KR20220020147A

KR20220020147A - 상황버섯균사체 추출물 또는 상황버섯균사체 추출물 분말의 제조방법 및 이들을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물

Info

Publication number: KR20220020147A
Application number: KR1020200100755A
Authority: KR
Inventors: 박병욱; 서승보; 김웅진
Original assignee: 주식회사한국신약
Priority date: 2020-08-11
Filing date: 2020-08-11
Publication date: 2022-02-18

Abstract

본 발명은 상황버섯균사체 추출물 또는 상황버섯균사체 추출물 분말의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 세포 독성을 나타내지 않고, 역관련 사이토카인인 IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10 또는 IL-12의 분비를 증가시키며, 흉선 내 T 림프구의 활성 및 면역세포수를 증가시키고, 대식세포에서 산화질소의 생성을 증가시키므로, 면역 증강용 조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

상황버섯균사체 추출물 또는 상황버섯균사체 추출물 분말의 제조방법 및 이들을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물{Method for preparing Phellinus linteus mycelia extract or Phellinus linteus mycelia extract powder and composition for enhancing immunity comprising them as an active ingredient}

상황버섯균사체 추출물 또는 상황버섯균사체 분말의 제조방법 및 이들을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다.

면역이란 자기(Self)와 비자기(Non-self)를 구별하여 인체 내에서 자연적으로 발생하거나 외부에서 들어온 유해 물질을 인지한 후 제거하여 신체의 항상성(Homeostasis)을 유지시키는 반응을 뜻한다(Cannon., 2000. News Physiol Sci, 15, 298-303). 이 반응은 외부로부터 인체에 침입한 바이러스, 박테리아 및 기생충과 같은 유해균과 내부에 생긴 암세포 등에 저항하거나 이를 제거하는데 매우 중요한 역할을 한다.

면역기능이 저하되면, 천식, 비염, 아토피성 피부염, 적혈구의 용혈, 급성 사구체 신염, 감기, 만성 피로 및 암 등 다양한 면역질환과 노화, 생활습관병 등이 발생할 수 있다. 이러한 질환은 치료보다 예방이 중요한데, 현재 시판되고 있는 치료제는 예방을 위하여 복용하기에는 어려운 것이 현실이다. 최근 면역 증진을 통한 면역질환, 노화, 생활습관병 등의 질병 예방에 관심이 집중되고 있지만, 질환 예방학적 측면에서 부작용이 적은 식품 성분에 의한 면역조절연구는 매우 제한적이다. 따라서, 체계적인 면역세포활성 조절 관련 연구 및 기능성 소재 개발이 요구되고 있다. 이를 위하여, 부작용이 적은 천연물로부터 면역 활성을 조절할 수 있는 성분을 발굴하고, 발굴된 성분을 이용하여 면역 활성을 조절할 수 있는 제제를 개발하기 위한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다.

이와 관련하여, 면역 활성화를 검증하는 대표적인 방법으로는 대식세포 증식 효과와 비장세포의 증식 효과를 확인하는 방법이 있다. 또한 산화질소(NO)는 대식세포 활성화의 지표로서, 대식세포에서 생성되는 NO에 의해 침입한 병원체를 제거하고 기본적인 숙주 방어체계를 작동시킨다. 따라서 NO의 생성 측정은 대식세포의 활성화를 확인할 수 있는 방법이다(Farrell AJ, Blake DR Nitric oxide Annals of the Rheumatic Dieases 1996;55:7-20). 특히 NO는 Th 세포의 분화단계 중 ThO 상태에서 Thl과 Th2로 나누어질 때, Thl로의 분화를 돕는 작용을 한다.

한편, 상황버섯(Phellinuse Linteus)은 목질진흙버섯이라고도 하며, 동의보감에서는 상목이(桑木耳)라는 이름으로 탕액편에 기록되어 있다. 갓은 지름 6 내지 12 ㎝, 두께 2 내지 10 ㎝로, 반원 모양, 편평한 모양, 둥근 산 모양, 말굽 모양 등 여러 가지 모양을 하고 있다. 다년생으로 뽕나무 등에 겹쳐서 나는 목재부후균이며, 초기에는 진흙 덩어리가 뭉쳐진 것처럼 보이다가 다 자란 후에는 나무 그루터기에 혓바닥을 내민 모습이어서 수설(樹舌)이라고도 한다. 상황버섯이 함유하고 있는 다당체가 항암 활성을 나타내는 것으로 널리 알려져 있어 지금까지 우리나라를 비롯하여 일본과 중국 등에서 많은 연구가 진행되었으며, 귀중한 약재로서 한국에서는 대량으로 재배하고 있다. 약용하기 위해 달이면 노란색이거나 연한 노란색으로 맑게 나타나며, 맛과 향이 없는 것이 특징이다. 맛이 순하고 담백하여 먹기에도 좋고, 한국, 일본, 오스트레일리아, 북아메리카 등에 자생한다.

이에, 본 발명자들은 부작용을 최소화하면서 면역 증강 효과를 나타내는 제제를 천연물로부터 개발하고자 노력하던 중, 상황버섯균사체 추출물이 세포 독성이 없으며, 면역 증강 및 골관절염의 치료에 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 상황버섯균사체 추출물 또는 상황버섯균사체 추출물 분말을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상황버섯균사체 추출물 또는 상황버섯균사체 추출물 분말을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상황버섯균사체 추출물 또는 상황버섯균사체 추출물 분말을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상황버섯균사체 추출물 또는 상황버섯균사체 추출물 분말을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상황버섯균사체 추출물 또는 상황버섯균사체 추출물 분말을 유효성분으로 포함하는 골관절염의 예방 또는 완화용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 복적을 달성하기 위하여,

본 발명은 상황버섯(Phellinus linteus)균사체를 배양하는 단계;

배양된 균사체 및 균사체의 8배 내지 12배의 정제수를 추출기에 투입하는 단계; 및

60℃ 내지 150℃에서 20시간 내지 30시간 동안 추출하는 단계;를 포함하는, 상황버섯균사체 추출물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상황버섯(Phellinus linteus)균사체를 배양하는 단계;

60℃ 내지 150℃에서 20시간 내지 30시간 동안 추출하는 단계;

추출된 추출액을 농축한 후 120℃ 내지 180 ℃에서 분무건조하여 분말화하는 단계

를 포함하는, 상황버섯균사체 추출물 분말의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 상황버섯균사체 추출물 또는 상황버섯균사체 추출물 분말을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 상황버섯균사체 추출물 또는 상황버섯균사체 추출물 분말을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 상황버섯균사체 추출물 또는 상황버섯균사체 추출물 분말을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 상황버섯균사체 추출물 또는 상황버섯균사체 추출물 분말을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 완화용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 상황버섯균사체 추출물 또는 상황버섯균사체 추출물 분말은 세포 독성을 나타내지 않고, 비장세포의 증식률 및 면역관련 사이토카인인 IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10 또는 IL-12의 분비를 증가시키며, PBMC, DNL, 흉선, 복강침출세포 내 T 림프구의 활성 및 면역세포수를 증가시키고, 대식세포에서 산화질소의 생성을 증가시키며, 염증 관련 단백질 및 관절 관련 단백질 발현을 감소시키는 효과가 우수하다.

도 1은 실시예 2에 따라 제조한 상황버섯균사체 추출물 분말의 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 단회투여 독성 평가에서 암수 마우스 랫드의 체중 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 상황버섯균사체 추출물 분말의 면역증강 효과 분석하기 위하여 산화질소 생성능을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a 내지 4e는 상황버섯균사체 추출물 분말의 면역증강 효과 분석하기 위하여 비장세포 활성 싸이토카인 레벨을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 상황버섯균사체 추출물의 세포독성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 6a 내지 도 6c는 상황버섯균사체 추출물 분말의 면역증강 효과 분석하기 위하여 PBMC 내 면역세포 레벨을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a 내지 도 7d는 상황버섯균사체 추출물 분말의 면역증강 효과 분석하기 위하여 DLN 내 면역세포 레벨을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8a 내지 도 8d는 상황버섯균사체 추출물 분말의 면역증강 효과 분석하기 위하여 흉선(Thymus) 내 면역세포 레벨을 분석한 것이다.
도 9a 내지 도 9d는 상황버섯균사체 추출물 분말의 면역증강 효과 분석하기 위하여 복강침출세포(PEC) 내 면역세포 레벨을 분석한 것이다.
도 10a 내지 도 10d는 상황버섯균사체 추출물 분말의 골관절염 치료 효과를 분석(in vivo)하여 염증 관련 단백질 레벨을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

한편, 본 발명의 실시 형태는 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.

상기 정제수는 바람직하게는 8배 내지 12배, 8.5배 내지 11.5배, 9배 내지 11배 또는 9.5배 내지 10.5배 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 약 10배로 사용할 수 있다.

상기 추출온도는 바람직하게는 70℃ 내지 140℃, 80℃ 내지 130℃, 90℃ 내지 120℃, 80℃ 내지 110℃, 90℃ 내지 110℃ 또는 95℃ 내지 105℃일 수 있고, 가장 바람직하게는 약 100℃에서 추출할 수 있다.

상기 추출시간은 바람직하게는 20시간 내지 30시간, 22시간 내지 28시간, 23시간 내지 26시간 또는 23시간 내지 25시간일 수 있고, 가장 바람직하게는 약 24시간 동안 추출할 수 있다.

상기 추출하는 단계는 1회 이상 반복하여 추출할 수 있고, 가장 바람직하게는 1회만 추출할 수 있다.

본 발명은 상기 제조방법으로 제조한 상황버섯균사체 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 제조방법으로 제조한 상황버섯균사체 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명은 상기 제조방법으로 제조한 상황버섯균사체 추출물을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 제조방법으로 제조한 상황버섯균사체 추출물을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 완화용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명은, 상황버섯(Phellinus linteus)균사체를 배양하는 단계;

60℃ 내지 150℃에서 20시간 내지 30시간 동안 추출하는 단계;

이때, 정제수의 양, 추출 온도 및 추출 시간은 상기 기재한 내용이 적용된다. 분무건조하여 분말화하는 단계는 바람직하게는 120℃ 내지 180 ℃, 130℃ 내지 170 ℃, 140℃ 내지 160 ℃, 150℃ 내지 170 ℃ 또는 150℃ 내지 160 ℃일 수 있고 가장 바람직하게는 155℃에서 분무건조하여 분말화할 수 있다.

본 발명은 상기 제조방법으로 제조한 상황버섯균사체 추출물 분말을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 제조방법으로 제조한 상황버섯균사체 추출물 분말을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명은 상기 제조방법으로 제조한 상황버섯균사체 추출물 분말을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 제조방법으로 제조한 상황버섯균사체 추출물 분말을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 완화용 건강기능식품을 제공한다.

상기 조성물은 면역관련 사이토카인의 분비량을 증가시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 인터페론(interferon, IFN) 또는 인터루킨(interleukin, IL) 사이토카인의 분비량을 증가시킬 수 있고, 더 구체적으로 상기 조성물은 IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10 및 IL-12로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 사이토카인의 분비량을 증가시킬 수 있다.

상기 조성물은 산화질소(NO)의 생성을 증가시킬 수 있다.

또한, 상기 조성물은 비장세포에서 세포 독성을 나타내지 않고 이의 증식을 촉진하였으며, 동시에 면역관련 사이토카인인 IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10 또는 IL-12의 분비량을 증가시켰다.

또한, 상기 조성물은 동물모델의 PBMC, DNL, 흉선, 복강침출세포 내 면역세포인 T 림프구의 활성을 증가시켰고, 대식세포의 산화질소(NO) 생성량을 증가시켰으며, 동물모델의 PBMC, DNL, 흉선, 복강침출세포 내 면역세포의 수를 증가시켰다.

따라서, 상기 상황버섯균사체 추출물 또는 상황버섯균사체 추출물 분말은 면역 증강용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 면역 증강용 조성물은 전체 중량에 대하여 유효성분인 상황버섯균사체 추출물 또는 이의 분말을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 면역 증강용 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제, 주사제제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 1,000 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 500 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 수회일 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.

본 발명의 건강기능식품에 있어서, 상황버섯균사체 추출물 또는 이의 분말의 혼합물은 상황버섯균사체 건조물에 추출용매를 첨가하여 단독 추출물을 제조하고 단독 추출물을 하기의 중량비로 혼합하여 제조한 것, 또는 상황버섯균사체 건조물을 하기 중량비로 혼합하고 이에 추출용매를 첨가하여 복합 추출물을 제조한 것일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 상기 건강기능식품은 상황버섯균사체 추출물 또는 이의 분말 각각의 건조물에 추출용매를 첨가하여 단독 추출물을 제조하고 단독 추출물을 하기의 중량비로 혼합하여 제조한 것일 수 있다.

상기 건강기능식품은 면역관련 사이토카인의 분비량을 증가시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 인터페론(interferon, IFN) 또는 인터루킨(interleukin, IL) 사이토카인의 분비량을 증가시킬 수 있고, 더 구체적으로 상기 건강기능식품은 IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10 및 IL-12로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 사이토카인의 분비량을 증가시킬 수 있다.

상기 건강기능식품은 산화질소(NO)의 생성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 상황버섯균사체 추출물 또는 이의 분말은 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.

건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예 및 실험예를 하기에 구체적으로 예시하여 설명한다. 다만, 후술하는 실시예 및 실험예는 본 발명의 일부를 예시하는 것일 뿐, 본 발명에 이에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 상황버섯균사체추출물 분말 제조 공정의 표준화

상황버섯균사체(P. linteus 0399BP) 배양의 최적의 배지를 선정하기 위해 아래의 배지의 조제하여 균총의 생장직경과 균체중량을 측정하였다.

조성	PDA	MCM	MEA	YMA	YMG
Potato	200
Dextrose	20	20		10	4
Peptone		2	5	5
Malt extract			20	3	10
Yeast extract		2		3	4
KH₂PO₄		0.46
K₂HPO₄		1
MgSO₄7H₂O		0.5
Agar	20	20	20	20	20

PDA(Potato dextrose agar), MCM(Mushroom complete media), MEA(malt extract agar), YMA(Yeast malt extract agar), YMG(Yeast malt extract glucose agar)

그 결과, 하기 표 2에 나타낸 것처럼 YMG 배지에서 균사생장 정도와 균체중량이 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다.

	생장직경 (mm/14일)					중량 (mg/14일)
	PDA	MCM	MEA	YMA	YMG	PDA	MCM	MEA	YMA	YMG
P. linteus 0399BP	57	42	40	58	65	105	30	27	100	112

다음으로, 배양 최적온도를 확인하기 위해 최적배지로 선정된 YMG 배지에 균주를 접종한 후 15~30℃ 항온기에서 균사를 배양하여 균사생장 정도와 균체중량을 측정하였다. 그 결과 하기 표 3에서 확인할 수 있듯이 30℃에서 균사생장이 가장 우수하였다. 또한 pH 조건에 따른 균사생장 정도 및 균체 중량을 평가한 결과, 하기 표 4에서 확인할 수 있듯이, pH 4~5 정도의 약산성에서 균사생장이 가장 우수하였다.

	생장직경 (mm/14일)				중량 (mg/14일)
	15℃	20℃	25℃	30℃	15℃	20℃	25℃	30℃
P. linteus 03399BP	27	51	60	67	80	89	102	110

	생장직경 (mm/14일)				중량 (mg/14일)
	pH 4	pH 5	pH 6	pH 7	pH 4	pH 5	pH 6	pH 7
P. linteus 03399BP	45	54	38	15	46	48	44	30

다음으로, 균사체 추출조건을 최적화하기 위하여, 추출온도, 추출시간, 용매량, 추출횟수에 따른 지표성분의 함량, 추출수율 및 지표성분 총량을 다음과 같이 확인하였다.

추출온도의 영향

	지표성분 함량 (mg/g)	추출수율 (%)	지표성분 총량 (mg)
70℃	13.6	3.7	50.32
100℃	16.4	5.4	88.56

추출시간의 영향

	지표성분 함량 (mg/g)	추출수율 (%)	지표성분 총량 (mg)
1시간	12.6	1.6	20.16
4시간	16.4	5.4	88.56
6시간	16.5	8.2	135.3
12시간	17.5	9.6	168
24시간	18.3	10.4	190.32

용매량의 영향

	지표성분 함량 (mg/g)	추출수율 (%)	지표성분 총량 (mg)
2배	13.6	2.1	28.56
5배	14.7	5.0	73.5
10배	15.4	5.2	80.08

추출횟수의 영향

	지표성분 함량 (mg/g)	추출수율 (%)	지표성분 총량 (mg)
1차	16.0	5.7	91.2
2차	7.5	1.6	12

그 결과, 추출온도 100℃, 추출시간 24시간, 용매량 정제수 10배, 추출횟수 1회에서 상황버섯균사체 추출물을 제조하는 것이 가장 최적화된 조건인 것으로 확인하였다.

< 실시예 2> 상황버섯균사체 추출물 분말의 제조

상기 실시예 1을 통해 확인한 상황버섯균사세 추출물 분말 제조의 최적의 조건을 적용하여 하기와 같이 상황버섯균사체 추출물 분말을 대량생산하였다.

먼저 상황버섯균주(P.linteus 03399BP)를 YMG에 계대하여 29℃ 인큐베이터에서 약 15일 동안 배양한 다음, 계대배양된 균주를 Cork borer를 이용하여 조각낸 후, 멸균된 증류수에 현탁하고, 현탁액을 HPIM 액체배지에서 접종한 후 29℃ 인큐베이터에서 6일동안 배양하였다. 배양된 1차 종균을 14 L 배양기에 접종한 후 배양온도 29℃, 통기량 2.0 NI/min, 교반수 200 rpm의 조건으로 6일 동안 배양하였다. 14 L 배양기 종균을 500 L 대용량 배양기에 접종한 후 배양온도 29 ℃, 통기량 90~130 NI/min, 교반수 80~100 rpm의 조건으로 72시간 동안 배양하였다. 500 L 배양기와 3 kL 배양기를 잇는 이송라인을 스팀멸균하고 식힌 다음 500 L 배양기에서 배양된 종균을 멸균된 이송라인을 통해 3 kL 배양기에 이송, 접종하고, 29℃, 750~1300 NI/min, 60~80 rpm 조건에서 72시간 배양하였다. 3 kL 배양기와 50 kL 배양기를 잇는 이송라인을 스팀멸균하고 식힌 다음, 3 kL 배양기에서 배양된 종균을 멸균된 이송라인을 통해 50 kL 배양기에 이송, 접종하고 29℃, 1050~1650 NI/min, 60~80 rpm 조건에서 96시간 배양하였다. 배양이 완료된 균사체를 저장탱크로 이송한 후 필터프레스를 이용하여 균사체와 배양액을 분리하여 추출기에 투입하고, 10배량의 정제수를 투입하여 100℃로 가온하여 24시간 추출하였다. 추출한 균사체를 필터프레스를 이용하여 균사체와 추출액을 분리하고, 추출액은 저장탱크에 이송하여 농축대기하고 균사체를 지정된 폐기장에 폐기하였다. 농축기를 이용하여 추출액을 시간당 20 kL 속도로 30 Brix가 될 때까지 농축하였다. 농축액 고형분량의 20배에 달하는 주정을 농축액에 가한 후 72시간 동안 정치하여 침전시켰다. 얻어진 침전물과 부형제를 혼합기에 혼합한 후 155℃로 가열된 분무건조기에 분당 20 L의 속도로 투입하여 분말화 작업을 하여 상황버섯균사체 추출물 분말을 제조하였다(도 1).

< 실험예 1> 단회투여 독성 평가

상기 실시예 2에서 제조한 상황버섯균사체 추출물 분말의 단회 투여 독성평가를 위해 Sprague-Dawley 랫드를 이용하여 하기와 같이 시험하였다. 구체적으로 상기 실시예 2에서 제조한 상황버섯균사체 추출물 분말을 Sprague-Dawley계 암수 6주령 랫드에 단회 경구투여시 나타나는 독성을 평가하고, 개략의 치사량을 구하기 위하여 군 구성은 상황버섯균사체 추출물 분말 5,000 mg/kg의 용량 및 대조군(주사용수)의 2군으로 하고, 암수 각각 5마리씩 단회 경구투여하였다. 투여 후 14일 동안 일반증상의 관찰 및 체중측정을 실시하였고, 관찰기간 종료시에 안락사시켜 부검하였다. 암(A)수(B) 체중 측정 결과는 도 2에 나타내었다.

그 결과, 암수 5,000 mg/kg 투여군에서 사망례는 관찰되지 않았으며 일반 증상, 체중 및 부검에서 상황버섯균사체 추출물 분말 투여에 의한 영향은 인정되지 않았다.

< 실험예 2> 상황버섯균사체 추출물 분말의 면역증강 효과 분석 ( in vitro )

상기 실시예 2에서 제조한 상황버섯균사체 추출물 분말의 면역증강 효과를 분석하기 위하여 하기와 같이 분석하였다.

2-1. 산화질소 생성능 평가 (Nitric oxide)

Balb/c계 생쥐에 고기능성 식품원료 (100 mg/kg, 200 mg/kg, 400 mg/kg)를 5주간 경구 투여하였다. 투여 종료 3일 전에 proteose peptone (Difco) 10% 수용액 15 ㎖을 생쥐 복강 내에 투여한 후 치사시키고 알코올로 복부를 소독하였다. 복부의 피부를 가위로 자르고 복막을 노출시킨 다음 냉각시킨 HBSS을 주사기로 복강 내에 10 mL 주입하고 30초간 복부를 마사지한 후 주사기로 회수하였다. 회수한 세포를 냉각시킨 다음 동일 HBSS 용액으로 2회 세척한 후 냉각된 배지 (RPMI1640)에 현탁시키고, tryphan blue 염색에 의해 살아있는 세포를 계산하여 2 × 106cells/㎖이 되도록 조정한 후 96 well 배양접시에 200 ㎕씩 분주하였다. CO₂ 배양기에서 1-2 시간 배양하여 대식세포를 부착시킨 다음 37℃의 HBSS 용액으로 3회 세척하여 부유 세포를 제거하고 100 ㎕의 배지 (RPMI 1640)를 넣고, CO₂ 배양기에서 72시간 배양 후 배양 상등액을 회수하여 냉동 보존하였다. 배양상등액 100 ㎕를 취하고 증류수 2 ㎖과 그리스 (Griese) 시약 I 200 ㎕를 혼합한 후 신속하게 그리스 시약 II 200 ㎕를 넣고 교반 후 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

그 결과, 정상군(Nor)의 경우 8.72±0.33 μM로 나타났으며, 홍삼 대조군(H)의 경우 24.00±16.95 μM로 나타나 정상군에 비해 유의하게 증가한 모습을 보였다 (p<0.001). 상황버섯 저농도 추출물 투여군(SL)은 32.83±20.80 μM로 정상군에 비해 유의하게 증가하였으며 (p<0.001), 상황버섯 중간농도 추출물 투여군과 고농도 추출물 투여군 (SM, SH)은 45.21±34.94 μM, 20.88±22.40 μM로 나타나 정상군에 비해 유의하게 증가하는 모습을 확인하였다 (p<0.01).

2-2. 비장세포 활성 싸이토카인 분석 : SPF에서 사육하며 5주간 고기능성 식물원료를 경구투여 한 8주령의 Balb/c계 생쥐 (male)의 비장을 취하여 적당량의 무균 HBSS 용액이 담긴 용기에 넣고, 핀셋으로 잘게 절단하여 단일 비장세포 현탁액중 CD4+ T isolation kit를 이용하여 분리한 T림프구를 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12 등 세포활성물질의 측정은 ELISA방법으로 수행하였다. ABTS 기질액을 각 well 에 100 ㎕씩 가하여 10 분간 발색을 유도한 다음 ELISA reader를 이용하여 405 nm 파장에서 IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-12 등을 측정하였다. 그 결과를 도 4a 내지 도 4e에 나타내었다.

그 결과는 다음과 같다.

IL-2: ELISA 키트를 이용하여 IL-2 싸이토카인 함량을 측정한 결과 정상군(Nor)의 경우 753.72 ±182.43 pg/ml로 나타났으며, 홍삼 대조군(H)의 경우 3263.02 ± 1228.02 pg/ml로 나타나 정상군에 비해 유의하게 증가하는 모습을 확인하였으며 (p<0.05), 상황버섯 저농도 추출물 투여군(SL)은 1720.26 ± 953.01 pg/ml로 정상군에 비해 증가하는 경향만 나타났다. 상황버섯 중간농도 추출물 투여군과 고농도 추출물 투여군 (SM, SH)은 2198.02 ± 580.50 pg/ml, 4175.94 ± 1437.29 pg/ml로 나타나 정상군에 비해 유의하게 증가하는 모습을 확인하였으며 (p<0.05), 특히 SH 투여군의 경우 홍삼 추출물 보다도 높은 모습을 나타내었다.

IL-4: ELISA 키트를 이용하여 IL-4 싸이토카인 함량을 측정한 결과 정상군의 경우 221.59 ± 14.88 pg/ml로 나타났으며, 홍삼 대조군의 경우 334.42 ± 33.43 pg/ml로 나타나 정상군에 비해 유의하게 증가하는 모습을 확인하였으며 (p<0.05), 상황버섯 저농도 추출물 투여군 (SL)은 262.41 ± 30.09 pg/ml로 정상군에 비해 증가하는 경향만 나타났다. 상황버섯 중간농도 추출물 투여군과 고농도 추출물 투여군 (SM,SH)은 300.74 ± 21.38 pg/ml, 405.03 ± 69.73 pg/ml로 나타나 정상군에 비해 유의하게 증가하는 모습을 확인하였으며 (p<0.05), 특히 SH 투여군의 경우 홍삼 추출물 보다도 높은 모습을 나타내었다.

IL-10: ELISA 키트를 이용하여 IL-4 싸이토카인 함량을 측정한 결과 정상군의 경우 221.59 ± 14.88 pg/ml로 나타났으며, 홍삼 대조군의 경우 334.42 ± 33.43 pg/ml로 나타나 정상군에 비해 유의하게 증가하는 모습을 확인하였으며 (p<0.05), 상황버섯 저농도 추출물 투여군 (SL)은 262.41 ± 30.09 pg/ml로 정상군에 비해 증가하는 경향만 나타났다. 상황버섯 중간농도 추출물 투여군과 고농도 추출물 투여군 (SM,SH)은 300.74 ± 21.38 pg/ml, 405.03 ± 69.73 pg/ml로 나타나 정상군에 비해 유의하게 증가하는 모습을 확인하였으며 (p<0.05), 특히 SH 투여군의 경우 홍삼 추출물 보다도 높은 모습을 나타내었다.

IL-12: ELISA 키트를 이용하여 IL-12 싸이토카인 함량을 측정한 결과 정상군의 경우 99.94 ± 9.30 pg/ml로 나타났으며, 홍삼 대조군의 경우 193.91 ± 26.76 pg/ml로 나타나 정상군에 비해 유의하게 증가하는 모습을 확인하였으며 (p<0.01), 상황버섯 저농도 추출물 투여군 (SL)은 125.12 ± 10.92 pg/ml로 정상군에 비해 증가하는 경향만 나타났다. 상황버섯 중간농도 추출물 투여군과 고농도 추출물 투여군 (SM,SH)은 181.88 ± 26.21 pg/ml, 241.05 ± 31.75 pg/ml로 나타나 정상군에 비해 유의하게 증가하는 모습을 확인하였으며 (p<0.05, p<0.01), 특히 SH 투여군의 경우 홍삼 추출물 보다도 높은 모습을 나타내었다.

IFN-γ: ELISA 키트를 이용하여 IFN-γ 싸이토카인 함량을 측정한 결과 정상군의 경우 135.79 ± 8.64 pg/ml로 나타났으며, 홍삼 대조군의 경우 234.41 ± 28.69 pg/ml로 나타나 정상군에 비해 유의하게 증가하는 모습을 확인하였으며 (p<0.01), 상황버섯 저농도 추출물 투여군 (SL)은 1185.84 ± 9.16 pg/ml로 정상군에 비해 유의하게 증가하였다 (p<0.01) 상황버섯 중간농도 추출물 투여군과 고농도 추출물 투여군 (SM,SH)은 167.43 ± 12.97 pg/ml, 279.88 ± 38.86 pg /ml로 나타나 정상군에 비해 유의하게 증가하는 모습을 확인하였으며 (p<0.05, p<0.01), 특히 SH 투여군의 경우 홍삼 추출물 보다도 높은 모습을 나타내었다.

이를 통해, 상기 실시예에 따른 상황버섯균사체 추출물 분말이 면역 증강에 우수한 효과를 나타냄을 알 수 있다.

< 실험예 3> 상황버섯균사체 추출물의 세포독성 평가

MTT assay를 통해 상황버섯 균사체 추출물의 세포생존율을 확인한 결과, 0.05 mg/ml의 농도에서는 109.91% ± 3.10, 0.1 mg/ml의 농도에서는 95.77% ± 1.40, 0.25 mg/ml의 농도에서는 93.83% ± 4.45, 0.5 mg/ml의 농도에서는 84.60% ± 4.94, 1 mg/ml의 농도에서는 81.90% ± 3.51로 나타나 상황버섯 추출물의 세포독성은 없는 것으로 확인되었다(도 5).

< 실험예 4> 상황버섯균사체 추출물 분말의 면역증강 효과 분석 ( in vivo )

상기 실시예 2에서 제조한 상황버섯균사체 추출물 분말의 면역증강 효과를 in vivo에서 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다. Balb/C 7주령 수컷을 오리엔트에서 구매하여 실험에 사용하였으며, 실험 당일까지 고형 사료 (Samyang corporation, Korea)와 물을 충분히 공급하였고 온도(22 ± 2℃), 습도 (55 ± 5%)가 조절된 사육실에서 12시간 light-dark cycle 환경을 유지하며 1주간 적응시킨 후 실험을 시작하였다. 정상군(Nor), 홍삼 500 mg/kg 투여군(H), 상황버섯 균사체 추출물 100 mg/kg 투여군(SL), 상황버섯 균사체 추출물 200 mg/kg 투여군(SM), 상황버섯 균사체 추출물 400 mg/kg 투여군(SH)로 각군당 14마리씩 5군으로 분리하여 5주간의 경구투여 후 부검을 진행하였다. 그 결과를 도 6a 내지 9d에 나타내었다.

4-1. PBMC 내 면역세포 분석

CD19+CD3+ 세포 변화 : 분리된 말초혈액 내 면역세포를 형광유세포 분석 결과, 정상군의 경우 CD3 T cell은 18.80% ± 0.40으로 나타났으며, 홍삼 대조군의 경우 23.70% ± 7.00으로 나타나 정상군에 비해 약간 증가하는 모습을 보였다. SL 투여군은 14.65% ± 0.55로 나타나 정상군에 비해 유의하게 감소함을 확인하였으며 (p<0.001), SM 투여군은 8.23% ± 2.17로 정상군에 비해 유의하게 감소하였다. SH 투여군의 경우 21.15% ± 8.55로 나타나 홍삼대조군과 비슷한 경향을 나타냈다. CD19 B cell의 경우 정상군은 78.45% ± 1.15로 나타났으며, 홍삼 대조군의 경우 72.30% ± 8.30으로 나타나 정상군에 비해 감소하는 경향을 보였다. SL 투여군은 82.85% ± 0.95로, SM 투여군은 89.45% ± 1.95로 나타나 정상군에 비해 유의하게 증가하는 모습을 보였다 (p<0.01, p<0.001). SH 투여군의 경우 75.75% ± 10.05로 정상군에 비해 감소하는 경향만 보였다(도 6a).

CD49b+CD3- 세포 변화 (NK 세포) : 정상군의 경우 CD49b+CD3- 세포는 6.7% ± 1.21로 나타났으며, 홍삼 대조군의 경우 11.2% ± 2.42로 정상군에 비해 16.8% 증가되는 경향을 나타내었다. SL 투여군과 SM 투여군은 7.3 ± 0.59, 7.3 ± 0.37로 10.9% 증가되었으며, SH 투여군은 7.8% ± 2.35로 정상군에 비해 116.% 유의하게 증가되었다(p<0.05)(도 6b).

Slelctin/CD62L+CD4+ 세포 변화 : 정상군의 경우 Slelctin/CD62L+CD4+ 세포는 43.7% ± 0.73으로 나타났으며, 홍삼 대조군의 경우 3.54% ± 0.11로 정상군에 비해 감소하는 경향을 나타내었다. SL 투여군은 5.08% ± 2.14, SM 투여군은 8.58% ± 2.73으로 정상군에 비해 증가하는 경향을 보였지만, SH 투여군의 경우 2.35% ± 0.45로 정상군에 비해 유의하게 감소 하였다 (p<0.05)(도 6c).

4-2. DLN 내 면역세포 분석

총 세포수 측정 : Draining lymph node 내 총 세포수 측정 결과 정상군의 경우 174 × 10⁶ cells/ml ± 26.00로 나타났으며, 홍삼 대조군의 경우 52 × 10⁶ cells/ml ± 48.01로 정상군에 비해 유의하게 세포수가 줄어들었다 (p<0.05) SL 투여군은 162 × 10⁶ cells/ml ± 50.01, SM 투여군은 118 × 10⁶ cells/ml ± 36.01, SH 투여군은 105 × 10⁶ cells/ml ± 27.00으로 측정되었다(도 7a).

CD4+CD25+ 세포 변화 : DLN 내 면역세포를 절대적 세포수 대비로 나타낸 결과 정상군의 경우 CD25 +CD4+ 세포는 10.68% ± 1.13으로 나타났으며, 홍삼 대조군의 경우 13.45% ± 1.85로 정상군에 비해 증가하는 경향을 보였으며, SL 투여군 14.85% ± 1.45, SM 투여군 14.40% ± 0.60, SH 투여군 13.65% ± 0.15로 농도의존적으로 감소하는 경향을 보였다(도 7b).

L-Slelctin/CD62L+CD4+ 세포 변화 : DLN 내 면역세포를 절대적 세포수 대비로 나타낸 결과 정상군의 경우 L-Slelctin/CD62L+CD4+ 세포는 48.35% ± 1.05으로 나타났으며, 홍삼 대조군의 경우 56.30% ± 0.80으로 정상군에 비해 유의하게 증가하는 것을 확인하였다 (p<0.001) SL 투여군은 54.70% ± 1.20, SM 투여군은 53.45% ± 2.05, SH 투여군의 경우 53.95% ± 0.05로 정상군에 비해 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 7c).

CD4+CD8+ 세포 변화 : DLN 내 면역세포를 절대적 세포수 대비로 나타낸 결과 정상군의 경우 CD4+T 세포는 60.05% ± 2.35로 나타났으며, 홍삼 대조군의 경우 64.55% ± 3.85로 정상군에 비해 증가하는 경향을 나타내었다. SL 투여군은 62.10% ± 0.20, SM 투여군은 60.90% ± 1.60, SH 투여군은 59.15% ± 0.05으로 정상군에 비해 증가하는 경향만을 보였다. CD8+ T 세포의 경우 정상군은 23.85% ± 0.95로 나타났으며, 홍삼 대조군은 27.30% ± 1.00로 정상군에 비해 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 (p<0.05), SL 투여군은 26.45% ± 0.25, SM투여군은 26.65% ± 0.35, SH 투여군은 25.50% ± 3.10으로 모두 정상군보다 증가하는 경향만 나타났다(도 7d).

4-3. 흉선(Thymus) 내 면역세포 분석

총 세포수 측정 : 흉선(Thymus) 내 총 세포수 측정 결과 정상군의 경우 1090 × 10⁶ cells/ml ± 30.00으로 나타났으며, 홍삼 대조군의 경우 4270 × 10⁶ cells/ml ± 650.10으로 정상군에 비해 유의하게 세포수가 증가하였다 (p<0.01) SL 투여군은 2400 × 10⁶ cells/ml ± 620.09, SM 투여군은 4350 × 10⁶ cells/ml ± 190.03, SH 투여군은 6210 × 10⁶ cells/ml ± 1490.23으로 농도의존적으로 세포수가 증가하는 모습을 확인하였다(도 8a).

CD4+CD25+ 세포 변화 : 흉선 내 면역세포를 절대적 세포수 대비로 나타낸 결과 정상군의 경우 CD25+CD4+ 세포는 1.51% ± 0.29로 나타났으며, 홍삼 대조군의 경우 2.48% ± 0.24로 정상군에 비해 유의하게 증가하였으나 (p<0.05), SH 투여군의 경우 2.01% ± 0.25은 정상군에 비해 증가하는 경향만을 나타내었다(도 8b).

CD4+CD8+ 세포 변화 : 흉선 내 면역세포를 절대적 세포수 대비로 나타낸 결과 정상군의 경우 CD4+T 세포는 14.25% ± 1.35로 나타났으며, 홍삼 대조군의 경우 11.60% ± 0.80으로 정상군에 비해 감소하는 경향을 나타내었다. SL 투여군은 12.80% ± 1.90, SM 투여군은 12.25% ± 0.15, SH 투여군은 12.85% ± 0.85로 정상군에 비해 감소하는 경향을 나타내었다. CD8+ T 세포의 경우 정상군은 4.96% ± 1.59, 홍삼 대조군은 4.55% ± 0.05로 정상군에 비해 감소하는 경향을 나타내었다. SL투여군은 4.12% ± 0.46, SM투여군은 3.91% ± 0.51, SH투여군은 4.92% ± 0.42로 모두 정상군보다 소폭 감소하는 경향을 보였다(도 8c).

CD4+CD69+ 세포 변화 : 흉선 내 면역세포를 절대적 세포수 대비로 나타낸 결과 정상군의 경우 CD4+CD69+ 세포는 5.55% ± 0.11으로 나타났으며, 홍삼 대조군의 경우 7.72% ± 0.01로 나타나 정상군에 비해 유의하게 증가하였다 (p<0.001). SL투여군은 8.87% ± 0.28, SM투여군은 8.09% ± 0.61, SH투여군은 9.08% ± 1.42로 나타나 정상군에 비해 유의하게 증가함을 확인하였다(도 8d).

4-4. 복강침출세포(PEC) 내 면역세포 분석

총 세포수 측정 : 복강침출세포(PEC) 내 총 세포수 측정 결과 정상군의 경우 990 × 10⁶ cells/ml ± 410.00으로 나타났으며, 홍삼 대조군의 경우 500 × 10⁶ cells/ml ± 23.10으로 정상군에 비해 세포수가 감소하였다. SL 투여군은 300 × 10⁶ cells/ml ± 11.55, SM 투여군은 420 × 10⁶ cells/ml ± 4620, SH 투여군은 520 × 10⁶ cells/ml ± 173.24로 농도의존적으로 세포수가 증가하였다(도 9a).

CD4+CD8+ 세포 변화 : 복강침출세포 내 면역세포를 절대적 세포수 대비로 나타낸 결과 정상군의 경우 CD4+ T 세포는 7.81% ± 0.40으로 나타났으며, 홍삼 대조군의 경우 10.90% ± 0.30으로 정상군에 비해 유의하게 증가하였다 (p<0.001) SL 투여군은 12.45% ± 1.15, SM 투여군은 11.25% ± 0.15, SH 투여군은 3.88% ± 0.39로 정상군에 비해 농도의존적으로 유의하게 감소하였다. CD8+ T 세포의 경우 정상군은 4.61% ± 0.18, 홍삼 대조군은 5.19% ± 0.61로 정상군에 비해 증가하는 경향만 나타났다. SL투여군은 5.48% ± 0.53로 정상군에 비해 다소 증가하는 모습을 나타내었고, SM투여군은 0.32% ± 0.15, SH투여군은 0.36% ± 0.12로 두군 모두 정상군보다 유의하게 감소하였다(도 9b).

B220+CD23+ 세포 변화 : 복강침출세포 내 면역세포를 절대적 세포수 대비로 나타낸 결과 정상군의 경우 B220+CD23+ 세포는 25.20% ± 2.00으로 나타났으며, 홍삼 대조군의 경우 24.75% ± 2.75로 나타나 정상군에 비해 감소하는 경향을 보였다. SL투여군은 18.10% ± 4.00, SM투여군은 26.00% ± 2.30으로 측정되었으며, SH투여군의 경우 13.40% ± 0.20으로 정상군에 비해 유의하게 감소하였다 (p<0.001)(도 9c).

B220+CD69+ 세포 변화 : 복강침출세포 내 면역세포를 절대적 세포수 대비로 나타낸 결과 정상군의경우 B220+CD69+ 세포는 9.16% ± 0.21, 홍삼 대조군의 경우 93.1% ± 0.07로 나타나 정상군과 비슷한 경향을 나타냄. SL투여군은 19.32% ± 1.78, SM투여군은 14.65% ± 1.15로 측정되었고, SH투여군의 경우 13.30% ± 0.40로 정상군에 비해 농도의존적으로 유의하게 증가하였다(도 9d).

< 실험예 5> 상황버섯균사체 추출물 분말의 골관절염 치료 효과 분석 ( in vivo )

상기 실시예 2에서 제조한 상황버섯균사체 추출물 분말의 골관절염 치료 효과를 in vivo에서 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

SD-rat 7주령 수컷을 대한바이오링크 (충북 음성, 한국)에서 구매하여 실험에 사용하였다. 정상군(Nor), MIA로 골관절염을 유발한 대조군(Con), 초록잎홍합 추출물 200 mg/kg 투여군(GML), 상황버섯균사체 추출물 50 mg/kg 투여군(SL), 상황버섯균사체 추출물 100 mg/kg 투여군(SM), 상황버섯 균사체 추출물 200 mg/kg 투여군(SH)로 각 군당 6마리씩 6군으로 분리하였다. 7일간의 적응기 후 MIA로 골관절염을 유발하였고, 유발 7일 뒤 뒷다리 체중 부하를 측정하여 군분리 후 2주간의 약물투여를 진행하고 부검하였다.

골관절염 유발을 위해, 정상군을 제외한 실험군에게 마취제 Zoletile mixture을 3.5 mg/kg를 복강에 투여하여 마취한 후, 오른쪽 무릅 주변을 깨끗하게 제모한 후 골관절염 유발물질인 MIA를 0.9% saline로 희석하여 0.3 mL 인슐린 주사기를 사용하여 오른쪽 무릎 관절강 내에 50 μL (80 mg/kg/mL) 씩 투여하였다. MIA 투여 7일 후 관절염 유발 유무를 확인하여 관절염이 유발된 동물만 사용하였다.

관절조직에서 세포질을 얻기 위해 100 mM Tris-HCl (pH 74), 5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl₂, 15 mM CaCl₂, 15 M sucrose, 0.1 M DTT, protease inhibitor cocktail을 첨가한 buffer A를 넣고 조직 분쇄기 (tissue grinder) (Biospec Product, Bartlesville, OK, USA)로 분쇄한 후 10% NP-40 용액을 첨가하였다. 아이스 위에서 20분간 정치시킨 후 12,000 rpm으로 2분간 원심분리 하여 세포질을 포함하고 있는 상층액을 분리한 후 핵을 얻기 위해 10% NP-40가 더해진 buffer A에 두 번 헹구고 100 ㎍의 buffer C (50 mM HEPES, 50 mM KCl, 0.3 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 10% glycerol)를 첨가해 재부유시킨 후 10분마다 vortex를 3번 반복한 후, 4℃에서 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리한 후 핵을 포함하고 있는 상층액을 얻어 -80℃에서 각각 냉동 보관하였다. 관절조직에서 세포질의 p-p38, iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6, IL-1β, MMP-1, TIMP-1, β-actin 단백질과 핵에서의 NF-kBp65, 히스톤 단백질 발현을 측정하기 위하여 12 μg의 단백질을 8-15% SDS polyacrylamide gel을 이용하여 전기연동 후, 아크릴아마이드 겔을 나이트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 이동시켰다. 준비된 멤브레인에 각각의 1차 항체를 처리하여 4℃에서 overnight 시킨 다음 PBS-T로 6분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체 (PBS-T로 1:3000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBS-T로 6분마다 5회 세척함. membrane을 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액에 노출시킨 후, Sensi-Q2000 Chemidoc (Lugen Sci Co, Ltd, Seoul, Korea)에 감광시켜 단백질 발현을 확인한 후, 해당 band를 ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan) 프로그램을 사용하여 정량하여 분석하였다. 그 결과를 도 10a 내지 도 10d에 나타내었다.

염증 관련 단백질 발현 분석

NF-kBp65 : 관절 조직 내 염증 관련 단백질 발현량을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과 정상군에 비해 MIA로 유발된 관절염 대조군은 1.26 ± 0.04로 유의하게 증가한 모습을 확인할 수 있었으며 (p<0.001), 양성대조군인 GML 투여군운 1.06 ± 0.06으로 대조군에 비해 유의하게 감소하였음다 (p<0.001). SL 투여군은 1.17 ± 0.05, SM 투여군은 1.10 ± 0.05, SH 투여군은 1.10 ± 0.06로 나타나 대조군에 비해 농도의존적으로 유의적 발현량 감소가 확임되었다.

p-p38 : 관절 조직 내 p-p38 인자의 단백질 발현량을 확인한 결과 정상군에 비해 MIA 유발 관절염 대조군은 1.29 ± 0.19로 정상군에 비해 유의하게 높은 발현량을 보였으며 (p<0.01), 양성대조군인 GML군은 0.81 ± 0.27로 대조군에 비해 유의하게 낮은 발현량을 나타내었다 (p<0.05). SL군은 0.82 ± 0.32, SM군은 0.69 ± 0.25, SH군은 0.68 ± 0.26으로 농도의존적으로 유의적인 발현량 감소가 확인되었다.

iNOS : 관절 조직 내 iNOS의 단백질 발현량을 확인한 결과 정상군에 비해 MIA 유발 관절염 대조군은 1.44 ± 0.10으로 정상군에 비해 유의하게 높은 발현량을 보였으며 (p<0.01), 양성대조군인 GML군은 1.04 ± 0.14로 대조군에 비해 유의하게 낮은 발현량을 나타내었다 (p<0.05). SL군은 1.20 ± 0.21, SM군은 1.08 ± 0.13, SH군은 1.07 ± 0.13 으로 농도의존적으로 유의하게 발현량이 감소하였다.

COX-2 : 관절 조직 내 COX-2 단백질 발현량을 확인한 결과 정상군에 비해 MIA 유발 관절염 대조군은 1.39 ± 0.07로 정상군에 비해 유의하게 높은 발현량을 보였으며 (p<0.01), 양성대조군인 GML군은 1.12 ± 0.10으로 대조군에 비해 유의하게 낮은 발현량을 나타내었다 (p<0.05). SL군은 1.12 ± 0.08로 양성대조군과 비슷한 경향을 나타냈으며, SM군은 1.08 ± 0.07, SH군은 1.04 ± 0.08로 농도의존적으로 유의하게 발현량이 감소하였다.

TNF-a : 관절 조직 내 TNF-a의 단백질 발현량을 확인한 결과 정상군에 비해 MIA 유발 관절염 대조군은 1.24 ± 0.06으로 정상군에 비해 유의하게 높은 발현량을 보였으며 (p<0.01), 양성대조군인 GML군은 0.82 ± 0.16으로 대조군에 비해 유의하게 낮은 발현량을 나타내었다 (p<0.05). SL군은 0.93 ± 0.26으로 대조군에 비해 감소하는 경향을 나타내었고, SM군은 0.73 ± 0.12, SH군은 0.75 ± 0.10로 대조군에 비해 유의하게 발현량이 감소하였다 (p<0.01, p<0.001).

IL-6 : 관절 조직 내 IL-6의 단백질 발현량을 확인한 결과 정상군에 비해 MIA 유발 관절염 대조군은 1.45 ± 0.10으로 정상군에 비해 유의하게 높은 발현량을 보였으며 (p<0.001), 양성대조군인 GML군은 1.31 ± 0.06, SL군은 1.39 ± 0.09, SM군은 1.32 ± 0.14로 대조군에 비해 감소하는 경향만을 나타냈으나, SH군은 1.12 ± 0.12로 대조군에 비해 유의하게 발현량이 감소하였다 (p<0.05).

IL-1b : 관절 조직 내 IL-1b의 단백질 발현량을 확인한 결과 정상군에 비해 MIA 유발 관절염 대조군은 1.32 ± 0.05로 정상군에 비해 유의하게 높은 발현량을 보였으며 (p<0.01), 양성대조군인 GML군은 1.31 ± 0.12, SL군은 1.24 ± 0.15, SM군은 1.05 ± 0.18로 대조군에 비해 감소하는 경향만을 나타냈으나, SH군은 1.01 ± 0.12로 대조군에 비해 유의하게 발현량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (p<0.05).

관절 관련 단백질 발현 분석

MMP-1 : 상황버섯 균사체 추출물의 골관절염 개선 효과를 확인하기 위해 관절 조직 내 관절관련 인자인 MMP-1의 발현량을 확인한 결과 정상군에 비해 MIA 유발 관절염 대조군은 1.44 ± 0.13으로 정상군에 비해 유의하게 발현량이 증가되었고 (p<0.05), 양성대조군인 GML군은 1.05 ± 0.09, SM군은 0.95 ± 0.12, SH군은 0.85 ± 0.09로 대조군에 비해 유의하게 감소하였다 (p<0.05, p<0.01). 그러나 SL군은 1.25 ± 0.13으로 대조군에 비해 감소하는 경향만 보였다.

TIMP-1 : 관절 조직 내 TIMP-1의 발현량을 확인한 결과 정상군에 비해 MIA 유발 관절염 대조군은 0.66 ± 0.05로 정상군에 비해 유의하게 발현량이 감소되었고 (p<0.05), 양성대조군인 GML군은 0.82 ± 0.08, SL군은 0.70 ± 0.04, SM군은 0.65 ± 0.07, SH군은 0.73 ± 0.06으로 대조군에 비해 유의하진 않지만 감소하는 경향을 나타내었다.

이상, 본 발명을 바람직한 제조예, 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명하였으나, 본 발명의 범위는 특성 실시예에 한정되는 것은 아니며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 해석되어야 할 것이다. 또한, 이 기술분야에서 통상의 지식을 습득한 자라면, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서도 많은 수정과 변형이 가능함을 이해하여야 할 것이다.

Claims

상황버섯(Phellinus linteus)균사체를 배양하는 단계;
배양된 균사체 및 균사체의 8배 내지 12배의 정제수를 추출기에 투입하는 단계; 및
60℃ 내지 150℃에서 20시간 내지 30시간 동안 추출하는 단계;를 포함하는, 상황버섯균사체 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서,
80℃ 내지 120℃에서 22시간 내지 26시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는, 상황버섯균사체 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 추출하는 단계는 1회 이상 반복하여 추출하는 것을 특징으로 하는, 상황버섯균사체 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 추출하는 단계는 1회만 추출하는 것을 특징으로 하는, 상황버섯균사체 추출물의 제조방법.
제1항의 제조방법으로 제조된 상황버섯균사체 추출물을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 조성물.
제1항의 제조방법으로 제조된 상황버섯 균사체 추출물을 유효성분으로 포함하는, 골관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
상황버섯(Phellinus linteus)균사체를 배양하는 단계;
배양된 균사체 및 균사체의 8배 내지 12배의 정제수를 추출기에 투입하는 단계; 및
60℃ 내지 150℃에서 20시간 내지 30시간 동안 추출하는 단계;
추출된 추출액을 농축한 후 120℃ 내지 180 ℃에서 분무건조하여 분말화하는 단계
를 포함하는, 상황버섯균사체 추출물 분말의 제조방법.
제7항의 제조방법으로 제조된 상황버섯균사체 추출물 분말을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 조성물.
제7항의 제조방법으로 제조된 상황버섯균사체 추출물 분말을 유효성분으로 포함하는, 골관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항의 제조방법으로 제조된 상황버섯균사체 추출물을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 건강기능식품.
제7항의 제조방법으로 제조된 상황버섯균사체 추출물 분말을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 건강기능식품.
제1항의 제조방법으로 제조된 상황버섯균사체 추출물을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 완화용 건강기능식품.
제7항의 제조방법으로 제조된 상황버섯균사체 추출물 분말을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 완화용 건강기능식품.