CN105769771B

CN105769771B - 一种艾塞那肽缓释微球组合物及其制备方法

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Publication number: CN105769771B
Application number: CN201410829179.1A
Authority: CN
Inventors: 姚东刚; 王丹; 苏正兴; 赵栋; 胡思玉; 王利春; 王晶翼; 程志鹏
Original assignee: Sichuan Kelun Pharmaceutical Research Institute Co Ltd
Current assignee: Sichuan Kelun Pharmaceutical Research Institute Co Ltd
Priority date: 2014-12-25
Filing date: 2014-12-25
Publication date: 2019-02-01
Anticipated expiration: 2034-12-25
Also published as: CN105769771A

Abstract

本发明提供了一种艾塞那肽缓释微球组合物，它是由药物艾塞那肽与聚合物组成；所述艾塞那肽占微球总重量的2～15％w/w；所述聚合物选自聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸‑羟基乙酸共聚物、聚酐中的一种或几种；所述微球的粒径为20‑90μm；所述艾塞那肽的相对生物活性保留率大于90％。本发明还提供了该微球组合物的制备方法。采用本发明的制备方法，在无需添加保护剂情况下能完全避免水相的使用造成的药物在油水界面的活性损失问题，且提高了包封率和艾塞那肽的生物活性保留率；利用药物在不同溶剂中溶解度差异形成均一的亚微米级药物颗粒的悬浊液或均一溶液，无需单独制备微粉化药物颗粒，从而简化制备工艺并避免突释效应。

Description

一种艾塞那肽缓释微球组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物制剂领域。更具体地说，本发明涉及一种艾塞那肽缓释微球组合物及其制备方法。

背景技术

多数蛋白多肽类药物(以下简称药物)口服生物利用度低，血中半衰期较短，通常需要频繁皮下注射维持治疗水平。缓释微球是使用生物降解性材料(如聚合物)包裹具有生物活性的药物，控制药物的释放，达到长期治疗效果，降低了给药频率，提高患者依从性。

已报道的蛋白多肽类药物的微球制剂的制备技术包括乳化-溶剂挥发法、凝聚法和喷雾干燥法等，其中普遍采用W/O/W乳化-溶剂挥发法制备，但由于蛋白多肽类药物为水溶性，在制备过程中，药物易扩散到外水相中，且药物通常分布在微球的表面，导致包封率通常较低，且具有较高的突释效应。有研究将药物微粉化，采用S/O/W乳化溶剂挥发法制备，有效控制了药物向微球表面的扩散，降低了突释，但是不能避免微球表面药物逐渐溶解于外水相，带来的较低的包封率。此外，在微球制备过程中药物很容易在油水界面导致空间结构的破坏，造成成分活性降低或降解。

艾塞那肽(exenatide,代号AC-2993)是人工合成的exendin-4。艾塞那肽为肠促胰岛素类似物,是胰高血糖素-1(GLP-1)受体激动剂,由39个氨基酸残基组成。艾塞那肽具有促进胰腺β细胞增殖、改善其功能,以及促进胰岛素分泌、增加机体对胰岛素的敏感性和延缓胃排空等作用,有着传统治疗糖尿病药物不可比拟的优点。美国食品药品监督管理局(FDA)于2005年4月批准了艾塞那肽在美国上市,由于半衰期短,其上市产品为每日2次注射剂。这制约了其作为药品的开发和利用,为了提高患者用药的顺应性,有必要对艾塞那肽的缓释制剂进行研究,以达到长效缓释的目的。目前报道的艾塞那肽缓释微球的制备方法存在制备工艺复杂较难控制，包封率低，以及难以保留药物活性等问题，因此需要一种新的制备方法对微球制剂进行改善。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供了一种相对生物活性保留率高、包封率高的艾塞那肽缓释微球组合物，本发明的另一技术方案是提供了艾塞那肽缓释微球组合物的制备方法。

本发明提供了一种艾塞那肽缓释微球组合物，它是由药物艾塞那肽与聚合物组成；所述艾塞那肽药物占所述微球总重量的2～15％w/w；所述聚合物选自聚己内酯、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚酐中的一种或几种；所述艾塞那肽微球的粒径为20～90μm；所述艾塞那肽的相对生物活性保留率大于90％。

其中，所述聚合物选自聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物或其混合，其中聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物可选自市售的医用PLA及PLGA，优选购自EVONIK公司的LAKESHOREBIOMATERIALS^TM、Boehringer Ingelheim公司的或Alkermes公司的

其中，所述艾塞那肽占所述微球总重量的5～10％w/w。

本发明还提供了一种制备艾塞那肽缓释微球组合物的制备方法，它包括如下步骤：

a、将艾塞那肽粉末溶解于强极性溶剂中；

b、取聚合物加入弱极性溶剂溶解；

c、将步骤a制备的溶液加入步骤b的溶液中，制备成悬浊液或均一溶液；

d、步骤c的悬浊液中加入凝聚剂，制备形成初期微粒；

e、将步骤d的初期微粒转移至淬灭溶剂中硬化；收集硬化微粒；干燥；

其中，所述强极性溶剂与弱极性溶剂的体积比为1:5～1:50。

优选地，所述强极性溶剂与所述弱极性溶剂的体积比为1:20～1:40。

进一步优选地，所述强极性溶剂与所述弱极性溶剂的体积比为1:30。

其中，步骤c中所述悬浊液的粒子的粒径≤2μm。

其中，步骤a中所述强极性溶剂选自二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、冰乙酸中的一种或几种；

步骤b中所述弱极性溶剂选自乙酸乙酯、甲基乙基酮、二氯甲烷、四氢呋喃中的一种或几种；

步骤d中所述凝聚剂选自硅油、液体石蜡、矿物油及其衍生物中的一种或几种；

步骤e所述淬灭溶剂选自正辛烷、正庚烷、正己烷、环己烷或环状液态烷烃中的一种或几种。

进一步优选地，步骤a中所述强极性溶剂选自冰乙酸或二甲基亚砜。

其中，步骤d中所述均质乳化处理时间为2-5min；

步骤e中微粒的硬化方法为：将d步骤的初期微球转至温度范围-5℃至5℃的淬灭溶剂中，搅拌1～2h；

步骤e中所述收集方法是用淬灭溶剂漂洗，并采用多层筛收集。

本发明涉及一种改进的制备艾塞那肽缓释微球的方法，在无需添加保护剂情况下，能完全避免水相使用造成的药物在油水界面的活性损失问题，且提高了包封率和艾塞那肽相对生物活性保留率(生物活性保留率大于90％)，利用药物在不同溶剂中溶解度差异形成均一的亚微米级药物颗粒的悬浊液或均一溶液，无需单独制备微粉化药物颗粒，从而简化制备工艺并避免突释效应。

附图说明

图1为艾塞那肽缓释微球组合物的体外释放曲线；

图2为艾塞那肽缓释微球组合物在大鼠体内药时曲线。

具体实施方式

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1本发明艾塞那肽微球组合物制备的条件筛选试验(悬浊液中粒子粒径的筛选)将50mg艾塞那肽溶于2ml冰乙酸中，将0.62g纯化的50:50DLG3A PLGA溶于9ml二氯甲烷，形成聚合物溶液，将艾塞那肽的冰乙酸溶液与溶解有PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)的二氯甲烷溶液混合后，搅拌制得的S/O型药物悬浊液中药物粒子的粒径分别为4μm、2μm、1μm、0.3μm、0.1μm(悬浮液粒径采用Malvern ZEN1690-纳米粒度仪测定)，其他操作与实施例1基本相同，制备艾塞那肽缓释微球，采用实验例5中(4)的体外释放测定方法检测所制备微球的起始释放度分别为22.6％、4.7％、1.32％、0.86％和0.63％。随着悬浊液中药物粒子的粒径的减小，微球初始释放度减小，通过控制悬浊液中药物粒子的粒径可以有效降低突释，优选悬浊液粒子的粒径≤2μm。

实验例2本发明艾塞那肽微球组合物制备的条件筛选试验(强极性溶剂筛选试验)

将20mg艾塞那肽分别溶解于2ml二甲基亚砜或2ml冰乙酸或2mlN,N-二甲基甲酰胺或2ml甲醇中，将其与PLGA的二氯甲烷溶液混合，悬浊液中粒子粒径为0.3μm，其他操作与实验例1基本相同，制备艾塞那肽缓释微球，采用实验例5中(2)的包封率测定方法检测所制备微球的包封率分别为91.2％、89.6％、36.4％和42.7％。为满足较高的包封率，优选强极性溶剂为二甲基亚砜和冰乙酸，更优选二甲基亚砜。

实验例3本发明艾塞那肽微球组合物制备的条件筛选试验(强极性溶剂/弱极性溶剂比例的筛选)

以二甲基亚砜为例进行筛选实验，将艾塞那肽溶解于不同体积的二甲基亚砜溶液中，二甲基亚砜与二氯甲烷溶液比例分别为1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50，其他操作与实验例2基本相同，制备艾塞那肽缓释微球，采用实验例5中(4)的体外释放测定方法测定所制备微球的包封率分别为30.2％、44.9％、86.1％、92.2％、89.4％、49.4％。为满足较高的包封率，优选二甲基亚砜与二氯甲烷溶液的体积比为1:20至1:40，更优选1:30。

实验例4本发明艾塞那肽微球组合物制备的条件筛选试验(艾塞那肽药物占所述微球总重量比例的筛选)

以二甲基亚砜与二氯甲烷溶液的体积比为1:30进行筛选实验，制备微球中艾塞那肽含量分别为1％、2％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、18％，其他操作与实验例3基本相同，制备艾塞那肽缓释微球，采用实验例5中(4)的体外释放测定方法测定包封率分别为60.9％、81.5％、89.3％、90.2％、90.6％、86.7％、80.3％、70.2％，为满足较高的包封率，优选艾塞那肽含量2～15％w/w，更优选5～10％w/w。

实施例1S/O型药物悬浊液制备：

(1)将0.62g纯化PLGA 50:50DLG3A溶于9ml二氯甲烷，形成聚合物溶液；

(2)50mg艾塞那肽溶解于0.3ml二甲基亚砜中；

(3)将步骤(1)中的聚合物溶液与步骤(2)中艾塞那肽溶液混合，搅拌得到均一的悬浊液，悬浊液中粒子粒径为0.33μm；

初期微粒制备：

(4)将15ml硅油加至步骤(3)中的悬浊液中，均质乳化处理2-5min；

微粒硬化：

(5)将步骤(4)中初期微粒粒转移至150ml冷的正庚烷中，5℃下搅拌1-2h。用200ml冷的正庚烷浸泡以冲洗微粒表面残留溶剂；

干燥与收集：

(6)使用多层筛收集，用正庚烷漂洗。4℃干燥24h，25℃真空干燥24h，35℃真空干燥24h。

实施例2本发明艾塞那肽微球组合物的制备

S/O型药物悬浊液制备：

(2)50mg艾塞那肽溶解于0.3ml二甲基亚砜中，

(3)将步骤(1)中的聚合物溶液与步骤(2)中艾塞那肽溶液混合，搅拌得到均一的悬浊液，悬浊液中粒子粒径为0.2μm；

初期微粒制备：

(4)将15ml硅油加至步骤(3)中的悬浊液中，均质乳化处理2-5min；

微粒硬化：

(5)将步骤(4)中初期微粒转移至150ml正庚烷和15ml乙醇的混合溶液中，5℃下搅拌1-2h。用200ml冷的正庚烷浸泡以冲洗微粒表面残留溶剂；

干燥与收集：

实施例3本发明艾塞那肽微球组合物的制备

S/O型药物悬浊液制备：

(1)将0.21g纯化PLGA 50:50DLG1A和0.42g纯化50:50DLG4A溶于9ml二氯甲烷，形成聚合物溶液；

(2)50mg艾塞那肽溶解于0.3ml冰乙酸中；

(3)将步骤(1)中的聚合物溶液与步骤(2)中艾塞那肽溶液混合，搅拌得到均一的悬浊液，悬浊液中粒子粒径为0.27μm；

初期微粒制备：

(4)将15ml液体石蜡加至步骤(3)中的悬浊液中，均质乳化处理2-5min；

微粒硬化：

(5)将步骤(4)中初期微粒转移至150ml冷的正庚烷中，5℃下搅拌1-2h。用200ml冷的正庚烷浸泡以冲洗微粒表面残留溶剂；

干燥与收集：

(6)使用多层筛收集，用正己烷漂洗。4℃干燥24h，25℃真空干燥24h，35℃真空干燥24h。

实施例4本发明艾塞那肽微球组合物的制备

药物-聚合物溶液制备：

(2)50mg艾塞那肽溶解于1.5ml冰乙酸中；

(3)将步骤(1)中的聚合物溶液与步骤(2)中艾塞那肽溶液混合，搅拌得到均一的溶液；

初期微粒制备：

(4)将15ml液体石蜡加至步骤(3)中的溶液中，均质乳化处理2-5min；

微粒硬化：

干燥与收集：

对比例1

不添加保护剂的W/O/O法制备参比样品：

(1)将0.62g纯化PLGA 50:50DLG3A溶于10ml二氯甲烷，形成聚合物溶液；

(2)40mg艾塞那肽溶解于0.5ml纯化水中，

(3)将步骤(2)中艾塞那肽溶液加至步骤(1)中的聚合物溶液，剪切1min，得到初乳；

初期微粒制备：

(4)将15ml硅油加至步骤(3)中的悬浊液中，均质乳化处理2-5min；

微粒硬化：

(5)将步骤(4)中初期微粒转移至200ml正庚烷和20ml乙醇的混合溶液中，5℃下搅拌1-2h。用400ml冷的正庚烷浸泡以冲洗微粒表面残留溶剂；

干燥与收集：

对比例2添加保护剂的W/O/O法制备参比样品：

(2)40mg艾塞那肽和保护剂蔗糖15mg溶解于0.5ml纯化水中，

初期微粒制备：

(4)将15ml硅油加至步骤(3)中的悬浊液中，均质乳化处理2-5min；

微粒硬化：

(5)将步骤(4)中初期微粒转移至200ml正庚烷和20ml乙醇的混合溶液中，5℃下搅拌1-2h。用400ml冷的正庚烷浸泡以冲洗微球表面残留溶剂；

干燥与收集：

实验例5样品的检测方法：

(1)粒径分布测定：采用激光粒度仪(Malvern 3000)测定微球的粒径分布。

(2)包封率测定：

称量10mg微球，加入2ml二甲基亚砜，涡流振荡使完全溶解，加入纯化水定容至10ml。通过HPLC分析柱：TSK-GEL进行定量检测。计算包封率。

(3)药物活性测定：

通过ELISA法测定艾塞那肽的生物活性，用酶标仪测定目标样品的吸光度，然后以艾塞那肽标准品的吸光度作为对照，计算包埋后药物的相对生物活性保留率。以对比实施例4、对比实施例5采用W/O/O法制备的微球作为参比样品。

(4)体外释放测定：

通过测定在释放缓冲液中不同时间艾塞那肽的浓度。室温下将30±2mg微球置于200ml缓冲液中，振荡约30s以悬浮该溶液，然后置于37℃恒温水浴中。一定时间后振荡混合，静置30min，取上清液，立即通过HPLC分析柱：TSK-GEL进行定量检测。测定4h后的释放度为初始释放。

(5)体内释放测定：

夹层免疫定量血浆中艾塞那肽，用固相单克隆抗体EXE4:2-8.4来捕获分析物，通过放射性碘标记单克隆抗体GLP-1:3-3来检测。标准校正曲线来定量。

(6)检测结果(检测结果见表1、图1、图2)：

表1 产品性质表征

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	对比例1	对比例2
							平均粒径μm	57.2	61.4	68.0	66.3	63.6	62.8
包封率/％	90.5	92.7	92.4	90.1	89.2	90.3
							活性保留/％	95.9	94.3	96.1	93.2	42.8	94.0
初始释放/％	0.95	0.86	0.91	1.82	0.96	1.02

从结果可知，与对比实施例1相比，采用本发明制备方法制备的艾塞那肽微球中艾塞那肽在不添加保护剂的情况下活性成分活性损失较小，其相对生物活性保留率大于90％，远高于对比例1制备的艾塞那肽微球中艾塞那肽的相对生物活性保留率(42.8％)。与对比例2相比，本发明制备方法无需添加保护剂即可实现较高的艾塞那肽相对生物活性保留率，但由于不需要使用保护剂降低了成本，提高了药物的安全性。

从图1可知，以冰乙酸和二甲基亚砜为溶剂能够有效控制突释效应，得到0-30d接近零级释药曲线，艾塞那肽在冰乙酸和二甲基亚砜溶解度较高，二者作为活性成分溶剂用量较小，制备得到的艾塞那肽微球的包封率高，且突释低。

采用单一聚合物，并以二甲基亚砜为溶剂制备的艾塞那肽微球能获得更加平稳的释放。其中将不同分子量PLGA 50:50DLG1A与50:50DLG4A以一定比例混合后制备微球的释药曲线接近零级释放，因此可通过调节聚合物的分子量或采用不同比例聚合物混合来调节微球的释药行为，以得到不同释药周期的缓释微球制剂。

从图2可知，给药7d后大鼠体内血药浓度达到峰值，2-30d血药浓度维持在100-200pg/ml之间，波动较小，说明采用该技术制备的微球制剂在体内平稳释放一个月，且具有较小的血药浓度波动。

Claims

1.一种艾塞那肽缓释微球组合物的制备方法，

它包括如下步骤：

a、将艾塞那肽粉末溶解于强极性溶剂中；所述强极性溶剂选自二甲基亚砜或冰乙酸；

b、取聚合物加入弱极性溶剂溶解；所述弱极性溶剂选自乙酸乙酯、甲基乙基酮、二氯甲烷、四氢呋喃中的一种或几种；

c、将步骤a制备的溶液加入步骤b的溶液中，制备成悬浊液或均一溶液；所述悬浊液的粒子的粒径≤2μm；

d、步骤c的悬浊液或均一溶液中加入凝聚剂，制备形成初期微粒；所述凝聚剂选自硅油或矿物油中的一种或两种；

e、将步骤d的初期微粒转移至淬灭溶剂中硬化；收集硬化微粒；干燥；所述淬灭溶剂选自正辛烷、正庚烷、正己烷或环状液态烷烃中的一种或几种；

其中，所述强极性溶剂与弱极性溶剂的体积比为1:20～1:40；

所述的艾塞那肽缓释微球组合物是由艾塞那肽与聚合物组成，所述艾塞那肽占所述微球总重量的2～15％w/w；所述聚合物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物；所述艾塞那肽微球的粒径为20～90μm；所述艾塞那肽的相对生物活性保留率大于90％。

2.根据权利要求1所述的艾塞那肽缓释微球组合物的制备方法，其特征在于：所述艾塞那肽占所述微球总重量的5～10％w/w。

3.根据权利要求1所述的艾塞那肽缓释微球组合物的制备方法，其特征在于：所述强极性溶剂与所述弱极性溶剂的体积比为1:30。

4.根据权利要求1或3所述的艾塞那肽缓释微球组合物的制备方法，其特征在于：

步骤d：步骤c的悬浊液或均一溶液中加入凝聚剂，均质乳化处理2～5min，制备形成初期微粒；

步骤e中微粒的硬化方法为：将d步骤的初期微球粒转至温度范围-5℃至5℃的淬灭溶剂中，搅拌1～2h；

5.根据权利要求1所述的艾塞那肽缓释微球组合物的制备方法，其特征在于：所述矿物油为液体石蜡。

6.根据权利要求1所述的艾塞那肽缓释微球组合物的制备方法，其特征在于：所述环状液态烷烃为环己烷。

7.权利要求1-6任一项所述的艾塞那肽缓释微球组合物的制备方法制备而得的艾塞那肽缓释微球组合物。