Ile Glu Asn Gly Val Tyr Tyr Ile Lys Asn Val

420 425 430

Asn Ala Gln Lys Tyr Leu Gln Val Ala Gly Asn Thr Gly Ala Asp Ala

435 440 445

Gln Asn Val Glu Leu Gly Ser Gly Thr Gly Val Ala Gly Gln Lys Trp

450 455 460

Glu Val Thr Asn Asn Ser Asp Gly Thr Val Thr Leu Lys Ser Ala Leu

465 470 475 480

Gly Ser Phe Ser Leu Asp Val Ala Asn Ala Ala Asp Glu Asp Gly Ala

485 490 495

Asn Val Gln Ile Tyr Thr Ser Tyr Asp Gly Asp Ala Gln Lys Phe Phe

500 505 510

Ile Lys Glu Thr Ala Thr Asp Gly Ile Tyr Gln Ile Ala Thr Lys Ala

515 520 525

Ser Ser Gly Thr Lys Asn Leu Asp Gly Ser Asn Tyr Gly Thr Glu Asp

530 535 540

Gly Thr Asn Ile Gln Gln Trp Ser Asn Thr Thr Asn Thr Asn Gln Gln

545 550 555 560

Trp Ile Phe Glu Lys Ile Gly Gly Ser Ser Ser Thr Thr Thr Gln Ala

565 570 575

Pro Ala Thr Thr Ser Val Pro Val Val Thr Ser Ser Ala Pro Ser Thr

580 585 590

Val Pro Thr Gln Ser Thr Gln Thr Asn Gly Ser Met Thr Asp Thr Ala

595 600 605

Lys Ala Tyr Met Ala Lys Met Asn Val Val Asn Lys Cys Pro Ser Gly

610 615 620

Ala Asp Gln Lys Gln Ala Gly Arg Thr Tyr Pro Ala Ala Thr Lys Lys

625 630 635 640

Thr Tyr Tyr Ser Thr Thr Thr Gly Ser Asn Arg Ser Cys Asn Val Phe

645 650 655

Leu Pro Ala Asn Tyr Ser Ser Ser Lys Lys Tyr Pro Val Leu Tyr Leu

660 665 670

Leu His Gly Ile Met Gly Asn Glu Asp Ser Met Leu Gly Asn Ala Ile

675 680 685

Glu Ile Pro Thr Asn Leu Ala Ala Gln Gly Lys Ala Lys Glu Met Ile

690 695 700

Ile Val Leu Pro Asn Glu Tyr Ala Pro Ala Pro Gly Thr Ser Val Ala

705 710 715 720

Ala Gly Leu Asn Gln Ala Tyr Phe Asp Gly Tyr Asp Asn Phe Ile Asn

725 730 735

Asp Leu Thr Lys Asp Leu Met Pro Tyr Ile Glu Lys Asn Tyr Ser Val

740 745 750

Ala Thr Gly Arg Asp Asn Thr Ala Ile Ala Gly Phe Ser Met Gly Gly

755 760 765

Arg Asn Ala Leu Tyr Ile Gly Tyr Ala Arg Pro Asp Leu Phe Gly Tyr

770 775 780

Val Gly Ala Phe Ser Pro Ala Pro Gly Val Thr Pro Gly Gln Asp Tyr

785 790 795 800

Ser Gly Phe His Lys Gly Leu Phe Ser Glu Asn Asp Phe Arg Ile Lys

805 810 815

Asp Glu Arg Tyr Val Pro Tyr Val Thr Leu Ile Ser Cys Gly Thr Asn

820 825 830

Asp Ser Val Val Gly Thr Phe Pro Lys Ser Tyr His Asp Ile Leu Thr

835 840 845

Arg Asn Asn Gln Pro His Ile Trp Phe Glu Val Pro Gly Ala Asp His

850 855 860

Asp Asn Asn Ala Ile Ala Ala Gly Tyr Tyr Asn Phe Val Ser Ala Ala

865 870 875 880

Phe Gly Val Leu Gly Ile Asp Asn Thr Thr Pro Ser Thr Gln Pro Ser

885 890 895

Thr Gln Pro Ser Val Ala Pro Ser Val Glu Pro Ser Val Glu Pro Ser

900 905 910

Thr Gln Pro Ser Thr Glu Pro Ser Thr Gln Pro Ser Val Thr Pro Ser

915 920 925

Gln Thr Pro Ser Gln Thr Gly Val Thr Cys Glu Tyr Asn Val Val Ser

930 935 940

Asp Trp Gly Ser Ser Phe Gln Gly Glu Ile Val Ile Thr Asn Asn Ser

945 950 955 960

Gly Lys Thr Ile Asn Gly Trp Thr Leu Thr Cys Asp Tyr Asn Cys Glu

965 970 975

Ile Val Asn Leu Trp Asn Ala Asp Phe Val Gly Gln Thr Gly Thr Lys

980 985 990

Val Thr Val Lys Asn Pro Ser Trp Asp Ala Asn Leu Pro Asp Gly Lys

995 1000 1005

Ser Val Thr Ile Ser Phe Ile Ala Asn Gly Thr Asp Lys Ser Ala

1010 1015 1020

Pro Thr Asn Met Val Val Lys

1025 1030

<210>2

<211>3093

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

atgaaaaaaa tattaagcgc gtttttatct cttgccttag tgttaagcct gattacaatc 60

gcacctgctg caaaagtaga agctgcagtg ccaggtaatg caaacttatt aaacacttac 120

ggcagatctt ttggacacat cggaacatgt gtcacacctt atcaatggaa tgatagtaat 180

acaagaaact ttattaaggg agaatacaac agcattacaa tggaaaatga aatgaaacct 240

gatgctgttt tgaattcctc aactatgtct gttgctcagg caaaacagca aggttattac 300

ataccaagca gctatacaga aagtactgta cctaagttaa acttcagtac aatcgacagt 360

atgatgaaaa atgcttatga caacggtctt cagatccgtt accatacctt agtttggcat 420

agccagactc cagactggta tttccgttcc ggttactctt caaacggcgg atatgtaagc 480

aaatcccaga tgaatgccag aatggaattc tacatcaaat ccgttatgaa tcatgtatac 540

agcagccagt atgcaagcac agtttactgc tgggacgttg taaatgaata catgcatgct 600

actaattcag gatggcagaa aatctacggt gctgtaaata caagaccaga ctttgtaaaa 660

ttagcattcc agtatgctta cgaaacatta gagtacttta acttagagaa ctctgtttcc 720

ttattctaca acgattacaa tacatatatt gactgcgaca aaatcatttc tatgattaac 780

tacatcaatg cagaaaagaa aatctgctct ggtgtcggca tgcagtctca cttaagttct 840

acatatccta gtgtttctta ttacaaagct gcattagata aatttattaa acaaggttac 900

gaagttcaga ttacagaatt agatgcaaaa ggtaacaata acagcgacca ggcaaattac 960

tgcaaacaga ttatggctgc tattctttct gctaagaaag caggcggaaa cattactgca 1020

attacctggt ggggacttca cgatggagct tcctggagaa gaggagacaa tccattatta 1080

ttctctagcc ttggcgtgaa aaaacaatcc tatacatctg tactggaagc ttattatgaa 1140

gcaggattcc caatcagtcc agtgactcca actgcttcta ttaaaccatc agtaaatcct 1200

tcaacagcac cttctaataa tccttctact gttccaactc agtcagtagc tacaactgga 1260

aaaatagaaa acggtgtata ttacatcaaa aatgtaaacg ctcagaaata cttacaggtt 1320

gccggtaaca ctggtgcaga cgctcagaat gttgagcttg gttctggtac aggtgttgca 1380

ggtcagaaat gggaagttac aaataactct gatggtactg taacattaaa gagtgcttta 1440

ggaagcttca gtttagacgt tgcaaatgca gctgatgaag atggcgcaaa tgttcagatt 1500

tacacttctt atgatggaga tgctcagaaa ttcttcatta aagaaactgc aactgatggc 1560

atttaccaga ttgcaacaaa agcaagcagc ggtacaaaga acttagacgg aagcaactac 1620

ggtacagaag atggtacaaa cattcagcag tggtccaaca ctactaatac aaaccagcag 1680

tggatctttg aaaagattgg cggaagttct tctactacaa cacaggctcc tgctacaact 1740

tcagttcccg ttgttacatc cagtgctcca agtactgtac caactcagtc tactcagaca 1800

aacggcagca tgacagatac tgcaaaagca tacatggcaa aaatgaatgt tgtaaataaa 1860

tgcccatctg gtgctgatca gaaacaggct ggcagaactt atcctgctgc aacaaagaaa 1920

acttattatt caacaacaac aggttcaaac cgttcctgta atgtattcct tcctgcaaac 1980

tattcttctt ccaagaaata tcctgtactt tacttattac atggtattat gggaaatgaa 2040

gattctatgt taggaaatgc aattgaaatc cctactaact tagctgcaca gggaaaagca 2100

aaagaaatga ttatcgtact tccaaatgaa tatgcaccag ctcctggtac ttctgtagct 2160

gctggattaa atcaggcata tttcgatgga tatgataact ttatcaacga tttaacaaaa 2220

gacttaatgc catacatcga aaagaactac tccgttgcaa ctggcagaga caatacagca 2280

atcgccggtt tctcaatggg tggacgtaac gctctttata tcggatatgc aagaccagac 2340

ttatttggtt atgttggagc attttctcca gctcctggtg taacacctgg acaggattat 2400

tccggtttcc acaaaggatt attctcagaa aatgatttcc gtatcaaaga tgaaagatat 2460

gtaccatatg taacattaat cagctgtgga accaatgact ctgttgttgg aacattccct 2520

aagagctatc atgatatttt aacaagaaac aatcagccac atatctggtt tgaagtacct 2580

ggtgcagacc atgacaacaa cgcaatcgct gctggatact ataactttgt atctgctgca 2640

tttggagttt taggcattga caatacaaca ccatctacac agcctagcac acagccttct 2700

gtagctccta gcgttgagcc ttcagtagaa cctagtacac agcctagtac agaacctagc 2760

acacagcctt ctgtaactcc tagccagaca ccttctcaaa caggtgtaac atgtgagtac 2820

aatgttgtaa gtgactgggg ttcatccttc cagggtgaaa ttgtaattac taacaactct 2880

ggcaaaacta taaatggctg gactttaaca tgtgactaca actgcgaaat cgtaaactta 2940

tggaatgctg atttcgttgg acagactgga acaaaagtta cagttaaaaa tccatcctgg 3000

gatgcaaatc ttcctgatgg aaaatctgtt acaatcagct tcattgcaaa tggaactgat 3060

aagagtgctc caactaatat ggttgtaaaa taa 3093

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

cggatccgca gtgccaggta atg 23

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

gcgtcgactt attttacaac catattag 28

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>5

cgagctccct gctacaactt cagttcc 27

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>6

cgagctcttc tatttttcca gttgtag 27

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>7

gcgtcgactt atacacctgt ttgaga 26

<210>8

<211>2274

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>8

gcagtgccag gtaatgcaaa cttattaaac acttacggca gatcttttgg acacatcgga 60

acatgtgtca caccttatca atggaatgat agtaatacaa gaaactttat taagggagaa 120

tacaacagca ttacaatgga aaatgaaatg aaacctgatg ctgttttgaa ttcctcaact 180

atgtctgttg ctcaggcaaa acagcaaggt tattacatac caagcagcta tacagaaagt 240

actgtaccta agttaaactt cagtacaatc gacagtatga tgaaaaatgc ttatgacaac 300

ggtcttcaga tccgttacca taccttagtt tggcatagcc agactccaga ctggtatttc 360

cgttccggtt actcttcaaa cggcggatat gtaagcaaat cccagatgaa tgccagaatg 420

gaattctaca tcaaatccgt tatgaatcat gtatacagca gccagtatgc aagcacagtt 480

tactgctggg acgttgtaaa tgaatacatg catgctacta attcaggatg gcagaaaatc 540

tacggtgctg taaatacaag accagacttt gtaaaattag cattccagta tgcttacgaa 600

acattagagt actttaactt agagaactct gtttccttat tctacaacga ttacaataca 660

tatattgact gcgacaaaat catttctatg attaactaca tcaatgcaga aaagaaaatc 720

tgctctggtg tcggcatgca gtctcactta agttctacat atcctagtgt ttcttattac 780

aaagctgcat tagataaatt tattaaacaa ggttacgaag ttcagattac agaattagat 840

gcaaaaggta acaataacag cgaccaggca aattactgca aacagattat ggctgctatt 900

ctttctgcta agaaagcagg cggaaacatt actgcaatta cctggtgggg acttcacgat 960

ggagcttcct ggagaagagg agacaatcca ttattattct ctagccttgg cgtgaaaaaa 1020

caatcctata catctgtact ggaagcttat tatgaagcag gattcccaat cagtccagtg 1080

actccaactg cttctattaa accatcagta aatccttcaa cagcaccttc taataatcct 1140

tctactgttc caactcagtc agtagctaca actggaaaaa tagaagagct ccctgctaca 1200

acttcagttc ccgttgttac atccagtgct ccaagtactg taccaactca gtctactcag 1260

acaaacggca gcatgacaga tactgcaaaa gcatacatgg caaaaatgaa tgttgtaaat 1320

aaatgcccat ctggtgctga tcagaaacag gctggcagaa cttatcctgc tgcaacaaag 1380

aaaacttatt attcaacaac aacaggttca aaccgttcct gtaatgtatt ccttcctgca 1440

aactattctt cttccaagaa atatcctgta ctttacttat tacatggtat tatgggaaat 1500

gaagattcta tgttaggaaa tgcaattgaa atccctacta acttagctgc acagggaaaa 1560

gcaaaagaaa tgattatcgt acttccaaat gaatatgcac cagctcctgg tacttctgta 1620

gctgctggat taaatcaggc atatttcgat ggatatgata actttatcaa cgatttaaca 1680

aaagacttaa tgccatacat cgaaaagaac tactccgttg caactggcag agacaataca 1740

gcaatcgccg gtttctcaat gggtggacgt aacgctcttt atatcggata tgcaagacca 1800

gacttatttg gttatgttgg agcattttct ccagctcctg gtgtaacacc tggacaggat 1860

tattccggtt tccacaaagg attattctca gaaaatgatt tccgtatcaa agatgaaaga 1920

tatgtaccat atgtaacatt aatcagctgt ggaaccaatg actctgttgt tggaacattc 1980

cctaagagct atcatgatat tttaacaaga aacaatcagc cacatatctg gtttgaagta 2040

cctggtgcag accatgacaa caacgcaatc gctgctggat actataactt tgtatctgct 2100

gcatttggag ttttaggcat tgacaataca acaccatcta cacagcctag cacacagcct 2160

tctgtagctc ctagcgttga gccttcagta gaacctagta cacagcctag tacagaacct 2220

agcacacagc cttctgtaac tcctagccag acaccttctc aaacaggtgt ataa 2274

Claims

1.蛋白质，是如下a)或b)或c)或d)或e)或f)所示的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列1第29-1030位所示的蛋白质；

b)氨基酸序列是序列1所示的蛋白质；

2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述A1)至A8)中的任一种：

A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。

3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)或5)所示的基因：

1)其编码序列是序列2第85-3093位所示的DNA分子；

2)其编码序列是序列2所示的DNA分子；

3)其编码序列是序列8所示的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述的蛋白质的DNA分子；

5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质的DNA分子。

4.如下S1)-S7)中任一种应用：

S1)权利要求1所述的蛋白质在作为木聚糖酶和/或阿魏酸酯酶中的应用；

S2)权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的生物材料在制备木聚糖酶和/或阿魏酸酯酶中的应用；

S3)权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的生物材料在制备羟基化肉桂酸或低聚木糖中的应用；

S4)权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的生物材料在降解木聚糖和/或羟基化肉桂酸酯类化合物中的应用；

S5)权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的生物材料在水解含有木聚糖和羟基化肉桂酸酯键的物质中的应用；

S6)权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的生物材料在催化木聚糖内部的木糖苷键断裂中的应用；

S7)权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的生物材料在催化羟基化肉桂酸与低聚糖或多糖间酯键的断裂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述羟基化肉桂酸酯类化合物为羟基化肉桂酸甲酯或羟基化肉桂酸乙酯；

或，所述羟基化肉桂酸包括阿魏酸、香豆酸、咖啡酸和芥子酸。

6.权利要求1所述的蛋白质的制备方法，包括如下步骤：发酵培养含有权利要求1所述的蛋白质的编码基因的重组微生物，使权利要求1所述的蛋白质的编码基因表达，得到含有所述蛋白质的重组微生物培养物，纯化所述重组微生物培养物，得到所述蛋白质。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述含有权利要求1所述的蛋白质的编码基因的重组微生物是将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物中得到的；

或，所述权利要求1所述的蛋白质的编码基因通过重组载体导入所述受体微生物；

或，所述重组载体为在表达载体的多克隆位点***权利要求1所述的蛋白质的编码基因得到的载体。

8.根据权利要求6或7的方法，其特征在于：所述权利要求1所述的蛋白质的编码基因为序列2第85-3093位所示的DNA分子或序列8所示的DNA分子。

9.根据权利要求6-8所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的条件为(16-37)℃诱导培养(3-24)h。

10.扩增权利要求3中所述的基因全长或其任一片段的引物对。