CN105765383A - 癌症用唾液生物标记物、其测定方法、装置、以及癌症用唾液生物标记物的特定方法 - Google Patents

癌症用唾液生物标记物、其测定方法、装置、以及癌症用唾液生物标记物的特定方法 Download PDF

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Abstract

使用癌症用唾液生物标记物，该唾液生物标记物的特征在于，其是作为唾液试样的代谢物的低分子化合物的任一种或其组合。此处，上述癌症用唾液生物标记物例如可以是肌酸酐、N1?乙酰亚精胺、α?氨基己二酸盐、N?乙酰神经氨酸盐、1,3?二氨基丙烷的组合。由此，即使是浓度变化大的唾液也可从健康者中早期发现胰腺癌、乳癌、口腔癌等。

Description

癌症用唾液生物标记物、其测定方法、装置、以及癌症用唾液生物标记物的 特定方法
技术领域
本发明涉及癌症用唾液生物标记物、其测定方法、装置、以及癌症用唾液生物标记物的特定方法，特别是涉及适合用于早期发现胰腺癌、胰腺导管内***状粘液肿瘤(IPMN)、乳癌、口腔癌的癌症用唾液生物标记物、其测定方法、装置、以及癌症用唾液生物标记物的特定方法。
背景技术
作为难治癌症的胰腺癌的治疗效果尚不充分，胰腺癌的化学疗法、放射线治疗等非外科切除实例的中位生存期未达到一年。即，为了提高这些难治癌症的治疗效果，尽可能早地进行外科切除的患病阶段的癌症诊断很重要。因此，需要开发出使用能够以非侵入/低侵入的形式简便地进行采集的活体试样(体液等)，实施高频率的检查，能够早期地或最迟在可以进行切除治疗的阶段检测出癌症的方法。
发明人中的一人在专利文献1中提出用于判定肾脏疾病的血清标记物，在专利文献2、3中提出肝脏疾病标记物。
另外，也竞相地进行着很多以胰腺癌的早期发现为目的，从血液中发现肿瘤诊断标记物的研究(专利文献4、5)。作为有关消化器***癌症的血中的蛋白标记物，在临床现场利用CA19-9(糖类抗原：carbohydrate antigen 19-9)，在评价胰腺癌/胆管癌的检测、化学疗法的效果上是有用的，但难以诊断早期的癌症，癌症筛选的精度不充分(非专利文献1)。另外，还存在在Lewis血型阴性者中即便患了癌症也不上升的假阴性的问题。其他还有DUPAN-2(胰腺癌相关糖蛋白抗原，pancreatic cancer associated antigen)、CEA(癌胚抗原：Carcinoembryonic Antigen)等，但前者在胆管癌、肝癌中，后者在食道癌、胃癌等消化器***癌症中也显示出阳性，并非胰腺癌特异性。另外，从成本方面考虑也尚未被广泛使用。
另外，已知精胺(Spermine)等多胺类与N8-乙酰亚精胺(N8-Acetylspermidine)、N1-乙酰亚精胺(N1-Acetylspermidine)、N1-乙酰精胺(N1-Acetylspermine)等多胺经乙酰化而成的物质在血中/尿中作为各种癌症的标记物(非专利文献2)。在代谢途径中精氨酸被代谢为鸟氨酸，其后经由腐胺，被代谢为多胺类。它们在癌组织表面氧较多的部位生物合成被活化，在癌症中央部的低氧状态下，由细胞外的吞噬上升。可认为癌组织整体浓度升高，流入到血中。例如，已知血中的亚精胺在乳癌、***癌、睾丸肿瘤中浓度上升(非专利文献1)。另外，通过动物实验得知精胺、亚精胺在血中的浓度因急性胰腺炎而降低(非专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2011-58863号公报
专利文献2：日本特开2011-232164号公报
专利文献3：WO2011/158590A1号公报
专利文献4：日本特开2011-247869号公报
专利文献5：日本特表2009-508493号公报
专利文献6：日本特开2013-521763号公报
非专利文献
非专利文献1：Hamada S,Shimosegawa T.,Biomarkers of pancreaticcancer.,Pancreatology.2011；11：14-9.
非专利文献2：Soda K(2011),The mechanisms by which polyaminesaccelerate tumor spread.Journal of Experimental&Clinical Cancer Research.30(1)：95.
非专利文献3：Jin HT,Lamsa T,Merentie M,Hyvonen MT,Sand J,Raty S,Herzig KH,Alhonen L,Nordback I(2008).Polyamine levels in the pancreas andthe blood change according to the severity of pancreatitis.Pancreatology.8(1),15-24.
非专利文献4：Zhang L,Farrell JJ,Zhou H,Elashoff D,Akin D,Park NH,Chia D,Wong DT.(2010),Salivary transcriptomic biomarkers for detection ofresectable pancreatic cancer.Gastroenterology.138(3)：949-57
非专利文献5：Sugimoto M,Wong DT,Hirayama A,Soga T,Tomita M,(2010),Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomicsidentified oral,breast and pancreatic cancer-specific profiles,Metabolomics,6,78-95
非专利文献6：Soga,T.,Baran,R.,Suematsu M.,Ueno,Y.,Ikeda,S.,Sakurakawa T.,Kakazu,Y.,Ishikawa,T.,Robert,M.,Nishioka,T.,Tomita,M.(2006),Differential methabolomics reveals ophthalmic acid as an oxidative stressbiomarker indicating hepatic glutathione sonsumption.,Journal of BiologicalChemistry,281(24)：16768-16776
非专利文献7：Sugimoto et al.Capillary electrophoresis massspectrometry-based saliva metabolomics identified oral,breast and pancreaticcancer-specific profiles,Metabolomics,2010,6,78-95
非专利文献8：Tsutsui et al,High-throughput LC-MS/MS basedsimultaneous determination of polyamines including N-acetylated forms inhuman saliva and the diagnostic approach to breast cancer patients,Anal Chem,2013,85,11835-42
非专利文献9：Wang Q et al.Investigation and identification of potentialbiomarkers in human saliva for the early diagnosis of oral squamous cellcarcinoma.,Clin Chim Acta.2014；427：79-85
发明内容
发明要解决的问题
在利用以往的血中蛋白质发现癌症时，胰腺癌的早期发现的筛选存在不足之处。另外，尽管血液检查是低侵入的检查，但也需要健康诊断、由医院的医务人员通过注射采血，所以事实上难以进行高频率的检查。另一方面，唾液因非侵入性完全不带来疼痛，而被验者个人也可以不选择场所地进行采集，具有可以进行高频率的检查的优点。例如专利文献6中提出了用于检测肺癌的唾液生物标记物。特别是认为胰腺癌难以早期发现，所以相比于血液检查以更高频率的检查迅速地检测出癌症的可能性尤为重要。
对于存在可以通过唾液诊断胰腺癌的可能性而言，非专利文献4中记载了可以通过唾液中的mRNA诊断胰腺癌。另外，还有可以通过血中代谢物诊断胰腺癌的报道。
然而，在定量mRNA中，需要在唾液采集后向唾液中添加RNase抑制剂以不使mRNA破坏的工序，还有进行测定需要复杂的工序和时间。因此，为了进行定量而使用定量PCR，但通常也只是对几个左右的标记物进行定量，非专利文献4中也仅对35种物质进行了定量。因此，为了确保全面性和定量性而有不能采集很多分子的倾向，也无法对唾液中产生的浓度进行校正，所以无法进行高精度的预测。而且由于工序复杂，因而在定量值中混入人工噪音的可能性也很高。一直以来没有报道通过以更简便的处理尽力排除给定量值中混入噪音的可能性且对全部分子进行定量，从而也考虑到唾液中产生的浓度变化的影响的可靠性高的标记探索实例的提案。另外，还没有提出可以根据这种可靠性高的唾液生物标记物对癌症特别是胰腺癌、胰腺导管内***状粘液肿瘤(IPMN)、乳癌、口腔癌与健康者进行识别的诊断法。
本发明是为了解决上述以往的问题而完成的，其课题在于使用唾液早期发现胰腺癌、乳癌、口腔癌等癌症。
用于解决问题的方案
本发明人等使用可以对生体试样内的低分子全面地进行测定的组合了毛细管电泳装置(CE)和质谱分析计(MS)的CE-MS，对胰腺癌患者的唾液中的低分子(＝代谢物)进行同时定量，确定了区分胰腺癌和健康者的多个生物标记物。另外，开发了将这些标记物组合而比单独的标记精度高的识别方法并且使用除胰腺癌以外的癌症的唾液进行了特异性评价。相应地，在统一采集方法并排除每日波动、进食的影响来采集唾液，但还是不能完全排除浓度的变化，因此也探索推测代谢物浓度的总和的标记物，开发了与区分胰腺癌和健康者的标记物进行组合的算法(algorithm)。
另外，对于乳癌和口腔癌而言，也用相同的方法发现了标记物。
本发明是基于上述研究结果而完成的，通过癌症用唾液生物标记物而解决了上述课题，所述癌症用唾液生物标记物的特征在于，其是作为唾液试样的代谢物的低分子化合物的任一种或其组合。
此处，上述癌症可为胰腺癌、胰腺导管内***状粘液肿瘤(IPMN)、乳癌、口腔癌的任一种。
另外，作为胰腺疾病检测用的上述癌症用唾液生物标记物可以使用以下的物质或其组合的唾液中的绝对浓度。N-乙酰腐胺(N-Acetylputrescine)、腺苷(Adenosine)、3-磷酸化-D-甘油酸(3PG)、尿素(Urea)、o-乙酰肉碱(o-Acetylcarnitine)、柠檬酸(Citrate)、甘氨酰-甘氨酸(Gly-Gly)、5-氨基戊酸(5-Aminovalerate)、2-氧代异戊酸(2-Oxoisopentanoate)、苹果酸(Malate)、苯甲酸酯(Benzoate)、富马酸(Fumarate)、N-乙酰天冬氨酸(N-Acetylaspartate)、肌苷(Inosine)、3-甲基组氨酸(3-Methylhistidine)、N1-乙酰精胺(N1-Acetylspermine)、肌酸(Creatine)、α-氨基己二酸(alpha-Aminoadipate)、磷酰胆碱(Phosphorylcholine)、2-羟基戊酸(2-Hydroxypentanoate)、黄嘌呤(Xanthine)、琥珀酸(Succinate)、6-磷酸葡糖酸(6-Phosphogluconate)、丁酸(Butanoate)、高香草酸(Homovanillate)、O-磷酸丝氨酸(O-Phosphoserine)、三甲胺N-氧化物(Trimethylamine N-oxide)、哌啶(Piperidine)、胱氨酸(Cystine)、2-异丙基苹果酸(2-Isopropylmalate)、N8-乙酰亚精胺(N8-Acetylspermidine)、N1-乙酰亚精胺(N1-Acetylspermidine)、N-乙酰神经氨酸(N-Acetylneuraminate)、氨基葡萄糖(Glucosamine)、精胺(Spermine)、胍丁胺(Agmatine)、N-乙酰组胺(N-Acetylhistamine)、蛋氨酸(Met)、对-4-羟基苯基乙酸(p-4-Hydroxyphenylacetate)、N,N-二甲基甘氨酸(N,N-Dimethylglycine)、亚牛磺酸(Hypotaurine)、谷氨酰-谷氨酸(Glu-Glu)、N1,N12-二乙酰精胺(N1,N12-Diacetylspermine)。
另外，在使用校正后了唾液的浓度的值的情况下，可以利用以下的物质或其组合作为标记物。N8-乙酰亚精胺(N8-Acetylspermidine)、肌酸酐(Creatinine)、精胺(Spermine)、天冬氨酸(Asp)、N1-乙酰亚精胺(N1-Acetylspermidine)、N1-乙酰精胺(N1-Acetylspermine)、胞苷(Cytidine)、α-氨基己二酸盐(alpha-Aminoadipate)、胞嘧啶(Cytosine)、甜菜碱(Betaine)、尿素(Urea)、高香草酸盐(Homovanillate)、N-乙酰神经氨酸盐(N-Acetylneuraminate)、胱氨酸(Cystine)、尿刊酸盐(Urocanate)、富马酸盐(Fumarate)、1,3-二氨基丙烷(1,3-Diaminopropane)、亚牛磺酸(Hypotaurine)、烟酸盐(Nicotinate)、胍丁胺(Agmatine)、缬氨酸(Val)、2-羟基-4-甲基戊酸盐(2-Hydroxy-4-methylpentanoate)、丙氨酰-丙氨酸(Ala-Ala)、柠檬酸盐(Citrate)、氨基葡萄糖(Glucosamine)、肌肽(Carnosine)、甘氨酰-甘氨酸(Gly-Gly)、2-氨基丁酸(2AB)、精氨酸(Arg)、N-乙酰谷氨酸盐(N-Acetylglutamate)、甘油磷酸盐(Glycerophosphate)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、异亮氨酸(Ile)、腺苷(Adenosine)、鸟嘌呤(Guanine)、磷酸二羟丙酮(DHAP)、尸胺(Cadaverine)。
另外，作为胰腺疾病检测用的上述癌症用唾液生物标记物的组合的一个例子，可以通过组合肌酸酐、N1-乙酰亚精胺、α-氨基己二酸盐、N-乙酰神经氨酸盐、1,3-二氨基丙烷进行高精度的预测。但是，也可以改变其他的组合、组合的方法论来进行预测。
另外，作为乳癌检测用的上述癌症用唾液生物标记物可以使用以下的物质或其组合的唾液中的绝对浓度。胆碱(Choline)、2-羟丁酸(2-Hydroxybutyrate)、β-丙氨酸(beta-Ala)、3-甲基组氨酸(3-Methylhistidine)、α-氨基丁酸(2AB)、N-乙酰-β-丙氨酸(N-Acetyl-beta-alanine)、羟乙基磺酸(Isethionate)、N-乙酰苯丙氨酸(N-Acetylphenylalanine)、三甲基赖氨酸(N6,N6,N6-Trimethyllysine)、α-氨基己二酸(alpha-Aminoadipate)、肌酸(Creatine)、γ-三甲铵基丁内盐(gamma-Butyrobetaine)、肌氨酸(Sarcosine)、丙酮酸(Pyruvate)、尿刊酸(Urocanate)、哌啶(Piperidine)、丝氨酸(Ser)、高香草酸(Homovanillate)、5-氧代脯氨酸(5-Oxoproline)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-氨基戊酸(5-Aminovalerate)、三甲胺N-氧化物(Trimethylamine N-oxide)、2-羟基戊酸(2-Hydroxypentanoate)、肉碱(Carnitine)、异丙醇胺(Isopropanolamine)、亚牛磺酸(Hypotaurine)、乳酸(Lactate)、2-羟基-4-甲基戊酸(2-Hydroxy-4-methylpentanoate)、羟脯氨酸(Hydroxyproline)、丁酸(Butanoate)、腺嘌呤(Adenine)、N-ε-乙酰赖氨酸(N-epsilon-Acetyllysine)、6-羟基己酸(6-Hydroxyhexanoate)、丙酸(Propionate)、甜菜碱(Betaine)、N-乙酰腐胺(N-Acetylputrescine)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)、巴豆酸(Crotonate)、色氨酸(Trp)、瓜氨酸(Citrulline)、谷氨酰胺(Gln)、脯氨酸(Pro)、2-氧代异戊烷酸(2-Oxoisopentanoate)、4-苯甲酸甲酯(4-Methylbenzoate)、3-(4-羟基苯基)丙酸(3-(4-Hydroxyphenyl)propionate)、半胱氨酸(Cysteate)、壬二酸(Azelate)、5-磷酸核酮糖(Ru5P)、哌啶酸(Pipecolate)、苯丙氨酸(Phe)、O-磷酸丝氨酸(O-Phosphoserine)、丙二酸(Malonate)、己酸(Hexanoate)、对羟基苯基乙酸(p-Hydroxyphenylacetate)。
在后面的表7中，上述物质并非为公知而有意义的物质。
另外，作为乳癌检测用的上述癌症用唾液生物标记物的组合的一个例子，可以使用β-丙氨酸、N-乙酰苯丙氨酸、瓜氨酸的组合。但是，也可以改变其他的组合、组合的方法论来进行预测。
另外，在使用校正后的唾液的浓度的值的情况下，可以利用以下的物质或其组合作为标记物。胆碱(Choline)、β-丙氨酸(beta-Ala)、3-甲基组氨酸(3-Methylhistidine)、α-氨基丁酸(2AB)、N-乙酰-β-丙氨酸(N-Acetyl-beta-alanine)、羟乙基磺酸盐(Isethionate)、N-乙酰苯丙氨酸(N-Acetylphenylalanine)、三甲基赖氨酸(N6,N6,N6-Trimethyllysine)、尿刊酸(Urocanate)、哌啶(Piperidine)、5-氨基戊酸(5-Aminovalerate)、三甲胺N-氧化物(Trimethylamine N-oxide)、异丙醇胺(Isopropanolamine)、亚牛磺酸(Hypotaurine)、羟脯氨酸(Hydroxyproline)、N-ε-乙酰赖氨酸(N-epsilon-Acetyllysine)、6-羟基己酸(6-Hydroxyhexanoate)、N-乙酰腐胺(N-Acetylputrescine)、壬二酸(Azelate)、磷酸二羟丙酮(DHAP)、乙醇酸(Glycolate)、4-甲基-2-氧代戊酸(4-Methyl-2-oxopentanoate)、N-乙酰天冬氨酸(N-Acetylaspartate)、甘油磷酸(Glycerophosphate)、3-羟丁酸(3-Hydroxybutyrate)、苯甲酸(Benzoate)、己二酸(Adipate)、2-异丙基苹果酸(2-Isopropylmalate)、磷酰胆碱(Phosphorylcholine)、N-唾液酸(N-Acetylneuraminate)、组胺(His)、o-乙酰肉碱(o-Acetylcarnitine)、N-乙酰葡萄糖胺1-磷酸(N-Acetylglucosamine 1-phosphate)、肌酸酐(Creatinine)、精氨酸(Arg)、丁香酸(Syringate)。
在后面的表8中，上述物质并非为公知而有意义的物质。
另外，作为乳癌检测用的上述癌症用唾液生物标记物的组合的一个例子，可以使用N-乙酰苯丙氨酸、N-乙酰亚精胺、肌酸的组合。但是，也可以改变其他的组合、组合的方法论来进行预测。
另外，作为口腔癌检测用的上述癌症用唾液生物标记物可以使用以下的物质或其组合的唾液中的浓度。甘氨酰-甘氨酸(Gly-Gly)、瓜氨酸(Citrulline)、γ-三甲铵基丁内盐(gamma-Butyrobetaine)、3-苯基乳酸(3-Phenyllactate)、丁酸(Butanoate)、己酸(Hexanoate)、蛋氨酸(Met)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)、亚精胺(Spermidine)、色氨酸(Trp)、天冬氨酸(Asp)、异丙醇胺(Isopropanolamine)、丙氨酰-丙氨酸(Ala-Ala)、N,N-二甲基甘氨酸(N,N-Dimethylglycine)、N1-乙酰亚精胺(N1-Acetylspermidine)、N1,N8-二乙酰亚精胺(N1,N8-Diacetylspermidine)、N8-乙酰亚精胺(N8-Acetylspermidine)、α-氨基丁酸(2AB)、三甲胺N-氧化物(Trimethylamine N-oxide)、N-乙酰天冬氨酸(N-Acetylaspartate)、腺嘌呤(Adenine)、2-羟基戊酸(2-Hydroxypentanoate)、腐胺(Putrescine(1,4-Butanediamine))、3-磷酸甘油酸钡(3PG)、3-苯丙酸(3-Phenylpropionate)、丝氨酸(Ser)、1-甲基烟酰胺(1-Methylnicotinamide)、3-羟基-3-甲基戊二酸(3-Hydroxy-3-methylglutarate)、鸟嘌呤(Guanine)、3-(4-羟基苯基)丙酸(3-(4-Hydroxyphenyl)propionate)、4-苯甲酸甲酯(4-Methylbenzoate)、5-磷酸核酮糖(Ru5P)、α-氨基己二酸(alpha-Aminoadipate)、N-ε-乙酰赖氨酸(N-epsilon-Acetyllysine)、氨基葡萄糖(Glucosamine)、胱氨酸(Cystine)、肌肽(Carnosine)、尿刊酸(Urocanate)、苯丙氨酸(Phe)、2-脱氧核糖-1-磷酸(2-Deoxyribose 1-phosphate)、胞苷5’-磷酸二钠(CMP)、对羟基苯基乙酸(p-Hydroxyphenylacetate)、多羟基丁酸(3-Hydroxybutyrate)、N-乙酰腐胺(N-Acetylputrescine)、7-甲基鸟嘌呤(7-Methylguanine)、肌苷(Inosine)、赖氨酸(Lys)、磷酸二羟丙酮(DHAP)、3-甲基组氨酸(3-Methylhistidine)、氨基甲酰天冬氨酸(Carbamoylaspartate)、肌酸酐(Creatinine)、N-甲基-2-吡咯烷酮(1-Methyl-2-pyrrolidinone)、丙酮酸(Pyruvate)、丙酸(Propionate)、5-氨基戊酸(5-Aminovalerate)、N-乙酰鸟氨酸(N-Acetylornithine)、5-氧代脯氨酸(5-Oxoproline)、肌酸(Creatine)、高丝氨酸(Homoserine)、富马酸(Fumarate)、甘氨酸(Gly)、N1,N12-二乙酰精胺(N1,N12-Diacetylspermine)。
在下面的表9中，上述物质并非为公知的物质。
本发明还提供癌症用唾液生物标记物的测定方法，其特征在于，其包括：采集唾液试样的工序；和检测采集的唾液试样中的上述癌症用唾液生物标记物的工序。
本发明还提供一种癌症用唾液生物标记物的测定装置，其特征在于，其具备：采集唾液试样的单元；和检测采集的唾液试样中的上述癌症用唾液生物标记物的单元。
本发明还提供一种癌症用唾液生物标记物的特定方法，其特征在于，其包括：对唾液试样进行超滤的步骤；对超滤后的唾液试样中的离子性代谢物全面地进行测定的步骤；以及根据测定的代谢物的浓度，来选定区分健康者和胰腺疾病者的能力高的物质的步骤。
此处，在选定上述癌症用唾液生物标记物时，可以计算测定的代谢物之间的相关值，用与最多的物质相关的物质的浓度对各物质的浓度进行归一化处理。
另外，可以使用数理模型，确定上述癌症用唾液生物标记物的组合。
发明的效果
根据本发明，可以使用能够以非侵入的形式进行简便地采集的唾液，不仅对胰腺癌而且对包括IPMN、慢性胰腺炎的胰腺疾病、乳癌、口腔癌等进行早期检测。特别是，通过多胺与其他新型物质的组合可以进行高精度的预测。
附图说明
图1是表示本发明的实施例中的生物标记物的确定步骤的流程图。
图2是表示本发明的实施例中的唾液中代谢物的相关网络的图。
图3是表示本发明的实施例中的数理模型的开发步骤的流程图。
图4是表示本发明的实施例中的从健康者中区分胰腺癌的决策树(Decision Tree)的模型的图。
图5是表示本发明的实施例中的使用以浓度标记物归一化的代谢物浓度时的从健康者中区分胰腺癌的数理模型的接受者操作特性(ROC)曲线的图。
图6是本发明的实施例中的利用对健康者(C)和胰腺癌(PC)进行分类的模型，绘制包括健康者、胰腺癌、慢性胰腺炎(CP)和IPMN的胰腺癌的风险的图。
图7是表示本发明的实施例中的直接利用浓度标记物的绝对浓度时从健康者中区分胰腺癌的MLR模型中变量选择地使用变量增减法时的图。
图8是表示本发明的实施例中的直接利用浓度标记物的绝对浓度时从健康者中区分胰腺癌的MLR模型中变量选择地使用变量增加法时的图。
图9表示本发明的实施例中的唾液中氨基酸的总浓度的例子的图。
图10是表示用于从健康者中识别乳癌患者的MLR模型中将变量设为β-丙氨酸、N-乙酰苯丙氨酸、瓜氨酸时的ROC曲线的图。
图11是表示本发明的实施例中的将变量设为N-乙酰苯丙氨酸、N1-乙酰亚精胺、肌酸时的ROC曲线的图。
图12是用于确定乳癌用生物标记物的浓度校正物质的代谢物之间的网络图。
图13是表示在健康者与乳癌患者之间存在显著性差异的物质中属于多胺类的物质的图。
图14是表示在健康者与乳癌患者之间存在显著性差异的物质中除了多胺类以外的物质的例子的图。
图15是表示无论是否进行浓度校正健康者与乳癌患者均存在显著性差异的物质的p值最小的前5的物质和ROC曲线的图。
图16是表示将Gly作为校正标记物的依据的相关网络图。
图17是表示在进行口腔癌的手术时得到的癌组织检体及其附近的健康组织检体的代谢物浓度的图。
图18是表示在改变口腔癌患者的唾液采集方法时与健康者的唾液的浓度的区别的图。
具体实施方式
以下，对本发明的优选实施方式(以下称为实施方式)进行详细说明。需要说明的是，本发明并不限定于以下的实施方式以及实施例中记载的内容。另外，在以下记载的实施方式和实施例中的构成要素中包括本领域技术人员容易想到的、实质上相同的、所谓均等的范围的内容。进而，以下记载的实施方式和实施例中公开的构成要素既可以进行适宜组合，也可以适宜选择使用。
首先，一边参照图1一边针对胰腺疾病用生物标记物的确定步骤进行说明。
1.唾液提供者
收集了胰腺癌患者的病期阶段不同的唾液样品、健康者、以及为了评价特异性的胰腺导管内***状粘液肿瘤(IPMN)、及慢性胰腺炎患者的唾液检体合计199检体。各组的病例数、男女的构成、年龄示于表1。在所有治疗前的病例中没有化学疗法的治疗履历的病例作为对象。表1中的欠缺数是不知道数值的病例数。
[表1]
2.唾液的采集方法(图1的步骤100)
○关于采集日
尽可能在除手术当天以外进行采集
○关于进食
前一天21：00以后，除水以外不饮用
当天不用早餐
○当天，至采集唾液时的注意事项
唾液采集在早餐前AM8：30～11：00之间进行
在唾液采集的1小时以上前，不用牙膏地刷牙
唾液采集的1小时前不做剧烈运动
不进行口腔内的清理(牙签的使用等)
也不吸烟
除水以外不饮用
○采集唾液的方法
在唾液采集前用水漱洗口腔内，采集非刺激性的混合唾液。
唾液不会刻意地流出，只采集自然滴落下来的唾液(吐唾法)。或者，在口腔内唾液蓄积到一定程度时(预计时间为3分左右)叼着吸管，流出唾液至管内(Passive Drool法)。面部朝下，垂直吸管并压出口腔内的唾液，则易于自然滴落，但在吸管中间附着唾液而没有完全下落时，用呼气压出(通过使嘴放开吸管，使唾液在口中积攒到一定程度后，一次性落入管中则易于收集)。
(尽可能)采集200μL以上。
唾液采集时，尽可能将管置于冰上保持低温，在15分以内结束采集(即使15分钟时未能收集200μL也结束采集)。
在5分钟内由冰上至-80度或者用干冰进行冷冻保存。
用聚丙烯材料的管和吸管采集唾液。
需要说明的是，唾液的采集方法不限于上述，也可以用其他的方法采集。
3.用于测定唾液的代谢物质的前处理方法(图1步骤110)
取400μL唾液样品，将其置于超滤器(截留分子量5000Da)中，在4℃下、以9100g离心分离3.5小时。将45μL滤液、与蛋氨酸砜(Methionine sulfone)、2-吗啉乙磺酸单水合物(2-Morpholinoethanesulfonic acid,monohydrate)、CSA(D-Camphor-10-sulfonic acid，D-樟脑-10-磺酸)、钠盐、3-氨基吡咯烷(3-Aminopyrrolidine)、苯三甲酸盐(Trimesate)各成为2mM的水溶液5μL混合制成50μL的样品，通过如下方法进行测定。
4.用毛细管电泳-飞行时间型质谱分析计(CE-TOFMS)测定唾液中代谢物的绝对浓度(图1的步骤120)
通过使用了CE-MS的代谢组解析，对唾液中的离子性代谢物进行了定性和定量。
测定方法根据非专利文献6所述的方法。以下示出参数。
1)阳离子性代谢物质测定模式
·HPCE
毛细管：熔融石英、内径50μm×长度100cm
缓冲液：1M甲酸(Formate)
电压：正，30kV
温度：20℃
注入：加压注入50mbar，5秒钟(约3nL)
测定前的洗涤：用30mM、pH9.0的甲酸铵(Ammonium Formate)洗涤5分钟，用Milli-Q水洗涤5分钟，用缓冲液洗涤5分钟
·TOFMS
极性：正
毛细管电压：4000V
裂解器(fragmenter)电压：75V
撇渣器(skimmer)电压：50V
OCT RFV：125V
干燥气体：氮气(N2)、10L/分钟
干燥气体温度：300℃
喷雾器气体压力：7psig
鞘液：含50％MeOH/0.1μM六(2,2-二氟乙氧基)磷腈的水
流速：10L/分钟
参比(reference)m/z：2MeOH 13C同位素[M+H]+m/z66.063061、六(2,2-二氟乙氧基)磷腈[M+H]+m/z622.028963
2)阴离子性代谢物质测定模式
·HPCE毛细管：COSMO(+)，内径50μm×长度10、6cm
缓冲液：50mM醋酸铵，pH8.5
电压：负，30kV
温度：20℃
注入：加压注入50mbar，30秒钟，(约30nL)
测定前的洗涤：50mM醋酸铵、在pH3.4下洗涤2分钟，用50mM、pH8.5的醋酸铵洗涤5分钟
·TOFMS
极性：负
毛细管电压：3500V
裂解器电压：100V
撇渣器电压：50V
OCT RFV：200V
干燥气体：氮气(N2)，10L/分钟
干燥气体温度：300℃
喷雾器气体压力：7psig
鞘液：含5mM醋酸铵50％MeOH/0.1μM六(2,2-二氟乙氧基)磷腈的水
流速：10μL/分钟
参比m/z：2[CH3COOH]13C同位素[M-H]-m/z120.038339、六(2,2-二氟乙氧基)磷腈+CH3COOH[M-H]-680.035541
ESI针：铂
需要说明的是，在测定阳离子性代谢物质之前也可以测定阴离子性代谢物质。
5.噪音的去除(图1的步骤130)
根据测定日去除数值变化大的物质、并非源自代谢物的信号等。
首先，从测定数据中检测出全部信号噪音比在1.5以上的峰。在测定唾液检体前对可以通过商用获得的标准物质进行测定，对于由质谱分析装置得到的质量电荷比(m/z)的值与移动时间一致的峰分配物质名，实施了鉴定。定量是各峰的峰面积除以内部标准物质的面积，对质谱分析装置的测定灵敏度的偏差进行校正并计算出比峰面积，使用唾液检体内的比峰面积与标准物质的比峰面积的比率计算出绝对浓度。
6.在各组中选定检测数多的物质(图1的步骤140)
从各组中仅筛选出可在30％以上的病例(例如，10人中3人)中检测出峰的物质。
7.选定组间具有统计学上显著性差异的物质(图1的步骤150)
实施通常的检验(这次为Mann-Whitney检验)后，使用错误发现率(FalseDiscovery Rate：FDR)，校正P值并计算Q值，筛选出Q值为Q＜0.05具有显著性差异的物质。
根据该步骤选定的物质是方案3中记载的物质。
8.推测唾液中的总代谢物的浓度并选出用于浓度校正的物质(图1的步骤142)
通过经测定的全部检体(包括健康、乳癌、口腔癌、IPMN、胰腺癌)，使用定量后的代谢物的定量值以循环的方式计算代谢物之间的相关值。列举出以皮尔逊(Pearson)相关系数(R)计满足R≥0.8的物质的组合。从最多的物质之间相关的代谢物组中选出进而与最多的物质相关的物质。
图2示出唾液中代谢物的相关网络图的一个例子。
9.在浓度校正后的物质中选定具有统计学上显著性差异的物质(图1的步骤152)
用步骤142中筛选出的物质的浓度校正各物质的浓度，用得到的值实施通常的检验(这次是Mann-Whitney检验)后，使用False Discovery Rate(FDR)，校正P值并计算出Q值，筛选出Q值为Q＜0.05具有显著性差异的物质。
接着，参照图3并对识别健康者和胰腺癌的数理模型的开发步骤进行说明。
使用在图1的步骤150或步骤152中选定的标记物，步骤200中从无变量状态开发作为数理模型的多元Logistic回归模型(MLR模型)。该多元Logistic回归(MLR)分析中，相对于作为目的变量的比率P，使用k个说明变量x1、x2、x3、……、xk，求出下述P的回归方程式：
In(P/1-P)＝b0+b1x1+b2x2+b3x3+……+bkxk…(1)。
具体而言，步骤210中，使用例如逐步法(step-wise selection)的变量增减方法，选择彼此不相关的独立且最小的变量的组合。追加变量时的P值为0.05，去除变量时的P值也为0.05时，则选择变量xi。
之后，进入步骤220，将数据分割为学习用和评价用后，在步骤230用学习用数据制作模型，用评价用数据进行评价。在由图3中的循环1构成的交叉验证中重复步骤220和步骤230。
使用选择后的模型在步骤240实施接受者操作特性(ROC)解析，计算ROC曲线以下的面积(AUC)及95％置信区间(CI)并评价了模型。另外，通过ROC曲线绘制Y＝X+α(α为常数)的曲线，将α的数值由1向0减小，在最初与ROC曲线相切的地方确定α的值，从而确定了最佳截止值(cut off value)。
之后，进入步骤250，选择在交叉验证的结果中精度最好模型。
在此，使用逐步回归(stepwise)法，但逐步回归法也有变量增加、变量增减、变量减少3种，也有在P＜0.05的阈值追加变量等阈值的调整，所以能够在图3中的大循环2中多次制作模型，并选择精度最好的。
具体而言，作为MLR模型的评价，关于乳癌、口腔癌(CP)和IPMN的唾液，也计算了胰腺癌(PC)的风险的值。还实施交叉验证(CV)：将健康者(C)、CP和IPMN作为1个组，计算出该组中能够识别胰腺癌的AUC值。另外，将数据随机分割10个，使用90％的数据制作模型，用其余10％的值进行模型的评价，将其重复10次，以所有的病例必然有1次被选为评价侧的方式进行，收集评价数据，计算AUC值。
10.将探索到的物质、与相对于通过识别胰腺癌的模型的结果图1的步骤120进行定量后的代谢物，在步骤142中显示出彼此相关关系高的值的物质示于图2。图2中，R≥0.8的物质之间连线。观察到8个团簇(代谢物的群体)，但图中最左上的团簇含有最多的物质。其中丙氨酸(Ala)与其他的物质连接网络最多，所以将本物质作为用于归一化唾液整体的浓度的代谢物。需要说明的是，用于归一化的代谢物不限定于与其他的物质连接网络最多的物质。例如，也可以将代谢浓度的总量、在通过CE-MS测定唾液时得到的信号的总和(Total Ion Electropherogram，总离子电泳图谱)、或将检测出的所有的信号按大小顺序排列并将位于其中央顺序的峰的面积用于归一化。另外，变量选择和数理模型也不限定于逐步回归法和MLR。
例如变量选择时，也可以适用Correlation-based Feature Subset法(参照M.A.Hall(1998).Correlation-based Feature Subset Selection for Machine Learning.Hamilton,New Zealand.)、Relief法(参照Marko Robnik-Sikonja,IgorKononenko(1997).An adaptation of Relief for attribute estimation in regression.In：Fourteenth International Conference on Machine Learning,296-304.)、SVM变量选择法(参照I.Guyon,J.Weston,S.Barnhill,V.Vapnik(2002).Geneselection for cancer classification using support vector machines.MachineLearning.46(1-3)：389-422.)等。
数理模型中也可以适用对2组进行划分的机器学***均、多个决定进行预测的Bootstrap法、Bagging法(参照Breiman,Leo(1996)Bagging predictors.Machine,Learning24(2)：123-140)。进而，也可以使用作为无监督学习的主成分分析(Principal Component Analysis；PCA)(参照Hotelling,H.(1933).Analysis of acomplex of statistical variables into principal components.Journal of EducationalPsychology,24,417-441.)的主要成分进行分离。图4是从健康者中区分胰腺癌的决策树的模型。代谢物的浓度利用通过浓度标记物(此处为Ala)进行归一化的浓度。ROC曲线以下的面积为0.856，在10分割交叉验证时为0.653。
将在前项9.的步骤152中区分健康者和胰腺癌能力高的物质示于表2。
[表2]
在表2中，检测率表示在健康者和胰腺癌各自的组中，在全部病例中几个病例能检测出峰的比例。95％CI(Confidential Interval)表示95％置信区间的值。
在健康者和胰腺癌之间，在健康者组和胰腺癌组中实施非参数的2组检验的Mann-Whitney检验，计算每个代谢物的p值，使用False DiscoveryRate(FDR)校正p值并实施了q值的检验。
另外，为了评价这些物质可区分胰腺癌(PC)和健康者(C)这2组到什么程度的灵敏度和特异性，进行了接受者操作特性(ROC)解析。该结果示于图5。代谢物的浓度利用通过浓度标记进行归一化的浓度。该MLR模型所含的物质、该参数和优势率(odds ratio)示于表3。
[表3]
图5中的ROC曲线以下的面积为0.8763(95％CI：0.8209-0.9317，p＜0.0001)。另外，最佳截止值的灵敏度为0.8348，(1-特异度)为0.2169。
使用能够区分健康者和胰腺癌的MLR模型，不仅将健康者(C)和胰腺癌(PC)，而且将计算了乳癌、口腔癌(CP)和IPMN的患者的胰腺癌风险的值示于图6。
图6是在分离健康者(C)和胰腺癌(PC)的模型中，绘制了还包括C、PC与乳癌、口腔癌(CP)与IPMN在内胰腺癌的风险的图，箱线图自上开始表示10％、25％、50％、75％、90％的值，通过绘制表示在10％和90％外侧的值。
表4中示出对MLR模型的特异性和通用性进行评价的AUC值。
[表4]
从C中区分PC 从C+CP+IPMN中区分PC
使用全部数据的情况 0.88 0.85
CV的情况 0.86 0.83
此处，CV是交叉验证的情况。
另外，将不进行浓度校正而使用绝对浓度制作MLR的模型时的ROC曲线示于图7。另外，将选择出的标记物和系数示于表5。ROC曲线以下的面积为0.8264(95％CI：0.7619-0.8874，p＜0.0001)，与不实施浓度校正的情况相比，虽然精度略微下降，但仍能够以高的预测精度进行预测。另外，制作本模型时使用逐步法的变量增减方法，追加变量时的P值为0.05，去除变量时的P值也为0.05，作为变量选择的方法使用变量增加方法，将追加变量时的P值为0.05时的ROC曲线示于图8。另外，将选择的标记物和系数示于表6。ROC曲线以下的面积为0.8373(95％CI：0.7792-0.8954，p＜0.0001)，无论是否使用了与图7的模型不同的标记、系数，均能够得到相同水平的预测精度。
[表5]
[表6]
11.针对探索到的物质的考察
本发明中，对唾液中所含的离子性代谢物的浓度同时进行测定，选出能够识别健康者和胰腺癌的能力高的标记物。进而通过该标记物的组合，能够开发出比单一物质精度(灵敏度和特异度)更高的模型。
作为处理唾液的问题点，可以举出与血液相比浓度变化大。本方法中，根据采集时间、采集前的进食限制，用统一的条件采集了唾液，然而明显有全部物质处于浓的或淡的倾向的样品。图9中示出唾液中的氨基酸的总浓度的每种疾病的差异。箱线的意思与图6相同。检验通过无参数的多元检验的克鲁斯凯-沃利斯(Kruskal-Wallis)实施，为P＝0.0138。另外，之后实施了Dunn的Post检验，仅C与PC之间为p＜0.05。
胰腺癌(PC)与健康者(C)相比浓度显著高，唾液中的总浓度高的也存在能够作为显示胰腺癌的风险的指标进行利用的可能性。但是，由于C中也存在浓度高于PC的检体、相反PC中也存在浓度低于C的检体，所以即使简单地将它们作为风险处理其精度也差(图8的数据中C和PC之间进行了ROC解析，结果为AUC＝0.6282，p＝0.004756)。
因此，在排除这些(C中浓度高，PC中浓度低)检体并仅将浓度在一定范围内的检体作为检查对象的情况，也能够考虑浓度整体，但不得不减少检查对象的病例。因此，根据图2所示的方法，唾液的代谢物浓度整体相关高，用能够在全部检体中检测出的物质进行归一化并排除整体浓度的变化，从而探索出了标记物质。需要说明的是，也可省略归一化。
在作为标记物候补的表2中的物质中，精胺等多胺类与N8-乙酰亚精胺、N1-乙酰亚精胺、N1-乙酰精胺等多胺经乙酰化的物质是在各种癌症中变化并且反映胰脏的状态的物质，但例如尿中的精胺等仅仅考虑通过肌酸酐进行浓度校正而无法达到与通过血液检查测定肿瘤标记物相匹配的精度。而且，为了在血液中多胺类被吸入红细胞内(参照Fu NN,Zhang HS,MaM,Wang H.(2007)Quantification of polyamines in human erythrocytes using a newnear-infrared cyanine1-(epsilon-succinimidyl-hexanoate)-1'-methyl-3,3,3',3'-tetramethyl-indocarbocyanine-5,5'-disulfonate potassium with CE-LIF detection.Electrophoresis.28(5)：822-9.)，在游离的状态下的存在量极其少，尿中浓度也极其淡。报道了即使在乳癌中测定血液、尿中的多胺类，浓度最高的亚精胺约为140nM(纳摩尔)，N-乙酰亚精胺约为64nM(纳摩尔)，比唾液中的浓度还低(参照Byun JA,LeeSH,Jung BH,Choi MH,Moon MH,Chung BC.(2008)Analysis of polyaminesas carbamoyl derivatives in urine and serum by liquid chromatography-tandemmass spectrometry.Biomed Chromatogr.22(1)：73-80.)。另外，红细胞中的多胺类的定量也需要复杂的工序。因此，本发明中检测出的诊断法的特点之处在于：用能够高浓度地检测出标记物质的唾液进行；另外，由于用于测定所进行的处理工序简便，因而使每次测定所产生的偏差变小；组合标记物并使用数理模型的3点起作用而可达到高精度的预测。另外，唾液中的mRNA在胰腺癌患者和健康者之间存在不同是已知的事实(非专利文献4)，但作为本发明的对象的分子组为代谢物，完全不同。另外，唾液中的代谢物本身在胰腺癌中变化是已知的(非专利文献5)，但本发明中将未包含在已知文献中的物质作为标记物，进而排除唾液中特有的浓度变化且通过组合这些物质，从而能够开发出灵敏度和特异性高的胰腺癌识别数理模型。
关于健康者、慢性胰腺炎、IPMN、胰腺癌这4组，由MLR模型预测的胰腺癌的风险分布可知，本模型针对胰腺癌显示出高特异性(图6)。另外，由交叉验证(表4)的结果、区分除了胰腺癌和胰腺癌以外的组的试验的结果，也显示出本模型具有现有方法无法实现的高灵敏度和特异性。
另外，实施例中，测定唾液中的代谢物使用了毛细管电泳-质谱分析(CE-MS)法，但高速液相色谱(LC)、气相色谱(GC)、芯片LC、芯片CE、在它们中组合质谱分析计(MS)的GC-MS、LC-MS、CE-MS法、各种的MS单独的测定法、NMR法、将代谢物质衍生化为荧光物质、UV吸收物质后进行测定的方法、使用制作抗体并用ELISA法等进行测定的酶法等，不拘泥于测定法，可以使用所有的分析法进行测定。
其次，针对乳癌用的生物标记物进行说明。
作为病例，在健康者(20病例)、治疗开始前的乳癌患者(37病例)、包括接受化学疗法、激素疗法等治疗后的乳癌患者(90病例)中，乳癌中仅1病例包含男性，其余均采用女性病例。治疗开始前的乳癌患者中的8病例为DCIS、29病例为乳腺浸润性导管癌。
唾液的采集方法、代谢物的测定方法等与胰腺癌的情况相同。
作为在制作多元Logistic回归模型(MLR模型)时进行的变量选择法，仅使用了Q值≤0.05的物质。图10中，根据变量增减法，以P≤0.05作为变量追加、以P≥0.05作为变量删除，使用了β-丙氨酸(Beta-Ala)、N-乙酰苯丙氨酸(N-Acetylphenylalanie)、瓜氨酸(Citrulline)。图11中，含有作为公知的标记物而已知的N1-乙酰亚精胺(N1-Acetylspermidine)，根据变量增减法，通过以P≤0.05进行变量追加(增加)的方法，采用了N-乙酰苯丙氨酸、N1-乙酰亚精胺、肌酸(Creatine)。图10的模型中每个物质的ROC值，β-丙氨酸为0.8373、N-乙酰苯丙氨酸为0.7122、瓜氨酸为0.698，通过将它们制成MLR模型，从而提高为0.9622。另外，含有公知的标记物的图12中，N-乙酰苯丙氨酸为0.7122、N-乙酰亚精胺为0.7811、肌酸为0.7824，将它们制成MLR模型并进行组合时，能够确认提高至0.9365。
将乳癌与健康者之间用绝对浓度表示统计学上显著性差异(用Mann-Whitney检验p＜0.05)的物质示于表7-1、表7-2、表7-3、表7-4。实施了健康者为20病例、乳癌患者未进行化学疗法、激素疗法等治疗前的患者(37病例)与全部病例(90病例)两种情况下的比较。Q值通过错误发现率(FalseDiscovery Rate，FDR)计算出。
[表7-1]
[表7-2]
[表7-3]
[表7-4]
在记载为公知的项目中记载有7和8的物质是非专利文献7和8中公知的物质。
接着，图10中所示的治疗开始前的乳癌患者(37病例)与作为健康者(20病例)的代谢物的以R2＞0.92显示相关的代谢物之间连线而制成网络图，其中，与其他的物质具有多个结合线的物质且是可在全部检体中检测出的物质为谷氨酰胺(Gln)，选择谷氨酰胺作为浓度校正物质。图中用○表示。
而且，将在乳癌与健康者之间以相对浓度计显示出统计学上的显著性差异(用Mann-Whitney检验p＜0.05)的物质示于表8-1、表8-2、表8-3、表8-4。相对浓度的计算用各物质除以谷氨酰胺的浓度得到无单位的值。
这次，由于测定了多个唾液中所含的代谢物，所以为了计算每个物质的显著性差异，需要重复进行(例如用曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验等)独立的统计。因此，在以显著性水平α＝0.05重复检验时，偶然舍弃的零假设增加，所以使用False Discovery Rate(FDR)的方法(Storey,J.D.,&Tibshirani,R.(2003).Statistical significance for genomewide studies.Proceedings of theNational academy of Sciences of the United States of America,100,9440-9445)校正了P值，计算出Q值。例如Q值为0.5时，在以P＜0.05舍弃的零假设(nullhypothesis)中，包括一半真实的零假设。
[表8-1]
[表8-2]
[表8-3]
[表8-4]
由此，作为与最多的代谢物显示出相关的物质且是可在全部检体中检测出的物质作为浓度校正标记物使用谷氨酰胺，从而即使在高龄患者的唾液整体浓度增高时，也能够使用本方法减去浓度变化的影响以区分开癌症和健康者。另一方面，由于70岁以上的唾液的整体的浓度存在上升倾向，所以在使用绝对浓度时，通过仅使用小于70岁的数据来构建模型，从而能够进行高精度的分离。
在健康者(C，n＝20)与乳癌患者(BC，不仅在治疗前还包括全部病例的n＝90)之间，将存在显著性差异的物质中属于多胺类的物质示于图13。
另外，在健康者(C，n＝20)与乳癌患者(BC，不仅在治疗前还包含全部病例的n＝90)之间，将存在显著性差异的物质中除了多胺类以外的物质的例子(P值最小的前5位)示于图14。
另外，将无论浓度校正与否的健康者(C，20病例)与乳癌患者(BC，90病例)中存在显著性差异(p＜0.05)的物质示于图15。使用全部检体(C，20病例和BC，90病例)的全部病例制作网络图(示于图16)确定了浓度校正物质Gly(图中用○表示)。在不用该浓度校正标记物进行浓度校正时73物质显示出显著性差异，在进行浓度校正(用作为对象的代谢物的浓度除以Gly的浓度)时，35物质显示出显著性差异，其中，11物质无论浓度校正与否均显示出显著性差异。示出其中P值最小的前5位的物质。另外，使用精胺和6-羟基己酸这2种物质制作MLR模型时的ROC曲线示于右下。
其次，针对口腔癌用的生物标记物进行说明。
表9-1、表9-2是关于口腔癌和健康者的唾液的代谢物以绝对浓度计表现出差异的物质。健康者为20病例、乳癌患者为(20病例)。健康者在进食后1.5小时采集唾液，癌患者在进食前(从前一天晚上开始绝食状态)和进食后1.5小时实施两次采集。无论何种比较均通过Mann-Whitney检验计算P值，进而通过False Discovery Rate(FDR)计算Q值，列举了Q＜0.05的物质。
[表9-1]
[表9-2]
在记载为公知的项目中记载有7、9的物质是非专利文献7和9中示出的物质。
此处，口腔癌患者包括阶段I～IVa，包括口腔扁平上皮癌(17病例)、恶性黑色素瘤(2病例)、腺样囊性癌(1病例)。需要说明的是，精胺、亚精胺、或者它们的乙酰化物在手术时得到的口腔癌检体与附近的健康部位的比较中浓度高且取得了一致性。
例如其中的胆碱(表中上数第2个)是文献7和9中公知的物质，确认了在唾液中物质的浓度上升，但根据通过与胰腺癌、乳癌相同的方法组合了多个新型标记物的数理模型，能够更高精度地识别口腔癌。另外，虽然本物质在口腔癌中上升但在乳癌中不上升，所以能够通过包含在数理模型中的变量中而表现出癌症种类的特异性。
将口腔癌的手术时得到的癌组织检体及其附近的健康组织检体的代谢物浓度(此处使用用组织重量校正过的μM/g)示于图17。图左部分为健康组织、右侧为癌组织。I、II、III、Via表示癌症的进度(等级)。为健康部分和癌症部分中存在显著性差异的物质的一部分。
另外，将改变口腔癌的唾液采集方法时与健康者(C)的唾液的浓度区别示于图18。在口腔癌患者的唾液的比较中，健康者也将P值最小的Choline(胆碱)作为例子示出。健康者(C)在进食后1.5小时采集，口腔癌从相同的患者，P1在进食后1.5小时、P2在进食后3.5小时、P3在绝食时(早餐前)进行采集。
表10是用健康者17名、胰腺癌21名、乳癌16名、口腔癌20名全部在绝食时(从前一天晚上9时开始空腹，采集当天不进食)采集的唾液，使用液相色谱·质谱分析装置(LC-MS)，测定关于多胺类以及次黄嘌呤的绝对浓度的结果。因病例数少，用于评价平均值的区别的P-值(P-value)通过作为参数检验的学生T检验(Student’st-test)计算得出。
作为多胺和多胺以外的代谢物的次黄嘌呤(Hypoxanthine)的定量结果示于表10。即使在多胺类中，对N1,N12-Diacetylspermine(N1,N12-二乙酰亚精胺)通过CE-TOFMS进行测定时，也与其他的物质的峰重叠，但通过LC-qTOFMS时能够将它们作为不同的峰进行测定。在此，登载了仅使用全部在绝食时采集的检体，对健康者17病例、胰腺癌21病例、口腔癌18病例、乳癌16病例进行了测定的定量值。(定量值的单位是μM)
[表10]
LC-MS用的唾液的处理如下。
1)在以成为2μM MES的方式调整的270uL MeOH+NH4OH中，溶解保持在-80℃的唾液，加入30uL进行搅拌。
2)在4℃下、以15000rpm离心分离10分钟，将上层全部转移至其他的管中。
3)向对该液体总量进行了离心浓缩的液体中加入18μL 90％MeOH、12μLBrateBuffer进行再溶解。
4)将其中5μL用于LC-MS测定，将20μL用于ELAISA测定。
5)在LC-MS测定中将上述5μL的溶液中加入10μL含有4μM蛋氨酸砜(Methionine-sulfone)的MilliQ水，经稀释后作为样品。
LC-MS的测定条件如下。
LC***：Agilent Technologies 1290 infinity
流动相：溶剂A：含有1％甲酸的水；溶剂B：含有0.1％甲酸的乙腈
流速：0.5mL/分钟
梯度[分钟.(％B)]：0(98)-1(98)-3(55)-5(5)
停止时间(Stop time)：7分钟
后处理时间(Post time)：3分钟
柱：CAPCELL CORE PC(Shiseido：2.1mm×50mm，2.7mm)
柱温：50℃
进样量：1·L
MS：Agilent Technologies G6230A
气体温度：350℃
气体流量：13L/分钟
雾化气体(Neblizer gas)：55psig
裂解器(Fragmentor)：150
撇渣器(Skimmer)：90
OCT1RF Vpp：200
VCap：3500
参比(Reference)：121.050873，922.009798
模式：正
根据本发明，通过用相关网络的数据解析对唾液的浓度进行校正(归一化)，从而能够减轻浓度的影响，即使是浓度变化大的唾液也能够从健康者中区分开胰腺癌。另外，本方法也可以进行慢性胰腺炎、IPMN、乳癌、口腔癌的预测。
而且，利用反映唾液浓度的浓度校正标记物的值，确定能够利用本发明的标记物实施检查的范围，范围以外的唾液作为检查对象外，仅范围内的唾液也能够通过绝对浓度或经校正后的相对浓度的标记物的组合的数理模型区分健康者和各种癌症患者。
产业上的可利用性
即使是浓度变化大的唾液也可从健康者中早期发现胰腺癌、乳癌、口腔癌等。

Claims (15)

1.一种癌症用唾液生物标记物，其特征在于，其是作为唾液试样的代谢物的低分子化合物的任一种或其组合。
2.根据权利要求1所述的癌症用唾液生物标记物，其特征在于，所述癌症为胰腺癌、胰腺导管内***状粘液肿瘤(IPMN)、乳癌、口腔癌的任一种。
3.一种胰腺疾病检测用的权利要求1或2所述的癌症用唾液生物标记物，其特征在于，其为N-乙酰腐胺(N-Acetylputrescine)、腺苷(Adenosine)、3-磷酸化-D-甘油酸(3PG)、尿素(Urea)、o-乙酰肉碱(o-Acetylcarnitine)、柠檬酸(Citrate)、甘氨酰-甘氨酸(Gly-Gly)、5-氨基戊酸(5-Aminovalerate)、2-氧代异戊酸(2-Oxoisopentanoate)、苹果酸(Malate)、苯甲酸酯(Benzoate)、富马酸(Fumarate)、N-乙酰天冬氨酸(N-Acetylaspartate)、肌苷(Inosine)、3-甲基组氨酸(3-Methylhistidine)、N1-乙酰精胺(N1-Acetylspermine)、肌酸(Creatine)、α-氨基己二酸(alpha-Aminoadipate)、磷酰胆碱(Phosphorylcholine)、2-羟基戊酸(2-Hydroxypentanoate)、黄嘌呤(Xanthine)、琥珀酸(Succinate)、6-磷酸葡糖酸(6-Phosphogluconate)、丁酸(Butanoate)、高香草酸(Homovanillate)、O-磷酸丝氨酸(O-Phosphoserine)、三甲胺N-氧化物(Trimethylamine N-oxide)、哌啶(Piperidine)、胱氨酸(Cystine)、2-异丙基苹果酸(2-Isopropylmalate)、N8-乙酰亚精胺(N8-Acetylspermidine)、N1-乙酰亚精胺(N1-Acetylspermidine)、N-乙酰神经氨酸(N-Acetylneuraminate)、氨基葡萄糖(Glucosamine)、精胺(Spermine)、胍丁胺(Agmatine)、N-乙酰组胺(N-Acetylhistamine)、蛋氨酸(Met)、对-4-羟基苯基乙酸(p-4-Hydroxyphenylacetate)、N,N-二甲基甘氨酸(N,N-Dimethylglycine)、亚牛磺酸(Hypotaurine)、谷氨酰-谷氨酸(Glu-Glu)、N1,N12-二乙酰精胺(N1,N12-Diacetylspermine)的任一种或其组合。
4.一种胰腺疾病检测用的权利要求1或2所述的癌症用唾液生物标记物，其特征在于，其为N8-乙酰亚精胺(N8-Acetylspermidine)、肌酸酐(Creatinine)、精胺(Spermine)、天冬氨酸(Asp)、N1-乙酰亚精胺(N1-Acetylspermidine)、N1-乙酰精胺(N1-Acetylspermine)、胞苷(Cytidine)、α-氨基己二酸盐(alpha-Aminoadipate)、胞嘧啶(Cytosine)、甜菜碱(Betaine)、尿素(Urea)、高香草酸盐(Homovanillate)、N-乙酰神经氨酸盐(N-Acetylneuraminate)、胱氨酸(Cystine)、尿刊酸盐(Urocanate)、富马酸盐(Fumarate)、1,3-二氨基丙烷(1,3-Diaminopropane)、亚牛磺酸(Hypotaurine)、烟酸盐(Nicotinate)、胍丁胺(Agmatine)、缬氨酸(Val)、2-羟基-4-甲基戊酸盐(2-Hydroxy-4-methylpentanoate)、丙氨酰-丙氨酸(Ala-Ala)、柠檬酸盐(Citrate)、氨基葡萄糖(Glucosamine)、肌肽(Carnosine)、甘氨酰-甘氨酸(Gly-Gly)、2-氨基丁酸(2AB)、精氨酸(Arg)、N-乙酰谷氨酸盐(N-Acetylglutamate)、甘油磷酸盐(Glycerophosphate)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、异亮氨酸(Ile)、腺苷(Adenosine)、鸟嘌呤(Guanine)、磷酸二羟丙酮(DHAP)、尸胺(Cadaverine)的任一种或其组合。
5.一种胰腺疾病检测用的权利要求4所述的癌症用唾液生物标记物，其特征在于，其为肌酸酐、N1-乙酰亚精胺、α-氨基己二酸盐、1,3-二氨基丙烷的组合。
6.一种乳癌检测用的权利要求2所述的癌症用唾液生物标记物，其特征在于，其为胆碱(Choline)、2-羟丁酸(2-Hydroxybutyrate)、β-丙氨酸(beta-Ala)、3-甲基组氨酸(3-Methylhistidine)、α-氨基丁酸(2AB)、N-乙酰-β-丙氨酸(N-Acetyl-beta-alanine)、羟乙基磺酸(Isethionate)、N-乙酰苯丙氨酸(N-Acetylphenylalanine)、三甲基赖氨酸(N6,N6,N6-Trimethyllysine)、α-氨基己二酸(alpha-Aminoadipate)、肌酸(Creatine)、γ-三甲铵基丁内盐(gamma-Butyrobetaine)、肌氨酸(Sarcosine)、丙酮酸(Pyruvate)、尿刊酸(Urocanate)、哌啶(Piperidine)、丝氨酸(Ser)、高香草酸(Homovanillate)、5-氧代脯氨酸(5-Oxoproline)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-氨基戊酸(5-Aminovalerate)、三甲胺N-氧化物(Trimethylamine N-oxide)、2-羟基戊酸(2-Hydroxypentanoate)、肉碱(Carnitine)、异丙醇胺(Isopropanolamine)、亚牛磺酸(Hypotaurine)、乳酸(Lactate)、2-羟基-4-甲基戊酸(2-Hydroxy-4-methylpentanoate)、羟脯氨酸(Hydroxyproline)、丁酸(Butanoate)、腺嘌呤(Adenine)、N-ε-乙酰赖氨酸(N-epsilon-Acetyllysine)、6-羟基己酸(6-Hydroxyhexanoate)、丙酸(Propionate)、甜菜碱(Betaine)、N-乙酰腐胺(N-Acetylputrescine)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)、巴豆酸(Crotonate)、色氨酸(Trp)、瓜氨酸(Citrulline)、谷氨酰胺(Gln)、脯氨酸(Pro)、2-氧代异戊烷酸(2-Oxoisopentanoate)、4-苯甲酸甲酯(4-Methylbenzoate)、3-(4-羟基苯基)丙酸(3-(4-Hydroxyphenyl)propionate)、半胱氨酸(Cysteate)、壬二酸(Azelate)、5-磷酸核酮糖(Ru5P)、哌啶酸(Pipecolate)、苯丙氨酸(Phe)、O-磷酸丝氨酸(O-Phosphoserine)、丙二酸(Malonate)、己酸(Hexanoate)、对羟基苯基乙酸(p-Hydroxyphenylacetate)的任一种或其组合。
7.一种乳癌检测用的权利要求2所述的癌症用唾液生物标记物，其特征在于，其为β-丙氨酸、N-乙酰苯丙氨酸、瓜氨酸的组合。
8.一种乳癌检测用的权利要求2所述的癌症用唾液生物标记物，其特征在于，其为胆碱(Choline)、β-丙氨酸(beta-Ala)、3-甲基组氨酸(3-Methylhistidine)、α-氨基丁酸(2AB)、N-乙酰-β-丙氨酸(N-Acetyl-beta-alanine)、羟乙基磺酸(Isethionate)、N-乙酰苯丙氨酸(N-Acetylphenylalanine)、三甲基赖氨酸(N6,N6,N6-Trimethyllysine)、尿刊酸(Urocanate)、哌啶(Piperidine)、5-氨基戊酸(5-Aminovalerate)、三甲胺N-氧化物(Trimethylamine N-oxide)、异丙醇胺(Isopropanolamine)、亚牛磺酸(Hypotaurine)、羟脯氨酸(Hydroxyproline)、N-ε-乙酰赖氨酸(N-epsilon-Acetyllysine)、6-羟基己酸(6-Hydroxyhexanoate)、N-乙酰腐胺(N-Acetylputrescine)、壬二酸(Azelate)、磷酸二羟丙酮(DHAP)、乙醇酸(Glycolate)、4-甲基-2-氧代戊酸(4-Methyl-2-oxopentanoate)、N-乙酰天冬氨酸(N-Acetylaspartate)、甘油磷酸(Glycerophosphate)、3-羟丁酸(3-Hydroxybutyrate)、苯甲酸(Benzoate)、己二酸(Adipate)、2-异丙基苹果酸(2-Isopropylmalate)、磷酰胆碱(Phosphorylcholine)、N-唾液酸(N-Acetylneuraminate)、组胺(His)、o-乙酰肉碱(o-Acetylcarnitine)、N-乙酰葡萄糖胺1-磷酸(N-Acetylglucosamine 1-phosphate)、肌酸酐(Creatinine)、精氨酸(Arg)、丁香酸(Syringate)的任一种或其组合。
9.一种乳癌检测用的权利要求2所述的癌症用唾液生物标记物，其特征在于，其为N-乙酰苯丙氨酸、N1-乙酰亚精胺、肌酸酐的组合。
10.一种口腔癌检测用的权利要求2所述的癌症用唾液生物标记物，其特征在于，其为甘氨酰-甘氨酸(Gly-Gly)、瓜氨酸(Citrulline)、γ-三甲铵基丁内盐(gamma-Butyrobetaine)、3-苯基乳酸(3-Phenyllactate)、丁酸(Butanoate)、己酸(Hexanoate)、蛋氨酸(Met)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)、亚精胺(Spermidine)、色氨酸(Trp)、天冬氨酸(Asp)、异丙醇胺(Isopropanolamine)、丙氨酰-丙氨酸(Ala-Ala)、N,N-二甲基甘氨酸(N,N-Dimethylglycine)、N1-乙酰亚精胺(N1-Acetylspermidine)、N1,N8-二乙酰亚精胺(N1,N8-Diacetylspermidine)、N8-乙酰亚精胺(N8-Acetylspermidine)、α-氨基丁酸(2AB)、三甲胺N-氧化物(Trimethylamine N-oxide)、N-乙酰天冬氨酸(N-Acetylaspartate)、腺嘌呤(Adenine)、2-羟基戊酸(2-Hydroxypentanoate)、腐胺(Putrescine(1,4-Butanediamine))、3-磷酸甘油酸钡(3PG)、3-苯丙酸(3-Phenylpropionate)、丝氨酸(Ser)、1-甲基烟酰胺(1-Methylnicotinamide)、3-羟基-3-甲基戊二酸(3-Hydroxy-3-methylglutarate)、鸟嘌呤(Guanine)、3-(4-羟基苯基)丙酸(3-(4-Hydroxyphenyl)propionate)、4-苯甲酸甲酯(4-Methylbenzoate)、5-磷酸核酮糖(Ru5P)、α-氨基己二酸(alpha-Aminoadipate)、N-ε-乙酰赖氨酸(N-epsilon-Acetyllysine)、氨基葡萄糖(Glucosamine)、胱氨酸(Cystine)、肌肽(Carnosine)、尿刊酸(Urocanate)、苯丙氨酸(Phe)、2-脱氧核糖-1-磷酸(2-Deoxyribose 1-phosphate)、胞苷5’-磷酸二钠(CMP)、对羟基苯基乙酸(p-Hydroxyphenylacetate)、多羟基丁酸(3-Hydroxybutyrate)、N-乙酰腐胺(N-Acetylputrescine)、7-甲基鸟嘌呤(7-Methylguanine)、肌苷(Inosine)、赖氨酸(Lys)、磷酸二羟丙酮(DHAP)、3-甲基组氨酸(3-Methylhistidine)、氨基甲酰天冬氨酸(Carbamoylaspartate)、肌酸酐(Creatinine)、N-甲基-2-吡咯烷酮(1-Methyl-2-pyrrolidinone)、丙酮酸(Pyruvate)、丙酸(Propionate)、5-氨基戊酸(5-Aminovalerate)、N-乙酰鸟氨酸(N-Acetylornithine)、5-氧代脯氨酸5-Oxoproline)、肌酸(Creatine)、高丝氨酸(Homoserine)、富马酸(Fumarate)、甘氨酸(Gly)、N1,N12-二乙酰精胺(N1,N12-Diacetylspermine)的任一种或其组合。
11.一种癌症用唾液生物标记物的测定方法，其特征在于，其包括：
采集唾液试样的工序；和
检测采集的唾液试样中的权利要求1～10中任一项所述的癌症用唾液生物标记物的工序。
12.一种癌症用唾液生物标记物的测定装置，其特征在于，其具备：
采集唾液试样的单元；和
检测采集的唾液试样中的权利要求1～10中任一项所述的癌症用唾液生物标记物的单元。
13.一种癌症用唾液生物标记物的特定方法，其特征在于，其包括：
对唾液试样进行超滤的步骤；
对超滤后的唾液试样中的离子性代谢物全面地进行测定的步骤；以及
根据测定的代谢物的浓度来选定区分健康者和胰腺疾病者的能力高的物质的步骤。
14.根据权利要求13所述的癌症用唾液生物标记物的特定方法，其特征在于，在选定所述癌症用唾液生物标记物时，计算测定的代谢物之间的相关值，用与最多的物质相关的物质的浓度对各物质的浓度进行归一化处理。
15.根据权利要求13或14所述的癌症用唾液生物标记物的特定方法，其特征在于，使用数理模型来确定所述癌症用唾液生物标记物的组合。
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