CN105734046B - 无细胞表达***制备Armored RNA的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种无细胞表达***制备Armored RNA的方法，属于基因工程领域。本发明采用无细胞表达***，首先将线性化的Armored RNA重组质粒DNA转录成mRNA，去除mRNA中的外源DNA，以mRNA为底物，使用无细胞表达***表达Armored RNA。表达产物经PCR和RT‑PCR检测，显示Armored RNA溶液中以及蛋白包膜内，都没有外源DNA的污染，PCR检测结果都为阴性；蛋白包膜包裹有外源RNA，可以使用RT‑PCR方法检测到。本发明方法可有效表达Armored RNA，且表达产物无外源DNA污染，可用于制备RNA阳性参考物质以及对RNA纯度要求较高的实验。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地，涉及一种无细胞表达***制备Armored RNA的方法。
背景技术
Armored RNA，国内通常翻译成假病毒，是一种保护目的RNA的蛋白颗粒。其制备原理是：使用分子生物学技术，将噬菌体MS2的成熟蛋白基因、衣壳蛋白基因和衣壳蛋白基因下游影响噬菌体包装的19bp发夹结构克隆到表达载体上，并在其下游处***外源DNA。该载体在表达过程中能够将***的外源DNA片段转录成RNA，同时合成的衣壳蛋白单体与成熟蛋白及RNA结合(含有19bp的发夹结构)，自发组装成180个衣壳蛋白单体包裹成熟蛋白和RNA的Armored RNA(图1)。Armored RNA颗粒与MS2噬菌体类似，能够耐受核酸酶的降解，具有较好的稳定性，可以有效的保护包裹其中的RNA，且不具复制能力和传染能力。目前，ArmoredRNA越来越多地应用于RNA阳性参考物质的制备、RNA样品的保存等领域。
Armored RNA的制备技术，分为重组质粒制备、Armored RNA蛋白表达和ArmoredRNA提纯3步骤。重组质粒制备基本都通过先酶切再连接的方法，将目的DNA连接入表达载体中；Armored RNA蛋白表达，目前普遍采用原核表达法，即将Armored RNA的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌中，IPTG诱导表达Armored RNA；提纯方法可分为离心法和亲和层析法，离心法是将表达产物经超声波破碎后，再使用差速梯度离心法或蔗糖/氯化铯梯度离心法去除杂质，从而达到提纯Armored RNA的目的；亲和层析法是表达载体具有6×His基因，因此表达的Armored RNA外膜带白带有6×His标签，可使用Ni柱进行亲和层析纯化。
目前普遍采用的原核表达Armored RNA的方法，表达产物中含有大量外源DNA。这些外源DNA可能包裹在蛋白包膜中，因此无法用酶水解法、离心法和亲和层析法完全去除。外源DNA会对RNA实验进行干扰，影响实验结果的可靠性。例如：检测RNA病毒时，以包裹病毒RNA的Armored RNA为阳性对照，若提纯的RNA中混有病毒外源DNA，则不需经过反转录步骤，直接PCR扩增就能扩增出目的基因，而真正的病毒RNAPCR结果反而是阴性，这样以来Armored RNA失去的作为参考RNA的意义；某些RNA实验，需要RNA样品非常纯，外源DNA会干扰RNA的定量，造成实验结果出现偏差。因此迫切需要一种没有外源DNA污染的Armored RNA用于制备RNA阳性参考物质以及满足对RNA纯度要求较高的病原检测的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无细胞表达***制备Armored RNA的方法，以克服现有技术的不足。
本发明提供的无细胞表达***制备Armored RNA的方法，包括以下步骤：。
(1)将线性化的Armored RNA重组质粒DNA体外转录成mRNA；
(2)去除mRNA中的外源DNA；
(3)以mRNA为底物，使用无细胞表达***表达Armored RNA。
本发明方法中，步骤(1)中线性化的Armored RNA重组质粒DNA是使用限制性内切酶将Armored RNA重组质粒切为线性DNA，并确保线性化酶切产物启动子—MS2基因—病毒基因的完整和连贯。
所述限制性内切酶满足以下条件：
(a)为Armored RNA重组质粒自带的酶切位点；
(b)外源基因和启动子基因序列不能有该酶的酶切位点；
(c)酶切位点不能在启动子与外源基因之间，以及各段外源基因之间。
本发明方法中个，步骤(1)的体外转录成mRNA之前还包括对线性化重组质粒进行鉴定。
具体地，线性化重组质粒鉴定方法为：
1)将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。若电泳结果只有1条DNA条带，则凝胶回收；若电泳结果有多条DNA条带，则说明酶切位点不止1个，必须重新选择酶切位点。
2)以回收的酶切产物为模板，使用检测引物进行PCR检测。若能扩增出目的基因，则说明线性化重组质粒中的外源基因完整，可继续实验；若无目的基因，则说明质粒中的外源基因已被破坏，需重新选择酶切位点进行线性化。
本发明方法的步骤1)中将线性化的Armored RNA重组质粒DNA体外转录成mRNA，其100μL转录体系为：15mM的5×Buffer 20μL，25mM的rNTP 30μL，线性化重组质粒DNA 2μg，转录酶10μL，dH2O加至总体积100μL；转录条件为37℃，3-6h。优选地，转录条件为37℃，4h。
本发明上述方法中，步骤(2)的去除mRNA中的外源DNA的方法为：按照与转录体系的体积比1:10-1：20加入无RNA酶的DNase I，37℃0.5h-1h。
优选地，按照与转录体系的体积比1:10加入无RNA酶的DNase I，37℃0.5h。
也可以使用商品化的体外转录试剂盒进行mRNA的转录。需要注意的是体外转录试剂盒分为针对T7启动子的试剂盒和针对SP6启动子的试剂盒，需根据所使用的假病毒特征选择相应的试剂盒。
在上述方法的步骤(2)和(3)之间，还包括提取转录产物中的mRNA，分别对其进行PCR和RT-PCR检测，根据上述两个检测方法的结果判断是否去除外源DNA。
具体地，是使用Trizol或商业化RNA提取试剂盒提取转录产物中的mRNA。以提纯的RNA溶液为模板，使用检测引物，分别进行PCR和RT-PCR检测，检测外源DNA是否去除干净，mRNA是否能扩增出目的基因。
若PCR检测结果为阴性，表明溶液中无外源DNA；若为阳性，则必须重新消化DNA。
若RT-PCR检测结果为阳性，说明溶液中含有外源DNA转录生成的mRNA；若为阴性，则必须重新提取RNA，或重新转录mRNA。
只有当PCR检测结果为阴性，RT-PCR检测结果为阳性时，说明溶液中只有外源DNA转录生成的mRNA，无外源DNA，此时才能进入步骤(3)，以mRNA为底物，使用无细胞表达***表达Armored RNA。
使用无细胞表达***表达Armored RNA。
表达体系：
反应条件：30℃90min。反应产物4℃保存。
也可以使用商品化无细胞表达试剂盒进行假病毒的表达。
本发明提供的上述方法中，还包括步骤(4)提纯Armored RNA。
若表达的Armored RNA外膜蛋白带有6×His标签，可以使用Ni-NTA亲和层析柱纯化Armored RNA，Ni-NTA亲和层析柱可使用商品化预装柱。
若表达的Armored RNA外膜蛋白无6×His标签，可以使用差速梯度离心法或蔗糖/氯化铯梯度离心法提纯Armored RNA。
本发明还提供了上述无细胞表达***表达Armored RNA的方法在制备RNA阳性参考物质中的应用。
本发明的无细胞表达***表达Armored RNA方法获得的表达产物经PCR和RT-PCR检测，显示Armored RNA溶液中以及蛋白包膜内，都没有外源DNA的污染，PCR检测结果都为阴性；蛋白包膜包裹有外源RNA，可以使用RT-PCR方法检测到。本发明方法可有效表达Armored RNA，溶液中和蛋白包膜内都不含有外源DNA，克服了原核表达***表达的ArmoredRNA含有外源DNA的缺陷，可用于制备RNA阳性参考物质以及对RNA纯度要求较高的病原检测。
附图说明
图1为Armored RNA表达过程示意图。
图2为pAR-IHNV mRNA质量的检测，M：DNA Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1：pAR-IHNV mRNA。
图3为Armored RNA-IHNV溶液的检测，M：DNA Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1、2：Armored RNA-IHNV溶液。
图4为Armored RNA-IHNV RNA的检测，M：DNA Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1、2：Armored RNA-IHNV RNA。
图5为Armored RNA-IHNV核酸酶耐受性检测，M：DNA Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1：未经核酸酶处理的Armored RNA-IHNV；2：核酸酶处理的Armored RNA-IHNV。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
使用无细胞表达***制备包含有1段传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)RNA片段的Armored RNA。使用表达载体pET-32a改造，多克隆位点中***了噬菌体MS2的成熟蛋白基因、衣壳蛋白基因、6×His基因和衣壳蛋白基因下游影响噬菌体包装的19bp发夹结构，并在下游处***1段IHNV的693bp的外源cDNA片段。该重组质粒命名为pAR-IHNV。
1、pAR-IHNV的线性化。
使用限制性内切酶Mlu I将pAR-IHNV切为线性DNA。
酶切体系：总体积50ul。
| 试剂 | 加入量(μL) |
| pAR-IHNV | 10 |
| Mlu I | 2 |
| Buffer | 5 |
| BSA | 0.5 |
| ddH<sub>2</sub>O | 32.5 |
反应温度：37℃，4h。
2、线性化重组质粒的鉴定。
经凝胶电泳和PCR检测，质粒线性化完全，线性化重组质粒中的外源DNA完整，可继续实验。
3、pAR-IHNV mRNA的体外转录。
转录体系：
| 试剂 | 体积(μL) |
| 5×Buffer(15mM) | 20 |
| rNTP(25mM each) | 30 |
| 线性化pAR-IHNV | 2ug |
| 转录酶 | 10 |
| dH<sub>2</sub>O | 加至总体积100μL |
将各成分吸入PCR管内，使用PCR仪进行转录，条件：37℃4h。
4、转录产物中外源DNA的去除。
在100uL转录体系内加入10uL DNase I(RNase free)，37℃0.5h。去除转录产物中的外源DNA。
5、使用Trizol提取转录产物中的mRNA，提取步骤按照Trizol使用说明书进行。
6、pAR-IHNV mRNA质量的检测。
提纯的mRNA溶液为模板，使用世界动物卫生组织(OIE)水生动物疾病诊断手册(2014)推荐的IHNV检测引物，分别进行PCR和RT-PCR检测，检测外源DNA是否去除干净，mRNA是否能扩增出目的基因目的基因长度693bp。
PCR体系：
| 试剂 | 体积(μL) |
| 10×PCR Buffer(15mM) | 5 |
| dNTP(2.5mM each) | 5 |
| Tag polymerase(5U) | 1 |
| 上游引物(10pmol/ul) | 3.5 |
| 下游引物(10pmol/ul) | 3.5 |
| DNA模版 | 10 |
| ddH<sub>2</sub>O | 22 |
| 总体积 | 50 |
PCR反应条件：95℃2min；30个循环:95℃30s；50℃30s；72℃60s；72℃7min。
RT-PCR体系：
| 试剂 | 体积(μL) |
| 10×One Step RNA PCR Buffer | 5 |
| dNTP(10mM) | 5 |
| MgCL2(25mM) | 10 |
| Rnase Inhibitor | 1 |
| AMV-Optimized Tag | 1 |
| AMV Rtase XL | 1 |
| 上游引物(10pmol/ul) | 2 |
| 下游引物(10pmol/ul) | 2 |
| RNA模版 | 10 |
| 无RNA酶的ddH<sub>2</sub>O | 13 |
| total | 50 |
RT-PCR反应条件：50℃30min；95℃2min；30个循环:95℃30s,50℃30s,72℃60s；72℃7min。
扩增产物电泳结果显示(图2)，PCR检测结果为阴性，表明溶液中无外源DNA；RT-PCR检测结果可以在700bp左右看到明显的目的DNA条带，与阳性对照相同，因此为阳性，说明溶液中含有外源DNA转录生成的mRNA，可以继续实验。
7、Armored RNA-IHNV的表达：
以pAR-IHNV mRNA为底物，使用无细胞表达***表达Armored RNA-IHNV。
表达体系：
| 试剂 | 体积(μL) |
| 兔红细胞溶解产物 | 70 |
| 氨基酸混合物(亮氨酸),1mM | 1 |
| 氨基酸混合物(蛋氨酸),1mM | 1 |
| RNA酶抑制剂 | 2 |
| pAR-IHNV mRNA | 4ug |
| DEPC处理过的水 | 加至总体积100μL |
反应条件：30℃90min。
反应产物4℃保存。
8、Armored RNA-IHNV的提纯：
表达的Armored RNA-IHNV外膜蛋白带有6×His标签，使用qiagen Ni-NTA快速纯化试剂盒提纯Armored RNA-IHNV。
9、Armored RNA-IHNV真实性检测
(1)使用Trizol提纯Armored RNA-IHNV的RNA。
(2)使用IHNV检测引物，分别以Armored RNA-IHNV溶液为模板，进行PCR和RT-PCR检测，检测溶液中是否有外源DNA和RNA。反应体系和条件见步骤6。电泳结果显示(图3)，PCR和RT-PCR结果都为阴性，表明溶液中无外源DNA污染，也没有游离的外源RNA。
(3)使用IHNV检测引物，分别以提取的Armored RNA-IHNV RNA为模板，进行PCR和RT-PCR检测，检测RNA中是否有外源DNA和RNA。反应体系和条件见步骤6。电泳结果显示(图4)，PCR结果为阴性，表明Armored RNA包膜中也没有外源DNA污染；RT-PCR结果为阳性，表明Armored RNA包膜中包裹有IHNV病毒的RNA。
(4)核酸酶耐受性检测。4ml假病毒溶液(约含病毒RNA 12ug)，加入10ul(100U，可处理100ug RNA)Benzonase Nuclease(qiagen)核酸酶，孵育1h。取200ul假病毒溶液提取RNA，进行RT-PCR检测。电泳结果显示为阳性(图5)，说明IHNV RNA包裹于Armored RNA包膜中，可有效抵抗核酸酶的水解。
综上所述，使用无细胞表达***制备得Armored RNA-IHNV，无外源DNA污染，具备较高的核酸耐受性，是真实的Armored RNA。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.无细胞表达***制备Armored RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将线性化的Armored RNA重组质粒DNA体外转录成mRNA；
(2)去除mRNA中的外源DNA；
(3)以mRNA为底物，使用无细胞表达***表达Armored RNA；
其中，步骤(1)中线性化的Armored RNA重组质粒DNA是使用限制性内切酶将ArmoredRNA重组质粒切为线性DNA，并确保线性化酶切产物中启动子—MS2基因—病毒基因的完整和连贯；
步骤(3)所述无细胞表达***表达Armored RNA的表达体系为：
表达体系：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述限制性内切酶满足以下条件：
(a)为Armored RNA重组质粒自带的酶切位点对应的内切酶；
(b)外源基因和启动子基因序列不能有所述限制性内切酶的酶切位点；
(c)酶切位点不能在启动子与外源基因之间，以及各段外源基因之间。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的体外转录成mRNA之前还包括对线性化重组质粒进行鉴定。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)的去除mRNA中的外源DNA的方法为：按照与转录体系的体积比1:10-1：20加入无RNA酶的DNase I，37℃0.5-1h。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，按照与转录体系的体积比1:10加入无RNA酶的DNase I，37℃0.5h。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)和(3)之间，还包括提取转录产物中的mRNA，分别对其进行PCR和RT-PCR检测，根据上述PCR和RT-PCR两个检测方法的结果判断是否去除外源DNA。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤(4)提纯Armored RNA。
8.权利要求1-7任一所述的方法在制备RNA阳性参考物质中的应用。
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