CN110343785B - 基于PCR-CRISPR-cas13a检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的试剂盒 - Google Patents

基于PCR-CRISPR-cas13a检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN110343785B
CN110343785B CN201910716750.1A CN201910716750A CN110343785B CN 110343785 B CN110343785 B CN 110343785B CN 201910716750 A CN201910716750 A CN 201910716750A CN 110343785 B CN110343785 B CN 110343785B
Authority
CN
China
Prior art keywords
hepatitis
virus
kit
cas13a
closed circular
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910716750.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110343785A (zh
Inventor
任锋
张向颖
李�浩
周育森
田原
金荣华
段钟平
陈德喜
李伟华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Youan Hospital
Original Assignee
Beijing Youan Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Youan Hospital filed Critical Beijing Youan Hospital
Priority to CN201910716750.1A priority Critical patent/CN110343785B/zh
Publication of CN110343785A publication Critical patent/CN110343785A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110343785B publication Critical patent/CN110343785B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了基于PCR‑CRISPR‑cas13a检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的试剂盒。本发明提供了一种用于检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的试剂盒，含有Cas13a蛋白和crRNA，或者二者形成的复合体；所述crRNA包括用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA跨缺口区靶序列的向导序列；所述乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA跨缺口区靶序列如SEQ ID No.4所示。本发明是采用PCR技术联合CRISPR‑Cas13a技术检测HBV cccDNA，以此方法开发的HBV cccDNA新型检测试剂盒，具有特异性强、灵敏度高的特点，有着非常重要的临床应用前景和开发价值。

Description

基于PCR-CRISPR-cas13a检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒检测领域，具体涉及基于PCR-CRISPR-cas13a检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的试剂盒。
背景技术
全球HBV慢性感染者约为2.57亿人，由HBV感染引起的失代偿肝硬化、肝衰竭和肝癌导致约90万人死亡，我国人群整体携带率为6.1％，约占全球的1/3。慢性乙型肝炎难以治愈的关键因素是未能彻底清除的HBV cccDNA，它是病毒复制产生的所有RNA和子代病毒合成的模板，可以在肝细胞核内持续、稳定地存在，且目前现有的抗病毒药均不能清除cccDNA，故HBV cccDNA的存在被认为是HBV感染慢性化及抗HBV治疗停止后肝炎复发最主要原因，解析cccDNA的调控机制被国内外专家公认为是慢乙肝治愈策略中需要优先解决的重要科学问题。因此，HBV cccDNA的检测对深入研究HBV致病机制、评价乙肝患者药物疗效等方面具有重要意义。
HBV cccDNA在患者肝脏中的水平极低，每个肝细胞内只有约5～50个拷贝，对检测技术的灵敏度提出了较高要求。乙肝病毒双链DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)分子与ccc DNA序列的高度同源性，又需要检测技术同时具有高度特异性。目前HBV cccDNA常用检测技术包括：①Southern印迹杂交：该方法定性检测较为准确，但操作繁琐、敏感性较低且不能准确定量，需标本量也较大，故在临床上应用较少。②套式或选择性聚合酶链式反应(PCR)：检测敏感性比较好，但是由于需要多次扩增，并且对PCR产物进行再次扩增，导致假阳性。③实时荧光定量PCR法：该检测方法的特异性比选择性PCR进一步提高，可以消除高rcDNA背景可能产生的非特异性扩增，灵敏度也明显提高，但仍不能完全排除rcDNA非特异性扩增存在。④微滴式数字PCR(ddPCR)方法。ddPCR方法能够检测到血清、单细胞和FFPE肿瘤组织中的cccDNA。与Southern blot及其他方法相比，检测cccDNA的灵敏性提高，但是价格昂贵，不利于广泛推广。
2017年，《Science》报道张峰实验室利用CRISPR-Cas13检测技术结合重组酶聚合酶扩增技术建立了灵敏度达到单碱基的痕量核酸检测技术，且该技术具有检测成本低，检测速度快等优点。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术中的问题，而提出一种HBV cccDNA的新型检测方法，稳定性高，特异性强，灵敏度高，能实现对乙肝的早期检测和药物疗效的有效监测，从而为改善乙肝患者在治疗疗效、用药监测等方面的问题，为乙肝的个体化治疗奠定坚实的基础。
第一方面，本发明要求保护一种用于检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的试剂盒。
本发明所要求保护的用于检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的试剂盒，含有Cas13a蛋白和crRNA，或者二者形成的复合体。
所述crRNA包括用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA跨缺口区靶序列的向导序列；
所述乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA跨缺口区靶序列如SEQ ID No.4所示。
进一步地，所述crRNA的序列具体可如SEQ ID No.1所示。SEQ ID No.1的第1-39位为用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列；第40-67位为靶向HBV cccDNA跨缺口区靶序列的向导序列。
进一步地，所述Cas13a蛋白具体可为LwCas13a蛋白。
进一步地，所述试剂盒中还可含有用于特异性扩增乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的引物对；所述引物对具体可为由SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示两条单链DNA组成的引物对。
进一步地，所述试剂盒中还可含有报告RNA；所述报告RNA为具有信号报告功能的RNA分子，当其中的RNA序列被降解时，能够报告阳性信号并被检测到。
其中，所述阳性信号可为荧光信号。
在本发明的具体实施方式中，所述报告RNA为RNaseAlertTM QC System v2，具体为InvitrogenTM公司产品，货号4479769。
进一步地，所述试剂盒中还可含有如下中的全部或部分：EcoR I酶、不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD酶)、T7转录酶、NTP、RNA酶抑制剂、无RNA酶水、PCR扩增缓冲液、转录及CRISPR-Cas13a检测反应缓冲液。
在本发明的具体实施方式中，所述PCR扩增缓冲液具体为北京博迈德基因技术有限公司产品，货号为MT211-02。
在本发明的具体实施方式中，所述转录及CRISPR-Cas13a检测反应缓冲液具体为10×buffer，配方如下：400mM Tris-HCl，600mM氯化钠，60mM MgCl2。
进一步地，所述试剂盒中还可含有记载有后文第三方面中所述方法的可读性载体。
第二方面，本发明要求保护如下任一物质：
(A1)前文第一方面中所述的crRNA；
(A2)前文第一方面中所述的Cas13a蛋白和crRNA，或者二者形成的复合体。
第三方面，本发明要求保护一种检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的方法。
本发明所要求保护的检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的方法，可包括如下步骤：
(a1)从待测样本中提取的总DNA，经EcoR I酶切后加入不降解质粒的ATP依赖的DNA酶消化非闭合线性DNA(EcoRI酶是将提取的基因组中含有该酶切位点的环状DNA切开为线性DNA，后经PSAD消化去除后续PCR时的干扰，HBVcccDNA中没有EcoRI酶切位点，因此可以保留，该步骤目的是使提取基因组中HBVcccDNA纯度更高，去除非特异性干扰)；
(a2)以步骤(a1)处理后样本为模板，采用由SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，得PCR产物；
(a3)配制含有如下组分的转录和CRISPR-Cas13a检测体系：步骤(a2)所得PCR产物，前文第一方面中所述的Cas13a蛋白、前文第一方面中所述的crRNA、前文第一方面所述的报告RNA、NTP、T7转录酶、RNA酶抑制剂、无RNA酶水、前文第一方面所述的转录及CRISPR-Cas13a检测反应缓冲液；反应；检测阳性信号，根据阳性信号的有无判定所述待测样本中是否含有乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA；和/或根据阳性信号的强弱判定所述待测样本中含有多少乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA。
如果有阳性信号，则判定所述待测样本中含有或者候选含有乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA；如果无阳性信号，则判定所述待测样本中不含有或者候选不含有乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA。
阳性信号越强，表示所述待测样本中含有的乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA含量越高；阳性信号越弱，表示所述待测样本中含有的乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA含量越低。
进一步地，步骤(a2)中，进行所述PCR扩增的反应条件可为：95℃预变性10min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，循环30次；72℃延伸10min。
进一步地，步骤(a3)中，所述反应的条件可为：37℃，每2min检测一次所述阳性信号，共检测30次。
进一步地，所述待测样本可为肝组织、全血或者细胞等。
本发明所提供的检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的方法既可为非疾病诊断治疗方法，也可为疾病诊断治疗方法。其中，所述非疾病诊断治疗方法可如在细胞水平筛选乙肝防治药物时检测用药前后细胞内是否含有以及含有多少乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA。
第四方面，本发明要求保护如下任一应用：
(I)前文第二方面所述物质在制备前文第一方面所述试剂盒中的应用；
(II)前文第一方面所述试剂盒或前文第二方面所述物质在检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA或者制备用于检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的产品中的应用；
(III)前文第一方面所述试剂盒或前文第二方面所述物质或前文第三方面所述方法在研究HBV致病机制或者制备用于研究HBV致病机制的产品中的应用；
(IV)前文第一方面所述试剂盒或前文第二方面所述物质或前文第三方面所述方法在筛选乙肝药物或者制备用于筛选乙肝药物的产品中的应用；
(V)前文第一方面所述试剂盒或前文第二方面所述物质或前文第三方面所述方法在评价乙肝患者药物疗效或者制备用于评价乙肝患者药物疗效的产品中的应用。
本发明以HBV cccDNA的检测为切入点，采用PCR技术联合CRISPR-Cas13a技术检测HBV cccDNA的方法，并以此方法开发了一种HBV cccDNA新型检测试剂盒。本发明试剂盒可同时提高HBV cccDNA检测的特异性和灵敏性，有着非常重要的临床应用前景和开发价值。
附图说明
图1为跨缺口引物示意图。
图2为设计的cccDNA引物进行PCR扩增结果和测序验证结果。泳道1-6均为阳性标本提取基因组后进行HBVcccDNA引物扩增后的产物电泳鉴定，泳道7为阴性对照。
图3为PSAD消化效果验证。泳道1-7为待检测样本提取基因组进行PSAD消化后，采用PCR验证消化效果，如果仅能扩增出HBV表面抗原的基因，并不能扩增出位于染色体上的A1AT基因，说明线性DNA已完全被PSAD消化。
图4为ddPCR扩增图微滴散点图。
图5为HBV cccDNA crRNA序列筛选。
图6为PSAD消化前后引物扩增结果。1和2表示两个阳性标本，以其PSAD消化前和消化后为模板，分别采用HBVcccDNA和HBVrcDNA引物扩增，结果提示PSAD消化后rcDNA扩增产物降低，因此提示PSAD消化线性DNA，引起扩增产物减少，提示PSAD消化效果良好。
图7为CRISPR-cas13a反应体系灵敏度检测。PCR-阴性对照是从PCR步骤开始时设计的阴性对照(PCR扩增时用水做模板)，CRISPR-阴性对照是在转录和CRISPR检测过程中加入的阴性对照(水替代PCR扩增产物)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、基于PCR-CRISPR-cas13a检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA
本发明所提供的基于PCR-CRISPR-cas13a检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)的方法的基本原理是：HBV cccDNA首先通过聚合酶扩增技术扩增特异性选择的DNA片段，随后进行转录转变成单链RNA，再通过CRISPR的crRNA特异性结合目的片段，最后利用Cas13a酶切活性带有荧光信号的报告RNA，通过荧光信号来检测HBV cccDNA。
一、PCR扩增HBV cccDNA特异性DNA片段
1、PCR扩增引物(cccDNA引物)
(1)针对乙型肝炎病毒基因组正链缺口上游的特异性PCR引物F：
5’-GGGGCGCACCTCTCTTTA-3’(SEQ ID No.2)；
其核酸序列长度为18个碱基，与负链互补；
(2)针对乙型肝炎病毒基因组负链缺口下游的特异性PCR引物R，连接T7序列：
5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGGCACAGCTTGGAGGC-3’(SEQ ID No.3，下划线部分为T7序列)；
其核酸序列长度为42个碱基。
上述两种引物扩增片段长度为320个碱基。
本发明所提供的PCR扩增所用的跨缺口引物示意图如图1所示。
2、相关试剂
本研究中基因组提取试剂盒为天根公司产品，DNA纯化回收试剂盒、2×Taq mix(货号MT211-02)和ddH2O为博迈德公司产品。
3、标准品的制备和检测方法
提取高病毒载量HBV感染患者肝脏组织基因组，EcoRI酶切后，经过PSAD消化线性DNA(EcoRI酶是将提取的基因组中含有该酶切位点的环状DNA切开为线性DNA，后经PSAD消化去除后续PCR时的干扰，HBVcccDNA中没有EcoRI酶切位点，因此可以保留，该步骤目的是使提取基因组中HBVcccDNA纯度更高，去除非特异性干扰)，PCR扩增cccDNA基因组，电泳鉴定后并进行测序验证结果如图2所示。由图可见1-6号均为肝组织阳性标本提取基因组后进行HBVcccDNA引物扩增后的产物电泳鉴定，7号为阴性对照(水做模板)。
以PSAD产物为模板，同时扩增位于细胞染色体上的A1AT基因和HBV表面抗原的S基因，分别作为阴性对照和阳性对照，用于检测PSAD酶切效果。其中，扩增A1AT基因采用的引物为5’-TTCCCTGGTCTGAATGTGTG-3’和5’-ACTGTCCCAGGTCAGTGGTG-3’；扩增HBV表面抗原的S基因采用的引物为5’-TCACAATACCGCAGAGTC-3’和5’-ACATCCAGCGATAACCAG-3’。结果如图3所示，图中1-7号为待检测样本提取基因组进行PSAD消化后，采用PCR验证消化效果，如果仅能扩增出HBV表面抗原的基因，并不能扩增出位于染色体上的A1AT基因，说明线性DNA已完全被PSAD消化。
采用微滴式数字PCR对高病毒载量HBV感染患者肝脏组织提取基因组PSAD消化产物进行定量用作标准品。ddPCR扩增图微滴散点图如图4所示。由图可见横坐标代表微滴数，纵坐标代表荧光强度，阴性微滴以灰色显示，阳性微滴以蓝色显示，按泊松分布95％置信度计算出HBVcccDNA浓度。
4、PCR扩增检测
PCR反应体系：2μl DNA模板(标准品)(以水作为模板为该步骤反应的阴性对照组)，10μl 2×Taq mix，上下游cccDNA引物(10μM)各1μl，加水至20μl。
PCR反应条件：95℃预变性10min，95℃30s，60℃30s，72℃30s，循环30次，72℃延伸10min。
PCR结束后可取5μl PCR产物做琼脂糖电泳检测。
二、CRISPR-Cas13a检测
1、crRNA的合成
设计crRNA的引物，crRNA的5’端带有39nt的重复序列，该段序列可与LwCas13a蛋白结合，设计单链的DNA序列作为扩增模板，序列包含重复序列+靶点序列，设计上游引物包含T7序列和20nt的重复序列，下游引物设计为靶序列3’端20nt左右的反向互补序列，序列如下：
T7-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAA-3’；
HBV-F：5’-GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACAACTTTTTCACCTCTGCCTAATC ATCTC-3’；
R：5’-GAGAT GA TTAGG CAG AGGTG-3’；
PCR反应体系：2μl T7-F，2μl HBV-F，2μl R，25μl 2×Taq mix，加水至50μl。
PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30s，60℃30s，72℃15s，循环38次，72℃延伸10min。
胶回收试剂盒回收。使用T7Quick High Yield RNA Synthesis kit转录crRNA。得到的crRNA利用Agencourt RNAClean XP磁珠进行纯化。
最终所得crRNA的序列如：
5’-GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACAACUUUUUCACCUCUGCCUAAUCAUCUC-3’(SEQ ID No.1，第1-39位为用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列；第40-68位为靶向HBVcccDNA跨缺口区靶序列的向导序列)。
SEQ ID No.1所示crRNA对应的HBV cccDNA跨缺口区靶序列具体为SEQ ID No.4。
2、PCR产物转录及CRISPR-Cas13a检测
PCR产物在T7酶的作用下转录为RNA，crRNA携带Cas13蛋白识别靶序列RNA，激活Cas13蛋白，切割报告RNA，释放荧光信号。
相关试剂：Cas13a蛋白为实验室纯化所得(具体操作步骤如下)。报告RNA为为RNaseAlertTM QC System v2，具体为InvitrogenTM公司产品，货号4479769。10×buffer为实验室配制：400mM Tris-HCl，600mM氯化钠，60mM MgCl2。
LwCas13a表达质粒为Addgene公司(ID：90097)产品，将该质粒按说明书转化到DE3Competent cell感受态细胞中，挑取单菌落接种，37℃摇床培养过夜，测序鉴定正确后，加入培养基扩大培养，至OD600＝0.6时，加入终浓度为500μM的异丙基硫代半乳糖苷，18℃培养16h诱导蛋白表达，4℃，5200g离心15min收集菌体，加入裂解液，超声破碎，超声5s，停10s，超声时间1.5h，结束后菌液澄清，将菌液放入离心管中，12000rpm，4℃离心10min，收集上清加入咪唑，使终浓度为10mM，0.22μm滤膜过滤。镍柱平衡后通过裂解的菌液，依次使用100mM、200mM、300mM、500mM咪唑洗脱目的蛋白。将上述所得目的蛋白加入透析袋，封口，放入500mlSUMO缓冲液(30mMTris-HCl，500mM氯化钠，1mM二硫苏糖醇，0.15％NP-40)中，4℃搅拌透析，约1h换液一次，换3次。透析结束后所得蛋白进行SUMO酶切(蛋白1000μg，SUMO酶2μl，酶切缓冲液20μl，索莱宝公司，货号P2070)。酶切产物进行离子柱纯化，离子交换柱平衡后，依次采用200mM、500mM、1M的氯化钠和0.5M的氢氧化钠洗脱，各个洗脱峰留取样品，电泳鉴定后即可获得纯化的Cas13a蛋白。
反应体系：5μl步骤一(PCR反应)所得PCR产物(以水替代PCR产物为该步骤反应的阴性对照组)，1μl Cas13a蛋白，2.5μl NTPmix，0.4μl T7转录酶，1μl RNA酶抑制剂，1μlcrRNA，1.6μl报告RNA，2.5μl 10×buffer，加无RNA酶水至25μl。
反应条件：检测反应条件为37℃，每2min为一个循环，读取荧光值，循环30次。
对比例：实验过程中共设计得到三条HBV cccDNA crRNA，具体如下：
crRNA1：5’-GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUCACCUCUGCCUAAUCAUCUCUUUGUUCA-3’；
crRNA2：5’-GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACAACUUUUUCACCUCUGCCUAAUCAUCUC-3’(SEQ ID No.1)；
crRNA3：5’-GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUUUUCACCUCUGCCUAAUCAUCUCUUGU-3’。
按照步骤2进行操作。结果如图5所示。由图可见，由于阴性对照组中未加crRNA，体系中的荧光信号保持在447830±34102范围内基本不变，crRNA-1的荧光信号保持在467694±6712，与阴性对照差异不大，crRNA-3的荧光信号由497296a.u.上升至674538a.u.，为阴性对照的1.5倍，crRNA-2的荧光信号由484515a.u.上升至1253694a.u.，为阴性对照的2.8倍。结果表明：crRNA-2的检测组在识别目标核酸后显示出较强的荧光信号，且从反应开始后，其荧光信号始终最强，最终确定选用crRNA2(SEQ ID No.1)作为本发明检测HBV cccDNA的crRNA。
实施例2、本发明方法的灵敏度、特异性和稳定性实验
一、特异性验证
采用经过鉴定的HBV cccDNA阳性标本作为模板扩增，PSAD酶消化前后的样本分别用cccDNA引物和rcDNA引物(引物在HBV基因组上分布示意图如图1)扩增。
其中，cccDNA引物即为实施例1步骤一中SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示引物。rcDNA引物为5’-GTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTC-3’和5’-GGAGGGATACATAGAGGTTCCTTGA-3’。
结果提示，PSAD酶消化前后，HBV cccDNA的量基本无变化，而HBV rcDNA的量在PSAD后明显减弱(图6)，说明本发明设计的cccDNA引物具有很好的特异性。
二、灵敏度检测
经过鉴定的HBVcccDNA阳性克隆采用ddPCR定量后为标准品(即步骤一制备的标准品)，104copy/μl梯度稀释至1copy/μl，阴性对照为水(PCR-阴性对照)，作为模板采用本发明方法(参照实施例1进行)进行检测，PCR扩增后即进行琼脂糖电泳鉴定，结果提示在模板中含有100copy/μl时，PCR扩增后电泳条带显示阴性。所有PCR产物，采用本发明方法(参照实施例1进行)CRISPR-Cas13a检测后显示，在1copy/μl时，检测20min时，即可与阴性对照的荧光值发生显著差异，提示本发明方法的灵敏度良好，可低至1copy/μl(图7)。
三、稳定性实验
采用本发明方法，以梯度稀释的标准品(即步骤一制备的标准品)为样本，每个样本分别进行6次重复实验(参照实施例1进行)，组间组内无显著性差异(p<0.05)。对临床来源的6份样本进行4次重复检测(参照实施例1进行)，组间组内无显著性差异(p<0.05)，表明本发明方法稳定性及可重复性较好。
<110> 首都医科大学附属北京佑安医院
<120> 基于PCR-CRISPR-cas13a检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的试剂盒
<130> GNCLN191631
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca acuuuuucac cucugccuaa 60
ucaucuc 67
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
ggggcgcacc tctcttta 18
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
aattctaata cgactcacta tagggaggca cagcttggag gc 42
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
aactttttca cctctgccta atcatctc 28

Claims (11)

1.一种用于检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的试剂盒，含有Cas13a蛋白和crRNA，或者所述Cas13a蛋白和所述crRNA形成的复合体；
所述crRNA包括用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA跨缺口区靶序列的向导序列；
所述乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA跨缺口区靶序列如SEQ ID No.4所示；
所述crRNA的序列如SEQ ID No.1所示；
所述试剂盒中还含有用于特异性扩增乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的引物对；所述引物对由SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示两条单链DNA组成；
所述试剂盒中还含有如下：T7转录酶、NTP、RNA酶抑制剂、无RNA酶水、EcoR I酶、不降解质粒的ATP依赖的DNA酶、报告RNA、转录及CRISPR-Cas13a检测反应缓冲液；所述转录及CRISPR-Cas13a检测反应缓冲液为 10×buffer，组成如下：400 mM Tris-HCl，600 mM氯化钠，60 mM MgCl2。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述Cas13a蛋白为LwCas13a蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述报告RNA为具有信号报告功能的RNA分子，当其中的RNA序列被降解时，能够报告阳性信号并被检测到。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性信号为荧光信号。
5.一种检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的非疾病诊断方法，包括如下步骤：
（a1）从待测样本中提取的总DNA，经EcoR I酶切后加入不降解质粒的ATP依赖的DNA酶消化非闭合线性DNA；
（a2）以步骤（a1）处理后样本为模板，采用由SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，得PCR产物；
（a3）配制转录和CRISPR-Cas13a检测体系：步骤（a2）所得PCR产物，权利要求1中所述Cas13a蛋白、权利要求1中所述crRNA、权利要求1中所述报告RNA、权利要求1中所述T7转录酶、所述NTP、所述RNA酶抑制剂、所述无RNA酶水、所述转录及CRISPR-Cas13a检测反应缓冲液；反应；检测阳性信号，根据阳性信号的有无判定所述待测样本中是否含有乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA；和/或根据阳性信号的强弱判定所述待测样本中含有多少乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（a2）中，进行所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性10min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，循环30次；72℃延伸10min。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（a3）中，所述反应的条件为：37℃，每2min检测一次所述阳性信号，共检测30次。
8.权利要求1-4中任一所述试剂盒在制备用于检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的产品中的应用。
9.权利要求1-4中任一所述试剂盒在制备用于研究HBV致病机制的产品中的应用。
10.权利要求1-4中任一所述试剂盒在制备用于筛选乙肝药物的产品中的应用。
11.权利要求1-4中任一所述试剂盒在制备用于评价乙肝患者药物疗效的产品中的应用。
CN201910716750.1A 2019-08-05 2019-08-05 基于PCR-CRISPR-cas13a检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的试剂盒 Active CN110343785B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910716750.1A CN110343785B (zh) 2019-08-05 2019-08-05 基于PCR-CRISPR-cas13a检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910716750.1A CN110343785B (zh) 2019-08-05 2019-08-05 基于PCR-CRISPR-cas13a检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110343785A CN110343785A (zh) 2019-10-18
CN110343785B true CN110343785B (zh) 2023-05-02

Family

ID=68183971

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910716750.1A Active CN110343785B (zh) 2019-08-05 2019-08-05 基于PCR-CRISPR-cas13a检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110343785B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111197098B (zh) * 2020-02-20 2023-08-22 首都医科大学附属北京胸科医院 一种从痰液中检测结核分枝杆菌的方法
CN113493855B (zh) * 2020-03-19 2023-12-26 首都医科大学附属北京佑安医院 一种基于RAA-CRISPR-cas13a检测HBV cccDNA的试剂盒
CN112359146A (zh) * 2020-11-30 2021-02-12 浙江大学 一种用于快速检测乙型肝炎病毒基因的试剂盒及其检测方法
CN114959108A (zh) * 2021-02-23 2022-08-30 首都医科大学附属北京佑安医院 基于RCA-PCR-CRISPR-cas13a检测HBV cccDNA的试剂盒
CN113667668B (zh) * 2021-08-04 2024-01-09 郑州大学 基于CRISPR/Cas***的HBV检测

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101967522A (zh) * 2009-07-27 2011-02-09 北京索奥生物医药科技有限公司 一种乙型肝炎病毒cccDNA双色荧光PCR检测方法及其试剂盒的应用
CN104630386A (zh) * 2015-02-03 2015-05-20 重庆医科大学附属第二医院 一种用于检测乙型肝炎病毒cccDNA的定性和绝对定量试剂盒
CN108048466A (zh) * 2017-12-21 2018-05-18 嘉兴市第医院 CRISPR-Cas13a***特异性靶向人RSPO2基因的crRNA及***和应用
CN108841958A (zh) * 2018-07-03 2018-11-20 武汉博杰生物医学科技有限公司 一种检测EGFR基因外显子21L858突变的crRNA及其检测方法
CN110066865A (zh) * 2019-04-30 2019-07-30 常州桐树生物科技有限公司 一种基于CRISPR-Cas13a的特异性核酸片段的检测方法及探针

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101967522A (zh) * 2009-07-27 2011-02-09 北京索奥生物医药科技有限公司 一种乙型肝炎病毒cccDNA双色荧光PCR检测方法及其试剂盒的应用
CN104630386A (zh) * 2015-02-03 2015-05-20 重庆医科大学附属第二医院 一种用于检测乙型肝炎病毒cccDNA的定性和绝对定量试剂盒
CN108048466A (zh) * 2017-12-21 2018-05-18 嘉兴市第医院 CRISPR-Cas13a***特异性靶向人RSPO2基因的crRNA及***和应用
CN108841958A (zh) * 2018-07-03 2018-11-20 武汉博杰生物医学科技有限公司 一种检测EGFR基因外显子21L858突变的crRNA及其检测方法
CN110066865A (zh) * 2019-04-30 2019-07-30 常州桐树生物科技有限公司 一种基于CRISPR-Cas13a的特异性核酸片段的检测方法及探针

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《CRISPR/Cas***在抗病毒研究中的应用》;于楠楠等;《中国生物化学与分子生物学报》;20190420;第35卷(第4期);第393-398页 *
《Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2》;Jonathan S Gootenberg等;《Science》;20170413;第356卷(第6336期);第438-442页 *
《Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection》;Alexandra East-Seletsky等;《Nature》;20160926;第538卷(第7624期);第270-273页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110343785A (zh) 2019-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110343785B (zh) 基于PCR-CRISPR-cas13a检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的试剂盒
CN108048466B (zh) CRISPR-Cas13a***特异性靶向人RSPO2基因的crRNA及***和应用
CN108192956B (zh) 一种基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法及其应用
US20180080021A1 (en) Simultaneous sequencing of rna and dna from the same sample
Huijsmans et al. Comparative analysis of four methods to extract DNA from paraffin-embedded tissues: effect on downstream molecular applications
CN107058623B (zh) 一种高度灵敏和特异的血液HBV pgRNA荧光定量PCR检测体系和检测方法
AU2008289447B2 (en) Methods of using miRNA for detection of in vivo cell death
CN112375847B (zh) 一种基于CRISPR/Cas13a***的乙型肝炎病毒基因分型检测方法
US10161005B2 (en) Method for detecting telomerase via washing-free anchored-extension and telomeric-binding amplification, and kit
CN108192965B (zh) 一种检测线粒体基因组a3243g位点异质性的方法
CN115058543B (zh) 一组鉴别Delta变异毒株和Omicron变异毒株的引物组和试剂盒
CN104024426A (zh) Dna二代测序技术中待测样品的追踪方法及检测试剂盒
CN114107567A (zh) 一种病毒核酸突变检测方法及应用
TW201139687A (en) Nucleic acid detection
CN117210437A (zh) 两种基因编辑工具酶鉴定及其在核酸检测中的应用
CN115323075B (zh) 一种检测鸡传染性支气管炎病毒及基因分型的rt-raa引物探针组、试剂盒及其应用
CN115896316A (zh) 一种结核病的检测方法
CN115029345A (zh) 基于crispr的核酸检测试剂盒及其应用
WO2011022970A1 (zh) 用于核酸pcr产物直接测序的测序引物和测序方法
US20170191061A1 (en) Blocking hepatitis c virus infection associated liver tumor development with hcv-specific antisense rna
CN113355399A (zh) 一种基于crispr***及胶体金检测条的冠状病毒核酸快速检测方法及其应用
CN112094860A (zh) 一种ctcf-eto2血液病的融合基因及其检测引物和应用
Zhang et al. Detection of HBV RNA in serum of patients
CN117344061B (zh) 一种同时检测五种人源病毒ebv、hbv、hcv、hiv、hpv的方法、试剂盒、引物和探针及其应用
CN110241255B (zh) 一种用于HBV miR-3荧光定量PCR的检测材料及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant