CN105733985A - 一种用动态扩培法制备椰果生产菌的方法 - Google Patents

一种用动态扩培法制备椰果生产菌的方法 Download PDF

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Abstract

一种用动态扩培法制备椰果生产菌的方法，具体步骤如下：(1)种子来源：将木葡糖醋酸杆菌的菌种从平板接到烧杯培养基中，2832℃静置培养2448h，再将液态种子转接到烧杯培养基中，2832℃静置培养2448h，得到初级种子液；(2)动态扩培过程：扩培容器为发酵罐，发酵罐径高比1:3，将培养基加入发酵罐中，灭菌后冷却至2832℃后加入菌液，菌种添加量为3％7％，维持扩培温度2832℃，搅拌速度20100r/min，通气量0.51V/V·min，扩培时间48h，得到发酵用种子液。本方法主要克服了菌种扩培时间长、发酵时间长、过程不易控制的技术问题，对实现椰果工业化生产有实际意义。

Description

一种用动态扩培法制备椰果生产菌的方法
技术领域
本发明涉及食品生物技术领域，尤其是涉及一种利用发酵罐动态扩培椰果发酵用的菌种、并用该菌种生产椰果的方法。
背景技术
椰果又称高纤椰果、纳塔，是木醋杆菌在液态培养基中生长所形成的代谢产物，其本质为细菌纤维素。椰果是具有高咀嚼性、口感滑爽、透明度高的水晶纤维，能与各种果汁调配，可以被赋予各种缤纷色彩和风味，具有良好的可塑性。椰果产品以其爽滑、脆嫩、细腻而有弹性的独特口感倍受消费者青睐。木醋杆菌发酵后形成的果块，结构稳定，持水性强，耐酸，耐热，在高温条件下不会溶解，具有良好的可加工性能。另外，椰果富含膳食纤维，被认为是目前发现的最好的膳食纤维之一，有“白色金矿”的美誉，在日本、我国台湾和内地成为一种非常流行的食品，深受广大消费者的欢迎。
现代众多研究者对细菌纤维素菌株筛选、培养基原料选择等方面做了大量研究，但对于扩培方式、发酵工艺的研究报道很少，适于工业化的椰果生产工艺方面研究报道更少，甚至有报道称木葡糖醋酸杆菌其菌种特性并不适合用于发酵罐扩培及发酵。当前椰果发酵所用的菌种大都是采用发酵桶静态扩培3天而成，扩培周期长、接种量较大且菌种质量不宜控制，本发明基于这一现状，在筛选出一株适用于工业化生产的椰果产生菌株基础上，以此菌株为出发点研究菌种扩培的工业化方法。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种用动态扩培法制备椰果生产菌的方法。本方法主要克服了菌种扩培时间长、发酵时间长、过程不易控制的技术问题，对实现椰果工业化生产有实际意义。
本发明的技术方案如下：
一种用动态扩培法制备椰果生产菌的方法，具体步骤如下：
(1)种子来源：将木葡糖醋酸杆菌的菌种从平板接到烧杯培养基中，28-32℃ 静置培养24-48h，再将液态种子转接到烧杯培养基中，28-32℃静置培养24-48h，得到初级种子液；
(2)动态扩培过程：扩培容器为发酵罐，发酵罐径高比1:3，将培养基加入发酵罐中，灭菌后冷却至28-32℃后加入菌液，菌种添加量为3％-7％，维持扩培温度28-32℃，搅拌速度20-100r/min，通气量0.5-1V/V·min，扩培时间4-8h，得到发酵用种子液，即所述椰果生产菌。扩培4-8h后，液态菌种呈乳白色，菌种浓度达到109cfu/ml。
步骤(1)所述培养基组成为：葡萄糖：80-120g/L、酵母提取物：0.1-0.12g/L、CaCO3：0.1-0.3g/L、pH为6.8。
步骤(2)所述动态扩培培养基组成为：葡萄糖40-80g/L、椰浆5-20g/L、冰醋酸5-20g/L、酵母膏0.01-1g/L、七水合硫酸镁0.2-0.5g/L、pH为2.5-3.5。
步骤(1)所述木葡糖醋酸杆菌选用木葡糖醋酸杆菌SY 1a(Komagataeibacter xylinus SY 1a)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2015196，保藏时间2015年4月6日，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
所述椰果生产菌制备椰果的方法：将发酵种子液按10％-20％的接种量接到发酵培养基中，装液量高度2-2.5cm，28-32℃下静置培养4-5d。所述发酵培养基的组成为：蔗糖20-30g/L、葡萄糖20-30g/L、椰浆5-20g/L、冰醋酸5-20g/L、大豆蛋白胨0.01-0.5g/L、七水合硫酸镁0.2-0.5g/L。
本发明有益的技术效果在于：
本发明提出了可控发酵罐对菌种进行扩培的方法，并首次实现了动态搅拌促进木葡糖醋酸杆菌传代生长。本发明研究搅拌速度、通气量、温度、pH、接种量、扩培时间对菌种发酵椰果的影响，发现以上各条件对菌种质量影响都较大，且在最佳条件下，发酵罐中动态培养的菌种较传统静态扩培有以下优点：(1)有效菌浓升高至109cfu/ml；(2)大大缩短了扩培时间，将扩培时间从静态发酵的36-72h缩短至4-8h；(3)菌种扩培接种量降为3％-7％；(4)椰果的浅盘发酵时间从6-7天缩短至4-5天；(5)动态扩培的菌种菌活较高，椰果产量提高至60％-75％。本发明最终成功将菌种动态扩培扩大至2t发酵罐，满足了椰果工业化生产的菌种需求。
本发明实现动态扩培放大至2t发酵罐，解决了木葡糖醋酸杆菌菌种扩培工业化问题。本发明中利用的菌种为木葡糖醋酸杆菌，利用蔗糖、葡萄糖、椰浆、 酵母膏、大豆蛋白胨、醋酸、硫酸镁等配成培养基，为菌种生长提供碳源、氮源、生长因子，经浅盘静置发酵制得椰果，得率达到60％-75％。椰果呈乳白色、晶莹透明、清润有弹性，椰果的品质特征为透光率100-190、硬度400-1300g，剪切力2000-4000g、咀嚼性300-500g·cm，持水性20％-40％。该椰果主要用于食品饮料领域，在椰果饮品行业拥有极大的市场价值。本方法成本低、产量高、椰果品质好，适合于大规模生产。
本发明适用于木葡糖醋酸杆菌(Komagataeibacter xylinus)高产菌株(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015196)，保藏时间2015年4月6日，保藏地址为中国，武汉，武汉大学；此外使用购买的木葡糖醋酸杆菌(中国科学院微生物研究所，菌种编号：CGMCC1.1812)进行验证，此方法也适合。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1
木葡糖醋酸杆菌SY 1a(Komagataeibacter xylinus SY 1a保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015196)的发酵培养：
将平板种子挑一环接种到250mL小烧杯中(种子培养基葡萄糖80g/L、酵母提取物0.1g/L、CaCO3：0.1g/L、pH为6.8)，在28℃的恒温培养箱中静置培养24h，待表面长出纤维膜后，按10％的接种量将其转接到1L的种子培养基中，在28℃恒温培养箱中静置培养24h，获得初级种子液。
动态扩培发酵种子：将初级种子液按3％的接种量接种到发酵罐中，发酵罐径高比1:3，发酵罐中为已灭菌的发酵种子培养基中(葡萄糖40g/L、椰浆12g/L、冰醋酸5g/L、酵母膏0.01g/L、七水合硫酸镁0.2g/L、pH3.5)，保持罐温28℃，搅拌速度20r/min，通气量0.5V/V·min，扩培4h。
浅盘静置发酵：将发酵种子液按10％的接种量接到发酵培养基中(蔗糖20g/L、葡萄糖20g/L、椰浆5g/L、冰醋酸5g/L、大豆蛋白胨0.01g/L、七水合硫酸镁0.2g/L)，混合均匀后分装到浅盘中，装液量2cm，在28℃发酵房中静置培养4d后收获椰果，得率60％。
实施例2
木葡糖醋酸杆菌(中国科学院微生物研究所，菌种编号：CGMCC1.1812)的发酵培养：
安瓿开封：用75％酒精脱脂棉对安瓿外表面进行消毒后，用火焰加热其顶端，滴少量无菌水至加热的安瓿顶端破裂，用锉刀或镊子敲下已经破裂的安瓿顶端。
恢复培养：用无菌吸管吸取0.3-0.5毫升液体培养基，滴入安瓿内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状。吸取全部菌悬液，移植于培养基试管中(葡萄糖100g/L、酵母提取物0.11g/L、CaCO3：0.2g/L、pH为6.8)，30℃恒温培养箱中静置培养2d。
扩大培养：将恢复培养的种子液按10％的接种量将其转接到培养基中(葡萄糖2％、酵母膏0.5％、K2HPO4：0.2％、MgSO4：0.15％、乙醇2％、pH4.5)，在30℃恒温培养箱中静置培养36h，转接2-3次，获得初级种子液。
动态扩培发酵种子：将初级种子液按5％的接种量接种到发酵罐中，发酵罐径高比1:3，发酵罐中为已灭菌的发酵种子培养基中(蔗糖60g/L、椰浆12g/L、冰醋酸12g/L、酵母膏0.5g/L、七水合硫酸镁0.35g/L、pH3.0)，保持罐温30℃，搅拌速度60r/min，通气量0.75V/V·min，扩培6h。
浅盘静置发酵：将发酵种子液按15％的接种量接到发酵培养基中(蔗糖25g/L、葡萄糖25g/L、椰浆12g/L、冰醋酸12g/L、大豆蛋白胨0.25g/L、七水合硫酸镁0.35g/L)，混合均匀后分装到浅盘中，装液量2.2cm，在30℃发酵房中静置培养4.5d后收获椰果，得率68％。
实施例3
木葡糖醋酸杆菌(Komagataeibacter xylinus，来源于福建省泉州喜多多食品有限公司)的发酵培养：
将平板种子挑一环接种到250mL小烧杯中(种子培养基葡萄糖120g/L、酵母提取物0.12g/L、CaCO3 0.3g/L、pH为6.8)，在32℃的恒温培养箱中静置培养48h，待表面长出纤维膜后，按10％的接种量将其转接到1L的种子培养基中，在32℃恒温培养箱中静置48h，获得初级种子液。
动态扩培发酵种子：将初级种子液按7％的接种量接种到发酵罐中，发酵罐径高比1:3，发酵罐中为已灭菌的发酵种子培养基中(葡萄糖80g/L、椰浆20g/L、冰醋酸20g/L、酵母膏1g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、pH2.5)，保持罐温32℃， 搅拌速度100r/min，通气量1.0V/V·min，扩培8h。
浅盘静置发酵：将发酵种子液按20％的接种量接到发酵培养基中(蔗糖30g/L、葡萄糖30g/L、椰浆20g/L、冰醋酸20g/L、大豆蛋白胨0.5g/L、七水合硫酸镁0.5g/L)，混合均匀后分装到浅盘中，装液量2.5cm，在32℃发酵房中静置培养5d后收获椰果，得率75％。
本文所描述的具体实施案例仅作为对本发明精神和部分实验做举例说明。本发明所述领域的技术人员可以对所描述的具体实施案例做出各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (6)

1.一种用动态扩培法制备椰果生产菌的方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)种子来源：将木葡糖醋酸杆菌的菌种从平板接到烧杯培养基中，28-32℃静置培养24-48h，再将液态种子转接到烧杯培养基中，28-32℃静置培养24-48h，得到初级种子液；
(2)动态扩培过程：扩培容器为发酵罐，发酵罐径高比1:3，将培养基加入发酵罐中，灭菌后冷却至28-32℃后加入菌液，菌种添加量为3％-7％，维持扩培温度28-32℃，搅拌速度20-100r/min，通气量0.5-1V/V·min，扩培时间4-8h，得到发酵用种子液，即所述椰果生产菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述培养基组成为：葡萄糖：80-120g/L、酵母提取物：0.1-0.12g/L、CaCO3：0.1-0.3g/L、pH为6.8。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)所述动态扩培培养基组成为：葡萄糖40-80g/L、椰浆5-20g/L、冰醋酸5-20g/L、酵母膏0.01-1g/L、七水合硫酸镁0.2-0.5g/L、pH为2.5-3.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述木葡糖醋酸杆菌选用木葡糖醋酸杆菌SY 1a(Komagataeibacter xylinus SY 1a)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015196，保藏时间2015年4月6日，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
5.一种采用权利要求1～4任一项所述的椰果生产菌制备椰果的方法，其特征在于：将发酵种子液按10％-20％的接种量接到发酵培养基中，装液量高度2-2.5cm，28-32℃下静置培养4-5d。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述发酵培养基的组成为：蔗糖20-30g/L、葡萄糖20-30g/L、椰浆5-20g/L、冰醋酸5-20g/L、大豆蛋白胨0.01-0.5g/L、七水合硫酸镁0.2-0.5g/L。
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