CN105713841B - 一种尖孢镰孢及其在苦荞麦种子萌发预处理上的应用 - Google Patents

一种尖孢镰孢及其在苦荞麦种子萌发预处理上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种尖孢镰孢，所述尖孢镰孢于2014年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.10102。还公开了尖孢镰孢在苦荞麦种子萌发预处理上的应用。本发明尖孢镰孢对苦荞麦种子的预处理方法简单易行，成本低廉、容易操作、无过高的技术要求，且提高苦荞种子发芽率和缩短萌发时间效果十分明显。

Description

一种尖孢镰孢及其在苦荞麦种子萌发预处理上的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种真菌及其在苦荞麦种子萌发预处理上的应用，尤其涉及一种尖孢镰孢及其在苦荞麦种子萌发预处理上的应用。
背景技术
苦荞又称鞑靼荞麦(Fagopyrum tataricum)，是一种著名的食药两用杂粮作物，具有很高的营养价值和保健功能。苦荞富含蛋白质、淀粉、脂肪、维生素、矿物质和微量元素等营养功能成分，尤其是苦荞中所含有的芦丁、槲皮素等生物黄酮类活性成分，具有降低血糖、胆固醇、血脂和增强人体免疫力等功效。我国是世界上第一大苦荞种植生产国，其常年种植面积在600万亩以上，年产量约40万吨，主产区主要集中在长江以南的四川、云南、贵州和西藏等省区。
目前当季收获的新鲜苦荞麦子发芽率通常在95％以上。然而，苦荞麦种子在自然环境存储过程中随着储存时间的增加，其酶蛋白逐渐发生变性，胚乳内的养分有所减少，从而导致发芽质量下降，造成发芽率降低，其中一年后其发芽率降为80-85％，两年后降低为50-60％，三年后发芽率仅为20-25％，甚至不发芽，其幼苗的质量及活力也大为降低，严重影响苦荞麦的种植生产及进一步开发利用。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种尖孢镰孢及其在苦荞麦种子萌发预处理上的应用。尖孢镰孢对苦荞麦种子的预处理方法简单易行，成本低廉、容易操作、无过高的技术要求，且在提高苦荞种子发芽率和缩短萌发时间效果十分明显。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
本发明提供一种新型的尖孢镰孢，命名为尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)Fataf9，所述尖孢镰孢于2014年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.10102。尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)Fataf9自健康苦荞植株中分离所得，为一株苦荞内生真菌。
尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)Fataf9具有以下特征：
在PDA平板上的菌落为紫色，边缘白色，背部轮纹状，白色和紫色相间，菌落边缘整齐，气生菌丝较长，大孢子近镰刀形或长椭圆形，2～3个隔，小孢子为卵圆形或椭圆形，两种孢子大小为(4.3μm～17.5μm)×(1.8μm～4.7μm)。
该尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)Fataf9在PDA培养基上生长良好，适宜的生长温度为20℃～32℃，最佳生长温度为25℃～28℃。另外，尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)Fataf9培养是在好氧条件进行的，培养基的适宜pH范围为pH6.0～pH7.5。
所述的尖孢镰孢的ITS序列为：
尖孢镰孢Fataf9的基因同源性的***发育树为：
尖孢镰孢可以在苦荞麦种子萌发预处理上有具体应用。
所述的尖孢镰孢在苦荞麦种子萌发预处理上的应用，包括以下处理方法：
A、尖孢镰孢菌丝水提多糖的制备：将尖孢镰孢菌丝接种培养，收获菌丝体；菌丝体干燥后先去除单糖、二糖和脂类物质，再水提、精制后得到菌丝水提多糖；
B、纯度测定：测定尖孢镰孢Fataf9菌丝水提多糖的糖含量及相应纯度，以葡萄糖为标准品建立标准曲线；
C、处理液的配制：取尖孢镰孢菌丝水提多糖溶于无菌水中，调整其浓度为15-25mg/mL，过滤后备用；
D、苦荞麦种子消毒：选取成熟饱满、大小一致、无霉变的苦荞麦种子用消毒剂浸泡消毒，然后用无菌水洗净，晾干；
E、苦荞麦种子处理：将消毒后的苦荞麦种子置于步骤C所制得的并稀释的处理液中，在25℃、黑暗条件下浸泡10-16h，苦荞麦种子重量与处理液的体积比为1:10(m/v)；
所述的尖孢镰孢在苦荞麦种子萌发预处理上的应用，优选所述步骤A中，尖孢镰孢菌丝接种培养时，采用将活化的菌丝接种在PD培养基上，所述PD培养基含有苦荞粉水提液。
所述的尖孢镰孢在苦荞麦种子萌发预处理上的应用中，优选所述步骤E中,稀释的处理液的浓度为150-200μg/mL。
本发明以源自苦荞麦自身的有益内生真菌--尖孢镰孢Fataf9所产生的活性代谢物(菌丝水提多糖WPS)为诱导物对苦荞种子进行预处理，提高种子发芽率，且对苦荞种子无毒害作用，安全性高，促进萌发效果显著。尖孢镰孢Fataf9制备方便，有利于生产中规模化使用。采用尖孢镰孢Fataf9进行预处理的处理方法简单易行，成本低廉，容易操作，无过高的技术要求，并且提高苦荞种子发芽率和缩短萌发时间效果十分明显。同时，该方法具有很好的经济社会价值和应用前景。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是对不同储存年限的苦荞麦种子，本发明实施例与未处理的种子发芽率对比图；
图2是对不同储存年限的苦荞麦种子，本发明实施例与未处理的种子发芽率对比图。
图1图示中每组柱形图中6个柱体分别依次代表西荞1号(对照)、西荞1号(WPS处理)、川荞1号(对照)、川荞1号(WPS处理)、米荞1号(对照)和米荞1号(WPS处理)后的种子发芽率。
图2图示中每组柱形图中6个柱体分别依次代表西荞1号(对照)、西荞1号(WPS处理)、川荞1号(对照)、川荞1号(WPS处理)、米荞1号(对照)和米荞1号(WPS处理)后的种子发芽率。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图详细说明本发明的具体实施方式。
一、尖孢镰孢Fataf9的分离培养和鉴定
分离纯化
1、苦荞麦处理：选取健康的苦荞麦根和茎，对其根茎表面先用70％乙醇处理30s，然后用0.2％氯化汞处理20min进行表面消毒，去除苦荞麦的根茎表皮，将根、茎分成约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的块段，摆放在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上。
2、培养：先将PDA培养基中加入200μg/mL硫酸链霉素(Streptomycin sulfate)抑制细菌干扰，然后将其置于25℃下进行暗培养。
3、分离纯化：从培养第3天开始观察，观察PDA平板中苦荞根、茎组织块上长出的真菌菌落，在无菌操作条件下用接种针挑取其边缘菌丝进行分离培养；进一步对所分离得到的真菌菌落进行分离纯化，连续纯化4-5次，至菌落形态一致，即得到苦荞麦尖孢镰孢Fataf9。
然后将苦荞尖孢镰孢Fataf9保存在PDA试管斜面和平板上，并对其进行形态特征观察和分子生物学鉴定。
培养性状观察
将在PDA平板上生长良好的尖孢镰孢Fataf9打菌饼，菌饼直径为Ф＝5mm，每个PDA平板上放置一块直径6cm的玻璃纸，将菌饼接种到玻璃纸上，25℃下黑暗培养，每24h观察记录Fataf9菌落的形状、大小、色泽变化、质地、生长速度、是否产生色素等。
该尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)Fataf9在PDA培养基上生长良好，适宜的生长温度为20℃～32℃，最佳生长温度为25℃～28℃。另外，尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)Fataf9培养是在好氧条件进行的，培养基的适宜pH范围为pH6.0～pH7.5。
显微观察
将玻璃纸从PDA平板上取下，剪成1cm2大小，将其置于载玻片上，以无菌水为浮载剂制成标本后，在显微镜下观察菌丝体的粗细、分生孢子体的着生部位、形状、类型、大小、产孢方式等详细情况，以及分生孢子的出芽方式、是否有隔、大小、形状、表面特点、色泽等形态特征。
在PDA平板上的菌落为紫色，边缘白色，背部轮纹状，白色和紫色相间，菌落边缘整齐，气生菌丝较长，大孢子近镰刀形或长椭圆形，2～3个隔，小孢子为卵圆形或椭圆形，两种孢子大小为(4.3μm～17.5μm)×(1.8μm～4.7μm)。
分子生物学鉴定
活化苦荞尖孢镰孢Fataf9打菌饼，菌饼直径为Ф＝5mm，将其接种到PD液体培养基上，在25℃、150rpm下暗培养6天后收获，真空抽滤至干，收获新鲜菌丝。然后采用CTAB冻融法提取尖孢镰孢Fataf9的基因组DNA。
然后选用真菌通用引物：序列1：ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和序列2：ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对尖孢镰孢Fataf9的ITS区进行PCR扩增。扩增后的序列测序得到的结果与GenBank中其它种的真菌ITS全序列进行比对，找出相似性最高的亲缘关系最近的真菌。
所述的尖孢镰孢的ITS序列(序列3)为：
二、所述的尖孢镰孢Fataf9在苦荞麦种子萌发预处理上的应用：
1、具体应用是包括以下处理方法：
A、尖孢镰孢Fataf9菌丝水提多糖的制备：将尖孢镰孢菌丝接种培养，收获菌丝体；菌丝体干燥后先去除单糖、二糖和脂类物质，再水提、精制后得到菌丝水提多糖。
具体为：从斜面上挑取少许尖孢镰孢菌丝到PDA平板上活化培养，然后将尖孢镰孢Fataf9活化的菌丝接种于盛有PD培养基的三角瓶中，PD培养基中优选含2.5g/L的苦荞粉水提液，将其在25℃、150rpm下暗培养7d后收获菌丝体；将所得尖孢镰孢Fataf9菌丝体进行真空冷冻干燥，粉碎，采用95％乙醇:石油醚(1:1，v/v)对其进行热回流提取，以去除单糖、二糖和脂类物质。然后称取定量预处理的尖孢镰孢Fataf9菌丝粉末，采用90℃热水回流提取结合醇沉、透析等方法得到尖孢镰孢Fataf9菌丝水提多糖(WPS)。
B、纯度测定：测定尖孢镰孢Fataf9菌丝水提多糖的糖含量及相应纯度，以葡萄糖为标准品建立标准曲线；纯度测定是采用硫酸蒽酮比色法测定尖孢镰孢Fataf9菌丝水提多糖的糖含量及相应纯度。
C、处理液的配制：取菌丝水提多糖溶于无菌水中，调整其浓度为15-25mg/mL，过滤后得处理液备用；过滤方式可以采用多种，本实施例采用经微孔滤膜(0.4μm)过滤。
D、苦荞麦种子消毒：选取成熟饱满、大小一致、无霉变的苦荞麦种子用消毒剂浸泡消毒，然后用无菌水洗净，晾干；消毒剂采用0.5％次氯酸钠溶液，也可以采用其他适用本发明的消毒剂。消毒浸泡时间为10-15min。
E、苦荞麦种子处理：将消毒后的苦荞麦种子置于步骤C所制得的处理液中，在25℃、黑暗条件下浸泡10-16h，苦荞麦种子重量与处理液的体积比为1:10(m/v)，处理后的种子即可用于种植。
苦荞麦种子的发芽率通过发芽培养实验进行验证。
发芽培养的条件为：培养温度25℃、湿度70-75％，每天光照时间为10-12小时。
以下以具体实施例来说明本发明的应用：
实施例1
1、尖孢镰孢Fataf9在苦荞麦种子萌发预处理上的应用包括以下处理方法：
(1)尖孢镰孢Fataf9菌丝水提多糖的制备：
a.尖孢镰孢Fataf9的发酵培养：从试管斜面上挑取少许尖孢镰孢菌丝到PDA平板上活化培养5天，然后将活化的尖孢镰孢菌丝接种于PD培养基，其中按照每200mL PD溶液需加入20.0-25.0g/L的苦荞粉水提液20mL计，在PD培养基中加入苦荞粉水提液。接种后于25℃、150rpm下悬浮培养7天后收获，离心(4000rpm)得到尖孢镰孢Fataf9新鲜菌丝体。
b.尖孢镰孢Fataf9菌丝水提多糖的制备：
将所得尖孢镰孢Fataf9鲜菌丝体进行真空冷冻干燥，粉碎，然后采用95％乙醇:石油醚(1:1，v/v)对其在50-55℃下进行热回流提取2h，以去除菌丝体中的单糖、二糖和脂类物质，离心，收集残渣，50-55℃下烘干。
水提：称取定量预处理Fataf9菌丝粉末，将其置于热回流提取器内，添加一定比例的蒸馏水进行热回流提取，提取条件为：水料比为25:1-30:1(v/w)、提取温度90℃，提取时间2-3h，共提取2次，合并提取液。
分离精制：通过离心的方式分离提取液和菌丝体残渣，离心上清液浓缩至一定体积，添加3倍体积95％乙醇，在4℃下沉淀48～72h，然后采用离心方式将沉淀和上清液分开，收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮洗涤。
进一步将其溶液置于透析袋中透析，每隔12h更换一次透析外液(本实施例采用去离子水作为透析外液)，48h后，将透析袋内溶液进行真空冷冻干燥，即得苦荞尖孢镰孢Fat9菌丝水提多糖(WPS)。
c.处理液的配制：取一定量的苦荞尖孢镰孢Fat9菌丝水提多糖(经硫酸蒽酮比色法测定，其纯度达到85.6％)，将其溶于无菌水中，调整其浓度为20.0mg/mL，经微孔滤膜(0.4μm)过滤后备用。
(2)苦荞种子的选取：选择成熟饱满、大小适中、均匀一致、无霉变健康的苦荞种子作为材料。
(3)苦荞种子的消毒：将选取的苦荞种子用0.5％次氯酸钠溶液浸泡处理10min，然后用无菌水洗净，将其置于无菌滤纸上晾干。
(4)Fataf9菌丝水提多糖诱导处理苦荞种子：将消毒后的苦荞种子置于(1)所制得的处理液WPS溶液中(浓度调至150μg/mL)，在25℃、黑暗条件下浸泡12-16h，种子重量与菌丝多糖溶液的体积比为1:10(m/v)。
(5)苦荞种子发芽培养：将经过步骤(4)处理的苦荞种子均匀放置在铺有3层润湿滤纸的发芽盒(120×120×50mm)内，每盒100粒种子，然后将其置于人工气候箱内(温度25℃，湿度70-75％，光照时间12h/天)进行发芽培养，发芽周期为2-4d。发芽结束后，统计其发芽率。
实施例2
(1)尖孢镰孢Fataf9菌丝水提多糖和处理液的制备方法同实施例1。
(2)苦荞种子的选取：选择成熟饱满、大小适中、均匀一致、无霉变健康的苦荞种子作为材料。
(3)苦荞种子的消毒：将选取的苦荞种子用0.5％次氯酸钠溶液浸泡处理10min，然后用无菌水洗净，将其置于滤纸上晾干。
(4)Fataf9菌丝水提多糖诱导处理苦荞种子：将消毒后的苦荞种子置于(1)所制得的处理液WPS溶液中(浓度调至200μg/mL)，在25℃、黑暗条件下浸泡10-12h，种子重量与菌丝多糖溶液的体积比为1:10(m/v)。
(5)苦荞种子发芽培养：将经过步骤(4)处理的苦荞种子均匀放置在铺有3层润湿滤纸的发芽盒(120×120×50mm)内，每盒100粒种子，然后将其置于人工气候箱内(温度25℃，湿度70-75％，光照时间10h/天)进行发芽培养，发芽周期为2-4d。发芽结束后，统计其发芽率。
采用下述实验验证本发明效果：
对比实验1：
提高苦荞麦种子萌发的预处理方法按照以下步骤进行：
采用实施例1的方法，制备浓度为150μg/mL的苦荞尖孢镰孢Fataf9菌丝水提多糖(WPS)溶液，备用。
选取当季收获的新鲜苦荞种子(0年)以及室温自然储存0.5年、1年、1.5年、2.0年、2.5年，以及3.0年的苦荞种子(西荞1号)为实验材料。
将不同储存期的苦荞麦种子用0.5％次氯酸钠溶液浸泡处理10min，然后用无菌水洗净，将其置于滤纸上晾干。
将消毒后的苦荞种子分别置于WPS溶液中(浓度调至150μg/mL)，在25℃、黑暗条件下浸泡16h，种子重量与菌丝多糖溶液的体积比为1:10(m/v)。
五、将处理后的各苦荞种子均匀放置在铺有3层润湿滤纸的发芽盒内，每盒100粒种子，然后将其置于人工气候箱内(温度25℃，湿度70-75％，光照时间12h/天)进行发芽培养。发芽结束后，统计其发芽率。
空白对照：将各储存年限(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0年)的苦荞种子不经WPS溶液处理，而只是置于无菌水中，浸泡温度、时间及料液比均与上述处理方法一致。
如图1所示，本对比实验1中经Fataf9菌丝多糖溶液处理后各储存年限(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0年)的苦荞种子发芽率分别达到91％，86.3％，83.0％，72.0％，61.0％，在图1中分别依次为柱形图第3组、第4组、第5组、第6组中和第7组中的第2个柱体，相应空白对照的发芽率为82.3％，74.7％，56％，35％，21.3％，在图1中分别依次为柱形图第3组、第4组、第5组、第6组中和第7组中的第1个柱体，本发明的发芽率为空白对照的1.1-2.9倍，平均萌发时间有效缩短为60小时。
对比实验2：
以当季收获的新鲜苦荞种子(0年)以及室温自然储存0.5年、1.0年、1.5年、2.0年、2.5年和3.0年的苦荞种子“川荞1号”作为实验材料，其余提高苦荞麦种子萌发的预处理方法与对比实验1相同。
如图1所示，本实验中经Fataf9菌丝多糖溶液处理后各储存年限(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0年)的苦荞种子发芽率分别达到90.3％，85.3％，82.0％，73.0％，62.3％，在图1中分别依次为柱形图第3组、第4组、第5组、第6组中和第7组中的第4个柱体，相应空白对照的发芽率为82.0％，73.7％，55.7％，34.0％，22.7％，在图1中分别依次为柱形图第3组、第4组、第5组、第6组中和第7组中的第3个柱体，本发明的发芽率为空白对照的1.1-2.7倍，平均萌发时间有效缩短为60小时。
对比实验3：
以当季收获的新鲜苦荞种子(0年)以及室温自然储存0.5年、1.0年、1.5年、2.0年、2.5年和3.0年的苦荞种子“米荞1号”作为实验材料，其余提高苦荞麦种子萌发的预处理方法与对比实验1相同。
如图1所示，本实验中经Fataf9菌丝多糖溶液处理后各储存年限(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0年)的苦荞种子发芽率分别达到91.3％，86.0％，81.0％，69.0％，60.3％，在图1中分别依次为柱形图第3组、第4组、第5组、第6组中和第7组中的第6个柱体，相应空白对照的发芽率为83.0％，76.0％，58.0％，38.0％，22.3％，在图1中分别依次为柱形图第3组、第4组、第5组、第6组中和第7组中的第5个柱体)，本发明的发芽率为空白对照发芽率的1.1-2.7倍，平均萌发时间有效缩短为48小时。
对比实验4：
提高苦荞麦种子萌发的预处理方法按照以下步骤进行：
根据实施例2，制备浓度为200μg/mL的苦荞尖孢镰孢Fataf9菌丝水提多糖(WPS)溶液作为处理液，备用。
选取当季收获的新鲜苦荞种子(0年)以及室温自然储存0.5年、1年、1.5年、2.0年、2.5年，以及3.0年的苦荞种子(西荞1号)为实验材料。
将不同储存期的苦荞麦种子用0.5％次氯酸钠溶液浸泡处理10min，然后用无菌水洗净，将其置于滤纸上晾干。
将消毒后的苦荞种子分别置于WPS溶液中(浓度调至200μg/mL)，在25℃、黑暗条件下浸泡12h，种子重量与菌丝多糖溶液的体积比为1:10(m/v)，空白对照：将各苦荞种子置于无菌水中，浸泡温度，时间及料液比均与上述处理方法一致。
将处理后的各苦荞种子均匀放置在铺有3层润湿滤纸的发芽盒内，每盒100粒种子，然后将其置于人工气候箱内(温度25℃，湿度70-75％，光照时间10h/天)进行发芽培养。
如图2所示，本实验中经Fataf9菌丝多糖溶液处理后各储存年限(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0年)的苦荞种子发芽率分别达到91.7％，87.7％，81.7％，71.0％，58.7％，在图2中分别依次为柱形图第3组、第4组、第5组、第6组中和第7组中的第2个柱体，相应空白对照的发芽率为82.3％，74.7％，56％，35％，21.3％，在图2中分别依次为柱形图第3组、第4组、第5组、第6组中和第7组中的第1个柱体，本发明的发芽率为空白对照的1.1-2.8倍，平均萌发时间有效缩短为48小时。
对比实验5：
以当季收获的新鲜苦荞种子(0年)以及室温自然储存0.5年、1.0年、1.5年、2.0年、2.5年和3.0年的苦荞种子“川荞1号”作为实验材料，其余提高苦荞麦种子萌发的预处理方法与实验四相同。
如图2所示，本实验中经Fataf9菌丝多糖溶液处理后各储存年限(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0年)的苦荞种子发芽率分别达到90.0％，86.3％，81.3％，74.0％，60.7％，在图2中分别依次为柱形图第3组、第4组、第5组、第6组中和第7组中的第4个柱体，相应空白对照的发芽率为82.0％，73.7％，55.7％，34.0％，22.7％，在图2中分别依次为柱形图第3组、第4组、第5组、第6组中和第7组中的第3个柱体，本发明的发芽率为空白对照的1.1-2.7倍，平均萌发时间有效缩短为54小时。
对比实验6：
以当季收获的新鲜苦荞种子(0年)以及室温自然储存0.5年、1.0年、1.5年、2.0年、2.5年和3.0年的苦荞种子“米荞1号”作为实验材料，其余提高苦荞麦种子萌发的预处理方法与实验四、五相同。本实验中经Fataf9菌丝多糖溶液处理后各储存年限(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0年)的苦荞种子发芽率分别达到90.3％，86.3％，80.0％，70.0％，58.7％，在图2中分别依次为柱形图第3组、第4组、第5组、第6组中和第7组中的第6个柱体，相应空白对照的发芽率为83.0％，76.0％，58.0％，38.0％，22.3％，在图2中分别依次为柱形图第3组、第4组、第5组、第6组中和第7组中的第5个柱体，本发明的发芽率为空白对照的1.1-2.6倍，平均萌发时间有效缩短为36小时。

Claims (2)

1.一种尖孢镰孢菌丝水提多糖在苦荞麦种子萌发预处理上的应用，尖孢镰孢Fataf9于2014年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.10102。
2.根据权利要求1所述的尖孢镰孢菌丝水提多糖在苦荞麦种子萌发预处理上的应用，其特征在于，包括以下处理方法：
A、尖孢镰孢Fataf9菌丝水提多糖的制备：将尖孢镰孢Fataf9菌丝接种培养，收获菌丝体；菌丝体干燥后先去除单糖、二糖和脂类物质，再水提、精制后得到尖孢镰孢Fataf9菌丝水提多糖；
B、纯度测定：测定尖孢镰孢Fataf9菌丝水提多糖的糖含量及相应纯度，以葡萄糖为标准品建立标准曲线；
C、处理液的配制：取尖孢镰孢Fataf9菌丝水提多糖溶于无菌水中，调整其浓度为15-25mg/mL，过滤后备用得到处理液；
D、苦荞麦种子消毒：选取成熟饱满、大小一致、无霉变的苦荞麦种子用消毒剂浸泡消毒，然后用无菌水洗净，晾干；
E、苦荞麦种子处理：将消毒后的苦荞麦种子置于步骤C所制得并稀释的处理液中，在25℃、黑暗条件下浸泡10-16h，苦荞麦种子重量与处理液的体积比为1:10(m/v)；
所述步骤A中，尖孢镰孢Fataf9菌丝接种培养时，采用将活化的菌丝接种在PD培养基上，所述PD培养基含有苦荞粉水提液；
所述步骤E中，稀释的处理液的浓度为150-200μg/mL。
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