CN105777716B

CN105777716B - 一种用于靶向治疗癌症的egfr抑制剂及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN105777716B
Application number: CN201610104656.7A
Authority: CN
Inventors: 饶燏; 杨兴林
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2016-02-25
Filing date: 2016-02-25
Publication date: 2018-04-10
Anticipated expiration: 2036-02-25
Also published as: CN105777716A

Abstract

本发明公开了一种用于靶向治疗癌症的EGFR抑制剂及其制备方法与应用。所述EGFR抑制剂的结构式如式Ⅰ所示。本发明提供的EGFR抑制剂可用预防和/或治疗癌症，如人皮肤鳞癌或肺癌。本发明提供的EGFR抑制剂，能够选择性抑制EGFR双突变(EGFR^T790M/L858R)的细胞系，而对EGFR野生型的细胞抑制活性较弱；因此本发明EGFR抑制剂可以用于治疗具有EGFR^T790M/L858R突变的肺癌患者，具有较小的副作用(副作用是由于抑制野生型EGFR导致，例如阿法替尼)。

Description

一种用于靶向治疗癌症的EGFR抑制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种用于靶向治疗癌症的EGFR抑制剂及其制备方法与应用。

背景技术

恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病，是由于人体内细胞的不正常增生所导致。肺癌、消化道肿瘤和肝癌是男性最常见的肿瘤，占所有病例的70％以上(肺癌23％、胃癌15.2％、肝癌13.57％、食管癌10.46％、结直肠癌9.39％)，而乳腺癌、肺癌、消化道肿瘤和肝癌是女性最常见的肿瘤，占所有病例的60％以上(乳腺癌16.97％、肺癌14.85％、结直肠癌9.68％、胃癌8.53％、肝癌6.17％)。随着中国人口老龄化的加剧，癌症的患病率势必增加。另外环境污染情况也增加了一些癌症的患病率，如肺癌。

癌症传统的治疗方式一般包括手术切除、化疗、放射线治疗等。治疗方式的选择取决于肿瘤的位置、恶性程度、发展程度以及病人身体状态。一些实验性治疗癌症的方法也在发展当中。目前对于癌症治疗方法的寻找，均是基于彻底清除癌细胞而不损害到其他的细胞的想法。而手术切除的方式，常因为癌细胞入侵蔓延到邻近组织或远端转移而效果有限。化疗则受限于对于体内其他正常组织的毒性。辐射也同样会对正常组织造成伤害。另外，癌症的治疗无论是化疗、手术或放疗都是对身体有极大负担，并且在发生恶性转移后，无论是何种方式都是很难彻底治愈。所以癌症的治疗仍然是人类面对的极大考验。近十年来，随着人类对肿瘤的认识进一步加深，一些新的技术和治疗手段逐步被应用的临床，比如，小分子靶向药物的研发就取得革命性的进展。基于正常细胞与肿瘤细胞在信号转导方面的差异，小分子靶向药物可以选择性抑制肿瘤细胞的生长，而对正常细胞没有或是有微小的副作用。这在癌症治疗方面比较于传统的肿瘤治疗手段有很大的优势。近几年来就有很多有效治疗癌症的小分子靶向药物成功上市。比如被批准用于非小细胞肺癌的针对表皮生长因子酪氨酸激酶的吉非替尼，厄洛替尼。用于治疗乳腺癌的针对受体酪氨酸激酶的拉帕替尼等。

EGFR是erbB受体家族的跨膜蛋白酶氨酸激酶成员。当与生长因子配体(例如表皮生长因子(EGF))结合时，受体可以与附加的EGFR分子发生同源二聚，或者与另一家族成员(例如erbB2(HER2)、erbB3(HER3)、或者erbB4(HER4))发生异源二聚。erbB家族信号传导的失调促进增殖、侵入、转移、血管生成、和肿瘤细胞生存，并且已在许多(包括肺癌、头颈部癌和乳腺癌的那些)人类癌症中得到描述。因此，erbB家族代表抗癌药物开发的合理靶点，靶向EGFR或erbB2的许多药剂现在是临床上可用的，包括吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼。

在我国无论男女肺癌的发病率在各项肿瘤中最高，其五年生存率仅有10％。第一代小分子靶向药物吉非替尼、厄洛替尼在在肺癌的治疗中取得一定疗效，但由于其耐药性，第二代的EGFR阿法替尼上市。第二代抑制剂虽然在一定程度上解决了耐药性的问题，但是，由于其对野生型的EGFR也有很高的抑制导致像腹泻、皮疹等副作用。因此人们开始了第三代抑制剂的研发。第三代抑制剂主要针对耐药性的突变EGFR，而不会对野生型EGFR抑制，从而大大减轻了药物的毒副作用。第三代抑制剂也是共价药物，它通过分子的可逆部分选择性的与EGFR(T790M)结合，然后，分子的亲电双键可以与Cys797发生共价Michael加成反应从而实现共价抑制的作用。2015年AZD9291已经在美国上市。第三代EGFR抑制剂的开发将会为肿瘤患者带来新的希望。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于靶向治疗癌症的EGFR抑制剂及其制备方法，本发明提供的EGFR抑制剂具有更好的水溶度，其结构异于现有的抑制剂分子，其在分子和细胞水平均具有较好的活性。

本发明提供的EGFR抑制剂为如式Ⅰ所示化合物或式Ⅰ所示化合物的药学上可接受的盐，

本发明提供的式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

式Ⅱ所示化合物与氧化剂经氧化反应即得式Ⅰ所示化合物，

上述的制备方法中，所述氧化反应的温度可为0～25℃，所述氧化反应的时间可为0.5～2小时。

上述的制备方法中，所述氧化剂为间氯过氧苯甲酸、过氧化氢或过氧化苯甲酰等。

上述的制备方法中，式Ⅱ所示化合物与所述氧化剂的摩尔比可为1：1～2。

本发明提供的式Ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐可用于制备预防和/或治疗癌症的药物。

所述癌症由EGFR^WT或EGFR^T790M/L858R介导引起；

所述癌症为人皮肤鳞癌或肺癌。

本发明还进一步提供了式Ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐在下述1)-3)中任一种应用：

1)制备抑制EGFR^WT酶活的产品，所述酶活参与阻断细胞内的激酶通路；

2)制备抑制EGFR^T790M/L858R酶活的产品，所述酶活参与阻断细胞内的激酶通路；

3)制备抑制癌细胞增殖的产品。

所述3)的应用中，所述癌细胞可为人皮肤鳞癌细胞系或肺癌细胞系。

所述人皮肤鳞癌细胞系具体可为A431细胞；

所述肺癌细胞系具体可为H1975细胞。

本发明具有如下优点：

本发明提供的EGFR抑制剂，能够选择性抑制EGFR双突变(EGFR^T790M/L858R)的细胞系，而对EGFR野生型的细胞抑制活性较弱；因此本发明EGFR抑制剂可以用于治疗具有EGFR^T790M ^/L858R突变的肺癌患者，具有较小的副作用(副作用是由于抑制野生型EGFR导致，例如阿法替尼)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、式Ⅰ所示化合物的制备

在搅拌条件下向AZD9291(式Ⅱ所示，200mg)的二氯甲烷(25mL)溶液中加入81mg间氯过氧苯甲酸。20℃下搅拌30min。TLC检测反应结束后，用碳酸氢钠饱和溶液(25mL)洗涤反应液，用二氯甲烷萃取三次(25mL×3)，得到的有机溶剂层合并在一起，在旋转蒸发仪上除去有机溶剂。采用反向高效液相纯化(CH₃OH/H₂O 10:1)，得到式Ⅰ所示化合物。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)13.21(s,1H),8.86(s,1H),8.50(s,1H),8.31(d,J＝5.32Hz,1H),8.26(d,J＝7.88Hz,1H),7.99-7.97(m,3H),7.50(J＝8.40Hz,1H),7.26-7.14(m,4H),6.97(s,1H),6.20-6.15(m,1H),5.62-5.59(m,1H),3.89(s,3H),3.86(s,3H),3.46-3.44(m,2H),3.33(s,3H),3.30(s,3H),3.25-3.24(m,2H),2.74(s,3H)；LRMS(ESI)calcd for C₁₆H₁₈Cl₂N₂O[M+H]⁺:516.27,found 516.35.

实施例2、式Ⅰ所示化合物对激酶的抑制活性

1、激酶测试

以下方法用来测定本发明化合物分别对EGFR^WT和EGFR^T790M/L858R酶活性的抑制作用，具体方法如下：

试剂盒的型号如表1中所示。

表1激酶的型号

激酶	公司来源及货号
		EGFR^WT	Invitrogen,PV3872
EGFR^T790M/L858R	Invitrogen,PV4879

用Invitrogen公司试剂盒对EGFR抑制剂进行体外活性检测。按照试剂盒的使用说明，依次配置相应浓度的酶缓冲液、酶/底物肽段溶液、ATP溶液和完全磷酸化底物肽段，轻轻混合均匀；用蒸馏水配置4X浓度的待测化合物溶液，混合均匀。

将配置好的酶/底物肽段溶液和完全磷酸化底物肽段2.5μL加入384孔板，然后在实验组加入1.25μLATP溶液及1.25μL化合物溶液，在完全抑制对照组中加入1.25μL酶缓冲液及1.25μL相应浓度DMSO溶液，在无抑制对照组中加入1.25μLATP溶液及1.25μL相应浓度DMSO溶液，在完全磷酸化底物对照组中加入1.25μL酶缓冲液及1.25μL相应浓度DMSO溶液。贴好封板贴在振荡器上震荡30秒使各溶液混合均匀，室温孵育1小时。按使用说明，将反应试剂按相应比例配置成显影溶液，混合均匀后加入反应孔各2.5μL，贴好封板贴在振荡器震荡30秒使各溶液混合均匀，室温孵育1小时。之后，每孔加入2.5μL终止液，混合均匀后，用400nM激发，分别使用不同的滤光片在445nm和520nm处读取荧光。

本发明化合物的生化学活性通过以上的实验进行测定，测得针对EGFR^WT和EGFR^T790M/L858R酶的活性抑制率如表2中所示。

表2式I所示化合物对EGFR^WT和EGFR^T790M/L858R抑制活性的抑制率

本发明化合物针对EGFR^WT的IC50值为245.5nM，针对EGFR^T790M/L858R的IC50值为9.7nM，结合表1中的数据可以看出，相比于已经上市的药物AZD9291，该化合物对于EGFR^WT的抑制作用较弱，对EGFR^T790M/L858R的抑制作用基本相当，因此该化合物理论上具有较小的毒副作用。

2、使用MTS(AQueous MTS Reagent Powder,promega/G1112)试剂检测化合物对A431细胞和H1975细胞的增殖抑制作用

A431细胞和H1975细胞均购自中国科学院细胞库。

操作按照MTS试剂的说明书进行，具体步骤如下：

将A431细胞和H1975细胞系培养在配好的培养液中(DMEM90％，FBS10％)，当细胞覆盖80％左右时，用0.25％胰酶(EDTA)消化吹散后种入96孔板(A4314000cells/well；H197510000cells/well)，放置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时。将药物配置成500uM的储备液，用培养基稀释成3μM至1nM溶度的8个梯度。24小时后去掉96孔板中的培养基，每孔加入100μL含有相应浓度的培养基。放置在37℃，5％CO₂培养箱中培养3天。之后每孔加入MTS试剂20μL，混匀，用酶标仪在490nm读取吸光值。

本发明化合物的生化学活性通过以上的实验进行检测，测得的对细胞增殖的抑制率如表3中所示。

表3式I所示化合物对H1975细胞的增殖抑制率

化合物编号及浓度	对于H1975增殖抑制率(％)
		式I(300nM)	49.9
AZD9291(300nM)	44.5

本发明化合物针对NCI-H1975的IC50值为376nM，针对A431的IC50值为4300nM，结合表3中的数据可以看出，在300nM的浓度下，式I所示化合物对于H1975细胞系具有更强的抑制。

表4化合物1-6对A431细胞增殖的抑制的IC50值

化合物	A431(uM)
		式I	4.341
AZD9291	0.49

由表4中的数据可以看出，式I所示化合物对于A431细胞系有较弱的抑制，表明该化合物具有较弱的毒副作用。

Claims

1.式Ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐，

2.式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

式Ⅱ所示化合物与氧化剂经氧化反应即得式Ⅰ所示化合物，

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述氧化反应的温度为0～25℃，所述氧化反应的时间为0.5～2小时。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：式Ⅱ所示化合物与所述氧化剂的摩尔比为1：1～2。

5.权利要求1所述式Ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用；

所述癌症由EGFR^T790M/L858R介导引起；

所述癌症为肺癌。

6.权利要求1所述式Ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐在下述1)-2)中任一种应用：

1)制备抑制EGFR^T790M/L858R酶活的产品，所述酶活参与阻断细胞内的激酶通路；

2)制备抑制癌细胞增殖的产品；

所述癌细胞为肺癌细胞系；

所述肺癌细胞系为H1975细胞。