JP2011058863A

JP2011058863A - 慢性腎臓病判定用血清マーカー、及び、その検出方法、装置

Info

Publication number: JP2011058863A
Application number: JP2009206717A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Shinomura; 裕之篠村; Kaori Hayashi; 香林; Yutaka Ito; 裕伊藤; Makoto Suematsu; 誠末松; Tomoyoshi Soga; 朋義曽我
Original assignee: Keio University
Current assignee: Keio University
Priority date: 2009-09-08
Filing date: 2009-09-08
Publication date: 2011-03-24

Abstract

【課題】尿検査を行わず、血液検査のみで、慢性腎臓病の初期ステージの患者のスクリーニングを可能とする。
【解決手段】血液サンプル中に含まれる、グルタミン酸、グルタミン、オルニチン、アスパラギン酸、ヒドロキシプロリン、タウリン、ヒポタウリン、アデノシン、ヒポキサンチン、乳酸の少なくともいずれか一つを、慢性腎臓病の初期ステージを健常者と識別可能な慢性腎臓病判定用血清マーカーとして用いる。
【選択図】図２

Description

本発明は、慢性腎臓病判定用血清マーカー、及び、その検出方法、装置に係り、特に、慢性腎臓病（Chronic Kidney Disease：ＣＫＤ）の初期ステージ１〜２を健常者と識別してスクリーニング可能な慢性腎臓病判定用血清マーカー、及び、その検出方法、装置に関する。

近年、末期腎不全（End-Stage Kidney Disease：ＥＳＫＤ）による透析や移植を必要とするＥＳＫＤ患者数が世界中で増加しており、医療経済上も大きな問題になっている。これに伴い、ＣＫＤも、ＥＳＫＤの予備軍として注目されている。更に、ＣＫＤは、心筋梗塞や脳卒中といった心血管疾患の重大な危険因子ともなっているので、ＣＫＤ患者の早期発見が望まれている。

ＣＫＤは、次の１、２のいずれか、又は、両方が、３ヶ月間以上持続する状態を指す。
１．腎障害の存在が明らか
（１）蛋白尿の存在、または
（２）蛋白尿以外の異常
病理、画像診断、検査（検尿／血液）等、で腎障害の存在が明らか
２．糸球体濾過量（Glomerular Filtration Rate：ＧＦＲ）＜６０（ｍｌ／ｍｉｎ／１．７３ｍ²）

ＣＫＤは、進行性・不可逆性の疾患であり、図１に示す如く、その進行度によりステージ１〜５に分類されている（非特許文献１）。

このうち、ＧＦＲ５９以下の進行したステージ３〜５のＣＫＤ患者に対しては、血清ＢＵＮ（Blood Urea Nitrogen）、クレアチニン、シスタチンＣ等の血清マーカーを用いて健常者と識別が可能である（非特許文献２、非特許文献３参照）。

他方、キャピラリー電気泳動-質量分析装置（ＣＥ−ＭＳ）による試料中の代謝物質測定法による細胞内の代謝物質の網羅的な測定方法（例えば、非特許文献４参照）は、ヒトまたは動物の身体の状態をモニタリングするために、該ヒトまたは動物の身体由来の液体サンプルの低分子化合物（代謝物質）パターンおよび／またはペプチドパターンを、定性的かつ／または定量的に決定する方法であって、ここで、該液体サンプルの代謝物質およびペプチドは、キャピラリー電気泳動により分離され、次いで直接イオン化され、そしてオンラインでインターフェースを介して、接続された質量分析計で検出される。長期間にわたって該ヒトまたは動物の身体の状態をモニタリングするために、該状態を示す参照値およびサンプル値、ならびに該値から導かれた偏差および対応は、自動的にデータベースに記憶される。キャピラリー電気泳動と質量分析を組合せて陰イオン性化合物を分離分析する場合は、キャピラリーの内表面が予め陽イオン性にコーティングされたコーティングキャピラリーを用いて、電気浸透流を反転することを特徴とする陰イオン性化合物の分離分析方法（例えば、特許文献１参照）が知られている。

特許第３３４１７６５号公報

Am J Kidney Dis 39:Ｓ1−Ｓ266,2002 Swan SK. The search continues - an ideal marker of GFR. Clinical Chemistry 43:913−914, 1997 O'Riordan S, Ouldred E, Brice S, Jackson SHD, Swift CG. Serum cystatin C is not a better marker of creatinine or digoxin clearance than serumcreatinine. Br J Clin Pharmacol 53:398-402, 2002. Soga, T., Ohashi, Y.,Ueno, Y. , Naraoka, H. ,Tomita, M., and Nishioka, T. ,"Quantitative Metabolome Analysis Using Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry", J. Proteome Res .2. 488-494, 2003.

しかしながら、ステージ３〜５の進行したＣＫＤ患者に対して用いられている血清ＢＵＮ、クレアチニン、シスタチンＣ等の血清マーカーは、ＧＦＲ６０以上のステージ１〜２の初期のＣＫＤ患者では変化しないことから、初期のＣＫＤ患者のマーカーとしては用いることができなかった。現在、ステージ１〜２のＣＫＤ患者は、日本で２３２万人（成人人口の２．３％）と推定されているが、これらの初期のＣＫＤ患者と健常者を識別するのに有用な血清マーカーは存在しなかった。

尚、尿検査を行うことによってステージ１〜２の初期のＣＫＤ患者と健常者を識別することは可能であるが、健常者と初期のＣＫＤ患者のスクリーニングに際して、検尿を行うことなく、血液検査のみで識別することが可能な血清マーカーが求められていた。

本発明は、前記従来の問題点を解消するためになされたもので、ステージ１〜２の早期のＣＫＤでも健常者と識別可能な慢性腎臓病判定用血清マーカーを提供することを課題とする。

本発明は、非特許文献４や特許文献１に記載したような、ＣＥ−ＭＳによる血清中の代謝物質の測定結果に基づいてなされたものである。

即ち、前記ＣＥ−ＭＳを用いてステージ１〜２の初期のＣＫＤ患者の血液サンプル（サンプル数は１５）と、健常者の血液サンプル（サンプル数は７）を分析したところ、図２に示す如く、グルタミン酸、グルタミン、オルニチン、アスパラギン酸、ヒドロキシプロリン、タウリン、ヒポタウリン、アデノシン、ヒポキサンチン、乳酸について、健常者Ｃと初期のＣＫＤ患者Ｐの間で有意の差が得られた。図２において、＊印は、２群の平均値の差に関するＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定のｐ値＜０．０５、＊＊印は同じくｐ値＜０．０１を示す。

各物質のアミノ酸代謝経路中の位置づけを図３及び図４に、核酸代謝経路中の位置づけを図５及び図６に、糖質代謝経路中の位置づけを図７に示す。

このうち、図４に示したアミノ酸代謝経路中のタウリン、ヒポタウリンの増加は、腎臓が高度な酸化ストレスにさらされている可能性を示す。

又、図６に示した核酸代謝経路中のアデノシンの減少、ヒポキサンチンの上昇は、ＣＫＤ患者におけるプリン体分解の亢進の可能性を示す。又、図５に示した同じく核酸代謝経路中のグルタミン酸の上昇は、核酸の合成にも変化が生じている可能性を示す。

又、図７に示した糖質代謝経路中の乳酸の上昇は、ＣＫＤ患者における好気性解糖の低下、嫌気性解糖の上昇の可能性を示す。その理由は明らかでないが、解糖系の途中から核酸の合成への経路が亢進しているため、好気性解糖が低下している可能性が考えられる。又、ＴＣＡ回路の代謝の低下により、アスパラギン酸やグルタミン酸が蓄積して上昇している可能性もある。

本発明は、上記知見に基づいてなされたもので、血液サンプル中に含まれる、グルタミン酸、グルタミン、オルニチン、アスパラギン酸、ヒドロキシプロリン、タウリン、ヒポタウリン、アデノシン、ヒポキサンチン、乳酸の少なくともいずれか一つでなる、慢性腎臓病の初期ステージを健常者と識別可能な慢性腎臓病判定用血清マーカーにより、前記課題を解決したものである。

本発明は、又、慢性腎臓病の初期ステージを健常者と識別可能な血清マーカーとして、血液サンプル中のグルタミン酸、グルタミン、オルニチン、アスパラギン酸、ヒドロキシプロリン、タウリン、ヒポタウリン、アデノシン、ヒポキサンチン、乳酸の少なくともいずれか一つを検出することを特徴とする慢性腎臓病判定用血清マーカーの検出方法を提供するものである。

ここで、前記血液サンプル中の血清マーカーを、キャピラリー電気泳動−質量分析装置を用いて検出することができる。

本発明は、又、血液サンプルから分析に適した試料を作成する手段と、試料中のグルタミン酸、グルタミン、オルニチン、アスパラギン酸、ヒドロキシプロリン、タウリン、ヒポタウリン、アデノシン、ヒポキサンチン、乳酸の少なくともいずれか一つを、慢性腎臓病の初期ステージを健常者と識別可能な血清マーカーとして検出するための分析手段と、を備えたことを特徴とする慢性腎臓病判定用血清マーカーの検出装置を提供するものである。

本発明によれば、被験者の血液サンプル中の血清マーカーの濃度を測定することにより、ステージ１〜２の早期のＣＫＤの有無を健常者と識別するスクリーニングマーカーとして用いることができる。

従って、尿検査等を行わずに、血液検査のみで、ステージ１〜２の早期のＣＫＤを検出でき、被験者の負担や検査の労力・費用を少なくできる。

ＣＫＤの病期（ステージ）分類を示す図本発明による慢性腎臓病判定用血清マーカーの健常者とＣＫＤの初期ステージの患者の網羅的メタボローム解析結果を比較して示す図アミノ酸代謝経路の一部を示す図アミノ酸代謝経路の他の一部を示す図核酸代謝経路の一部を示す図核酸代謝経路の他の一部を示す図糖質代謝経路を示す図本発明の実施形態における処理手順を示す図

以下図面を参照して、本発明の実施の形態を詳細に説明する。

本実施形態の処理手順を図８に示す。

ステージ１〜２のＣＫＤ患者の血液サンプルと、健常者の血液サンプルを、３，０００ｒｐｍで１０分間、遠心した上澄みを、それぞれ血清サンプルとして採取した。サンプル数は、ＣＫＤ患者１５検体、健常者７検体である。

１．血清から代謝物質の抽出
血清２００μｌを内部標準物質入りのメタノール１．８ｍｌに入れて（ステップ１００）攪拌し、酵素を不活性化した後、８００μｌの純水および２ｍｌのクロロホルムを加えて（ステップ１１０）燐脂質を除去し、４℃で５分間、５０００ｒｐｍで遠心した（ステップ１２０）。静置後、分離した水−メタノール相８００μｌを分画分子量５ｋＤａの遠心限外ろ過フィルターを通過し、除タンパクした（ステップ１３０）。ろ液を凍結乾燥後（ステップ１４０）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水５０μｌを加えて水中で溶解し（ステップ１５０）、それをＣＥ−ＭＳ（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）測定に用いた（ステップ１６０）。

２．キャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析装置（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）による試料中の代謝物質測定
ＣＥ−ＴＯＦＭＳを用いて陽イオン測定条件および陰イオン測定条件で質量数１０００
以下の代謝物質を網羅的に測定した。

（１）陽イオン性代謝物質測定条件
１）キャピラリー電気泳動（ＣＥ）の分析条件
キャピラリーには、フューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、外径３５０μｍ、全長１００ｃｍ）を用いた。緩衝液には、１Ｍギ酸（ｐＨ約１．８）を用いた。印加電圧は、＋３０ｋＶ、キャピラリー温度は２０℃で測定した。試料は、加圧法を用いて５０ｍｂａｒで３秒間注入した。
２）飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ）の分析条件
正イオンモードを用い、イオン化電圧は４ｋＶ、フラグメンター電圧は７５Ｖ、スキマー電圧は５０Ｖ、ＯｃｔＲＦＶ電圧は１２５Ｖに設定した。乾燥ガスには窒素を使用し、温度３００℃、圧力１０ｐｓｉｇに設定した。シース液は５０％メタノール溶液を用い、質量較正用にレゼルピン（ｍ/ｚ６０９．２８０７）を０．５μＭとなるよう混入し１０μ/ｍｉｎで送液した。レゼルピン（ｍ/ｚ６０９．２８０７）とメタノールのアダクトイオン（ｍ/ｚ８３．０７０３）の質量数を用いて得られた全てのデータを自動較正した。

（２）陰イオン性代謝物質測定条件
１）キャピラリー電気泳動（ＣＥ）の分析条件
キャピラリーには、ＳＭＩＬＥ（＋）キャピラリー（内径５０μｍ、外径３５０μｍ、全長１００ｃｍ）を用いた。緩衝液には、５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ８．５）を用いた。印加電圧は、−３０ｋＶ、キャピラリー温度は２０℃で測定した。試料は、加圧法を用いて５０ｍｂａｒで３０秒間注入した。
２）飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ）の分析条件
負イオンモードを用い、イオン化電圧は３．５ｋＶ、フラグメンター電圧は１００Ｖ、スキマー電圧は５０Ｖ、ＯｃｔＲＦＶ電圧は２００Ｖに設定した。乾燥ガスには窒素を使用し、温度３００℃、圧力１０ｐｓｉｇに設定した。シース液は５ｍＭ酢酸アンモニウム−５０％メタノール溶液を用い、質量較正用に２０μＭＰＩＰＥＳおよび１μＭレゼルピン（ｍ/ｚ６０９．２８０７）を加え１０μ/ｍｉｎで送液した。レゼルピン（ｍ/ｚ６０９．２８０７）とＰＩＰＥＳの１価（ｍ/ｚ３０１．０５３４）と２価（ｍ/ｚ１５０．０２３０）の質量数を用いて得られた全てのデータを自動較正した。

これにより、前出図２に示す様な結果が得られた。

本実施形態においては、ＣＥ−ＴＯＦＭＳを分析に用いているので、全マーカーのデータを網羅的に得ることができ、高精度の判定を行うことができる。

なお、分析手段はＣＥ−ＴＯＦＭＳに限定されず、ＴＯＦ以外のＣＥ−ＭＳやマイクロチップ型ＣＥ−ＭＳ、ＣＥ−ＭＳ以外の高速液体クロマトグラフィー−質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー−質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）、マイクロチップ型を含む単体のＣＥ、ＬＣ、ＧＣ、ＭＳ、核磁共鳴装置（ＮＭＲ）、比色分析計等のマーカーの一部を検出する分析手段を用いても良い。

Ｃ…健常者
Ｐ…ステージ１〜２の初期のＣＫＤ患者

Claims

血液サンプル中に含まれる、グルタミン酸、グルタミン、オルニチン、アスパラギン酸、ヒドロキシプロリン、タウリン、ヒポタウリン、アデノシン、ヒポキサンチン、乳酸の少なくともいずれか一つでなる、慢性腎臓病の初期ステージを健常者と識別可能な慢性腎臓病判定用血清マーカー。
慢性腎臓病の初期ステージを健常者と識別可能な血清マーカーとして、血液サンプル中のグルタミン酸、グルタミン、オルニチン、アスパラギン酸、ヒドロキシプロリン、タウリン、ヒポタウリン、アデノシン、ヒポキサンチン、乳酸の少なくともいずれか一つを検出することを特徴とする慢性腎臓病判定用血清マーカーの検出方法。
前記血液サンプル中の血清マーカーを、キャピラリー電気泳動−質量分析装置を用いて検出することを特徴とする請求項２に記載の慢性腎臓病判定用血清マーカーの検出方法。
血液サンプルから分析に適した試料を作成する手段と、
試料中のグルタミン酸、グルタミン、オルニチン、アスパラギン酸、ヒドロキシプロリン、タウリン、ヒポタウリン、アデノシン、ヒポキサンチン、乳酸の少なくともいずれか一つを、慢性腎臓病の初期ステージを健常者と識別可能な血清マーカーとして検出するための分析手段と、
を備えたことを特徴とする慢性腎臓病判定用血清マーカーの検出装置。