CN105695352A - 一种中药水提物增强双歧杆菌活菌数的方法及其产品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中药水提物增强双歧杆菌活菌数的方法及其产品。一种利用中药水提物增加双歧杆菌活菌数的方法，利用中药增强的TPY培养基对双歧杆菌进行厌氧或兼性厌氧培养发酵。中药增强的TPY培养基是将特定几种中草药水提液加入TPY培养基所得。太子参、北沙参、黄芪、虫草花等都是属于药食同源类中药，具有补中益气的作用，能够促进双歧杆菌的生长，提高活菌数，同时中药本身的效用又能协同提高的双歧杆菌的益生保健和增强免疫功能作用。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种中药水提物增强双歧杆菌活菌数的方法及其产品。
背景技术
双歧杆菌作为人体内的正常生理菌和最重要的益生菌，为人体肠道健康提供独特的保护作用。在迄今为止，已有大量的文献表明，双歧杆菌具有维持肠道微生态平衡、营养与促机体生长作用、免疫增强抗衰老作用、降低血脂和胆固醇作用、改善糖尿病症状和抗肿瘤作用等。双歧杆菌是严格兼性厌氧菌，在生产上需要一定的厌氧条件，同时对营养要求非常苛刻，有时候需要在培养基中加入牛肉汤，猪肝汤等才能进一步提高活菌数或延长活菌存活时间，在一定意义上限制了双歧杆菌活菌产品的保存和大规模的生产。且增加了产品在贮藏过程中染菌的风险。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种利用中药水提物增加双歧杆菌活菌数的中药增强型TPY培养基。
本发明的另一目的是提供一种中药水提物增强双歧杆菌活菌数的方法。
本发明的又一目的是提供按照该方法制备的口服液产品或菌粉产品。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种利用中药水提物增加双歧杆菌活菌数的中药增强型TPY培养基，所述的中药增强型TPY培养基是在常规TPY双歧杆菌培养基中加入相当于常规TPY双歧杆菌培养基体积1％～5％(V/V)的中药水提液混合而成；所述的中药水提液选自北沙参、太子参、黄芪、虫草花、党参、白术、百合中的一种的水提液或多种的水提液的混合物。
作为本发明的优选方式，所述的中药水提液优选北沙参、太子参、黄芪、虫草花、党参、白术、百合中的任意一种的水提液。
作为本发明的优选方式，所述的中药水提液选自北沙参水提液和太子参水提液的混合物、北沙参水提液和黄芪水提液的混合物、太子参水提液和黄芪水提液的混合物、太子参水提液、北沙参水提液和黄芪水提液的混合物、太子参水提液和虫草花水提液的混合物、北沙参水提液和和虫草花水提液的混合物、黄芪水提液和虫草花水提液的混合物、太子参水提液、北沙参水提液、黄芪水提液和虫草花水提液的混合物。
作为本发明进一步的优选方式，所述的中药水提液选自北沙参水提液和太子参水提液1:1～2体积比混合的混合物、北沙参水提液和黄芪水提液1:1～3体积比混合的混合物、太子参水提液和黄芪水提液1～2:1～3体积比混合的混合物、太子参水提液和虫草花水提液1～2:1～2体积比混合的混合物、北沙参水提液和和虫草花水提液1:1～2体积比混合的混合物、黄芪水提液和虫草花水提液1～3：1～2体积比混合的混合物。
作为本发明的更进一步优选方试，所述的中药水提液为北沙参水提液、太子参水提液、黄芪水提液按照1:1～2:1～3体积比混合而成，或者为北沙参水提液：太子参水提液：黄芪水提液：虫草花水提液体积比按照1:1～2:1～3：1～2混合而成。
所述的北沙参、太子参、黄芪、虫草花、党参、白术或百合的水提液通过以下方法制备得到：取药材，按照1：10(g/ml)的料液比加入去离子水冷浸1～3h，加热回流1～3h，取滤液，向药渣中按照1：5～10(g/ml)的料液比加入去离子水，加热回流1h～3h，合并两次滤液，趁热过滤，加热浓缩，使药材与浓缩液的质量体积比为1:1，121℃高压灭菌40～50min。
所述的虫草花水提液通过以下方法制备得到：取虫草花药材，按照1:30(g/ml)的料液比加入去离子水，90℃热浸25～30min，在水浴上90℃提取1～2h，取滤液，加热浓缩，使药材与浓缩液的质量体积比为1:1，121℃高压灭菌40～50min。
双歧杆菌常规TPY培养基[1]组方：大豆蛋白胨5g、胰胨5g、酵母粉10g、葡萄糖10g、吐温-801mL、L-半胱氨酸0.5g、无机盐液40mL(每1L中CaCl2含量为0.2g，K2HPO4为1.0g，MgSO4·7H2O为0.48g，KH2PO4为1.0g，NaHCO3为10.0g，NaCl为2.0g)、H2O加至1L，pH7.0。121℃高压灭菌20min。
本发明所述的中药增强型TPY培养基在增加双歧杆菌活菌数中的应用。
一种利用中药水提物增加双歧杆菌活菌数的方法，取双歧杆菌种子液按照0.5～5％(V/V)接种量，接入常规TPY培养基，35～38℃静置培养8小时活化，活化后的双歧杆菌以0.1～1％体积比接入到中药增强的TPY培养基中，35-38℃厌氧或兼性厌氧培养12-16h的发酵产物。
本发明所述的方法优选将发酵产物无菌灌装成口服液，或离心集菌后冷冻干燥成菌粉。
本发明所述的方法优选将所述的发酵产物经过8000～10000rpm离心浓缩，得菌泥，按菌泥：冻干保护剂＝10～20：1(V/V)向菌泥中加入冻干保护剂，充分混合均匀后置于真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥制得的菌粉，粉碎，过40目筛得中药增强双歧杆菌菌粉；其中冻干保护剂保护剂配方为Vc1～2wt％，谷氨酸钠1～2wt％，脱脂乳12～20wt％，乳糖8～15wt％，溶剂为去离子水。
本发明所述的双歧杆菌选自长双歧杆菌，青春双歧杆菌，两歧双歧杆菌，婴儿双歧杆菌中的任意一种。
按照本发明所述的方法制备得到的中药增强双歧杆菌口服液或中药增强双歧杆菌菌粉。
有益效果：
本发明加了中药的TPY培养基能够取代牛肉汤、猪肝汤等物质，比一般TPY培养基明显增加双歧杆菌的活菌数，并且有利于双歧杆菌活菌的存活和提高稳定性。其次牛肉汤和猪肝汤操作麻烦，本身的营养过于丰富，不利于发酵产品的贮存。而上述所加的中药大部分是药食同源的物质，本身具有一定的保健作用，具有补中益气的作用，不仅能够促进双歧杆菌的生长，提高活菌数，还能发挥中药本身的药效协同提高双歧杆菌的益生保健和增强免疫功能。
附图说明
图1、中药增强培养双歧杆菌电泳图，从左到右分别为TPY培养基组，TPY培养基组加牛肉汤和猪肝汤组，加太子参、北沙参和黄芪组，加黄芪组，加太子参组，加北沙参组。
具体实施方式
实施例1
(1)中药水提液的制备：取太子参药材或药材粉末500g，加5L去离子水冷浸1h，加热回流2h，取滤液，药渣再加2.5L去离子水加热回流1h，合并两次滤液，趁热过滤，加热浓缩至500ml(即相对于生药量为1g/ml)，121℃高压灭菌40min。北沙参、黄芪水提液的制备方法同上述太子参。
(2)双歧杆菌TPY常规培养基的制备方法：大豆蛋白胨5g、胰胨5g、酵母粉10g、葡萄糖10g、吐温-801mL、L-半胱氨酸0.5g、无机盐液40mL(每1L中CaCl2含量为0.2g，K2HPO4为1.0g，MgSO4·7H2O为0.48g，KH2PO4为1.0g，NaHCO3为10.0g，NaCl为2.0g)、H2O1L，pH7.0。121℃高压灭菌20min。
(3)将太子参、北沙参、黄芪中药水提液分别离心，离心转速6000rpm，离心时间10min。按体积比，分别取离心后的北沙参水提液20ml、太子参水提液20ml和黄芪水提液20ml单独或不同组合混合加入到1L高压灭菌的TPY常规培养基中，混匀。按照接种量0.5％体积比接入长双歧杆菌于TPY常规培养基，37℃静置培养8小时活化，活化后的青春双歧杆菌将以0.1％体积比接入到中药增强的TPY培养基中，37℃静置培养14h，培养液尽量充满培养瓶，减少氧气含量。培养时间按照不同体积通过测定OD值确定培养终点。
(4)在酶标仪或分光光度计上测得OD600数值，测定单独、不同组合中药增强培养基培养的双歧杆菌的OD600数值，并且活菌采用不同稀释度，在TPY常规培养基加牛肉汤和猪肝汤及琼脂的平板上厌氧培养，计算同步OD600测量值与活菌数的线性关系，从而通过OD值直接换算出活菌数。结果，TPY培养基中添加了单味中药、两两组合或者三者混合的中药组方的双歧杆菌OD值和活菌数见表1。
表1添加太子参、北沙参、黄芪培养的双歧杆菌活菌数
(5)将已经测定确定最佳组合的中药增强双歧杆菌大批培养发酵，发酵液自动灌装成100ml,250ml,500ml等不同体积的口服液，或者经过8000rpm离心浓缩发酵液，得菌泥。冷冻干燥，按菌泥：冻干保护剂＝15：1(V/V)加入冻干保护剂，充分混合均匀。冻干保护剂配方为Vc1.5wt％，谷氨酸钠1.5wt％，脱脂乳16wt％，乳糖10wt％，溶剂为去离子水.然后将上述样品置于真空冷冻干燥机中，预冻至－40℃，启动真空，在0.1mmHg的真空条件下进行真空冷冻干燥。待样品完全干燥后，释放真空，取出制得的菌粉，粉碎，过40目筛得中药增强双歧杆菌菌粉。口服液或菌粉可以直接口服使用，或加入牛奶中口服使用。
实施例2
(1)中药水提液的制备：取虫草花500g，以料液比1:30(g/ml)加入90℃热水，在水浴上90℃提取2h，过滤除渣，加热浓缩至500ml(即相对于生药量为1g/ml)，121℃高压灭菌40min。
(2)双歧杆菌TPY常规培养基的配制同实例1所述。
(3)将上述浓缩的中药水提液离心，离心转速6000rpm，离心时间10min。按体积比，取虫草花浓缩液20ml单独加入到1L高压过的TPY常规培养基中，混匀。按照接种量0.5％体积比接入青春双歧杆菌于TPY常规培养基，37℃静置培养8小时活化，活化后的长双歧杆菌将以0.1％体积比接入到虫草花增强的TPY培养基中，37℃静置培养14h，培养液尽量充满培养瓶，减少氧气含量。培养时间按照不同体积通过测定OD值确定培养终点。
(4)在酶标仪或分光光度计上测得OD600数值，测定中药增强培养基的OD600数值，通过OD值直接计算出活菌数。结果，常规培养基中添加的单味中药OD值和双歧杆菌的活菌数见表2。
表2添加虫草花培养的双歧杆菌活菌数
(5)确定培养组方的虫草花增强双歧杆菌大批培养发酵和冻干方法见实施例1。
实施例3
(1)中药水提液的制备：取虫草花500g，以料液比1:30(g/ml)加入90℃热水，在水浴上90℃提取2h，过滤除渣，加热浓缩至500ml(即相对于生药量为1g/ml)，121℃高压灭菌40min。取太子参药材或药材粉末各500g，加5L去离子水冷浸1h，加热回流2h，取滤液，药渣再加2.5L去离子水加热回流1h，合并两次滤液，趁热过滤，加热浓缩至500ml(即相对于生药量为1g/ml)，121℃高压灭菌40min。北沙参、黄芪水提液的制备方法同上述太子参。
(2)双歧杆菌TPY常规培养基的制备方法同实例1所述。
(3)将虫草花、太子参、北沙参、黄芪中药水提液分别离心，离心转速6000rpm，离心时间10min。按体积比，分别取离心后的虫草花水提液20ml、北沙参水提液20ml、太子参水提液20ml和黄芪水提液20ml单独或不同组合混合加入到1L高压过的TPY常规培养基中，混匀。按照接种量0.5％体积比接入婴儿双歧杆菌于TPY常规培养基，37℃静置培养8小时活化，活化后的婴儿双歧杆菌将以0.1％体积比接入到中药增强的TPY培养基中，37℃静置培养14h，培养液尽量充满培养瓶，减少氧气含量。培养时间按照不同体积通过测定OD值确定培养终点。(4)在酶标仪或分光光度计上测得OD600数值，按照实施例1方法计算OD600测量值与活菌数的线性关系，从而通过OD值直接计算出活菌数。结果，TPY培养基中添加了单味中药及各种不同组合中药的OD值和双歧杆菌的活菌数见表3。
表3添加黄芪、太子参、北沙参、虫草花培养的双歧杆菌活菌数
(5)加北沙参和虫草花或加太子参、黄芪、北沙参、虫草花增强双歧杆菌大批培养发酵和冻干方法见实施例1。
实施例4
(1)中药水提液的制备：取枸杞药材或药材粉末各500g，加5L去离子水冷浸1h，加热回流2h，取滤液，药渣再加2.5L去离子水加热回流1h，合并两次滤液，趁热过滤，加热浓缩至500ml(即相对于生药量为1g/ml)，121℃高压灭菌40min。百合、天冬、麦冬、白术、女贞子、绞股蓝、党参、墨旱莲、刺五加水提液的制备方法同上述枸杞。
(2)双歧杆菌TPY常规培养基的制备方法同实例1所述。
(3)将枸杞、百合、天冬、麦冬、白术、女贞子、绞股蓝、党参、墨旱莲、刺五加中药水提液分别离心，离心转速6000rpm，离心时间10min。分别取上述各水提液20ml单独加入到1L高压过的TPY常规培养基中，混匀。按照接种量0.5％体积比接入两歧双歧杆菌于TPY常规培养基，37℃静置培养8小时活化，活化后的两歧双歧杆菌将以0.1％体积比接入到中药增强的TPY培养基中，37℃静置培养14h，培养液尽量充满培养瓶，减少氧气含量。培养时间按照不同体积通过测定OD值确定培养终点。
(4)在酶标仪或分光光度计上测得OD600数值，按照实施例1方法计算OD600测量值与活菌数的线性关系，从而通过OD值直接计算出活菌数。结果，常规培养基中添加的单味中药OD值和双歧杆菌的活菌数见表4。
表4常规培养基中添加的单味中药OD值和双歧杆菌的活菌数。
(5)加党参和百合增强双歧杆菌大批培养发酵和冻干方法见实施例1
实施例5
将实施例1中的长双歧杆菌离心，取沉淀，称取菌体的湿重，每个组别分别取0.1g湿菌加1mlPB洗涤两次，洗涤后的沉淀加4mlPB超声1h。取200ul的超声液加电泳样品缓冲液，煮10min，稍离心，取40ul上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。电泳结果可见，加了不同中药组合的长双歧杆菌的蛋白电泳图的高分子量蛋白条带明显不同于TPY培养基组，说明中药增强培养，使双歧杆菌的蛋白表达谱发生了改变(图1)。
实施例6
上述实施例中的双歧杆菌口服液产品和冻干粉产品择优选择活菌数高的配方生产的产品，进一步进行了质量鉴定。结果表明，实施例1-3中的口服液的pH为4-5，可溶性固形物大于或等于2.6％,蛋白质大于或等于1.0％，砷小于或等于0.2mg/kg,铅小于或等于0.3mg/kg。双歧杆菌刚培养结束，活菌数很高，在保存期间或测量期间暴露空气后容易死亡，活菌数在1年保存期内大于或等于每毫升1亿，霉菌计数小于10个/mL,酵母菌计数小于10个/mL，大肠杆菌计数小于40个/mL，致病菌(肠道致病菌及致性球菌)未检出，异常毒性试验小鼠健康存活，体重增加。食品添加剂符合GB2760规定。
实施例1-3中双歧杆菌冻干粉刚冻干时候活菌数很高，在负20-80℃保存期间双歧杆菌死亡少于4-8℃保存，在1年4-8℃保存期间中双歧杆菌数大于或等于每克5亿，杂菌总数小于或等于1000个/克，霉菌总数小于100个/克，大肠杆菌未检出，绿脓杆菌未检出，沙门志贺氏菌未检出，金黄色葡萄菌未检出，干燥失重小于或等于6％，异常毒性试验小鼠健康存活，体重增加。食品添加剂符合GB2760规定。
参考文献
1、邱宏端,李志达,朱秋亭,等.异麦芽寡糖对双歧杆菌增殖及影响因素的研究[J].福州大学学报(自然科学版).1999,27(4):50-53。
Claims (10)
1.一种利用中药水提物增加双歧杆菌活菌数的中药增强型TPY培养基，其特征在于所述的中药增强型TPY培养基是在常规TPY双歧杆菌培养基中加入相当于常规TPY双歧杆菌培养基体积1％～5％(V/V)的中药水提液混合而成；所述的中药水提液选自北沙参、太子参、黄芪、虫草花、党参、白术、百合中的一种的水提液或多种的水提液的混合物。
2.根据权利要求1所述的方法其特征在于中药增强型TPY培养基，其特征在于中药水提液为北沙参水提液、太子参水提液、黄芪水提液按照1:1～2:1～3体积比混合而成，或者为北沙参水提液：太子参水提液：黄芪水提液：虫草花水提液体积比按照1:1～2:1～3：1～2混合而成，或者选自北沙参、太子参、黄芪、虫草花、党参、白术、百合中任意一种或两种的水提液。
3.根据权利要求2所述的方法其特征在于中药增强型TPY培养基，其特征在于所述的北沙参、太子参、黄芪、虫草花、党参、白术或百合的水提液通过以下方法制备得到：取药材，按照1：10(g/ml)的料液比加入去离子水冷浸1～3h，加热回流1～3h，取滤液，向药渣中按照1：5～10(g/ml)的料液比加入去离子水，加热回流1h～3h，合并两次滤液，趁热过滤，加热浓缩，使药材与浓缩液的质量体积比为1:1，121℃高压灭菌40～50min。
4.根据权利要求2所述的方法其特征在于中药增强型TPY培养基，其特征在于所述的虫草花水提液通过以下方法制备得到：取虫草花药材，按照1:30(g/ml)的料液比加入去离子水，90℃热浸25～30min，在水浴上90℃提取1～2h，取滤液，加热浓缩，使药材与浓缩液的质量体积比为1:1，121℃高压灭菌40～50min。
5.权利要求1～4中任一项所述的中药增强型TPY培养基在增加双歧杆菌活菌数中的应用。
6.一种利用中药水提物增加双歧杆菌活菌数的方法，其特征在于取双歧杆菌种子液按照0.5～5％(V/V)接种量，接入常规TPY培养基，35-38℃静置培养8小时活化，活化后的双歧杆菌以0.1～1％体积比接入到中药增强的TPY培养基中，35-38℃厌氧或兼性厌氧培养12-16h的发酵产物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于权利要求6中所述的发酵产物无菌灌装成口服液，或离心集菌后冷冻干燥成菌粉。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于权利要求6中所述的发酵产物经过8000～10000rpm离心浓缩，得菌泥，按菌泥：冻干保护剂＝10～20：1(V/V)向菌泥中加入冻干保护剂，充分混合均匀后置于真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥制得的菌粉，粉碎，过40目筛得中药增强双歧杆菌菌粉；其中冻干保护剂保护剂配方为Vc1～2wt％，谷氨酸钠1-2wt％，脱脂乳12～20wt％，乳糖8～15wt％，溶剂为去离子水。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的双歧杆菌选自长双歧杆菌，青春双歧杆菌，两歧双歧杆菌，婴儿双歧杆菌中的任意一种。
10.按照权利要求7～9中任一项方法制备得到的中药增强双歧杆菌口服液或中药增强双歧杆菌菌粉。
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