CN106399129B

CN106399129B - 一株哈茨木霉菌株及其应用

Info

Publication number: CN106399129B
Application number: CN201611087340.8A
Authority: CN
Inventors: 秦云霞; 阳江华; 唐朝荣; 肖小虎; 龙翔宇; 方永军; 戚继艳
Original assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2016-12-01
Filing date: 2016-12-01
Publication date: 2019-09-20
Anticipated expiration: 2036-12-01
Also published as: CN106399129A

Abstract

本发明公开了一株哈茨木霉及其应用。该木霉菌株为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13‑3‑2 CGMCC No.13163。该菌株及其代谢产物具有广谱抑制病原真菌活性，对峙生长实验表明，该木霉菌株具有拮抗橡胶树红根病菌，炭疽病菌等多种病原菌的能力，还具有防治其它多种污染杂菌和促进橡胶苗生长的作用。因此可以即时应用于橡胶树苗期培育过程，促进橡胶苗的健康生长，屏蔽或抑制橡胶树根部病害的发生。

Description

一株哈茨木霉菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株多功能哈茨木霉菌株及其应用。

背景技术

木霉属Trichoderma Pers.(有性阶段曾称为“肉座菌属”Hypocrea Fr.)隶属于粪壳菌纲Sordariomycetes，子囊菌门Ascomycota，肉座菌科Hypocreaceae，肉座目Hypocreales。该属真菌种类繁多，分布广泛，是一类重要的可再生自然资源，具有较高经济价值和应用前景(Doi 1969，1972；朱兆香和庄文颖，2014)。木霉菌(Trichoderma spp.)是一类重要的多功能益生真菌，广泛存在于自然界中。它们不仅能通过多种机制来控制病原菌的侵染和病害的发生，且还具有促进作物生长、提高作物抗生物和非生物胁迫的能力，是一种公认的环境友好型真菌，应用于农业、工业、环境保护等领域，其中部分种类对植物病原真菌具有较强的杀伤能力，自1950年代以来，木霉属真菌作为生防菌的功能渐渐得到人们的重视和应用。

研究表明，橡胶树红根病的致病菌是Ganoderma pseudoferreum(Wakef.)Over.etsteinm，具有寄主多、潜伏期长、在土壤中蔓延迅速等特点，是严重危害橡胶树的根部传染性病害。红根病病原菌属于真菌界层菌纲，担子菌门，灵芝属，危害巴西橡胶树根颈部，主要依靠根系接触传染，也可通过风雨和昆虫传播。橡胶树红根病在我国各植胶区内发生普遍，感染严重的林段发病率可达4.0％,若没有及时处理死亡率可为100％。橡胶树根病的调查需要大量人力劳动，早期跟踪调查工作不到位，普查效率低。而当橡胶树地上部出现明显的病症时，已是侵染严重发病时期，防治成本高且防效差。

由于橡胶树是多年生高大乔木，利用生防菌有效防治红根病等多种病害，将是一项延长橡胶树采胶年限，保护环境的有力举措。

尽管木霉菌是一类应用前景广阔的资源微生物，利用其拮抗性进行生物防治是生态农业可持续发展的一个重要方面，是近年来生防菌剂研制开发的热点，但是要筛选到高效防治某一植物的具体病原菌并且有目的地用于生物防治，需要做大量的基础工作。比如需要考虑该木霉菌的生物学适应性、其扩繁、保存、生产和应用成本，退化及变异等问题。

发明内容

木霉菌与植物协同进化，独特而丰富，而且木霉菌对不同作物甚至不同品种都有特异性，发明人通过多年的实验发现，木霉菌对橡胶树红根病病菌具有很强的体外拮抗能力，考虑到木霉菌的地域适应能力及拮抗能力的差异，因此决定筛选本地优势菌株。

本发明的目的是提供一株具有广谱抑制病原真菌的哈茨木霉(Trichodermaharzianum)Hb13-3-2菌株，它是从海南热带地区分离得到的本地菌株，不但能够抑制橡胶树红根病菌侵染橡胶苗，而且能够促进橡胶苗生长，是具有推广应用价值的益生菌株。

本发明所得的菌株具有生长繁殖快、成本低、抑菌谱宽、而且对叶部病害和根部病害都有抑制作用等优点。本发明的目的是提供一株能够抑制橡胶树红根病菌、橡胶树棒孢霉落叶病菌、橡胶树炭疽病菌等多种病菌的具有较广抑菌谱的木霉菌，它生长快，扩繁效率高，并能促进橡胶苗的生长，因而有望应用于橡胶苗商业化生产的菌株。

本发明通过从产胶橡胶树根际、胶园土壤、橡胶树种质材料的不同组织中分离筛选，纯化得到体外抑菌拮抗效果达80％以上的哈茨木霉生防菌Hb13-3-2菌株；利用组培材料，体内同时接种木霉菌和红根病菌，发现木霉菌抑制红根病菌在组培苗上的侵染效率达到100％，在考察该木霉菌株的生物学特性及厚垣孢子形成特性后发现，该菌株将是防治橡胶树红根病的生物菌肥开发的优选菌株，可以应用于生物防治和促进农业可持续发展应用中。

本发明所述哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2是从海南省儋州市橡胶种植区一株感染红根病的橡胶树根际土壤中分离得到的，已于2016年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号为CGMCC No.13163。

所述哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2的基本培养形态特征为：在PDA平板上，28℃培养菌落直径的平均生长速度为4.9cm/天。菌丝具分枝，有隔，无色，直或弯曲，光滑；分生孢子梗对称分枝或偶尔轮生分支，无隔，梗基比梗顶端稍粗，一般有2-3次分枝，着生分生孢子的小梗瓶形；分生孢子单孢，椭圆状或球状。

以上述哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2为活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围。在需要的时候，该菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。

哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163在作为植物病原菌拮抗菌中的应用也属于本发明的保护范围。

哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用也属于本发明的保护范围。其中，所述植物病原菌为橡胶树红根病菌，橡胶树棒孢霉落叶病菌，橡胶树炭疽病菌，香蕉枯萎病菌和/或大薯炭疽病菌。

本发明还要求保护一种植物病原菌拮抗菌剂，其活性成分为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163。

本发明还要求保护一种生物菌肥，包括哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163。

所述生物菌肥中还包括钼元素、锌元素和/或铜元素。所述钼元素通过钼酸铵添加，添加的质量百分浓度为0.05％-0.3％；所述锌元素通过硫酸锌添加，添加的锌离子的浓度是1-4mM，所述铜元素通过硫酸铜添加，添加的质量百分比浓度为0.0001-0.001％。

所述生物菌肥中还可以包括大量元素和/或有机肥。

哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163在促进橡胶树幼苗或组培苗生长和/或在制备促进橡胶树苗或组培苗生长的生物菌剂或生物菌肥中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还要求保护哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCCNo.13163在制备挥发性抑菌气体中的应用；其中，挥发性气体对橡胶树红根病菌，橡胶棒孢霉落叶病菌，橡胶树炭疽病菌，香蕉枯萎病菌和/或大薯炭疽病菌具有抑菌效果。

本发明所得的菌株具有生长繁殖快、成本低、抑菌谱宽、而且对叶部病害和根部病害都有抑制作用等优点。该菌株及其代谢产物具有广谱抑制病原真菌活性、能够产生具有抑制病原真菌的活性挥发性物质，该菌株能够拮抗橡胶树红根病菌，拮抗炭疽病菌，对橡胶幼苗无害，而且在适当增加木霉菌快速扩繁所需营养物质后，能够广泛应用于植物组培繁育的污染防治、促进生长，缩短生根培养和壮苗的时间。

利用组培材料，体内同时接种哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2木霉菌和红根病菌，发现本发明的木霉菌对红根病菌的抑制率达到100％，结合平板对峙结果和橡胶苗共培养试验结果可知，该菌株将是防治橡胶树红根病的生物菌肥开发的优选菌株。

本发明的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163及其代谢产物具有广谱抑制病原真菌活性、能够产生具有抑制病原真菌的活性挥发性物质。对峙生长实验表明，该木霉菌株具有拮抗橡胶树红根病菌，炭疽病菌等多种病原菌的能力，还具有防治其它多种杂菌污染和促进橡胶苗生长的作用。在橡胶苗规模化培育过程中，具有防止橡胶苗被污染的作用。因此可以即时应用于橡胶树苗期培育过程，促进橡胶苗的健康生长，屏蔽或抑制橡胶树根部病害的发生。该菌株对橡胶幼苗无害，而且在适当增加木霉菌快速扩繁所需营养物质后，能够广泛应用于植物组培繁育的防治污染、促进生长，缩短生根培养和壮苗的时间。

本发明中所述的木霉菌株Hb13-3-2是可以内生于植物。该特性是通过接种橡胶苗共培养一段时间后，可以重新分离得到该菌株。通过对其生长特性和可能的功能进行较细致的比较分析后，发现如微量元素Cu²⁺、Mo²⁺和中量元素Zn²⁺对木霉菌分生孢子和厚垣孢子形成有一定影响。同时对木霉菌在橡胶树组培苗污染防治、根部病害防范及其对苗期生长的影响进行分析。结果表明：在合理调控木霉菌生长的营养需求条件下，可以高效防除污染、防治根部病害，并且促进橡胶苗快速生长，具有良好的开发应用潜力。另外，该木霉菌株对生长抑制剂重铬酸钾的耐性也比较强，能够在1000μg/mL浓度下存活，该特性可以应用于检测其田间应用情况。

附图说明

图1为Hb13-3-2在PDA培养基上的生长和分生孢子形成情况以及在孟加拉红培养基上7d的生长情况，图1中A为Hb13-3-2在PDA培养基上生长4天的情况、B为Hb13-3-2在孟加拉红培养基上生长10天后分生孢子形成情况，棉兰染色显示其分生孢子梗及分生孢子形态；图1中C和D为Hb13-3-2在孟加拉红培养基上7d的生长情况，显示其褶皱纹(C为正面特征，D为背面生长特征)。

图2为在不同培养基平板上培养10天时Hb13-3-2菌株的生长状态；图2中A为土豆培养基，B为NA培养基，C为胡萝卜培养基，D为CA培养基，E为玉米粉培养基，F为Min培养基。

图3为Hb13-3-2在不同碳源培养基上的生长情况，A为甘露醇、B为山梨醇、C为甘油、D为淀粉、E为玉米粉、F为半乳糖、G为葡萄糖、H为果糖、I为蔗糖、J为木糖。

图4为Hb13-3-2在不同碳/氮比率下的生长情况，其中，A为碳氮比0:0(只添加碳源而不加氮源)，B为碳氮比10:1，C为碳氮比20:1，D为碳氮比40:1，E为碳氮比80:1。

图5为微量元素钼对木霉菌株Hb13-3-2的促生作用。图中Mo0是不加钼元素，Mo1-Mo5代表钼元素的质量百分比浓度为0.05％、0.1％、0.15％、0.2％和0.3％。

图6中量元素Zn²⁺和微量元素Cu²⁺对木霉菌株Hb13-3-2的促生作用(图6I中，A为0PPMCuSO4、B为1PPMCuSO4、C为6PPMCuSO4、D为10PPMCuSO4,图6的II，A为0mMZnSO4、B为0.5mMZnSO4、C为1mMZnSO4、D为2mMZnSO4、E为4mMZnSO4、F为10mMZnSO4)。

图7木霉菌Hb13-3-2与红根病病菌B05的对峙生长9天的效果，其中A为红根病菌B05生长13天的情况，B为B05先接种4天后，再接种Hb13-3-2，对峙共培养生长9天时的情况。

图8为在PDA平板上Hb13-3-2菌株与植物病原真菌对峙培养时病原菌受抑制的情况；图中A和B为橡胶树炭疽菌株HDHL和Hz、C为橡胶树棒孢霉落叶病菌、E为香蕉枯萎病菌FOC4,D和F分别代表大薯的两株炭疽病菌12DP116和12DP06。

图9为在PDA平板上Hb13-3-2与香蕉枯萎病菌以及橡胶棒孢霉落叶病菌YN49对峙培养6天试验结果I是与FOC4对峙6天，II是与YN49对峙培养6天。

图10为Hb13-3-2抑制大薯炭疽病菌12DP06(I)和12DP116(II)侵染木薯叶片的情况图中每片叶子上方(A和C)的是同时接种病原菌和木霉菌，下方(B和D)是只接种病原菌作为对照。

图11为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163产生挥发性物质及该物质对病原真菌的抑制作用实验。图中A，C，E，G为对照，B，D，F和H是受挥发性产物影响后被抑制的情况。

图12为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163挽救污染橡胶试管苗的试验A，(1-12)分别是热研7-33-97自根无性系胚从萌发逐渐形成一个健康个体过程中受到污染的苗子；B，是将A所示的污染苗子同一天即时接种Hb13-3-2营养液，24天后的污染苗子被挽救成活的样子(每一个试管接种Hb13-3-2分生孢子营养液1ml，浓度为10⁷个/ml)。

图13为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163促进橡胶试管苗生长的试验I和II为两次独立重复试验，显示用Hb13-3-2处理后橡胶苗比对照生长更快、更壮的结果，II中箭头所指为新生叶蓬，对照没有新生叶蓬出现。

图14为利用哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2的保护可以提前打开试管苗的盖子培育壮苗的试验。

图15为Hb13-3-2在植物不同组织的定植情况A，主根或侧根段；B，茎段；C，下部叶切片片；D，顶部嫩叶切片。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2菌株的筛选和鉴定

1、木霉菌株的筛选

Hb13-3-2菌株是我们从海南省儋州市橡胶种植区一株感染红根病的橡胶树根际土壤中分离得到的，采集橡胶树根际5-10cm土层的土样，按采集地顺序和分离先后顺序编号。采用稀释平板法，对各土样按10^-3、10^-4的不同浓度稀释，接种于孟加拉红培养基上(PDA+氯霉素0.015g/L+链霉素0.015g/L+孟加拉玫瑰红0.05g/L)，28℃培养3d；挑取木霉菌菌落再接种于孟加拉红培养基上(不加抗生素)，28℃培养3d，进一步单孢分离纯化，获得木霉菌株，再编号鉴定。

对分离纯化的木霉菌株进行病原菌拮抗菌的筛选，最终获得一株对多种病原菌特别是橡胶树红根病病原菌具有优异拮抗性能的木霉菌，将其命名为Hb13-3-2。

2、Hb13-3-2菌株的形态特征

将Hb13-3-2菌株接种于PDA培养基平板上培养，该菌株的形态特征为：在PDA平板上，28℃培养1天后菌落直径为4.9cm，有基内菌丝和气生菌丝，菌丝具分枝，有隔，无色，直或弯曲，光滑；分生孢子梗对称分枝或偶尔轮生分支，无隔，梗基比梗顶端稍粗，一般有2-3次分枝，着生分生孢子的小梗瓶形；分生孢子单孢，椭圆状或球状。基本生长特性及类别如表1和图1所示。

表1 Hb13-3-2的基本生长特性及类别

Hb13-3-2在PDA平板上，菌丝生长旺盛，菌落平整，边缘较规则；在孟加拉红培养基上平板背面产生明显且较规则的褶皱纹(见图1-D孟加拉红培养基平板背面褶皱纹)。

3、本发明中木霉菌株Hb13-3-2的分子鉴定

利用通用引物ITS4、ITS5扩增ITS1-5.8S-ITS2段序列，送到上海生物工程技术服务有限公司测序，所得序列信息通过TrichoKEY软件进行序列比对，鉴定菌株种类。

a.木霉基因组DNA的提取

参照曹文波等(2008)的方法并略作修改，具体步骤如下：收集分离培养生长在PDA培养基上的Hb13-3-2菌株的菌丝，称取0.1g用液氮研磨，加入已经预热好的CTAB提取液(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA,pH8.0，2％CTAB)，并添加少许灭菌了的石英砂，在研钵中将孢子充分研磨后移入离心管中，并在65℃下孵育15分钟，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1v/v/v)溶液，用力震荡上下颠倒混匀，12000r/min离心10min，将上清液移入到另一个新离心管中，再加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1v/v/v)溶液，用力震荡上下颠倒混匀，12000r/min离心10min；取上清液到另一个新离心管中加入等体积的异丙醇和1/10体积的3mol/LNaAc溶液(pH5.2)，一20℃放置20min，12000r/min离心5min，弃上清、倒置使管壁液体流尽，加70％无水乙醇漂洗两次DNA沉淀，离心1min，弃上清，室温风干挥发乙醇，加入灭菌水溶解。放置4℃冰箱过夜溶解；一20℃保存。

b.rDNA一ITS区测序分析

所用引物序列:ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；ITSS:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’；pCR反应体系(25μL):Taq酶0.20μL，10xbuffer 2.5μL、dNTP0.2μL、10μL的primer各0.5μL，ddH2O 21.1μL。DNA模板25ng PCR扩增程序：94℃预变性4min，94℃变性30秒，57℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

该菌株的rDNA-ITS序列如序列表中序列1所示的ITS1，ITS2区域部分序列，结果发现其与不同Trichoderma属菌株的rDNA-ITS区序列相似性为98～100％。

tef1鉴定序列如序列表中序列2所示，选用延伸因子1(tef1)的α-基因片段用于鉴定，是因为该片段中含有比较长的第四个内含子，理论上内含子越长，能够辨析的种内、种间序列差异序列越丰富，可以更好地用于鉴定差异。

通过上述表型特征和分子特征将Hb13-3-2菌株鉴定为哈茨木霉(Trichodermaharzianum)，已于2016年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号为CGMCC No.13163。

4、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163不同保存方法的研究

利用PDA培养基作为活化培养基。主要采用了四种方法，分别是4℃平板保存法，常温石蜡油保存法、-80℃超低温保存法、斜面保存法。4℃平板保存法：PDA平板接种Hb13-3-2菌块后，28℃暗培养1周后保存于4℃；-80℃超低温保存法：PDA平板接种Hb13-3-2菌块后，28℃暗培养2周后，用营养液把分生孢子洗下来，与灭菌甘油混合均匀，于-80℃保存；斜面保存法：将斜面活化培养好的，具有大量成熟分生孢子保菌管4℃保存。常温石蜡油保存法：向斜面活化培养好的，具有大量成熟分生孢子保菌管中加入严格灭菌后的石蜡油(石蜡油的量要充分覆盖培养面)封口膜封闭，室温保存。

结果发现，常温石蜡油保存法可以保持菌的活性，但是复活时菌丝相对生长慢；4℃平板保存时间越长被污染的可能性大。为降低污染，在有条件的情况下，可以采用-80℃保存法作长期保存。

实施例2、Hb13-3-2菌株的生物学特性

一、Hb13-3-2菌株的碳源、氮源需求特性

1、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163最适生长培养基的确定

哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163在如下所述的固体培养基(pH6)平板上生长情况的比较：

Min(Minimal agar medium)培养基:KNO₃ 10g，KH₂PO₄ 5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeCl₃ 0.02g，葡萄糖10g，琼脂20g，定容到1000mL；

PDA(马铃薯葡萄糖)培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂14g，去皮马铃薯煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL；

CMV(玉米粉)培养基：玉米粉30g，琼脂14g，煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL；

OA(燕麦)培养基：燕麦片30g，琼脂14g，煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL；

CA(胡萝卜)培养基：胡萝卜200g，葡萄糖20g，琼脂14g，煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL；

NA培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，琼脂14g，定容至1000mL；

上述培养基均在121℃，灭菌20min。

分别在直径9cm的培养皿中倒入20mL融化的上述六种固体培养基，凝固后即得各种培养基的等厚度固体平板，在平板中央接种直径约4mm大小的哈茨木霉(Trichodermaharzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163菌块，每种培养基设三次重复，28℃暗培养，每天测量菌落大小，计算菌落生长速度，10天后拍照。

结果如表2所示，在CA平板上生长速度最快，其次为PDA平板，Min平板，OA平板，NA平板和CMV平板，在CMV平板上的生长速度最慢。如图2所示，Hb13-3-2菌株在6种不同培养基上的菌丝生长速度差异不大，但是分生孢子形成量存在明显差异，从其在最低营养培养基和玉米培养基上的生长情况来看，可以看出该菌株生长和营养需求不高，属于容易扩繁类型。在CMV，NA，PDA和CA培养基上菌落质地疏松，在Min和OA培养基上菌落质地非常紧密。分生孢子的形成的快慢顺序是Min>CMV>OA>CA>NA>PDA平板,菌落由淡绿色变为绿色，深绿色。

表2.Hb13-3-2在不同培养基上的生长速度(菌落直径/培养时间)

2、Hb13-3-2菌株的碳源、氮源需求特性

不同碳/氮源对哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163生长的影响

配制不同碳源的培养基：以Czapek培养基为基本培养基，分别用甘露醇，甘油、玉米粉、D-葡萄糖，半乳糖，淀粉，D-山梨醇，D-果糖，D-木糖替换Czapek培养基中的蔗糖，其它成分不变，制备以这些物质为唯一碳源的培养基(加入琼脂配制固体培养基)。

配制不同氮源的培养基：以Czapek培养基为基本培养基，分别用硝酸钾，硝酸铵，硫酸铵，酵母提取物，牛肉浸膏，酵母浸膏，蛋白胨替换Czapek培养基中的硝酸钠，其它成分不变，制备以这些物质为唯一氮源的培养基(加入琼脂配制固体培养基)。

上述Czapek培养基的配方为：MgSO4·7H₂O 0.5g，K₂HPO₄ 1g，KCl 0.5g，FeSO₄ 7H₂O0.01g，NaNO₃ 2g，蔗糖20g，定容至1000mL，pH7.0(加入琼脂配制固体培养基)。均经121℃，20min灭菌。

采用固体平板法测其菌落平均直径计算生长速度：分别将上述不同碳原和氮原的固体培养基灭菌后，分别倒入直径9cm的培养皿中，20mL/皿，凝固后即得的等厚度上述不同固体培养基平板。在平板中央接种直径约4mm大小的菌块，设三次重复，28℃暗培养3天，用十字交叉法测量菌落直径。结果如表3所示，结果表明，在含唯一碳源为蔗糖的平板上，其生长速度最快，而在含唯一碳源为D-山梨醇的平板上生长最差，在以D-木糖(图3中J)和半乳糖(图3中F)为唯一碳源的平板上其生长速度不如在甘油、淀粉、玉米粉、D-果糖、D-甘露醇和D-葡萄糖平板上的(图3)。

Hb13-3-2菌株在10种碳源条件下的生长速度差异不明显，但是不同碳源对分生孢子形成数量和速度影响很大，比如在甘油、淀粉和玉米粉培养基上，可以快速形成大量的分生孢子。考虑的产品的价格等因素，所以以后扩繁培养Hb13-3-2时，应选用玉米粉、甘油、淀粉作为碳源。

如表3所示，在含唯一氮源平板上，在以酵母提取物为唯一氮源的平板上生长最快，其次分别为酵母浸膏，硝酸钠，硝酸钾，硫酸铵，大豆蛋白胨，而在牛肉浸膏和硝酸铵平板上生长最慢。Hb13-3-2菌株在8种氮源条件下的生长速度虽有差异，但是考虑到产品价格等因素，菌培养时我们选用硫酸铵作为氮源。

表3.不同唯一碳氮源、碳源平板上Hb13-3-2菌株生长直径(mm/天)

二、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2菌株的碳/氮比率需求特性

由于Hb13-3-2能很好地利用玉米粉作为碳源，兼顾成本及材料的易得性，本发明以玉米粉和硫酸铵作为碳源(30g/L)和氮源(比例分别是碳源与氮源的摩尔比)为0:0(0指的是加碳源，不加氮源)，10:1，20:1，40:1，80:1)，再加入K₂HPO₄ 1g/L，KCl 0.5g/L，FeSO₄.7H₂O 0.01g/L，MgSO₄.5H₂O 0.5g/L，Agar 14g/L，考察其碳、氮比率需求特性。

结果如表4和图4所示，在相同的培养时间内Hb13-3-2菌株在5种比例的培养基上都有分生孢子形成，以0:0的比例(不加硫酸铵只加碳源)形成的数量多，说明该菌生长对碳源需求多，对氮源需求很少。

表4、Hb13-3-2菌株在不同碳/氮比率培养基上的生长情况

三、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163菌株生长温度范围研究

PDA平板的制备：在直径9cm的培养皿中倒入20mL溶化的PDA固体培养基，凝固后即得等厚度的PDA固体平板，在平板中央接种打孔得到的直径约4mm大小的菌龄为3天的Hb13-3-2菌块，分别置于不同的温度(4℃(处理3天)，16℃(处理3天)，20℃(处理3天)，28℃，37℃和45℃(处理1h)，50℃(处理1h)，55℃(处理1h))后再放置于28℃下暗培养，每个测试温度设三次重复，观察菌落生长情况。在所采用的8个温度中，28℃为其生长最适温度，55℃处理1h，虽然菌丝生长降低为1cm/天，但是还不会死亡，说明该菌对高温和低温都具有一定的适应能力。

实施例3、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2菌株的对特殊培养条件的耐性

一、Hb13-3-2菌株的耐盐碱特性

配制含有盐份NaCl(质量百分浓度分别为1％、3％、5％、7％、10％或15％)或KCl(质量百分浓度分别为1％、3％、5％、7％、10％或15％)的PDA培养基、含有碱份KOH(质量百分浓度分别为1％、3％、5％、7％或9％)的PDA培养基、含有NaOH(质量百分浓度分别为1％、3％、5％、7％或9％)的PDA培养基或含有Na₂CO₃(质量百分浓度分别为1％、3％、5％、7％或9％)的PDA培养基，用于检测Hb13-3-2菌株对不同浓度盐碱的耐受。

制备上述培养基的平板，并接种Hb13-3-2菌株菌块，每个培养基处理三次重复。28℃暗培养7天,用十字交叉法测量菌落直径。

结果如表5所示，Hb13-3-2菌株至少能耐受质量百分比浓度为7％的NaCl，至少能够耐受11％KCl。但是对碱的耐受力很差，在三种碱KOH、NaOH或Na₂CO₃质量百分比浓度为1％的浓度上不能够生长。

表5.Hb13-3-2菌株在含不同浓度盐、碱的PDA平板上生长7天后菌落平均直径(cm)

三、Hb13-3-2菌株的pH特性

木霉菌(Trichoderma)Hb13-3-2 CGMCC No.13163生长pH值范围检测：

制备不同pH值的PDA平板：分别用1M HCl和1M NaOH调节液体PDA培养基pH值到4，5，6，7，8，9，10，11，12，调节好pH后，加入琼脂配制成固体培养基，121℃，20min灭菌得到PH值分别为4，5，6，7，8，9，10，11，12的PDA平板。

在上述制备的pH值分别为4，5，6，7，8，9，10，11或12的PDA平板中央分别接种一个用灭菌打孔器打取直径约4mm大小的菌龄为PDA固体平板培养4天的菌块，分别置28℃暗培养，培养3天，分别用十字交叉法测量菌落直径，三次重复，求取平均数和标准差。结果如表6所示，结果表明，该菌株在供试pH4～8范围内都能生长，生长速度差异不大，最适生长pH为5，虽然在碱性培养基上也能生长，速度显著减慢，也应该考虑到pH11和pH12时，酸碱度的不准确性，但是至少可以说明该菌在偏碱性环境下是可以存活的。

表6 Hb13-3-2 CGMCC No.13163在不同pH培养基上的生长速度

实施例4、木霉菌(Trichoderma)Hb13-3-2菌株CGMCC No.13163对不同浓度重铬酸钾的耐受研究

重铬酸钾是一种重金属盐类，能够抑制真菌的生长，在分离土壤放线菌时，培养基中加入50μg/mL的重铬酸钾即可较好得起到抑制真菌污染的效果。本实验用10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL或1000μg/mL的重铬酸钾的PDA培养基的平板，接种木霉菌(Trichoderma)Hb13-3-2菌块，每个浓度的重铬酸钾处理进行三次重复，将平板置于28℃暗培养，每天测量菌落直径。

结果如表7所示，随着重铬酸钾浓度的升高，菌株Hb13-3-2的生长速度递减。Hb13-3-2菌株在含1000μg/mL重铬酸钾的PDA平板上，1天后菌落直径为1.3cm，5天后菌落直径可达7.1±0.5cm。由于该菌株对重铬酸钾具有较强的耐性，在以后考察其在植物根部的定植鉴定过程中，利用该特性可以很好的抑制杂菌污染，从而可以将其或相关菌从宿主植物中分离出来。

表7.木霉菌(Trichoderma)Hb13-3-2在含不同浓度重铬酸钾的PDA平板的菌落平均直径(cm/天)

浓度(μg/mL)	10	50	100	150	200
						平均直径(cm)	2.72±0.12	2.51±0.11	2.17±0.15	2.12±0.08	1.84±0.09
浓度(μg/mL)	300	400	500	600	1000
						平均直径(cm)	1.57±0.09	1.50±0.07	1.47±0.14	1.33±0.08	1.30±0.1

实施例5、微量元素钼、铜和中量元素锌对哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2的促生作用

一、微量元素钼对木霉菌株Hb13-3-2的促生作用

钼肥具有1)纯度高，不含对作物有害杂志成分2)溶解性能好：有效成分完全水溶，3)吸收效率高：酸碱适度，养分形态适合作物吸收；4)肥效持久：具有良好的叶片附着能力，耐雨水冲刷，肥效持久；5)增产优质等特点。为了探索钼肥是否会促进木霉菌的生长这个问题，本发明利用PDA为基本培养基，添加5个质量百分比浓度(0，0.05％，0.1％，0.15％，0.2％，0.3％)的钼酸铵，接种平板放置在28℃暗培养10天,用十字交叉法测量菌落直径并观察分生孢子形成量。结果表明，在0.05％-0.3％范围内，添加钼肥会促进木霉菌菌丝快速生长、增厚和分生孢子形成，以添加0.2％的钼肥效果最好。具体如图5所示，图5中，A为不加钼元素；B为添加0.05％的钼元素；C为添加0.1％的钼元素；D为添加0.15％的钼元素；E为添加0.2％的钼元素；F为添加0.3％的钼元素。

二、中量元素锌和铜对哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2的促生作用

利用PDA为基本培养基，添加6个浓度(0，0.5，1，2，4,10mM)的硫酸锌或浓度为0、1PPM、6PPM、10PPM(1PPM相当于质量百分浓度为百万分之一)硫酸铜配置成相应的平板，同一天接种后放置在28℃暗培养10天,用十字交叉法测量菌落直径并观察分生孢子形成量。

结果表明，在1-10PPM Cu²⁺离子范围内和1-4mM Zn²⁺的浓度范围内，添加锌元素和铜元素会促进木霉菌菌丝快速生长、增厚或分生孢子形成(图6)。

实施例6、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163对多种病原菌拮抗作用的测试

一、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163与病原菌的对峙试验

检测哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163与病原真菌的拮抗活性，包括橡胶树红根病菌，橡胶树棒孢霉落叶病菌，橡胶树炭疽病菌，香蕉枯萎病菌，大薯炭疽病菌等。

供试病原真菌有：香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporium f.sp.cubense)4号小种(FOC4)(孙勇,曾会才,彭明,王旭初,易小平*香蕉枯萎病致病分子机理与防治研究进展[J].热带作物学报2012，33(4)：759-766)，橡胶炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides，购买于中国农业微生物菌株保藏管理中心，保藏编号ACCC No.30012)，下述根据其在拮抗实验中的编号将其命名为HDHL，橡胶树棒孢霉落叶病菌(Corynesporacassicola，购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No.3.10072)，下述根据其在拮抗实验中的编号将其命名为HbYN58，另外自行采集并鉴定一株橡胶树棒孢霉落叶病菌，根据其在拮抗实验中的编号命名为YN49；两株大薯炭疽病菌按照常规方法从海南大薯田间采集并鉴定，根据其在拮抗实验中的编号将其命名为12DP06和12DP116，橡胶树红根病病原菌(G.pseudoferreum)菌株YN1(涂敏等，橡胶树红根病菌遗传多态性的RAPD分析，2012，中国植物病理学会2012年学术年会论文集)、B05和橡胶树红根病菌(海南分离株)DF，由本单位种质资源课题组的涂敏博士采自不同橡胶种植区，按照常规方法从田间表现红根病症状明显的橡胶树上采集样品，纯化、培养，鉴定性状等。本实验在应用之前进一步分子鉴定确认，用PDA平板保存于4℃冰箱，定期复苏培养。

橡胶树红根病病菌的增殖培养方法：经过(A、1/2MS+CMA；B、CMA；C、PDA；D、PDA+胡萝卜E、1/2MS+PDA)5种培养基的试验，发现红根病菌在1/2MS+CMA(玉米粉培养基)和1/2MS+PDA培养基上扩增培养生长速度快。

对峙培养与抑菌率：在相同的1/2MS+PDA培养基上，与木霉菌生长速度相比，红根病菌B05的生长还是相对慢些(7.8±0.45mm/天)，为了更准确鉴定木霉菌的拮抗效果，采用先把复壮培养好的橡胶树红根病菌接种到培养平板上，在28℃恒温培养箱中培养，等病菌直径长至约3-4cm时，再接种Hb13-3-2 CGMCC No.13163木霉菌，二者间隔2～3cm，重复接种3次。在28℃恒温培养箱中培养并定期观察、记录和拍照。定期测量病菌的生长直径，同时测量没接种木霉菌的病菌的生长情况(对照)，计算抑制率。而对于橡胶棒孢霉落叶病菌HbYN58(生长速度为6.3mm±0.09/天)，橡胶树炭疽病菌(HDHL的生长速度为6.0mm±0.12/天；Hz的生长速度为4.0mm±0.15/天)，香蕉枯萎病菌(FOC4的生长速度为3.9mm±0.3/天)，大薯炭疽病菌(12DP116菌株在培养基上的生长速度为10mm±0.08/天，12DP06菌株为13mm±0.05/天)也是相对较慢的，因此也和红根病菌一样，先接种病原菌，而后接种Hb13-3-2木霉菌，这样做的目的是为了更加确定木霉菌是否真正能够杀死或抑制病原菌的生长，因为先行培养病原菌，病原菌在平板上占据优势，如果木霉菌在处于劣势下能够在对峙中最后杀死或抑制病原菌，才能更好地证明其功能。而后我们也做了将病原菌和Hb13-3-2同一天对峙接种于培养平板上的试验，6天的对峙结果是100％抑制病原菌的(图9)；红根病菌也是一样的，同时接种病原菌和Hb13-3-2，Hb13-3-2对红根病菌的抑制率达100％。抑菌率(％)＝(对照组病菌的菌落半径－处理组病菌的菌落半径)×100/对照组病菌的菌落半径。数据处理利用统计分析软件DPS(7.5版)进行。

表8. 9天对峙培养，Hb13-3-2对不同病原真菌的抑制率

木霉菌Hb13-3-2 CGMCC No.13163对对峙培养的实验结果表明(图7)，在B05先行接种4天后，B05的直径在2.7-4.0cm时，再接种Hb13-3-2，对峙培养9天后，Hb13-3-2对红根病菌均有显著地拮抗效果，能够快速抑制、侵占、甚至杀死红根病病菌菌丝体。图中B05完全被Hb13-3-2包围，不可再生长。图7中B05完全被Hb13-3-2包围，不可再生长。另外，对YN1和BT的拮抗效果也达到DF相似的水平(图表中未显示)。木霉菌Hb13-3-2 CGMCC No.13163对橡胶树棒孢霉落叶病菌(图8中C)、炭疽病菌(图8中A和B)、香蕉枯萎病菌(图8中E)、大薯炭疽病菌(图8中D和F)的拮抗活性鉴定结果如图8所示：木霉菌Hb13-3-2能够显著抑制橡胶树病原菌HDHL、Hz和HbYN58的生长，对其它作物病害FOC4、12DP06和12DP116也有明显的抑制作用。

表8是拮抗9天的数据结果：Hb13-3-2木霉菌对4种病原菌具有显著拮抗效果；其中对橡胶树橡胶棒孢霉菌和炭疽菌的抑制率达到86.7％-90％。对香蕉枯萎病菌和大薯炭疽病菌的抑制率也在50％以上。所以Hb13-3-2是多功能的木霉菌。

病原菌和木霉菌株Hb13-3-2同时接种的试验结果再次证明Hb13-3-2对香蕉枯萎病菌FOC4和棒孢霉落叶病菌YN49的显著拮抗作用。图9为在PDA平板上Hb13-3-2菌株与香蕉枯萎病菌FOC4以及橡胶棒孢霉落叶病菌YN49对峙培养6天试验结果照片。图9中I A是香蕉枯萎病菌FOC4单独培养6天的情况；B为对峙培养显示FOC4被抑制的情况。图9II中A是橡胶树棒孢霉落叶病菌YN49单独培养6天的情况；B为对峙培养显示YN49被抑制的情况。

二、Hb13-3-2对大薯炭疽病菌12DP06(I)和12DP116(II)侵染力的抑制情况的离体叶片试验

利用离体大薯叶片，采用机械损伤并接种菌块的方法，观察在有拮抗菌存在的情况下，炭疽菌对叶片的侵染能力受抑制情况。结果如图10所示，图10(I)中A和C是Hb13-3-2和炭疽病原菌12DP06同时接种；B是只接种炭疽菌12DP06。图10(II)中A是Hb13-3-2和炭疽病原菌12DP116同时接种；B是只接种炭疽菌12DP116。在28度下黑暗培养4天，拍照。结果表明在拮抗菌Hb13-3-2存在的情况下，与对照相比，有拮抗菌的受损叶片枯黄面积较小，说明炭疽病原菌12DP06和12DP116对大薯叶片的致病性显著降低，证明木霉菌Hb13-3-2抑制炭疽菌的侵染力，能够抑制病原菌在叶片上的侵染。试验重复了3次，结果相近。

实施例7、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163产生挥发性气体化合物及该气体对病原真菌的抑制作用实验

1、用直径为9cm的培养皿制备PDA平板，并在每个平板上的中央接种一块直径约4mm大小的Hb13-3-2培养2天的菌块，28℃培养4天，待其基本长满平板后，即用于活性挥发性气体化合物试验。

2、采用类似于对峙培养的方法，先在培养基平板上接种病原菌菌块(橡胶树红根病菌B01，B05、橡胶树炭疽病菌HDHL、大薯炭疽病菌12DP06)，等其大小为3cm左右时，再按照以下方法共培养。

3、取步骤1所培养4天的Hb13-3-2平板，轻轻将下方长有Hb13-3-2菌落的皿底与4种接好病原真菌的PDA平皿皿底(中央带有接种好的病原真菌菌块)倒扣在一起，用parafilm“M”封口共培养；而以倒扣在没有培养过Hb13-3-2的皿底与病原真菌的PDA平皿皿底扣在一起，用parafilm“M”封口共培养作对照，三次重复，28℃暗培养10天后观察，按照实施例6的方法计算抑菌率。

病原菌受抑制的生长情况如图11所示，图11中A-D中右图分别为受到Hb13-3-2产生活性挥发性气体物质抑制影响的橡胶树红根病菌B05(图11中A和B)、B01(图11中C和D)、橡胶树炭疽病菌HDHL(图11中E和F)、和大薯炭疽病菌12DP06(图11中G和H)菌落生长状况，图11中A-D中左图均为没有加盖培养过Hb13-3-2的皿底(加盖无菌皿底)的对照的生长状况。可见所有供试病原真菌的生长都受到抑制，其中对橡胶树红根病菌(保亭分离株B01)病菌菌株抑制率最高，表明菌株Hb13-3-2能够产生活性挥发性气体物质抑制病原真菌的生长。

实施例8、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163挽救污染橡胶试管苗的生长试验

橡胶组培苗在培养过程中，后期会出现污染率不断升高、生长迟缓、发育畸形、老小苗等现象，不但降低了以后移栽的成活率、商品出售率和价格，而且增加了成本(见图12中A)。从胚芽刚刚形成到子叶、茎、根的发育完全到一个健壮的适合移栽的苗子的过程中，这个新个体都会遭遇的不同菌的污染而死亡。用益生菌Hb13-3-2去保护这个新个体的成长，可以有效防治其它杂菌的污染，并促进其健康快速成长，因而将在橡胶苗的产业发展中具有重要作用。

本发明第一次实验是为了证明哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2CGMCC No.13163是否能够挽救污染橡胶试管苗。从2016年9月5接种到9月29日共24天，利用热研7-33-97自根无性系胚从萌发逐渐形成一个健康个体过程中受到污染的苗子如图A的(1-12)所示，然后是图A中的污染苗子同一天即时接种Hb13-3-2营养液(在每一个试管接种Hb13-3-2分生孢子营养液1ml，浓度为10⁷个/ml)，24天后拍照所处理后的污染材料是否被挽救成活。在每一个试管接种Hb13-3-2分生孢子营养液是用PDB+1/2MS无机盐溶液配置新培养的分生孢子，并定容为10⁷个/ml。结果如图12所示，处于不同生长阶段的试验材料中(图A的1-12)，Hb13-3-2处理都能够杀死污染菌。本发明的试验结果表明Hb13-3-2可以有效防治污染橡胶苗，使其免于死亡，减少经济损失。

为了考察Hb13-3-2是否能够促进橡胶苗的生长，从2016年6月21或27日到8月12日共40-50天。我们选用生长势相对一致的热研7-33-97橡胶组培苗进行了第二次和第三次两次接种试验，处理组每一个试管内接种Hb13-3-2分生孢子数量为10⁷个/ml的营养液1ml(用PDB+1/2MS无机盐溶液配制)，对照组的每一个试管内加入等量不添加Hb13-3-2分生孢子的PDB+1/2MS无机盐溶液。

结果如图13所示，图13为Hb13-3-2促进橡胶试管苗生长的试验图I中的B,C,D和图II中的A，B,C,D是处理组；图I中的A和图II中的E，F,G为对照株试管苗的生长情况。图13I中B,C,D株高和新蓬叶明显增加，Hb13-3-2处理比对照株高平均增加1.78±1.51cm；图13II中新蓬叶的催生早于对照，Hb13-3-2处理比对照株高平均增加0.76±0.83cm。本发明的试验结果表明Hb13-3-2对橡胶苗有明显的促生作用，增加橡胶苗的活力，因此可以应用于橡胶苗的壮苗培养。注：不同批次的试管苗的生长状态不一样，但响应木霉菌的促生作用的情况是一样的。橡胶树幼苗茎和叶的生长特征是一蓬(一蓬叶是一个伸长单位)一蓬叶地抽出，蓬与蓬之间相差20-30天。因此新的一蓬叶出现的早也就意味着提早至少6-7天时间。

为了更好地利用木霉菌Hb13-3-2，我们根据生产实践需求，设计了在木霉菌Hb13-3-2的保护下，提前去掉试管苗的盖子练苗的试验。在常规生产流程中，组培苗直接移栽沙床，不经过先打开培养试管的盖子练苗这个阶段，是因为打开盖子3-4天，橡胶苗就会受到污染而降低成活率和生长势。本发明中是从2016年9月2打开盖子到9月12日共10天(每一个试管接种Hb13-3-2分生孢子营养液1ml，浓度为10⁷个/ml(用PDB+1/2MS无机盐溶液配制)，对照试管苗是同时打开，只接种等量不添加Hb13-3-2分生孢子的PDB+1/2MS无机盐溶液)。试验结果是在木霉菌Hb13-3-2的保护下，打开盖子10天也不会受到其它杂菌的污染，而且Hb13-3-2处理植株比对照植株生长更有活力，并长出鲜嫩的蓬叶(如图14中1,2,3和4)而4株对照株(如图14中5,6,7和8)都已经被污染了。该结果表明：在木霉菌Hb13-3-2的保护下，试管苗能够免除其它杂菌的侵扰，可以提前得到更好的光、温、水、气的锻炼，提前达到移栽的要求。而对照试管苗一打开盖子则受环境中各种杂菌的侵扰而影响其生长发育。图14中5,6,7和8污染的情况。因此该措施可以应用在生产中，在沙床移栽前20天加入木霉菌液，打开盖子，进行练苗和壮苗培养而不用再担心实际上也是会发生的苗子污染问题。

为了更好的验证本发明木霉菌对橡胶苗的促生和防治污染的作用，本发明设计了如下实验：选用5组橡胶树热研7-33-97试管苗，根据其生长势不同，分为A、B、C和D、E五组，每组40株试管苗，E组为对照。其中A组试管苗根、茎、叶俱全，但是叶色发暗，生长迟缓，有4-5片叶子；B组试管苗长势较差，叶子发黄，植株弱小，有3-4片叶子；C组试管苗长势差，植株弱小，有1-2片叶子，而且发黄；D组试管苗长势很差，植株弱小，有的只是光茎一条。对照E组是从A-D各取10株，共40株；对照试管苗中加1ml PDB+1/2MS溶液，处理试管苗中各加入1ml用PDB+1/2MS溶液配制Hb13-3-2分生孢子液，孢子数为10⁷个/ml。各处理的试管苗放在温室内同样条件下生长。处理时间是2016年9月27日-10月20日共24天。试验结果统计如表9所示：

表9、木霉菌对橡胶苗的促生和防治污染的作用

**表示与对照相比具备显著差异

该结果表明，用木霉菌Hb13-3-2处理橡胶树7-33-97品系组培苗可以大大降低污染率(从20％到零)和死亡率从7％到1-5％，而且显著促进了橡胶树7-33-97品系试管苗的生长。

实施例8、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163的内生性鉴定

用Hb13-3-2分生孢子营养液(浓度为10⁷个/ml)接种污染病原菌的组培幼苗，共接种100株，成活率为95.2％。共培养时间段分别为10天、15天、30天后，分别随机选取3株经过Hb13-3-2处理过的组培苗，先流水充分冲洗30分钟，再经70％(体积百分含量)酒精消毒3-5分钟，再用质量百分浓度为20％的次氯酸钠溶液消毒20min，无菌水清洗5次，无菌滤纸吸干后，将不同组织切段或片置于1/2MS平板上，将最后无菌水同样涂板作为对照，以考察是否消毒完全。平板放于28℃暗培养2-3天，每天观察并统计带菌组织，并记录数据，结果表明Hb13-3-2在处理后的幼苗根部的存活率为99±0.21％，茎部为40±0.11％，幼叶和老叶为14.37±0.62％。因此用Hb13-3-2处理橡胶苗后，橡胶苗可以得到持久的保护和促生作用。Hb13-3-2在植物不同组织的定植情况见图15。

序列表

<110> 中国热带农业科学院橡胶研究所

<120> 一株哈茨木霉菌株及其应用

<130> WHOI160078

<160> 2

<210> 1

<211> 644

<212> DNA

<213> 哈茨木霉（Trichoderma harzianum）

<400> 1

ttcctccgct tattgatatg cttaagttca gcgggtattc ctacctgatc cgaggtcaac 60

atttcagaag ttgggtgttt aacggctgtg gacgcgccgc gctcccgatg cgagtgtgca 120

aactactgcg caggagaggc tgcggcgaga ccgccactgt atttcggaga cggccaccgc 180

caagaggcag ggccgatccc caacgccgac cccccggagg ggttcgaggg ttgaaatgac 240

gctcggacag gcatgcccgc cagaatactg gcgggcgcaa tgtgcgttca aagattcgat 300

gattcactga attctgcaat tcacattact tatcgcattt cgctgcgttc ttcatcgatg 360

ccagaaccaa gagatccgtt gttgaaagtt ttgattcatt ttcgaaacgc ctacgagagg 420

cgccgagaag gctcagatta taaaaaaccc gcgagggggt atacaaaaag agttttggtt 480

ggtcctccgg cgggcgcctt ggtccggggc tgcgacgcac ccggggcaga gatcccgccg 540

aggcaacagt ttggtaacgt tcacattggg tttgggagtt gtaaactcgg taatgatccc 600

tccgctggtt caccaacgga gaccttgtta cgacttttac ttcc 644

<210> 2

<211> 1320

<212> DNA

<213> 哈茨木霉（Trichoderma harzianum）

<400> 2

aacttgcagg caatgtgggc agtgtggcag tcaagaacgg gggcgtagcc ggcaccgacc 60

tggccagggt ggttcatgac gatgacctga gcggtgaacg aagcggcacc catggggggg 120

tcgttcttgg agtcaccggc aacgttacca cggcgaattt ccttaacgga aacgttcttg 180

acgttgaaac caacgttgtc accgggaaca ccctcgacga gctgctcgtg gtgcatctcg 240

acggacttga cttcagtggt gacgttggag ggagcgaagg tgacgaccat accgggcttg 300

aggataccag tctcgatacg gccgacggga actgttccaa taccaccgat cttgtagaca 360

tcctggaggg gaagacggag gggcttgtcc gtgggacgct tggggggctc gatggagtcg 420

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ttgtaccagg ggcagttggt ggagggctgg agcatgttgt caccgttgaa accggagatg 540

gggacgaaag caacagcctt ggggttgaag ccgaccttct tgatgaagtt ggaggtctcc 600

ttgatgattt cctggtaacg agcctcggcc cagttggcag tgtccatctt gttgatggca 660

acgatgagct gcttgacacc cagggtgtag gcgagcagag cgtgctcacg ggtctggcca 720

tccttggaga taccagcctc gaactcacca gtaccggcgg caatgatgag gatagcgcaa 780

tcggcctggg aagtaccagt gatcatgttc ttgatgaaat cacggtggcc gggagcgtct 840

gtgaattgcc tgttagcact ggattgcaat tgcagcatga agttgatgaa gtagacatac 900

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agtggggttg cacagagaac cccactaaaa atcaaacggc agcaaaaaaa atttgcgtcg 1200

ctgcagaggg gtaatggaaa gcggggtgac gaaaaattgt cgacccaaaa agtctctgag 1260

gaattgtcgg gcacaattga atatgaaaga agaggaatcg aggcgaaaat cagttgacgc 1320

Claims

1.哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.13163。

2.哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163在防治植物病害中的应用。

3.哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163在制备防治植物病害的菌剂中的应用。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述植物病害是橡胶树红根病菌，橡胶树棒孢霉落叶病菌，橡胶树炭疽病菌，香蕉枯萎病菌和/或大薯炭疽病菌引起的橡胶树病害。

5.一种植物病原菌拮抗菌剂，其活性成分为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163。

6.一种生物菌肥，包括哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCCNo.13163。

7.根据权利要求6所述的生物菌肥，其特征在于：所述生物菌肥中还包括钼元素、锌元素和/或铜元素。

8.根据权利要求7所述的生物菌肥，其特征在于：所述生物菌肥中还包括大量元素和/或有机肥。

9.哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163在促进橡胶树幼苗、组培苗生长或防治橡胶树病害中的应用。

10.哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Hb13-3-2 CGMCC No.13163在制备挥发性抑菌气体中的应用；其中，挥发性气体对橡胶树红根病菌，橡胶树棒孢霉落叶病菌，橡胶树炭疽病菌，香蕉枯萎病菌和/或大薯炭疽病菌具有抑菌效果。