CN101947318B - 一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法。该制备方法包括：ST细胞或IBRS-2细胞的复苏培养；ST细胞或IBRS-2细胞的生物反应器微载体培养；ST细胞或IBRS-2细胞的生物反应器微载体的连续培养；接种猪细小病毒培养；收集病毒液，灭活病毒，制成猪细小病毒灭活疫苗。本发明的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，为采用反应器微载体培养ST细胞的猪细小病毒工艺，微载体提供了更大的表面积，不仅能提高ST细胞密度，提高病毒滴度，而且反应器能自动监控细胞生长或病毒繁殖时的最适生化条件，每批反应器生产上清的病毒滴度均一批间小、质量稳定。
Description
技术领域
本发明涉及一种疫苗的制备方法，尤其涉及一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法。
背景技术
利用猪睾丸(ST)传代细胞系生产猪细小病毒灭活疫苗是一种常用猪细小病毒灭活疫苗的生产工艺。目前，该生产工艺是采用传统的转瓶培养ST细胞工艺，即采用种毒接种已形成单层的转瓶ST细胞或采用细胞传代时同时接入种毒来生产猪细小病毒灭活疫苗，因各个转瓶都是独立的细胞元，所以每瓶的细胞质量、病毒产量和滴度都不同，直接导致产生疫苗批间差大和隐性污染引起高内毒素等缺点，同时劳动强度大。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，以实现制备出的猪细小病毒灭活疫苗质量均一。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)ST细胞或IBRS-2细胞的复苏培养；
用方瓶培养从液氮中复苏的ST细胞或IBRS-2细胞，培养条件包括：pH值7.0～7.3、温度35～37℃，培养基为DMEM；培养48～72h，培养至细胞浓度为3～6×105cells/ml，即可；
(2)ST细胞或IBRS-2细胞的生物反应器微载体培养；
细胞接种密度为1～2×105cells/ml，微载体浓度为3～5g/L，溶氧为30％～60％，pH值7.0～7.3，温度35～37℃，转速40～60r/min，培养基为DMEM；培养至细胞浓度为3～5×106cells/ml；其中，微载体为球状载体Cytodex1或片状载体；
(3)ST细胞或IBRS-2细胞的生物反应器微载体的连续培养；
以一定速度向生物反应器中连续添加新鲜的DMEM培养基，同时用相同的速度向外排出培养好的ST细胞或IBRS-2细胞，保证ST细胞或IBRS-2细胞在反应器中停留时间内扩增至浓度为3～5×106cells/ml，即可；
(4)接种猪细小病毒培养；
将猪细小病毒接种于连续培养ST细胞或IBRS-2细胞的生物反应器中进行培养，接种MOI为0.01，培养条件包括：溶氧30-60％、PH值7.1-7.4、温度35-37℃，使病毒含量达到≥106.0TCID50/ml；
(5)收集病毒液，灭活病毒，制成猪细小病毒灭活疫苗。
步骤(1)中，在所述的DMEM培养基中，添加有体积浓度为5～10％的血清(BVDV抗体阴性)。
步骤(3)中，所述的一定速度为2～3个生物反应器体积/天。
步骤(4)中，在培养过程中，监控葡萄糖的消耗、乳酸的产生和氨的产生，并对微载体上细胞进行计数。所述的球状载体Cytodex1上细胞计数，先用PBS漂洗2次，经0.1％结晶紫的柠檬酸溶液染色，用血球计数板计数细胞核。
上述的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法所制得的疫苗产品。
本发明的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，利用ST细胞专用培血清(BVDV抗体阴性)培养，血清浓度可降低至5％，首先从液氮中复苏ST细胞，接着用三角瓶培养扩增种子细胞，然后接种5L反应器进行微载体培养，待ST细胞生长合适密度，接种猪细小病毒种毒，收获病毒上清，按照常规的灭活疫苗制备工艺制备猪细小病毒灭活疫苗即可。
有益效果：本发明的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，为采用反应器微载体培养ST细胞的猪细小病毒工艺，微载体提供了更大的表面积，不仅能提高ST细胞密度，提高病毒滴度，而且反应器能自动监控细胞生长或病毒繁殖时的最适生化条件，每批反应器生产上清的病毒滴度均一批间小、质量稳定。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。
本发明使用的猪细小病毒来源于金宇保灵生物药品有限公司，命名为Porcine parvovirus isolate/Beijing/BJ-2/04，简称猪细小病毒BJ-2株；猪睾丸细胞(ST细胞)，来源于中国兽药监察所；猪肾细胞(IBRS-2)，来源于上海交通大学药学院。
实施例1筛选适宜细胞系
将猪细小病毒BJ-2株接种于ST或者IBRS-2传代细胞，在DMEM培养基中，控制培养条件为PH值7.0～7.3，温度35～37℃，不断传代培养，使病毒适应细胞，测定病毒繁殖滴度，至达到所需病毒含量要求≥106.0TCID50/ml，筛选出适宜的细胞系。
适宜的细胞系应该具有形态良好，状态稳定、一致，产毒高等特点。具体细胞标准为：
细胞形态：用含10％胎牛血清的DMEM培养液，置5％CO2培养箱中37℃培养观察6h即可贴壁，40h可长成单层。显微镜下观察，细胞呈不规则形状。
外源病毒检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无外源性病毒污染。
胞核学检查：对不同传代水平的细胞，取50个处于有丝***中期的细胞进行检查。在基础细胞库细胞中存在的染色体标志，在最高代次细胞中也应存在，与基础细胞库的细胞相比，所有细胞的染色体模式差异数不得超过15％，核型必须相同。
无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。
支原体检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无支原体生长。
细胞代次：基础细胞代次为2～10代，工作细胞代次为11～20代，生产用细胞代次不超过30代。
细胞保存：液氮保存，保存期24个月。
毒种继代：应不超过3代。
毒种种子批的建立：将分离纯化后的BJ-2株病毒在ST细胞上连传20代，测定病毒含量及对豚鼠红细胞HA效价，并选取E1、E5、E10、E15、E20代毒进行特异性、免疫原性及纯净性鉴定，结果表明：各代次病毒含量稳定，均在106.0～107.0TCID50/ml，其免疫原性、特异性、纯净性均符合种毒标准，且未发生明显改变。为保证生产用毒种良好的免疫原性和安全性，原始种子批代次定位E1～E5代种毒，基础种子批代次为E6～E10代种毒，生产种子为E11～E13代种毒。
实施例2病毒鉴定
使BJ-2株病毒在实施例1筛选出的合适的细胞系上，在添加有5～10％血清浓度的在DMEM培养基中，控制培养条件为PH值7.0～7.3，温度35～37℃，不断传代培养，同时鉴定病毒的特异性、免疫原性、毒力等病毒特性，并作基因序列分析，保证病毒在培养过程中与原分离株在特异性、毒力、免疫原性等方面没有发生明显改变。
(1)病毒的特异性鉴定
理化特性检测：结果表明，该分离株对脂溶剂、酸、碱均不敏感，对热稳定性强。这些特点符合PPV的一般特性。
荧光抑制试验：猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(HCV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)均为可引起怀孕母猪相似症状的病毒。根据试验可知(见表1)，分离的毒株培养物不能被PRV荧光抗体、PRRSV间接荧光抗体特异性染色，所以该毒株排除了PRV和PRRSV的可能性；三价荧光抗体对分离的毒株培养物和猪瘟病毒培养物均敏感，而且该分离毒株可被PPV抗血清特异结合而抑制三价荧光抗体特异性染色，初步判定该分离毒株不是猪瘟病毒(HCV)而是猪细小病毒(PPV)
表1荧光抑制试验
特异性血清中和试验：该分离毒株的细胞培养物特异性荧光可被PPV阳性血清所抑制，其CPE效应也可被PPV阳性血清特异性中和(见表2)，进一步证明该分离毒株为PPV。
表2特异性血清中和试验
病毒的PCR基因扩增和序列测定：采用常规的基因序列分析方法包括设计引物、PCR、电泳、连接、转化、单克隆鉴定、测序、序列拼接和与NADL-2全序列相比，结果显示，所测毒株只在第1828位碱基发生了变化。相应的氨基酸由原来的N(天冬氨酸)变为H(组氨酸)。病毒的PCR基因扩增和序列测定结果显示，确证该分离株病毒为猪细小病毒BJ-2株
(2)免疫原性鉴定
毒株的免疫原性
猪的免疫原性：取BJ-2株F1、F5、F10、F15、F20代毒(灭活前病毒含量不低于106.0TCID50/ml)适量，按照“规程草案”方法灭活后制成油乳剂灭活疫苗，分别颈部肌肉注射适龄健康阴性猪(HI抗体效价不高于1∶8)各4头，每头注射2ml，28天后采血，分离血清，用BJ-2株PPV检验用抗原做微量HI试验，测定免疫猪血清的血凝抑制价，同时设空白对照猪。
豚鼠的免疫原性：用体重约300～350g的细小病毒HI抗体阴性健康豚鼠，分别肌肉注射上述猪的免疫原性试验中制备的BJ-2株F1、F5、F10、F15、F20代毒灭活疫苗各4只，28天后采血分离血清，测定HI抗体。
结果：接种F1、F5、F10、F15、F20代BJ-2株PPV制成的灭活疫苗后，猪和豚鼠均产生了较高的血清HI抗体，猪抗体平均滴度达1∶128以上，豚鼠抗体平均滴度达1∶128以上。
(3)毒力鉴定
病毒对怀孕母猪的毒力：取BJ-2株F1、F10和F20代毒，依据各代毒测定的病毒含量，用细胞培养液将病毒液稀释至含量为105.0TCID50/ml，分别滴鼻接种怀孕45天左右的初产母猪各3头，其中F10代接种2头，每头4ml，跟踪观察母猪的产仔情况。
结果：F1、F10、F20代BJ-2株PPV，以病毒含量为105.0TCID50/ml的毒液4ml，可使初产母猪发生繁殖障碍，出现死胎、产弱仔等，可见该毒株毒力较强，且毒力稳定，连传20代毒力未发生明显变化。
上述鉴定和分析结束后的结果证明，实施例1所述选出的适合细胞系培养的病毒与原分离毒株在特异性、毒力、免疫原性方面与原毒株没有发生明显改变，即确定采用的细胞系为ST或IBRS-2细胞。
实施例3细胞系培养
用方瓶培养从液氮中复苏的筛选出的ST细胞或IBRS-2细胞，培养条件包括：pH值7.0～7.3、温度35～37℃，培养基为DMEM；培养48～72h，培养至细胞浓度为3～6×105cells/ml，即可；
将细胞系进行生物反应器微载体培养，培养条件为：培养基为DMEM，细胞接种密度为1～2×105cells/ml，微载体浓度为3～5g/L，溶氧为30％～60％，pH值7.0～7.3，温度35～37℃，转速40～60r/min，培养至细胞浓度为3～5×106cells/ml。其中，微载体为球状载体Cytodex1或片状载体。
根据细胞的生长特性和生物反应器体积的大小，以2～3个生物反应器体积/天的流速流加新鲜DMEM培养基，同时以同样速率泵出细胞悬浮液，维持生物反应器稳定的同时，保证细胞在反应器中停留时间内扩增至3～5×106cells/ml，实现细胞连续培养。
实施例4病毒连续培养
将BJ-2株病毒接种于连续培养的ST细胞或IBRS-2细胞的生物反应器中，接种MOI为0.01，培养条件包括：溶氧30～60％、pH值7.1～7.4、温度35～37℃，使病毒适应在载体细胞中扩增，连续培养，使病毒含量达到≥106.0TCID50/ml。
在培养过程中监控生物反应器中葡萄糖的消耗以及乳酸和氨的产生，同时在不同的节点上细胞计数，球状载体Cytodex1上细胞计数先用PBS漂洗2次，经0.1％结晶紫的柠檬酸溶液染色，用血球计数板计数细胞核。例如：每间隔8h从反应器上取样，用试剂盒测糖，根据代谢结果调节灌流量，球状载体可随时取出载体进行细胞计数，片状载体不可计数，只能通过代谢水平评估细胞状况。如代谢不旺盛或细胞数少了，加大灌注量和延长培养时间，以求获得合适的细胞。
实施例5灭活疫苗制备
收集病毒液，灭活病毒，按照灭活疫苗制备工艺制备猪细小病毒灭活疫苗，参照《猪细小病毒灭活疫苗制造及检验规程》检验。
收集实施例4中最终得到的病毒液，经30KD截流分子量的膜包浓缩至病毒HA血凝效价≥29时，停止浓缩，采用甲醛溶液灭活，使灭活剂终浓度为0.1％，37℃灭活16h，可以完全灭活病毒。
灭活疫苗的制备：
(1)油相制备：取注射用白油94份，加硬脂酸铝1份，边加边搅拌，直到完全透明为止，再加入司本-80 6份，混合后，高压灭菌备用；
(2)水相制备：取浓缩后灭活的病毒液96份，加入灭菌的吐温-80 4份，充分摇动，直到吐温-80完全溶解；
(3)乳化：取油相3份置于乳化罐中，搅拌的同时缓慢加入水相1份，持续搅拌30～60min，搅拌速度800r/min，后通过剪切机2次剪切，剪切速度4000r/min，即制成猪细小病毒灭活疫苗；
(4)检测：取样5～10mL，以3000r/min离心15min，如有分层现象，应重复乳化1次。
实施例6疫苗试验
(1)疫苗性状：参照现行《中国兽药典》灭活疫苗检验方法标准。
外观：为乳白色或淡红色均匀乳剂。
剂型：为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水中，除第1滴外，均应呈油滴状不扩散。
稳定性：取疫苗10ml加入离心管中，经3000r/min离心15分钟，应不分层，管底析出水相应不高于0.5ml。
粘度：用1ml清洁吸管(下口内径1.2mm，上口内径2.7mm)吸取25℃左右的疫苗1ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间，应在6秒以内。
(2)疫苗无菌检验：按现行《中国兽药典》附录检验，应无细菌生长。
(3)疫苗的安全性：将实验室试制的3批疫苗分别进行了安全性试验。试验内容包括对3～5日龄乳鼠、3～5周龄断奶仔猪、5～6月龄青年后备猪、种公猪、怀孕母猪分别进行1次单剂量接种、超剂量接种、单剂量重复接种的安全性试验。试验结果表明3批疫苗接种动物后，均未出现红肿、瘙痒、破溃等局部反应，采食和精神状态正常，无全身反应。
(4)疫苗的效力试验：将实验室试制的3批疫苗分别进行免疫效力试验。试验内容包括：最小免疫剂量试验、HI抗体滴度与免疫攻毒保护结果相关性试验、豚鼠的HI抗体滴度与猪的HI抗体滴度相关性试验、免疫持续期试验与免疫程序的确定。
最小免疫剂量试验：将3批疫苗分别以0.2ml、1ml、2ml/头免疫青年后备母猪、4～6月龄公猪，28天后采血分离血清，测定HI抗体效价。结果表明，免疫0.2ml/头，HI抗体效价平均不低于1∶32，免疫1ml/头，抗体效价平均不低于1∶64，而免疫2ml/头的试验组抗体效价均不低于1∶128。根据文献报道，免疫后猪的HI抗体效价在1∶64以上，即可达到攻毒保护效果。
HI抗体滴度与免疫攻毒保护相关性试验：将3批疫苗分别免疫后备母猪，在7、14、21、28日采血测血清HI抗体，取抗体为1∶16、1∶32、1∶64、1∶128的猪，以BJ-2株PPV病毒含量为105.0TCID50/ml的病毒液4ml滴鼻攻毒，在攻毒后5、7、9日采血，综合三次测定结果，测定有无病毒血症，并跟踪母猪产仔情况。结果表明，当HI抗体达1∶64时，攻毒保护率可达95％以上，可以确定血清HI抗体效价不低于1∶64即可满足攻毒保护要求。但考虑到疫苗临床应用时的复杂情况，为保证疫苗的实际使用的免疫保护效果，确定疫苗效力检验时，检验标准为免疫28日后，其血清HI抗体效价几何平均值不低于1∶128。
与此同时进行了豚鼠的免疫效力平行实验，即同时将实验室试制的3批疫苗，分别免疫体重300～350g的豚鼠0.5ml/只，与免疫2ml/头的后备母猪、种公猪，均于免疫14、21、28、42日采血，测定HI抗体效价。结果显示同一批疫苗免疫后，随着免疫时间的增长豚鼠、后备母猪及种公猪的HI抗体效价逐步升高，至28日豚鼠HI抗体几何平均值不低于1∶128，而后备母猪及公猪抗体效价亦不低于1∶128。比较各组免疫后，同一时间豚鼠的血清HI抗体效价与猪的血清HI抗体效价，可看出二者有明显的平行关系。因而可以用实验动物--豚鼠代替本动物--猪做免疫效力检验。标准确定为300～350g健康阴性豚鼠5只，免疫0.5ml/只，免疫28日后采血，分离血清，其血清HI抗体效价几何平均值不低于1∶128判为合格。
(5)免疫持续期试验与免疫程序确定：将实验室试制的3批疫苗，分别免疫初产母猪(两组：一组首免2～3周后加强免疫1次，一组配种强一个月免疫1次)、经产母猪、4～6月龄公猪，于免疫后28日、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月分别采血，测定HI抗体效价，分析抗体消长规律，确定疫苗的免疫持续期。根据猪细小病毒感染发病特点及免疫持续期确定免疫程序。结果表明，初产母猪首免后，2～3周加强免疫1次与经产猪免疫1次，免疫后的抗体高峰均在2～5个月，6个月后其抗体水平开始下降，至9个月抗体效价降至28天左右水平，初产母猪和4～6月龄公猪的抗体变化规律与经产猪基本相同，但抗体高峰值低于经产猪和加强免疫的初产猪，且至6个月时抗体效价降已降至28天时水平，因而将疫苗的免疫持续期定为6个月。
根据细小病毒感染发病特点及抗体消长规律，确定使用该疫苗的免疫程序为：初产母猪配种前1个月，免疫1次，2～3周加强免疫1次，每次2ml/头；经产母猪于配种前一个月免疫1次，种公猪每6个月免疫1次，2ml/头。
疫苗的保存期试验：将实验室试制的5批猪细小病毒灭活疫苗(BJ-2)，放在2～8℃条件下保存，并在6、9、12、15个月分别取样进行性状、无菌检验，取其中3批进行安全性及免疫效力检验。结果5批疫苗在2～8℃条件下保存15个月，疫苗的剂型、黏度、稳定性等性状均未发生显著变化，无菌检验5批5/5无菌生长；安全检验结果，3批疫苗贮藏在2～8℃6、9、12、15个月，接种乳鼠、3～5周龄断奶仔猪均未见全身及局部反应，5/5(2/2)健活，安全检验结果符合规定，证明该疫苗2～8℃贮藏15个月，仍具有良好的安全性；效力检验结果，3批疫苗2～8℃保存6、9、12、15个月，用猪和豚鼠两种效力检验方法，28日后测定HI抗体，3批疫苗免疫豚鼠的HI抗体效价几何平均值不低于1∶128，猪的HI抗体效价几何平均值亦不低于1∶128，表明15个月后疫苗的免疫效力仍符合免疫保护要求。对疫苗在2～8℃保存不同时间的各项检验结果表明，疫苗贮藏15个月后，各项检验结果均符合规定。考虑到疫苗运输、贮藏条件的不确定性，为确保用于动物预防疫苗的安全、有效，故将疫苗的保存期定为12个月。
(6)疫苗与市售同类制品的对比试验：购得市售某公司产品猪细小病毒灭活疫苗，与实验苗进行免疫抗体滴度、免疫持续期、疫苗保存期比较。本试验均与前述的相关试验同步进行，结果表明：实验苗免疫猪和豚鼠，28日采血，其血清HI抗体效价几何平均值不低于1∶128，市售苗免疫28日，HI抗体效价不低于1∶113.4，可见实验苗与市售同类疫苗均可满足免疫保护要求，但免疫实验苗产生的抗体效价高于市售疫苗。
在免疫后3、6、9、12个月，分别采血测定实验苗和市售疫苗免疫猪的HI抗体效价，结果表明：在免疫后6个月内，实验室试制疫苗免疫后备猪，HI抗体效价均能够维持在相对较高的水平，即1∶128以上。而用市售疫苗免疫的试验猪，HI抗体效价也可以到达免疫保护抗体要求，即1∶64以上。二者持续的时间基本相同，可见试验苗与市售同类疫苗免疫持续期基本相同。但血清HI抗体效价几何平均值低于试验苗。
2～8℃贮藏了6、9、12、15个月的疫苗，各组免疫猪产生的HI抗体基本符合免疫保护要求，且试验苗平均HI抗体效价高于市售疫苗。但不同贮藏时间的同批疫苗免疫的猪，其HI抗体水平没有明显差异，由此判定试制疫苗与市售同类疫苗的保存期基本相同。
Claims (6)
1.一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)ST细胞或IBRS-2细胞的复苏培养；
用方瓶培养从液氮中复苏的ST细胞或IBRS-2细胞，培养条件包括：pH值7.0～7.3、温度35～37℃，培养基为DMEM；培养48～72h，培养至细胞浓度为3～6×105cells/ml，即可；
(2)ST细胞或IBRS-2细胞的生物反应器微载体培养；
细胞接种密度为1～2×105cells/ml，微载体浓度为3～5g/L，溶氧为30％～60％，pH值7.0～7.3，温度35～37℃，转速40～60r/min，培养基为DMEM；培养至细胞浓度为3～5×106cells/ml；其中，微载体为球状载体Cytodex1或片状载体；
(3)ST细胞或IBRS-2细胞的生物反应器微载体的连续培养；
以2～3个生物反应器体积/天的流速流加新鲜DMEM培养基，同时用相同的速度向外排出培养好的ST细胞或IBRS-2细胞，保证ST细胞或IBRS-2细胞在反应器中停留时间内扩增至浓度为3～5×106cells/ml，即可；
(4)接种猪细小病毒培养；
将猪细小病毒接种于连续培养ST细胞或IBRS-2细胞的生物反应器中进行培养，接种MOI为0.01，培养条件包括：溶氧30-60％、PH值7.1-7.4、温度35-37℃，使病毒含量达到≥106.0TCID50/ml；
(5)收集病毒液，灭活病毒，制成猪细小病毒灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，在所述的DMEM培养基中，添加有体积浓度为5～10％的血清。
3.根据权利要求1所述的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的一定速度为2～3个生物反应器体积/天。
4.根据权利要求1所述的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，在培养过程中，监控葡萄糖的消耗、乳酸的产生和氨的产生，并对球状载体Cytodex1上细胞进行计数。
5.根据权利要求4所述的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述的球状载体Cytodex1上细胞计数，先用PBS漂洗2次，经0.1％结晶紫的柠檬酸溶液染色，用血球计数板计数细胞核。
6.根据权利要求1所述的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法所制得的疫苗产品。
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Citations (2)
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Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (4)
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| L. Maranga, et al..Large scale production and downstream processing of a recombinant porcine parvovirus vaccine.《Appl Microbiol Biotechnol》.2002,全文. |
| Large scale production and downstream processing of a recombinant porcine parvovirus vaccine;L. Maranga, et al.;《Appl Microbiol Biotechnol》;20021231;全文 * |
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| C06 | Publication | ||
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: VACBIO CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: YANGZHOU VAC BIO ENGINEERING CO., LTD. Effective date: 20130315 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20130315 Address after: 225008 No. 7 Huai Road, Weiyang Economic Development Zone, Jiangsu, Yangzhou Patentee after: YANGZHOU YOUBANG BIO-CHEMICAL PHARMACEUTIAL Co.,Ltd. Patentee after: SINOPHARM YANGZHOU VAC BIOLOGICAL ENGINEERING CO.,LTD. Address before: 225008 Jin Huai Road, Weiyang Economic Development Zone, Yangzhou, Jiangsu Patentee before: YANGZHOU YOUBANG BIO-CHEMICAL PHARMACEUTIAL Co.,Ltd. Patentee before: YANGZHOU VAC BIO ENGINEERING Co.,Ltd. |
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| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 225000 Jinhuai Road, Weiyang Economic Development Zone, Yangzhou City, Jiangsu Province Co-patentee after: SINOPHARM YANGZHOU VAC BIOLOGICAL ENGINEERING CO.,LTD. Patentee after: YANGZHOU UNI-BIO PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Address before: 225008 No. 7 Jinhuai Road, Weiyang Economic Development Zone, Yangzhou City, Jiangsu Province Co-patentee before: SINOPHARM YANGZHOU VAC BIOLOGICAL ENGINEERING CO.,LTD. Patentee before: YANGZHOU YOUBANG BIO-CHEMICAL PHARMACEUTIAL Co.,Ltd. |
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| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120905 Termination date: 20210909 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |