CN105733923A - 一种微流控芯片及利用微流控芯片的核酸提取纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种微流控芯片及利用微流控芯片的核酸提取纯化方法。所述微流控芯片为4层膜结构，分别为液路层、气路控制层、和磁铁控制层和玻璃基底层四部分；所述气体控制层位于液路层下方，所述基底层位于气体控制层下方；所述磁铁控制层位于基底层下方；该方法采用上述微流控芯片按照如下步骤进行：A、引入目的样品；B、引入用于核酸纯化的超顺磁硅珠；C、从混合样品中提取纯化核酸。本发明通过将样品的进入、非核酸物质清洗及核酸的收集纯化集中到一个微流控芯片上，优化了核酸提取纯化流程，极大的提高了提取纯化的效率，简化人为操作程序，并且实现了传统方法难以实现的时空分辨信息，取得了较好的核酸提取纯化效果。

Description

一种微流控芯片及利用微流控芯片的核酸提取纯化方法

技术领域

本发明涉及核酸提取与纯化领域，尤其涉及一种微流控芯片及利用微流控芯片的核酸提取纯化方法。

背景技术

生物大分子核糖核酸的分离与纯化技术是进行分子生物学各方面研究的基础，是生命科学研究与应用中的关键技术。核酸样品制备的效率和质量，将直接影响后续实验的结果。目前实验室通常采用的提取方法存在诸多缺点：如酚/氯仿提取法和离心柱法，需要多部离心，对外界设备的要求比较高，也容易造成样品流失；而使用有机溶剂也会造成环境污染，危害操作者身体健康；耗时繁琐的提取步骤也降低了核酸检测的速度。因此，开发集成化、无需离心操作、试剂消耗少及分析时间短的核酸纯化平台已经成为一个迫切的需求。

微流控芯片平台将核酸纯化技术带入了一个崭新的阶段，在一块几平方厘米的芯片上，由网络化的微通道控制流体，可以完成从细胞裂解、核酸特异性结合和洗脱的样品提取全过程。传统的芯片提取核酸方法是将二氧化硅固定在芯片内壁，或者将硅胶、硅藻土、玻璃珠、有机硅烷颗粒、磁珠等基质填充在芯片通道内，来吸附核酸。洗去其他物质和未结合的核酸后，再通入洗脱液使待提取的物质从固体表面洗脱下来，达到提取纯化的目的。在芯片上进行核酸提取适应于不同样本，核酸降解较少。然而，目前将微流控芯片技术用于核酸纯化还存在一些不足，主要体现在对流体的操控上。在已有的方法中，待纯化样品和纯化试剂在注射泵的推动下进入微通道，实现混合、清洗和洗脱等步骤。核酸纯化的效率取决于纯化试剂的流速，操作不灵活，不能实现多个样品的同步纯化，不符合自动化控制的要求。

人们迫切希望获得一种集成有气动泵阀的核酸纯化芯片，实现从细胞裂解、杂质清洗，到核酸特异性结合和洗脱的样品提取全过程，尤其要求适用于自动化控制的需要。

发明内容

本发明的目的是开发一种适应自动化要求的基于气动泵阀的微流控核酸纯化芯片利用微流控芯片的核酸提取纯化方法；具体涉及样品引入、杂质清洗、核酸特异性结合和洗脱等样品提取的全过程。

一种微流控芯片，利用集成有气动泵阀的PDMS微流控芯片作为平台，通过操作气动微阀控制下述内容之一或其组合：样品的引入、样品的混合及核酸样品的收集。

所述微流控芯片为4层膜结构，分别为液路层、气路控制层、和磁铁控制层和玻璃基底层四部分；所述气体控制层位于液路层下方，所述基底层位于气体控制层下方；所述磁铁控制层位于基底层下方，

所述液路层包括上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口，液体通道，流通池，样品池，储液池，储样池，DNA收集池，废液池，加入样品池的样品进入储样池；加入上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口的液体在流通池产生的负压下，经液体通道进入储液池，与储样池的样品混合进入DNA收集池，废液池收集每一步产生的多余液体；

所述的气路控制层含有14个气阀，所述气阀由进气口、气体通道、气动微阀构成；气动微阀分别位于液体通道和储液池下方通过气动微阀控制液体通道的开关；

所述的磁铁控制层含有磁铁放置区域，磁铁放置区域的位置与储液池和储样池相对应。

所述的气动微阀由液路层和气路控制层之间的PDMS薄膜构成；液路层和气路控制层之间只通过气动微阀相联系，二者内部并不连通。

所述的14个气阀，具体分布和描述如下：

1#气阀，2#气阀，3#气阀，4#气阀和6#气阀具1个呈细长方形的气动微阀，1#气阀，2#气阀，3#气阀，4#气阀的气动微阀位于上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口的液体通道下方、6#气阀的气动微阀位于流通池的液体通道下方，控制相应液体通道开关；

7#气阀,8#气阀,10#气阀,12#气阀,13#气阀,14#气阀具4个呈细长方形的气动微阀，气动微阀分别位于四个混合区域的液体通道下方，可同时控制四个混合区域的液体通道开关，其中7#气阀控制进入储液池前的液体通道，8#气阀控制样品池至储样池之间的液体通道，10#气阀控制储液池至储样池之间的液体通道，12#气阀控制储样池至DNA收集池之间的液体通道，13#气阀控制储液池至废液池之间的液体通道，14#气阀控制储样池至废液池之间的液体通道；

5#气阀具1个呈圆形的气动微阀，位于流通池的下方，产生负压提供液体在液体通道中流动的动力；

9#气阀和11#气阀具4个呈正方形的气动微阀，气动微阀分别位于四个混合区域储液池、储样池的下方，控制液体进出储液池和储样池。

所述液路层1a中液体流动通道的横截面为弧形结构，气体控制层1b中气体通道的横截面积为矩形结构。

一种利用微流控芯片的核酸提取纯化方法，采用上述微流控芯片，按照如下步骤进行：

A、引入目的样品；

B、引入用于核酸纯化的超顺磁硅珠；

C、从混合样品中提取纯化核酸。

步骤A和步骤B分别进行样品和超顺磁磁珠的引入，操纵气动泵阀实现样品液体自动进入混合区域,并维持混合样品溶液在混合单元30。

所述步骤C包括：

C1、将含有核酸的样品溶液通过超顺磁性纳米颗粒，在pH6.1酸性条件下，核酸与超顺磁性纳米颗粒相结合形成核酸-磁纳米颗粒复合物而被固定；

C2、通入洗涤液对未结合到超顺磁性纳米颗粒上的杂质成分进行洗涤；

C3、通入pH7.5的碱性的缓冲液对核酸-磁纳米颗粒复合物进行洗脱，碱性条件下，核酸与超顺磁性纳米颗粒分离，收集含有纯化核酸的洗脱液。

所述核酸为DNA。

本发明的优点：

1.本发明将气动微阀用于液体的操控，通过调节气动微阀的顺序开启和关闭，灵活控制样品液体的自动引入和混合，无需使用注射泵。

2.本发明可以同时处理四个不同类型的样品，且不同样品间核酸纯化过程独立进行，互不干扰。

3.本发明将样品引入、非核酸物质清洗及核酸的收集纯化集中到一个微流控芯片上，优化了核酸提取纯化流程。

4.本发明采用采用微泵阀***实现了核酸纯化各步骤的自动运行，避免了人为操作，减少误差，实现了传统方法难以实现的时空分辨信息。

附图说明

图1为本发明微流控核酸纯化芯片平面结构示意图。a液路层结构；b气路层结构；c磁铁控制层结构，d各层组合位置效果图；

图2为本发明进样及混合区域放大图；

其中：1上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口；2液体通道；3流通池；4样品池；5储液池；6储样池；7DNA收集池；8废液池；9为1#气阀，10为2#气阀，11为3#气阀，12为4#气阀，13为5#气阀，14为6#气阀，15为7#气阀，16为8#气阀。17为9#气阀，18为10#气阀，19为11#气阀，20为12#气阀，21为13#气阀，22为14#气阀，23为进气口，24为气体通道，25为长方形气动微阀,26为圆形气动微阀，27为方形气动微阀，28磁铁放置区域；29混合区域,30为混合单元。

图3为本发明微流控核酸纯化芯片用于λDNA纯化结果。

具体实施方式

下面通过实施例来具体说明核酸的提取纯化方法流程。

一种微流控芯片，利用集成有气动泵阀的PDMS微流控芯片作为平台，通过操作气动微阀控制下述内容之一或其组合：样品的引入、样品的混合及核酸样品的收集。

所述微流控芯片如图1所示，为4层膜结构，分别为液路层、气路控制层、和磁铁控制层和玻璃基底层四部分；所述气体控制层位于液路层下方，所述基底层位于气体控制层下方；所述磁铁控制层位于基底层下方，

所述液路层包括上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口1；液体通道2；流通池3；样品池4；储液池5；储样池6；DNA收集池7；废液池8，加入样品池4的样品进入储样池6；加入上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口1的液体在流通池3产生的负压下，经液体通道2进入储液池5，与储样池6的样品混合进入DNA收集池7，废液池8收集每一步产生的多余液体；

所述的气路控制层含有14个气阀，所述气阀由进气口23、气体通道24、气动微阀构成；气动微阀分别位于液体通道2和储液池5下方通过气动微阀控制液体通道2的开关；

所述的磁铁控制层含有磁铁放置区域28，磁铁放置区域28的位置与储液池5和储样池6相对应。

所述的气动微阀由液路层和气路控制层之间的PDMS薄膜构成；液路层和气路控制层之间只通过气动微阀相联系，二者内部并不连通。

所述的14个气阀，具体分布和描述如下：

1#气阀9，2#气阀10，3#气阀11，4#气阀12和6#气阀14具1个呈细长方形的气动微阀，1#气阀9，2#气阀10，3#气阀11，4#气阀12的气动微阀位于上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口1的液体通道2下方、6#气阀14的气动微阀位于流通池3的液体通道下方，控制相应液体通道开关；

7#气阀15,8#气阀16,10#气阀18,12#气阀20,13#气阀21,14#气阀22具4个呈细长方形的气动微阀，气动微阀分别位于四个混合区域的液体通道2下方，可同时控制四个混合区域的液体通道开关，其中7#气阀15控制进入储液池5前的液体通道，8#气阀16控制样品池4至储样池6之间的液体通道，10#气阀18控制储液池5至储样池6之间的液体通道，12#气阀20控制储样池6至DNA收集池7之间的液体通道，13#气阀21控制储液池5至废液池8之间的液体通道，14#气阀22控制储样池6至废液池8之间的液体通道；

5#气阀13具1个呈圆形的气动微阀，位于流通池3的下方，产生负压提供液体在液体通道中流动的动力；

9#气阀17和11#气阀19具4个呈正方形的气动微阀，气动微阀分别位于四个混合区域储液池5、储样池6的下方，控制液体进出储液池5和储样池6。

具体控制方式如下所述：打开1#气阀，7#气阀，使上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口1至储液池5的液体通道联通；上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口1加入液体，打开5#气阀，9#气阀，产生负压，使液体由上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口1进入储液池5；打开6#气阀，14#气阀，使流通池3、储液池5至废液池8联通，多余液体进入废液池8。

打开8#气阀，使样品池4至储样池6的液体通道联通；样品池4加入样品，打开11#气阀，产生负压，使样品由样品池4进入储样池6；打开14#气阀，使样品池6至废液池8的液体通道联通，多余样品进入废液池8.

打开9#气阀，使储液池5至储样池6液体通道联通；打开11#气阀，产生负压，使样品由储液池5进入储样池6与样品混合；打开12#气阀，使储样池6至DNA收集池7的液体通道联通，混合样品进入DNA收集池7。

所述液路层1a中液体流动通道的横截面为弧形结构，气体控制层1b中气体通道的横截面积为矩形结构。

一种利用微流控芯片的核酸提取纯化方法，采用上述微流控芯片，按照如下步骤进行：

A、引入目的样品；

B、引入用于核酸纯化的超顺磁硅珠；

C、从混合样品中提取纯化核酸。

步骤A和步骤B分别进行样品和超顺磁磁珠的引入，操纵气动泵阀实现样品液体自动进入混合区域,并维持混合样品溶液在混合单元30(如图2所示)。

所述步骤C包括：

C1、将含有核酸的样品溶液通过超顺磁性纳米颗粒，在pH6.1酸性条件下，核酸与超顺磁性纳米颗粒相结合形成核酸-磁纳米颗粒复合物而被固定；

C2、通入洗涤液对未结合到超顺磁性纳米颗粒上的杂质成分进行洗涤；

C3、通入pH7.5的碱性的缓冲液对核酸-磁纳米颗粒复合物进行洗脱，碱性条件下，核酸与超顺磁性纳米颗粒分离，收集含有纯化核酸的洗脱液。

所述核酸为DNA。

实施例1

λDNA的提取纯化

分别向图1所示芯片样品池4中加入6ng/μLλDNA溶液，入口1中加入超顺磁硅珠、上样缓冲液、洗涤液和洗脱液，在气动微阀操控下，λDNA、超顺磁硅珠上样缓冲液、清洗液和洗脱液在真空驱动力条件下进入混合单元，同样操控气动微阀，实现核酸提取缓冲液与λDNA的充分混合、纯化，分别收集上样缓冲液、清洗液和洗脱液。

具体步骤包括：

1.将含有λDNA的样品溶液与超顺磁性纳米颗粒充分混合，在pH6.1酸性条件下，核酸与超顺磁性纳米颗粒相结合形成核酸-磁纳米颗粒复合物而被固定，在废液池中收集剩余的含部分λDNA的上样缓冲液；

2.通入洗涤液对未结合到超顺磁性纳米颗粒上的蛋白质、脂类细胞杂质成分进行洗涤，收集残余的含部分λDNA的洗涤液；D3、通入pH7.5的碱性的缓冲液对核酸-磁纳米颗粒复合物进行洗脱，碱性条件下，核酸与超顺磁性纳米颗粒分离，收集含有绝大部分纯化λDNA的洗脱液。微流控核酸纯化芯片用于λDNA纯化结果如图3所示。

实施例2

真实样品DNA的提取纯化

分别向图1所示芯片样品池4中分别加入细胞裂解液(真核细胞或者原核细胞)，入口1中加入超顺磁硅珠、上样缓冲液、洗涤液和洗脱液，在气动微阀操控下，真实样品、超顺磁硅珠、上样缓冲液、清洗液和洗脱液在真空驱动力条件下进入混合单元，同样操控气动微阀，实现核酸提取缓冲液与裂解的细胞缓冲液充分混合、纯化，最后收集含纯化DNA样品的洗脱液。具体步骤包括：1.将含有裂解的细胞溶液与超顺磁性纳米颗粒充分混合，在pH6.1酸性条件下，核酸与超顺磁性纳米颗粒相结合形成核酸-磁纳米颗粒复合物而被固定；2.通入洗涤液对未结合到超顺磁性纳米颗粒上的蛋白质、脂类细胞杂质成分进行洗涤；D3、通入pH7.5的碱性的缓冲液对核酸-磁纳米颗粒复合物进行洗脱，碱性条件下，核酸与超顺磁性纳米颗粒分离，收集含有纯化DNA的洗脱液。

Claims (9)

1.一种微流控芯片，其特征在于：利用集成有气动泵阀的PDMS微流控芯片作为平台，通过操作气动微阀控制下述内容之一或其组合：样品的引入、样品的混合及核酸样品的收集。

2.按照权利要求1所述的一种微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片为4层膜结构，分别为液路层、气路控制层、和磁铁控制层和玻璃基底层四部分；所述气体控制层位于液路层下方，所述基底层位于气体控制层下方；所述磁铁控制层位于基底层下方；

所述液路层包括上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口，液体通道，流通池，样品池，储液池，储样池，DNA收集池，废液池，加入样品池的样品进入储样池；加入上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口的液体在流通池产生的负压下，经液体通道进入储液池，与储样池的样品混合进入DNA收集池，废液池收集每一步产生的多余液体；

所述的气路控制层含有14个气阀，所述气阀由进气口、气体通道、气动微阀构成；气动微阀分别位于液体通道和储液池下方通过气动微阀控制液体通道的开关；

所述的磁铁控制层含有磁铁放置区域，磁铁放置区域的位置与储液池和储样池相对应。

3.按照权利要求1所述的一种微流控芯片，其特征在于所述的气动微阀由液路层和气路控制层之间的PDMS薄膜构成；液路层和气路控制层之间只通过气动微阀相联系，二者内部并不连通。

4.按照权利要求1所述的一种微流控芯片，其特征在于所述的14个气阀，具体分布和描述如下：

1#气阀，2#气阀，3#气阀，4#气阀和6#气阀具1个呈细长方形的气动微阀，1#气阀，2#气阀，3#气阀，4#气阀的气动微阀位于上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口的液体通道下方、6#气阀的气动微阀位于流通池的液体通道下方，控制相应液体通道开关；

7#气阀,8#气阀,10#气阀,12#气阀,13#气阀,14#气阀具4个呈细长方形的气动微阀，气动微阀分别位于四个混合区域的液体通道下方，可同时控制四个混合区域的液体通道开关，其中7#气阀控制进入储液池前的液体通道，8#气阀控制样品池至储样池之间的液体通道，10#气阀控制储液池至储样池之间的液体通道，12#气阀控制储样池至DNA收集池之间的液体通道，13#气阀控制储液池至废液池之间的液体通道，14#气阀控制储样池至废液池之间的液体通道；

5#气阀具1个呈圆形的气动微阀，位于流通池的下方，产生负压提供液体在液体通道中流动的动力；

9#气阀和11#气阀具4个呈正方形的气动微阀，气动微阀分别位于四个混合区域储液池、储样池的下方，控制液体进出储液池和储样池。

5.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：液路层1a中液体流动通道的横截面为弧形结构，气体控制层1b中气体通道的横截面积为矩形结构。

6.一种利用微流控芯片的核酸提取纯化方法，采用上述微流控芯片，其特征在于按照如下步骤进行：

A、引入目的样品；

B、引入用于核酸纯化的超顺磁硅珠；

C、从混合样品中提取纯化核酸。

7.按照权利要求6所述的核酸提取纯化方法，其特征在于：步骤A和步骤B分别进行样品和超顺磁磁珠的引入，操纵气动泵阀实现样品液体自动进入混合区域,并维持混合样品溶液在混合单元。

8.按照权利要求7所述的核酸提取纯化方法，其特征在于，所述步骤C包括：

C1、将含有核酸的样品溶液通过超顺磁性纳米颗粒，在pH6.1酸性条件下，核酸与超顺磁性纳米颗粒相结合形成核酸-磁纳米颗粒复合物而被固定；

C2、通入洗涤液对未结合到超顺磁性纳米颗粒上的杂质成分进行洗涤；

C3、通入pH7.5的碱性的缓冲液对核酸-磁纳米颗粒复合物进行洗脱，碱性条件下，核酸与超顺磁性纳米颗粒分离，收集含有纯化核酸的洗脱液。

9.按照权利要求6～8中任意一项所述的核酸提取纯化方法，其特征在于所述核酸为DNA。