CN105748515A - 具有抗肿瘤作用的疟疾血清及其制备方法和应用 - Google Patents

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韦海艳
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蒋智华
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韦树娇
张伟尉
燕慧
区德锦
贺颖
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Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤作用的疟疾血清及其制备方法和应用。发明人经长期艰苦的科学实验发现，疟疾病人的血清具有一定的抗肿瘤作用，特别是来自疟疾合并血小板减少的患者的血清，在特定的浓度条件下，其对治疗或预防肿瘤尤其是肝癌效果明显。实验证实，该血清对体外培养的肝癌细胞株(7721)具有明显诱导细胞凋亡作用，并且随血清浓度增大诱导肝癌细胞凋亡比率增加。本发明为进一步研究由疟原虫产生的诱导肿瘤细胞凋亡因子提供了理论和实验依据，也为重新认识疟疾危重和脑型疟病例的发病机理及各种疟原虫种株流行病学研究开辟了新的思路，同时在利用疟疾血清或血清制剂在制备治疗或预防肿瘤的药物中方面进行了新的尝试，极具科学研究价值和意义。

Description

具有抗肿瘤作用的疟疾血清及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于肿瘤治疗技术领域，尤其涉及一种具有抗肿瘤作用的疟疾血清及其制备方法和应用。
背景技术
1927年诺贝尔医学奖授予奥地利精神病医师朱利叶斯.瓦格纳-尧雷格(JuliusWagner-Jauregg，1857-1940)，奖励他开创了利用疟原虫人工感染给全身麻痹性痴呆(GeneralParesisoftheInsaneGPI)患者，其人为的造成患者高烧达到当时对GPI疾病治疗束手无策的患者得以治愈和缓解，因此，他被学术界称之为“发热疗法之父”。上世纪40年代以前，“发热疗法”被广范用于当时各种疑难疾病的治疗中，如肿瘤、梅毒和淋病等疾病，直到青霉素发明后，发热疗法的使用范围缩小，但在人类各种肿瘤的治疗中仍不断使用至今，并发展出各种物理发热方法来***，如微波热疗法及近几年的纳米发热疗法等。该方法的治疗机理是肿瘤细胞在40℃以上的温度下极易死亡，而人在感染疟原虫后高烧均达到40℃左右，这无疑对肿瘤细胞具有一定杀伤作用，但除此物理性作用之外。
临床疟疾病例观察发现，约有三分之一的疟疾病例存在有血小板减少的现象，特别是由恶性疟感染引起的疟疾危重患者和脑型疟患者，均存在血小板减少的现象。动物实验证实，当实验猴感染疟原虫几天后血小板开始下降，不予以药物治疗的情况下，并长期保持在低水平波动，血小板减少持续保持不变并不随血内疟原虫密度高低变化而变化，经抗疟药物治疗几天后血小板恢复正常。
自从1975年E.A.Carswell等人发现接种卡介苗的小鼠注射细菌脂多糖后，血清中出现一种能使多种肿瘤发生出血性坏死的物质，将其命名为肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，TNF)。这种肿瘤坏死因子主要由机体活化的巨噬细胞、NK细胞及T淋巴细胞产生。同样，上世纪七十年代中期国外在在动物及人类感染疟原虫后机体也会产生肿瘤坏死因子，但到目前为止，国内外资料均限于研究由疟原虫产生的肿瘤坏死因子对疟原虫的毒性及发育过程的作用，未见一般疟原虫引起的肿瘤坏死因子与导致血小板减少的疟原虫引起的肿瘤坏死因子对各种肿瘤作用情况的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有抗肿瘤作用的疟疾血清及其制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：具有抗肿瘤作用的疟疾血清，来自于疟疾病人的血清。
疟疾病人为疟疾合并血小板减少的患者。
疟疾为间日疟或恶性疟。
上述具有抗肿瘤作用的疟疾血清的制备方法，获取疟疾病人全血后，经离心分离得到血清。
上述具有抗肿瘤作用的疟疾血清制成的血清制剂。
该制剂中血清的浓度为0-16％
上述疟疾血清或血清制剂在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
上述肿瘤为肝癌、胃癌。
针对由疟原虫感染所引起的肿瘤坏死因子对各种肿瘤细胞作用方面研究存在的空白，发明人进行了深入的探索，经长期艰苦的科学实验发现，疟疾病人的血清具有一定的抗肿瘤作用，特别是来自疟疾合并血小板减少的患者的血清，在特定的浓度条件下，其对治疗或预防肿瘤尤其是肝癌效果明显。实验证实，该血清对体外培养的肝癌细胞株(7721)具有明显诱导细胞凋亡作用，并且随血清浓度增大诱导肝癌细胞凋亡比率增加。据此，发明人推测疟原虫感染机体后，在人体内发育过程中产生了能在体外诱导肿瘤细胞早期凋亡(细胞程序性死亡)的生物活性因子，该因子有别于肿瘤坏死因子，它不仅对人类机体的白细胞和血小板具有抑制作用，而且具有明显诱导细胞凋亡作用。因为研究表明，只有在疟疾病人合并血小板减少的情况下的血清才表现诱导肿瘤细胞凋亡现象，且病人血小板越低诱导肿瘤细胞凋亡比率越高。本发明为进一步研究由疟原虫产生的诱导肿瘤细胞凋亡因子提供了理论和实验依据，也为重新认识疟疾危重和脑型疟病例的发病机理及各种疟原虫种株流行病学研究开辟了新的思路，同时在利用疟疾血清或血清制剂在制备治疗或预防肿瘤的药物中方面进行了新的尝试，极具科学研究价值和意义。
附图说明
图1是正常人血清诱导7721肝癌细胞早期凋亡结果图，图中：血清浓度从左至右再从上到下依次为0％、4％、8％、12％、16％、20％。
图2是疟疾合并血小板减少的同一患者的血清浓度诱导7721肝癌细胞早期凋亡结果图，图中：血清浓度从左至右再从上到下依次为0％、4％、8％、12％、16％。
图3是疟疾合并血小板减少的不同患者的血清浓度诱导7721肝癌细胞早期凋亡结果图，图中：血清浓度依次为8％、16％。
图4是疟疾合并血小板正常的同一患者的血清浓度诱导7721肝癌细胞早期凋亡结果图，图中：血清浓度从左至右再从上到下依次为0％、4％、8％、12％、16％。
图5是用TUNEL法检测疟疾合并血小板减少患者的血清诱导7721肝细胞癌凋亡结果图，图中：箭头所示放大倍数200X。
图6是疟疾合并血小板减少患者的血清诱导7901胃癌细胞早期凋亡结果图，图中：血清浓度从左至右依次为0％、4％、8％、12％。
图7是疟疾合并血小板减少患者血清诱导白血病Jurkat细胞早期凋亡结果图，图中：血清浓度从左至右再从上到下依次为0％、4％、8％、12％、16％。
具体实施方式
实施例1疟疾患者血清诱导7721肝癌细胞早期凋亡实验
1.实验材料
1.1材料
1.1.1疟疾病人血清的采集：抽取临床住院现症疟疾病人(包括不同种类的疟原虫感染者)并伴有病人血常规检查血小板减少的全血。
1.1.2疟疾病人血清的分离及储藏：获取疟疾病人全血后，在短时间内离心将血清分类分装后置低温保存备用。
1.1.3实验前疟疾病人血清准备：实验前将低温保存的疟疾病人血清取出后置室温中回温后用于实验。
1.2.1细胞株：7721肝癌细胞由上海细胞所提供。
1.2.2试剂：1640培养液：改良型的1640培养液由赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司(Thermo)提供；胎牛血清：由新西兰进口赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司(Thermo)提供并在本实验室灭活分装；流式检测细胞凋亡试剂盒由ebioscience提供；TUNEL凋亡试剂盒由Roche试剂公司提供；胰蛋白酶由南宁市浩泰生物技术有限公司提供。
1.2.3器材：CO2培养箱(日本HERAEUS)；荧光倒置显微镜(日本NIKON)；流式细胞仪(美国BeckmanCoulter公司EpicsXL，获取及Mfa32软件分析)
2实验方法
2.1细胞培养：将7721肝癌细胞复苏放入含有10％的胎牛血清改良型1640培养液培养(温度为37℃，含5％CO2)48小时，等到细胞长势良好(90％)以上的细胞是贴壁生长，没有污染的情况下才0.25％胰蛋白酶进行消化分入6孔板再培养48小时，等细胞长满整个底部(80％以上的细胞是贴壁生长)，用PBS洗两次，再按下表加入相应的试剂。
表1细胞培养各血清浓度所需加入血清情况
2.2收集所有的悬浮细胞分别倒入标有8％，16％的离心管(10ml)，离心2000r/2min，弃去上清液，用PBS洗2次，再离心2000r/2min，弃清液，重悬，离心2000r/2min，再重悬，细胞计数(1X106)/ml，按表2加入相应试剂，避光、放入冰浴在1h内上FACSCalibur进行流式细胞术阻断24小时定量检测。
表2流式细胞仪检测细胞的凋亡结果
2.3TUNEL法检测细胞凋亡实验：配制0.1M柠檬酸盐缓冲液(PH＝6)：21.01g柠檬酸钠+1000mL蒸馏水。0.1MTris-HCL(PH＝7.5)：12.1gTris+100mL蒸馏水。封闭液：0.1MTris-HCL8mL+胎牛血清2mL+BSA0.3g。TUNEL反应液：Enzymesolution20μL+Lablesolution180μL。将孔板的培养基吸出，PBS洗涤三次，浸入4℃丙酮1ml避光固定10min。PBS洗涤，每次1min，洗涤3次。在孔板内滴加配制好的封闭液，每个组织区域滴加200μL，室温孵育30min。PBS洗涤3次，每次1min。每个孔滴加200μL的TUNEL反应液，37℃孵育60min。PBS洗涤3次，每次5min。用0.5μg/mL的DAPI溶液室温染核30min。甩掉液体，滴加抗荧光淬灭封片剂封片。并在荧光显微镜下观察并拍照，蓝色荧光为细胞核，绿色荧光为凋亡细胞的阳性信号。
3实验结果
3.1流式细胞仪定量检测疟疾患者血清诱导7721肝癌细胞早期凋亡实验结果示：正常人血清不能诱导7721肝癌细胞早期凋亡，如图1所示；同一疟疾患者合并血小板减少的血清能诱导7721肝癌细胞早期凋亡，并随血清浓度增加凋亡越明显，如图2所示；不同疟疾患者合并血小板减少血清能诱导7721肝癌细胞早期凋亡，如图3所示，疟疾患者感染疟原虫及血小板情况如表3所示(正常人血小板参考值为(100-300)X109)；不同疟疾患者合并血小板正常血清不能诱导7721肝癌细胞早期凋亡，如图4所示。
表3不同种类疟疾合并血小板减少病例及不同血清浓度细胞凋亡比率信息
3.2TUNEL法检测疟疾合并血小板减少患者血清诱导7721肝细胞癌凋亡结果，如图5所示。
实施例2疟疾患者血清诱导7901胃癌细胞早期凋亡实验
1.实验材料
1.1材料
1.1.1疟疾病人血清的采集：抽取临床住院现症疟疾病人(包括不同种类的疟原虫感染者)并伴有病人血常规检查血小板减少的全血。
1.1.2疟疾病人血清的分离及储藏：获取疟疾病人全血后，在短时间内离心将血清分类分装后置低温保存备用。
1.1.3实验前疟疾病人血清准备：实验前将低温保存的疟疾病人血清取出后置室温中回温后用于实验。
1.2.1细胞株：7901胃癌细胞由上海细胞所提供。
1.2.2试剂：1640培养液：改良型的1640培养液由赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司(Thermo)提供；胎牛血清：由新西兰进口赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司(Thermo)提供并在本实验室灭活分装；流式检测细胞凋亡试剂盒由ebioscience提供；胰蛋白酶由南宁市浩泰生物技术有限公司提供。
1.2.3器材：CO2培养箱(日本HERAEUS)；倒置显微镜(日本NIKON)；流式细胞仪(美国BeckmanCoulter公司EpicsXL，获取及Mfa32软件分析)
2实验方法
2.1细胞培养：将7901胃癌细胞复苏放入含有10％的胎牛血清改良型1640培养液培养(温度为37℃，含5％CO2)48小时，等到细胞长势良好(90％)以上的细胞是贴壁生长，没有污染的情况下才0.25％胰蛋白酶进行消化分入6孔板再培养48小时，等细胞长满整个底部(80％以上的细胞是贴壁生长)，用PBS洗两次，再按下表加入相应的试剂。
表4细胞培养各血清浓度所需加入血清情况
2.2收集所有的悬浮细胞分别倒入标有0％，4％，8％，12％的离心管(10m1)，离心2000r/2min，弃去上清液，用PBS洗2次，再离心2000r/2min，弃清液，重悬，离心2000r/2min，再重悬，细胞计数(1X106)/ml，按下表加入相应试剂，避光、放入冰浴在1h内上FACSCalibur进行流式细胞术阻断48小时定量检测。
表5流式细胞仪检测细胞的凋亡结果
3实验结果
3.1流式细胞仪定量检测疟疾患者血清不能诱导7901胃癌细胞早期凋亡，如图6所示。
实施例3疟疾患者血清诱导Jurkat细胞(白血病细胞)早期凋亡实验
1.实验材料
1.1材料
1.1.1疟疾病人血清的采集：抽取临床住院现症疟疾病人(包括不同种类的疟原虫感染者)并伴有病人血常规检查血小板减少的全血。
1.1.2疟疾病人血清的分离及储藏：获取疟疾病人全血后，在短时间内离心将血清分类分装后置低温保存备用。
1.1.3实验前疟疾病人血清准备：实验前将低温保存的疟疾病人血清取出后置室温中回温后用于实验。
1.2.1细胞株：Jurkat细胞(白血病细胞)由上海细胞所提供。
1.2.2试剂：1640培养液：改良型的1640培养液由赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司(Thermo)提供；胎牛血清：由新西兰进口赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司(Thermo)提供并在本实验室灭活分装；流式检测细胞凋亡试剂盒由ebioscience提供；胰蛋白酶由南宁市浩泰生物技术有限公司提供。
1.2.3器材：CO2培养箱(日本HERAEUS)；倒置显微镜(日本NIKON)；流式细胞仪(美国BeckmanCoulter公司EpicsXL，获取及Mfa32软件分析)
2实验方法
2.1细胞培养：将Jurkat细胞复苏放入含有10％的胎牛血清改良型1640培养液培养(温度为37℃，含5％CO2)48小时，等到细胞长势良好(90％)，没有污染的情况下才0.25％胰蛋白酶进行消化分入6孔板再培养48小时，等细胞长满整个底部(80％以上的细胞是贴壁生长)，用PBS洗两次，再按下表加入相应的试剂。
表6细胞培养各血清浓度所需加入血清情况
2.2收集所有的悬浮细胞分别倒入标有0％，4％，8％，12％，16％的离心管(10ml)，离心2000r/2min，弃去上清液，用PBS洗2次，再离心2000r/2min，弃清液，重悬，离心2000r/2min，再重悬，细胞计数(1X106)/ml，按下表加入相应试剂，避光、放入冰浴在1h内上FACSCalibur进行流式细胞术阻断24小时定量检测。
表7流式细胞仪检测细胞的凋亡结果
3实验结果
3.1流式细胞仪定量检测疟疾患者血清不能诱导Jurkat细胞早期凋亡，如图7所示。

Claims (8)

1.一种具有抗肿瘤作用的疟疾血清，其特征在于来自于疟疾病人的血清。
2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的疟疾血清，其特征在于：所述疟疾病人为疟疾合并血小板减少的患者。
3.根据权利要求2所述的具有抗肿瘤作用的疟疾血清，其特征在于：所述疟疾为间日疟或恶性疟。
4.权利要求1所述具有抗肿瘤作用的疟疾血清的制备方法，其特征在于获取疟疾病人全血后，经离心分离得到血清。
5.权利要求2所述具有抗肿瘤作用的疟疾血清制成的血清制剂。
6.根据权利要求5所述的血清制剂，其特征在于该制剂中血清的浓度为0-16％。
7.权利要求2所述疟疾血清或权利要求5所述血清制剂在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为肝癌、胃癌。
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