CN108531662B - 一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物及检测方法 - Google Patents
一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108531662B CN108531662B CN201810720390.8A CN201810720390A CN108531662B CN 108531662 B CN108531662 B CN 108531662B CN 201810720390 A CN201810720390 A CN 201810720390A CN 108531662 B CN108531662 B CN 108531662B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- leukemia virus
- mouse leukemia
- reverse
- reverse primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 24
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 title claims abstract description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 5
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 229950010203 nimotuzumab Drugs 0.000 description 2
- 108020004437 Endogenous Retroviruses Proteins 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物及检测方法，特异性引物包括逆向引物5’‑CACTGGAGACCGAGGAATCAT‑3’。检测方法包括如下步骤：根据X‑MuLV病毒基因组序列设计特异性引物，特异性引物包括正向引物5’‑GACAGGACAAACAGCTAACGC‑3’、逆向引物为5’‑CACTGGAGACCGAGGAATCAT‑3’；提取生物制品中的总RNA；根据逆向引物和总RNA进行逆转录；以逆转录产物为模板，以正向引物和逆向引物进行PCR扩增；取扩增产物进行凝胶电泳获得检测结果。本发明能够快速实时检测生物制品中的异嗜性小鼠白血病病毒，耗时约3小时，检测效果明显提高。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物及检测方法。
背景技术
目前重组融合类生物制品一般是以中国仓鼠卵巢细胞（CHO）作为表达载体，CHO细胞内本身可能存在内源性逆转录病毒，如异嗜性小鼠白血病病毒（X-MuLV）。虽然该病毒对人类不具有致病性，但仍有潜在的风险。现国内对于X-MuLV检测的研究报道较少，目前检测X-MuLV的方法主要有病毒感染性试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）和聚合酶链反应法（PCR）等方法。病毒感染性试验存在检测周期长且步骤繁琐等缺陷；ELISA方法容易导致假阴性且成本高；PCR技术由于具有较高的灵敏度和特异性，对工作人员的要求低，费用低，能广泛普及。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种能够快速、灵敏检测生物制品中的X-MuLV的特异性引物。
本发明的另一个目的是提供一种能够快速、灵敏检测生物制品中的X-MuLV的检测方法。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物，所述的特异性引物包括逆向引物，所述的逆向引物为5’-CACTGGAGACCGAGGAATCAT-3’。
优选地，所述的特异性引物还包括正向引物，所述的正向引物为5’-GACAGGACAAACAGCTAACGC-3’。
本发明的另一个目的是提供一种异嗜性小鼠白血病病毒的检测方法，包括如下步骤：
（1）根据X-MuLV病毒基因组序列设计特异性引物，所述的特异性引物包括正向引物和逆向引物，所述的正向引物为5’-GACAGGACAAACAGCTAACGC-3’， 所述的逆向引物为5’-CACTGGAGACCGAGGAATCAT-3’；
（2）提取生物制品中的总RNA；
（3）根据步骤（1）设计逆向引物和步骤（2）提取的总RNA进行逆转录；
（4）以步骤（3）得到的逆转录产物为模板，以步骤（1）设计的正向引物和逆向引物进行PCR扩增；
（5）取步骤（4）得到的扩增产物进行凝胶电泳获得检测结果。
优选地，所述的生物制品为重组融合类生物制品、单克隆抗体或生物组织提取制品。
优选地，步骤（4）中进行所述的PCR扩增的扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃总延伸10min；4℃保存。
优选地，所述的扩增产物的长度为345bp。
优选地，所述的凝胶电泳采用琼脂糖凝胶电泳。
本发明中总RNA的提取、逆转录的进行以及PCR的扩增体系等均采用本领域的常规方法。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优势：
本发明能够快速实时检测生物制品中的异嗜性小鼠白血病病毒，耗时约3小时，而传统的细胞感染试验需耗时5~7天，因此，本发明的检测效果明显提高。
附图说明
附图1为检测结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点，而本发明不受以下实施例的限制。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1
X-MuLV病毒液中检测X-MuLV病毒的检测方法，包括如下步骤：
（1）根据X-MuLV病毒基因组序列设计特异性引物，特异性引物包括正向引物和逆向引物，正向引物为5’-GACAGGACAAACAGCTAACGC-3’（SEQ ID NO.1），逆向引物为5’-CACTGGAGACCGAGGAATCAT-3’ （SEQ ID NO.2）；
（2）提取X-MuLV病毒液中的总RNA；
（3）根据步骤（1）设计逆向引物和步骤（2）提取的总RNA进行逆转录；
（4）以步骤（3）得到的逆转录产物为模板，以步骤（1）设计的正向引物和逆向引物进行PCR扩增；扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃总延伸10min；4℃保存；
（5）取步骤（4）得到的扩增产物进行1%凝胶电泳（120V，30min）获得检测结果，结果见图1。
实施例2
尼妥珠单抗制品中检测X-MuLV病毒的检测方法，包括如下步骤：
（1）根据X-MuLV病毒基因组序列设计特异性引物，特异性引物包括正向引物和逆向引物，正向引物为5’-GACAGGACAAACAGCTAACGC-3’（SEQ ID NO.1），逆向引物为5’-CACTGGAGACCGAGGAATCAT-3’ （SEQ ID NO.2）；
（2）提取尼妥珠单抗制品中的总RNA；
（3）根据步骤（1）设计逆向引物和步骤（2）提取的总RNA进行逆转录；
（4）以步骤（3）得到的逆转录产物为模板，以步骤（1）设计的正向引物和逆向引物进行PCR扩增；扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃总延伸10min；4℃保存；
（5）取步骤（4）得到的扩增产物进行1%凝胶电泳（120V，30min）获得检测结果，结果见图1。
对比例1
MuLV病毒液中检测X-MuLV病毒的检测方法，包括如下步骤：
（1）根据X-MuLV病毒基因组序列设计特异性引物，特异性引物包括正向引物和逆向引物，正向引物为5’-GACAGGACAAACAGCTAACGC-3’（SEQ ID NO.1），逆向引物为5’-CACTGGAGACCGAGGAATCAT-3’ （SEQ ID NO.2）；
（2）提取MuLV病毒液的总RNA；
（3）根据步骤（1）设计逆向引物和步骤（2）提取的总RNA进行逆转录；
（4）以步骤（3）得到的逆转录产物为模板，以步骤（1）设计的正向引物和逆向引物进行PCR扩增；扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃总延伸10min；4℃保存；
（5）取步骤（4）得到的扩增产物进行1%凝胶电泳（120V，30min）获得检测结果，结果见图1。
图1中M代表Marker，1为实施例1的扩增产物的检测结果，2为实施例2的扩增产物的检测结果，3为对比例1的扩增产物的检测结果，N为无模板的阴性对照。从图1可见，实施例1和实施例2在345bp处出现明显的条带，而对比例1无条带出现，由此可见，本发明能够很好的检测生物制品中是否存在X-MuLV病毒。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州良辰生物医药科技有限公司
<120> 一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物及检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 1
gacaggacaa acagctaacg c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
cactggagac cgaggaatca t 21
Claims (6)
1.一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物，其特征在于：所述的特异性引物包括逆向引物，所述的逆向引物为5’-CACTGGAGACCGAGGAATCAT-3’；所述的特异性引物还包括正向引物，所述的正向引物为5’-GACAGGACAAACAGCTAACGC-3’。
2.一种非疾病诊断目的的异嗜性小鼠白血病病毒的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）根据X-MuLV病毒基因组序列设计特异性引物，所述的特异性引物包括正向引物和逆向引物，所述的正向引物为5’-GACAGGACAAACAGCTAACGC-3’， 所述的逆向引物为5’-CACTGGAGACCGAGGAATCAT-3’；
（2）提取生物制品中的总RNA；
（3）根据步骤（1）设计逆向引物和步骤（2）提取的总RNA进行逆转录；
（4）以步骤（3）得到的逆转录产物为模板，以步骤（1）设计的正向引物和逆向引物进行PCR扩增；
（5）取步骤（4）得到的扩增产物进行凝胶电泳获得检测结果。
3.根据权利要求2所述的非疾病诊断目的的异嗜性小鼠白血病病毒的检测方法，其特征在于：所述的生物制品为重组融合类生物制品、单克隆抗体或生物组织提取制品。
4.根据权利要求2所述的非疾病诊断目的的异嗜性小鼠白血病病毒的检测方法，其特征在于：步骤（4）中进行所述的PCR扩增的扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃总延伸10min；4℃保存。
5.根据权利要求2所述的非疾病诊断目的的异嗜性小鼠白血病病毒的检测方法，其特征在于：所述的扩增产物的长度为345bp。
6.根据权利要求2所述的非疾病诊断目的的异嗜性小鼠白血病病毒的检测方法，其特征在于：所述的凝胶电泳采用琼脂糖凝胶电泳。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810720390.8A CN108531662B (zh) | 2018-07-02 | 2018-07-02 | 一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810720390.8A CN108531662B (zh) | 2018-07-02 | 2018-07-02 | 一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物及检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108531662A CN108531662A (zh) | 2018-09-14 |
| CN108531662B true CN108531662B (zh) | 2022-04-08 |
Family
ID=63487931
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810720390.8A Active CN108531662B (zh) | 2018-07-02 | 2018-07-02 | 一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物及检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108531662B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111020060A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-04-17 | 苏州药明检测检验有限责任公司 | 一种利用空斑染色测定异嗜性鼠白血病病毒滴度的方法 |
| CN110923364B (zh) * | 2019-12-25 | 2022-04-19 | 苏州药明检测检验有限责任公司 | 一种利用多重定量pcr技术检测样品中多种病毒的方法 |
| CN112011649B (zh) * | 2020-10-29 | 2021-01-15 | 苏州良辰生物医药科技有限公司 | 一种用于检测异嗜性小鼠白血病病毒的引物探针、试剂盒及应用 |
| CN112011648B (zh) * | 2020-10-29 | 2021-01-15 | 苏州良辰生物医药科技有限公司 | 一种检测生物制品中异嗜性小鼠白血病病毒的方法 |
| CN112359139A (zh) * | 2020-11-06 | 2021-02-12 | 苏州药明检测检验有限责任公司 | 利用组织半数感染法染色测定异嗜性鼠白血病病毒滴度的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102337359A (zh) * | 2011-11-02 | 2012-02-01 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 用于检测小鼠白血病病毒的引物、探针及其方法 |
| CN106399588A (zh) * | 2016-09-19 | 2017-02-15 | 中国农业大学 | 一种用于检测禽白血病病毒j亚群的试剂盒 |
-
2018
- 2018-07-02 CN CN201810720390.8A patent/CN108531662B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102337359A (zh) * | 2011-11-02 | 2012-02-01 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 用于检测小鼠白血病病毒的引物、探针及其方法 |
| CN106399588A (zh) * | 2016-09-19 | 2017-02-15 | 中国农业大学 | 一种用于检测禽白血病病毒j亚群的试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108531662A (zh) | 2018-09-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108531662B (zh) | 一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物及检测方法 | |
| Hudu et al. | Cell culture, technology: enhancing the culture of diagnosing human diseases | |
| CN107988340B (zh) | 一种快速检测绵羊肺炎支原体的pcr扩增引物及其应用 | |
| CN110453014B (zh) | 检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法 | |
| CN102676701A (zh) | 禽肺病毒通用型rt-pcr检测引物及检测方法 | |
| CN101875983B (zh) | 一种快速检测多种甜瓜病毒的方法 | |
| CN110643580B (zh) | 槟榔坏死梭斑病毒及其检测方法 | |
| CN106947834A (zh) | 一种检测六种鸭易感病毒的多重pcr方法 | |
| CN113846185A (zh) | 一种用于新冠病毒e484k/q、k417n/t变异快速检测的引物组合物和试剂盒 | |
| CN108531659A (zh) | 一种快速检测牛流行热病毒的rt-pcr引物及试剂盒 | |
| CN111518954A (zh) | H5和n8亚型禽流感病毒双重纳米pcr检测的引物组、试剂盒及方法 | |
| CN107058630B (zh) | 一种牛副流感3型病毒3种基因型多重rt-pcr检测方法 | |
| CN114032336A (zh) | 一种检测黄瓜花叶病毒的方法及其试剂盒 | |
| CN104946637B (zh) | 一种向日葵黄萎病的两种轮枝病菌的多重dpo‑pcr检测试剂盒及其应用 | |
| JP2019013169A (ja) | ウイルス診断法 | |
| CN110643579B (zh) | 槟榔坏死环斑病毒及其检测方法 | |
| CN108728579B (zh) | 一种采用植物微组织直接rt-pcr检测多种植物病毒的方法 | |
| CN115491431A (zh) | 基于基因编辑技术检测日本乙型脑炎病毒核酸的检测试剂盒及应用 | |
| CN106319080A (zh) | 一种快速鉴别猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、猪鼻支原体的pcr检测试剂盒及其应用 | |
| CN107287315B (zh) | 用于志贺氏菌的检测试剂盒、检测方法及应用 | |
| Ho et al. | Characterization of endogenous Rubus yellow net virus in raspberries | |
| CN106755567B (zh) | 猴srv病毒实时荧光定量pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法 | |
| CN106755317B (zh) | 一种用于检测水稻橙叶病植原体的引物、方法及应用 | |
| Cannella et al. | Genotyping of bovine viral diarrhea viruses (BVDV) isolated from cattle in Sicily | |
| CN113846184B (zh) | 一种快速检测SARS-CoV-2 Delta变异株变异的引物组合物和试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20180914 Assignee: Jiangsu Jinmao Finance Leasing Co.,Ltd. Assignor: LIANGCHEN BIO (SUZHOU) Corp. Contract record no.: X2023320010004 Denomination of invention: A Specific Primer and Detection Method of Heterophilic Mouse Leukemia Virus Granted publication date: 20220408 License type: Exclusive License Record date: 20230106 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A Specific Primer and Detection Method of Heterophilic Mouse Leukemia Virus Effective date of registration: 20230109 Granted publication date: 20220408 Pledgee: Jiangsu Jinmao Finance Leasing Co.,Ltd. Pledgor: LIANGCHEN BIO (SUZHOU) Corp. Registration number: Y2023320010019 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| EC01 | Cancellation of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Jiangsu Jinmao Finance Leasing Co.,Ltd. Assignor: LIANGCHEN BIO (SUZHOU) Corp. Contract record no.: X2023320010004 Date of cancellation: 20240203 |
|
| EC01 | Cancellation of recordation of patent licensing contract | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Granted publication date: 20220408 Pledgee: Jiangsu Jinmao Finance Leasing Co.,Ltd. Pledgor: LIANGCHEN BIO (SUZHOU) Corp. Registration number: Y2023320010019 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |