CN105708868B - 蝉花菌丝体活性物质及保护神经细胞的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种蝉花菌丝体活性物质及保护神经细胞的组合物。所述蝉花菌丝体活性物质在40μ/ml的无细胞毒性浓度下，可用以保护MPP⁺对多巴胺神经元(dopaminergic neuron)的神经毒性，亦能够抑制衣霉素(Tunicamycin)造成的内质网压力所引起的细胞凋亡；因此本发明所述蝉花菌丝体活性物质具有预防神经退化疾病的潜力。

Description

蝉花菌丝体活性物质及保护神经细胞的组合物

技术领域

本发明涉及菌丝体活性物质，特别是涉及蝉花菌丝体活性物质及保护神经细胞的组合物。

背景技术

神经退化性疾病(Neurodegenerative Diseases)：

神经退化性疾病(neurodegenerative diseases)是一种大脑及中枢神经***中神经元细胞逐渐失去功能的症状。脑部及脊髓是由各种神经元所构成，各自负责不同功能，例如控制运动、处理接收讯息、进行判定。而脑区中的海马回(Hippocampus)主要是负责学习与记忆的枢纽，海马回上的神经细胞受损则会导致失智及学习能力的缺陷。由于神经元的恶化或负责传递讯息的髓鞘随着时间而失去功能，都可能会造成神经退化性疾病。因为脑部和脊髓的神经细胞不易再生，只要受到损伤可能造成永久性的伤害。神经退化疾病的患者需要经过一段长时间后，症状才会逐渐出现。病患可能要经过数个月或数年才能感受到其影响。通常是在许多脑室内神经细胞死亡或是细胞功能停止，以及大量神经死亡影响脑室的功能之后，症状出现才会被注意到。其明显的特征即是：(1)某特定脑区的神经细胞缓慢渐进地死亡；(2)神经讯息传递功能丧失；(3)常好发于中老年人身上，且随着时间症状会更加严重。由于患者在发病期间会逐渐与社会隔离，再加上目前相关的医药知识匮乏不足，所以社会大众很少了解和注意。随着人口结构的老化，神经退化病患也日益增加，对家属、患者和社会大众而言，无论是经济、心里和生活形态的冲击、着实是难以估计和承担的。常见的神经退化性疾病包括帕金森氏症(Parkinson's disease)、阿兹海默症(Alzheimer's disease)以及亨丁顿氏症(Huntington's disease)等。

阿兹海默症(Alzheimer's disease)：

阿兹海默症是老年人口中最常见的神经退化性疾病，主要病变在大脑皮质(cortex)和海马回(hippocampus)的神经细胞，许多病理上出现大脑异常老年斑(senileplaque)，神经纤维纠结(neurofibrillary tangle)以及β型类淀粉(β-Amyloid)的沉积。老年斑是一种复杂的病变结构，在疾病初期是由淀粉样β型类淀粉逐渐堆积形成。它是由大约40至42个胺基酸所组成。β型类淀粉蛋白存在于身体各器官，在脑部的各区域也都有分泌。然而，单一的β型类淀粉蛋白是无害的，只有聚合的β型类淀粉蛋白才具有毒性，形成衰老斑而破坏细胞的正常运作。虽然单一的β型类淀粉蛋白在脑部各区域皆有分泌，但具有毒性的衰老斑最密集的地方是在海马回。堆积成熟的类淀粉斑块(amyloid plaques)经常围绕在许多功能不良的轴突(axons)跟树突(dendrites)周围，使的这些神经突增厚，成熟的类淀粉斑块亦能够活化微胶细胞(microglia)来帮助引起发炎反应及清除类淀粉斑块。在大脑皮质跟海马回中累积大量的老年班和类淀粉斑块病理是判断阿兹海默症状最好的标的。阿兹海默症在生理上主要的症状包括认知功能退化(例如记忆力变差，对时间、人物、地点感到混淆)、行为功能退化(例如处理日常生活的能力减退)、及精神状态退化(例如出现忧郁、妄想及异常行为等等)。目前用来治疗阿兹海默症的药物仅能延缓病人的症状，并无法治愈。

帕金森氏症(Parkinson's disease)：

另一个常见的神经退化疾病为帕金森氏症，好发于五、六十岁以上的人口，主要是肇因于一种叫做多巴胺(dopamine)化学物质的缺乏。而多巴胺是由脑干中一处叫黑质(substantia nigra)的神经细胞所制造。中脑黑质的多巴胺神经元退化无法制造足够的神经引导物质多巴胺来指挥肌肉的活动；神经元之间讯息传递必需仰赖多巴胺才能使身体的动作来的流顺，缺乏足够的多巴胺就产生各种活动障碍。表现的症状以肢体静止型颤抖、肌肉僵硬、动作迟缓、姿态不稳导致平衡失调为主。而早期症状常出现有单手规律性颤抖，动作变慢，肌肉僵硬逐渐地蔓延全身，到了末期几乎都要靠轮椅才能行动。由于帕金森氏症是由于多巴胺的缺乏导致，疾病初期并没有明显特征，到确定病例时往往都已经过五年，且目前并没有有效药物来治疗。粒线体功能丧失及氧化压力已被证实 是导致帕金森氏症的重要致病机转，而MPP⁺(1-甲基-4-苯基吡啶)是一个带正电的化合物。它是粒线体complex I的抑制剂，能够抑制粒线体中的氧化磷酸化，造成ATP耗尽及细胞死亡，因此具有毒性。在小鼠实验中，MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)能够通过血脑屏障(Blood-brainbarrier，BBB)，并被大脑中的神经胶细胞转化成MPP⁺，而MPP⁺会引起黑质的发炎反应并杀死黑质致密部中产生多巴胺的神经细胞，使动物产生类似帕金森氏症的症状。MPP⁺会在引发产生多巴胺神经细胞死亡上具有高度的选择性。它是通过一个在神经末梢中负责再吸收多巴胺的转运蛋白，多巴胺转运蛋白(dopamine transporter)在这个过程中将MPP⁺会转运至细胞中。

内质网压力(Endoplasmic Reticulum Stress)：

老化过程中，神经细胞接收到过多的氧化压力，过量氧化物的累积造成神经细胞损伤或死亡，以及神经胶质细胞异常活化或死亡，则称之为氧化神经毒性(oxidativeneurotoxicity)，而此种氧化毒性的逐渐累积便是神经退化性疾病的发生的原因。Tunicamycin(衣霉素，TM)能经由抑制蛋白质N端的醣化作用(N-linked glycoproteins)来引起大量未折叠蛋白的产生，并使细胞停留在G1期，导致内质网压力(EndoplasmicReticulumStress)。过去研究指出，内质网压力跟神经退化性疾病有相关，内质网压力是主要诱导神经细胞凋亡的路径，因此利用TM引起神经细胞压力后能当作筛选模式。

大蝉花(Cordyceps cicadae)

大蝉花(学名：Cordyceps cicadae)，又名胡蝉、蝉菌、蝉蛹草、金蝉花、蚕茸，为子囊菌亚门(Ascomy cotina)，麦角菌目(Claricipiyales)，麦角菌科(Clavicipitaceae)，虫草属(Cordyceps)真菌。大蝉花会寄生在蝉蛹或者是山蝉(Cicada flammate)、竹蝉(Platylomia pieli)等幼虫后于虫体头部形成花蕾状子囊，故名大蝉花。子囊壳为长卯形，埋生于子座内；子囊呈圆柱形，内含8枚线状、条隔、透明的子囊抱子。野生大蝉花多分布在中国南方诸省，主要集中在四川、江苏、浙江、福建各地居多。性寒，晒干后可入药，味甘，无毒。能散风热，退翳障，透疹。近来研究亦发现，该菌菌丝在固体培养和发酵过程中含有甘露醇等物质。

小蝉花(学名：C.sobolifera)又名虫花、蝉菌、蝉草为子囊菌亚门(Ascomycotina)，麦角菌目(Claricipiyales)，麦角菌科(Clavicipitaceae)，虫草属(Cordyceps)真菌感染蝉科蟪蛄属(Platypleura sp.)若虫所形成的虫生真菌复合体，型体较大蝉花小，故名，是传统的中药材之一。小蝉花主要产于广东、福建，中国台湾花莲亦发现有少许。小蝉花与冬虫夏草功效相近，且含有许多相同的生物活性成分。小蝉花的分生孢子阶段属于尚未定名的棒束孢霉(Isaia sp)，而大蝉花的分生孢子阶段则为蝉棒束孢菌(Isaia cicadae)，且其分生孢子阶段为无性型，子曩壳阶段则为有性型。在自然界中有性型很稀少，一般采收到的多为无性型，所以在产销第常将两者统称为「蝉花」，一起收购使用。蝉花的药理作用广泛，将蝉花菌丝体开发为功能性食品或中药制剂都具有发展潜能。蝉花药理作用：(l)免疫调节作用：研究人员将蝉花菌株进行人工发酵产生蝉花菌丝，从中提取蝉花多醣，并以冬虫夏草多醣为阳性对照组，对小鼠进行淋巴转化试验、Ea及E玫瑰花环试验、特异性免疫玫瑰花环试验、巨噬细胞吞噬试验、抗绵羊红细胞抗体效价试验，结果显示蝉花多醣具有明显提升免疫功能作用；(2)滋补强壮作用：近期报导指出，蝉花与多种虫草的主要成分氨基酸种类相似，含量较一致。药理试验表明，蝉花与多种虫草的氨基酸都有程度不同的补益作用，故可供服用者达滋补强壮之效；(3)抗疲劳作用：蝉花水煎剂能明显延长小鼠的游泳时间，有助于提高在常压缺氧状态下及在高温环境下的小鼠的存活时间；(4)镇静催眠作用：根据药理实验之结果发现，蝉花组小鼠给药1小时后，测定10分钟内自主活动次数，显著少于对照组。说明蝉花还能明显延长小鼠睡眠时间，缩短戊巴比妥钠(Pentobarbital Sodium)组的翻正反射消失时问，蝉花亦能增加在单位时问内的入睡率，经实验证实人工培养品与天然蝉花功效相近；(5)中枢神经***调节作用：小鼠腹腔注射天然蝉花或人工培养品的醇类萃取物能明显减少其自主活动，对神经节有阻断作用。

有鉴于现今社会人口逐渐老化，且神经退化疾病并无明显治疗药物，神经退化病是需要病患配合、且长期治疗及控制的慢性疾病，利用天然的药用真菌 或中草药来开发成改善神经退化的产品，是最自然健康的方法。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种蝉花菌丝体活性物质及其组合物。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种蝉花菌丝体活性物质，由如下步骤制备得到：

(a)发酵:蝉花菌丝体于15-30℃、压力0.5-1公斤/平方公分及pH 2-8下，以10-150rpm速度搅拌或不搅拌，并以0.01-1.5VVM通气速率通入气体后，发酵培养3-5天，最后得蝉花菌丝体液体培养悬浮液；

(b)冷冻干燥:将所述蝉花菌丝体液体培养悬浮液冷冻干燥，以形成酦酵液冻干粉；

(c)萃取:将所述酦酵液冻干粉以其10-30倍体积的溶剂萃取，其中所述萃取是以10-250rpm于15-25℃震荡萃取24小时，以形成上清液；

(d)浓缩干燥:将所述上清液减压浓缩至干燥，最后得所述蝉花菌丝体活性物质。

在其中一个实施例中，所述蝉花菌丝体为寄存于财团法人食品工业发展研究所，登录号码:BCRC 37801或BCRC MU30106的蝉花菌丝体。

在其中一个实施例中，所述气体为空气，或空气与氧气、空气与二气化碳、空气与氮气的混合物。

在其中一个实施例中，所述溶剂为水、乙醇、乙酸乙酯或正己烷。

在其中一个实施例中，所述蝉花菌丝体活性物质是用以拮抗MPP⁺引起的细胞毒性。

在其中一个实施例中，所述蝉花菌丝体活性物质是用以拮抗衣霉素(Tunicamycin)引起的细胞毒性。

本发明的目的还在提供一种保护神经细胞的组合物，所述组合物包含上述蝉花菌丝体活性物质，以及药学上可接受的载体。

在其中一个实施例中，所述组合物是用以拮抗MPP⁺引起的细胞毒性。

在其中一个实施例中，所述组合物是用以拮抗Tunicamycin引起的细胞毒性。

本发明所述的所有科学性及技术性用语，除非另有定义，否则皆为本领域技术人员可通晓的定义。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所述蝉花菌丝体活性物质，可以有效改善神经毒性，提供了一种可改善神经退化症状的产品，方便一般中老年人于日常生活中服食；且由于蝉花或蝉花萃取物本身具多种有益功能且无副作用外，更可供一般使用者同时改善、控制、治疗或预防高神经退化及其并发症。

具体实施方式

以下结合具体实施例来详细说明本发明。

实施例1

(一)有机体的来源

本实施例所用的大蝉花(Cordyceps cicadae)菌丝体可购得自寄存于中国台湾的财团法人食品工业发展研究所的大蝉花(Cordyceps cicadae)菌丝体BCRC MU30106(寄存日期：2013年11月25日)；所用的小蝉花(Cordyceps sobolifera)菌丝体系可购得自寄存于中国台湾的财团法人食品工业发展研究所的小蝉花(Cordyceps sobolifera)菌丝体BCRC37801(寄存日期：2010年3月12日)，但本发明所述的蝉花菌丝体活性物质不限于由此菌种所得。

(二)有机体的发酵

蝉花菌丝体活性物质的液体培养，包括将蝉花菌丝体接种于平板上，使用马铃薯糊精培养基(Potato Dextroso Agar，PDA)于适当温度如15-35℃(较佳者约25℃)下培养5天至两周后，刮取菌丝接种于烧瓶内，用培养基(配方如表1所示)，在约25℃，pH 4.5，及振荡速率10-250rpm之下振荡培养数天；然后，将烧瓶培养物接种于酦酵槽培养基(同烧瓶培养基)内，在15-30℃(较佳者约 25℃)，槽压0.5-1公斤/平方公分，pH 2-8下，10-150rpm搅拌速度或不搅拌情况下(air lift)，以0.01-1.5VVM通气速率通入空气，或空气与氧气、空气与二氧化碳、空气与氮气的混合物，较佳者空气，培养时间为3-5天内，即得蝉花菌丝体液体培养悬浮液，所述蝉花菌丝体液体培养悬浮液可进一步藉由冷冻干燥步骤以制备为酦酵液冻干粉的剂形。

表1

(三)有机体的萃取

100升所述蝉花菌丝体液体培养悬浮液经冷冻干燥后，可得约2公斤酦酵液冻干粉，冷冻干燥后的酦酵液冻干粉以10-30倍体积的100％乙醇萃取，并以摇瓶进行震荡萃取，以10-250rpm于15-25℃震荡萃取24小时，可重复萃取数次，将上清液减压浓缩至干燥，得所述蝉花菌丝体活性物质，置于4℃保存备用。

藉上述步骤所得的蝉花菌丝体活性物质，再以其它溶剂，如水、甲醇、乙酸乙酯、正己烷等，进行液态分层萃取，以不同极性的溶剂萃取此活性物质，将不同层的萃取物一一分离，可重复萃取数次，将上清液减压浓缩至干燥，得不同溶剂的所述蝉花菌丝体活性物质萃取物，并以适当溶剂回溶并定量至适当浓度，置于4℃保存备用。

实施例2

实施例1所述蝉花菌丝体活性物质神经细胞毒性损伤及保护神经细胞分析。

1、拮抗MPP⁺引起的NG108-15细胞株毒性

将NG108-15的细胞株铺设在密度为2×10⁴cells/ml-well的96孔平底组织培 养盘；24小时后，每个细胞适当的贴覆其上；最后这些细胞再以检测样品(蝉花菌丝体活性物质)来测试。检测样品利用二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂，分别溶解在浓度为10、20和40mM的DMSO中。培养基(medium)中DMSO的浓度维持在不大于1μl/ml，以确保它不会影响到NG108-15细胞的生长；在以检测样品处理细胞2天后，分别以浓度20、40、60μM MPP⁺(1-甲基-4-苯基吡啶)处理NG108-15细胞；四天后，移走培养基并加入100μl/well的MTT溶液(浓度为0.5mg/ml)；将细胞放入37℃，5％CO₂的培养箱中培养1小时后，移去96-well培养基的混合液；最后加入30μl/well的DMSO到细胞中，并以分光比色计(ELISA reader)，于570nm吸光波长下测定吸光值，来获得实验结果；而和DMSO溶剂控制组比较可计算其存活率百分比(％)，存活率百分比＝[样品的吸光值(570nm)/DMSO的吸光值(570nm)]×100。

如表2，在细胞存活率试验中，正己烷(HEX)萃取物处理的NG108-15实验组中，低浓度正己烷萃取物组(大蝉花-正己烷组，20μ/ml)有增加细胞存活率的情况，但没有统计上的意义，而高浓度正己烷萃取物组(大蝉花-正己烷组，40μ/ml)则对不同浓度MPP⁺引起的细胞毒性都有明显保护的效果，在20μM MPP⁺浓度下可使存活率增加18％，60μM MPP⁺浓度下可使存活率增加7％，在水跟乙醇的萃取物实验组中亦有保护神经细胞的效果。(*p value<0.05，t-test)

表2蝉花菌丝体活性物质对MPP⁺引起NG108-15细胞株毒性的存活率分析

2.拮抗Tunicamycin引起的Neuro2a细胞株毒性

将Neuro2a的细胞株铺设在密度为2×10⁴cellc/ml-well的96孔平底组织培养盘；24小时后，每个细胞适当的贴覆其上；最后这些细胞再以检测样品(蝉花菌丝体活性物质)来测试。检测样品利用二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂，溶解在浓度为20mM的DMSO中。培养基(medium)中DMSO的浓度维持在不大于1μl/ml，以确保它不会影响到Neuro2a细胞的生长；在以检测样品处理细胞2天后，分别以浓度0.25、0.5、0.75、1μg/ml Tunicamycin(衣霉素，TM)处理Neuro2a细胞；四天后，移走培养基并加入100μl/well的MTT溶液(浓度为0.5mg/ml)；将细胞放入37℃，5％CO₂的培养箱中培养1小时后，移去96-well培养基的混合液；加入30μl/well的DMSO到细胞中，并以一分光比色计ELISA reader，于570nm吸光波长下测定吸光值，来获得实验结果；而和DMSO溶剂控制组比较可计算其存活率百分比(％)，存活率百分比＝[样品的吸光值(540nm)/DMSO的吸光值(570nm)]×100。(*p value<0.05，t-test)

在细胞存活率的数据中显示(表3)，在乙醇萃取物的实验组中，对浓度0.75μg/mltunicamycin造成的细胞毒性，其存活率为明显由55.19％增加到63.55％；而在高浓度TM的毒性下则没有显著差异；而甲醇萃取物的实验组中，对不同浓度TM引起的细胞毒性都有明显保护的效果，在0.25μ/ml TM浓度下可使存活率增加8％，0.5μ/ml TM浓度下可使存活率增加8％，0.75μ/ml TM浓度下可使存活率增加10％，1μ/ml TM浓度下可使存活率增加12％。(*p value<0.05，t-test)

表3蝉花菌丝体活性物质对Tunicamycin引起Neuro2细胞株毒性的存活率分析

本发明所述蝉花菌丝体活性物质，是用天然药用真菌发酵而成，故相较于化学药物，除更具安全性，亦具有治疗及改善神经退化疾病的潜力。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种用于保护神经细胞的蝉花菌丝体活性物质，其特征在于，由如下步骤制备得到:

(a)发酵:蝉花菌丝体于15-30℃、压力0.5-1公斤/平方厘米及pH 2-8下，以10-150rpm速度搅拌或不搅拌，并以0.01-1.5VVM通气速率通入气体后，发酵培养3-5天，最后得蝉花菌丝体液体培养悬浮液，所述蝉花菌丝体为大蝉花(Cordyceps cicadae)菌丝体，寄存于财团法人食品工业发展研究所，登录号码:BCRC MU30106或小蝉花(Cordyceps sobolifera)菌丝体，寄存于财团法人食品工业发展研究所，登录号码:BCRC 37801；

(b)冷冻干燥:将所述蝉花菌丝体液体培养悬浮液冷冻干燥，以形成蝉花菌丝体冻干粉；

(c)萃取:将所述蝉花菌丝体冻干粉以其10-30倍体积的溶剂萃取，其中所述萃取是以10-250rpm于15-25℃震荡萃取24小时，以形成上清液；当所述蝉花菌丝体为所述大蝉花菌丝体时，所述溶剂为正己烷；当所述蝉花菌丝体为所述小蝉花菌丝体时，所述溶剂为甲醇；

(d)浓缩干燥:将所述上清液减压浓缩至干燥，得最后所述蝉花菌丝体活性物质。

2.根据权利要求1所述蝉花菌丝体活性物质，其特征在于，所述气体为空气。

3.一种保护神经细胞的组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的蝉花菌丝体活性物质，以及药学上可接受的载体。

4.权利要求1-2任一项所述蝉花菌丝体活性物质或权利要求3所述保护神经细胞的组合物在制备具有保护神经细胞的功效的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述保护神经细胞是指拮抗1-甲基-4-苯基吡啶引起的细胞毒性。

6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述保护神经细胞是指拮抗衣霉素引起的细胞毒性。