CN105671079A - 一种转人神经生长因子基因的小鼠及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转人神经生长因子基因的小鼠及其制备方法和应用。具体地，本发明涉及利用转基因方法获得唾液腺特异表达人源NGF的转基因小鼠，且通过这种方法制备的转基因小鼠唾液可分泌人源NGF，经过分离纯化后可用于人类疾病的治疗。该方法包括如下步骤：(1)构建转座子载体，该载体包含人源NGF基因序列、腮腺分泌蛋白基因启动子序列、转座子piggyBac？5’和3’末端重复序列；(2)将构建好的转座子载体注射至小鼠受精卵的雄原核，然后将注射后的小鼠受精卵移植至***母鼠的子宫内，饲养***母鼠至小鼠出生；(3)对出生的小鼠进行检测，筛选出人源NGF基因能在后代中稳定遗传的转基因小鼠；(4)从转人神经生长因子基因的小鼠的唾液中分离纯化出人源NGF。
Description
技术领域
本发明涉及通过转基因方法获得的动物及其制备方法和应用，特别涉及一种转人神经生长因子基因的小鼠及其制备方法和应用。
背景技术
神经生长因子(即NerveGrowthFactor，简称NGF)是神经营养素家族的第一位成员，它由Cohen和Levi-Montalcini在1954年发现,并在随后的研究中阐明了其功能。Cohen和Levi-Montalcini因此获得了1986年的诺贝尔医学或生理奖。NGF不但对神经细胞的增殖和分化有重要作用，还对非神经细胞，例如免疫细胞、成纤维细胞、胰腺细胞和心肌细胞等的生长和活性都有重要功能。因此，NGF对神经性和非神经性疾病都有良好的潜在治疗作用。
因为鼠神经生长因子即鼠源NGF(mouseNGF,mNGF)和人神经生长因子即人源NGF(humanNGF,hNGF)在氨基酸序列上有85％的同源性，并且许多研究已经报道鼠源NGF对治疗各种神经损伤或退化疾病有明显的效果，从雄性小鼠的颌下腺纯化而来的鼠源NGF在2003年已被中国药监局批准用于治疗人神经损伤和退化相关疾病。目前，在中国药品市场上，鼠源NGF的价格约为1000元/毫克，2015年的销售总量约为5百万毫克，产量远远不足以满足市场需求。而且，最新的研究发现鼠源NGF和人源NGF在生理、生化和生物特性上存在显著的差异，并且在人细胞中鼠源NGF的生物活性显著低于人源NGF。此外，由于鼠源NGF对人来说是一种外源蛋白，在使用鼠源NGF进行治疗可能会导致病人产生免疫反应，不太安全。
为了消除鼠源NGF用于人类治疗时带来的上述问题，已经有许多研究尝试通过大肠杆菌、酵母、昆虫细胞，哺乳动物细胞等表达***来生产人源NGF。但是这些细胞***表达人源NGF的产量通常较低，并且其中一些***无法对其所合成的人源NGF提供正确的翻译后修饰，影响人源NGF的药用效果。同时，已有团队尝试利用转基因兔的乳腺作为生物反应器生产人源NGF。但乳腺作为生物反应器存在如下缺陷：1)只有性成熟后并且处在哺乳期的雌性动物才能分泌乳汁；2)乳汁的分泌量有限；3)乳汁含有大量的内源蛋白，不利于从乳汁中纯化出所特异表达的外源蛋白即人源NGF。
发明内容
本发明的目的是提供一种转人神经生长因子基因的小鼠，通过转基因方法将人源NGF序列***小鼠第5号染色体上，并获得能在第5号染色体上稳定遗传人源NGF基因序列和在唾液腺组织特异表达具有生物活性的人源NGF的转人神经生长因子基因的小鼠，并利用该转人神经生长因子基因的小鼠唾液腺作为生物反应器生产人源NGF药物，且从转人神经生长因子基因的小鼠分泌的唾液中分离纯化出人源NGF，并将人源NGF应用于人类疾病的治疗。由于小鼠唾液分泌量大，产生的人源NGF也多，而且唾液中内源蛋白较少，便于人源NGF的分离纯化；且唾液腺能对NGF产生正确的翻译后修饰，产生的NGF是人源化的，其在人类疾病治疗时不会产生免疫反应，更加安全，因此可以解决上述问题。
根据本发明的一个方面，提供了转人神经生长因子基因的小鼠，该转人神经生长因子基因的小鼠的基因组中包含人源NGF基因序列，且该转人神经生长因子基因的小鼠唾液腺特异表达人源NGF。由此，该转人神经生长因子基因的小鼠可以通过唾液分泌来产生人源NGF，再对唾液中人源NGF进行分离提纯，得到纯化后的人源NGF并可用于人类疾病的治疗。该转人神经生长因子基因的小鼠可以通过繁殖来获得数量庞大的家系，并源源不断的产生唾液，从而获得更多的人源NGF，而且能在唾液腺中进行正确的翻译后修饰，以及唾液中内源蛋白较少便于人源NGF的分离纯化。而该人源NGF是人源化的，在用于人类疾病治疗时不会产生免疫反应，更加安全。
在一些实施方式中，该人神经生长因子基因序列如SEQIDNO:1所示。
在一些实施方式中，该人神经生长因子基因序列整合在转人神经生长因子基因的小鼠的第5号染色体上。
在一些实施方式中，该人神经生长因子基因序列整合在转人神经生长因子基因的小鼠的第5号染色体的quaninenucleotide-bindingproteinsubunitalpha-12基因与caspaserecruitmentdomain-containingprotein11基因间的非编码间隔序列上的一个“TTAA”位点中，且quaninenucleotide-bindingproteinsubunitalpha-12与caspaserecruitmentdomain-containingprotein11基因是小鼠第5号染色体上的已知公开基因。由此，人源NGF基因序列整合在转人神经生长因子基因的小鼠的第5号染色体且定点***第5号染色体quaninenucleotide-bindingproteinsubunitalpha-12基因与caspaserecruitmentdomain-containingprotein11基因间的非编码间隔序列上的一个“TTAA”位点中，该转人神经生长因子基因的小鼠在唾液腺中特异表达人源NGF及从该转人神经生长因子基因的小鼠唾液中分离纯化的人源NGF药物具有更好的生物活性，对人类相关疾病的治疗具有更好的效果。
根据本发明的另一个方面，提供了转人神经生长因子基因的小鼠的制备方法，该转人神经生长因子基因的小鼠通过转基因技术将人源NGF整合到小鼠基因组中，并能在转人神经生长因子基因的小鼠后代中稳定的遗传。因此，通过该方法可以获得能在后代中稳定遗传的包含人源NGF基因序列的转人神经生长因子基因的小鼠，且该转人神经生长因子基因的小鼠的唾液腺特异分泌人源NGF，唾液中分泌的人源NGF被分离纯化后可用于人类疾病的治疗，且通过该方法获得的转人神经生长因子基因的小鼠，及通过该转人神经生长因子基因的小鼠分离纯化的人源NGF，产量高、不会对人类产生免疫反应更加安全，该方法包括如下步骤：
(1)构建转座子载体，该转座子载体包含如SEQIDNO:1所示的人源NGF基因序列、如SEQIDNO:5所示的腮腺分泌蛋白基因启动子序列、如SEQIDNO:6所示的转座子piggyBac5’末端重复序列和如SEQIDNO:7所示的转座子piggyBac3’末端重复序列；
(2)将构建好的转座子载体注射至小鼠受精卵的雄原核，然后将注射后的小鼠受精卵移植至***母鼠的子宫内，饲养***母鼠至小鼠出生；
(3)对出生的小鼠进行检测，筛选出人源NGF基因能在后代中稳定遗传的转人神经生长因子基因的小鼠。
在一些实施方式中，转座子载体的序列如SEQIDNO:8所示。
在一些实施方式中，转座子载体整合在转人神经生长因子基因的小鼠的第5号染色体的quaninenucleotide-bindingproteinsubunitalpha-12基因与caspaserecruitmentdomain-containingprotein11基因间的非编码间隔序列上的一个“TTAA”位点中。
根据本发明的另一个方面，提供了制备人神经生长因子药物的方法，通过建立利用转人神经生长因子基因的小鼠的唾液腺作为生物反应器生产人源NGF药物的方法，获得在唾液腺组织特异表达具有生物活性的人源NGF的转人神经生长因子基因的小鼠，且从转人神经生长因子基因的小鼠分泌的唾液中分离纯化出人源NGF，通过该方法获得的人源NGF产量更高、生物安全性更好，该方法包括如下步骤：
1)根据上述方法培养转人神经生长因子基因的小鼠，该转人神经生长因子基因的小鼠为根据权利要求上述转人神经生长因子基因的小鼠；
2)从步骤1)中所述转人神经生长因子基因的小鼠的唾液中分离纯化出人源NGF药物。
在一些实施方式中，该人源NGF药物能够促进NGF受体细胞增殖。
在一些实施方式中，该人源NGF药物能够做成制剂用于人类疾病的治疗。
附图说明
图1为转座子载体结构示意图。
图2为转基因原代小鼠PCR检测电泳结果图，图中“N”表示空白对照，“WT”表示野生型小鼠，“P”表示阳性对照，“M”表示Marker标记，“557-569”表示转基因原代小鼠。
图3为转基因原代小鼠的荧光结果图。
图4为转基因原代小鼠的Southernblot结果图，图中“M”表示Marker标记，“P(3C)”表示阳性对照(3个拷贝)，“P(5C)”表示阳性对照(5个拷贝)，“WT”表示野生型小鼠，“557-569”表示转基因原代小鼠。
图5为转基因原代小鼠腮腺中hNGFmRNA的相对表达量检测结果。
图6为转人神经生长因子基因的小鼠家系中唾液分泌NGF的浓度检测结果。
图7为包含人源NGF基因序列的转座子载体序列整合在553家系转人神经生长因子基因的小鼠第5号染色体上的比对结果分析图。
图8为转人神经生长因子基因的小鼠不同组织中hNGF检测结果图，图中“M”表示Marker标记，“TG”表示转人神经生长因子基因的小鼠，“Pa”表示腮腺，“Sm”表示颌下腺，“Sl”表示舌下腺，“Muscle”表示肌肉，“Liver”表示肝脏，“Lung”表示肺，“Fat”表示脂肪，“Testis”表示睾丸组织，“N”表示空白对照，“WTPa”表示野生型小鼠腮腺。
图9为转人神经生长因子基因的小鼠3个唾液腺组织中hNGFmRNA相对表达量检测结果图。
图10为转人神经生长因子基因的小鼠及野生型小鼠分别在白光及荧光下照片结果，图中“TG”表示转人神经生长因子基因的小鼠，“WT”表示野生型小鼠。
图11为转人神经生长因子基因的小鼠及野生型小鼠3个唾液腺组织中mNGF表达检测结果图，图中“WTmale”表示野生型公鼠，“WTfemale”表示野生型母鼠，“TGmale”表示转基因公鼠，“TGfemale”表示转基因母鼠，“Pa”表示腮腺，“Sm”表示颌下腺，“Sl”表示舌下腺，“M”表示Marker标记。
图12为553家系的转人神经生长因子基因的小鼠与野生型小鼠唾液腺组织中的hNGF蛋白表达分析及其唾液中纯化的hNGF蛋白分析结果图，图中“TG”表示553家系的转人神经生长因子基因的小鼠，“WT”表示野生型小鼠家系，“S”表示唾液，“P”表示腮腺，“SL”表示舌下腺，“SM”表示颌下腺，“PurifiedhNGF”表示从转人神经生长因子基因的小鼠唾液中纯化的hNGF。
图13为从553家系转人神经生长因子基因的小鼠唾液中纯化的hNGF蛋白与mNGF药品对人TF1细胞增殖作用的比较结果图，图中“Negative”表示阴性对照，“mNGF”表示mNGF药品，“PurifiedhNGF”表示从553家系转人神经生长因子基因的小鼠唾液中纯化的hNGF蛋白。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。
本发明中所涉及的SEQIDNO:2基因序列来源于GenBankaccessionnumber:NM_002506.2；SEQIDNO:3基因序列来源于GenBankaccessionnumber:NM_002506.2；SEQIDNO:4基因序列来源于GenBankaccessionnumber:X01697.1；SEQIDNO:5基因序列来源于SergueiP.Golovanetal,Transgenicmiceexpressingbacterialphytaseasamodelforphosphoruspollutioncontrol,NaturePublishingGroup,2001文章报道；SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、bGHpolyA序列、CMV启动子序列、Neo-2A-EGFP融合基因序列、bGHpolyA序列来源于zhenfangWuetal,Co-expressionoftwofibrolyticenzymegenesinCHOcellsandtransgenicmice,TransgenicResearch,2013文章报道。
1、构建含人源NGF基因的转座子载体。
利用PCR从小鼠基因组DNA中扩增出12.2kb长的小鼠腮腺分泌蛋白(ParotidSecretoryProtein，PSP)基因启动子序列(SEQIDNO:5)。将726bp长的hNGF基因编码序列(SEQIDNO:2)中54bp长的信号肽序列(SEQIDNO:3)用60bp长的猪PSP信号肽序列(SEQIDNO:4)替换,将重组后732bp长的hNGF基因编码序列(SEQIDNO:1)人工合成。此外，还将人工合成piggyBac5’末端重复序列(SEQIDNO:6)和3’末端重复序列(SEQIDNO:7)，以及包含bGHpolyA序列，CMV启动子序列，Neo-2A-EGFP融合基因序列和bGHpolyA序列的一个片断序列。将这些人工合成序列与重组hNGF编码序列及小鼠PSP启动子序列连接后替换位于pGEM-T载体的XhoI和NotI酶切位点之间的序列就产生20.1kb长的pmPSP-hNGF载体(SEQIDNO:8)，经过测序和酶切等验证，携带hNGF基因表达盒和EGFP标记基因表达盒的转座子质粒pmPSP-hNGF被成功构建，其结构见图1。
2、转人神经生长因子基因的小鼠的制备及其鉴定。
将浓度为9ng/μl的pmPSP-hNGF质粒与浓度为3ng/μl的pmPB质粒按1:1体积混合后注射至110个小鼠受精卵的雄原核，每个受精卵注射1-2pL。注射后的胚胎移植至7只***母鼠子宫，共有35只小鼠出生。
将35只转人神经生长因子基因的小鼠尾巴组织的基因组DNA通过TissueDNAextractionkit(Omega,GA,USA)试剂盒抽提获得。hNGF、EGFP和Rgs7基因的PCR扩增分别使用以下三对引物完成。引物对1：P1(5’-GAACTCATATTGTACCACGACT-3’)+P2(5’-CCCCAGAATAGAATGACACC-3’)；引物对2：EGFP-F(5’-TTGATGCCGTTCTTCTGCTTG-3’)+EGFP-R(5’-ACGTGCTGGTTGTTGTGCTGT-3’)；引物对3：Rgs7-F(5’-CAACCACTTACAAGAGACCCGTA-3’)+Rgs7-R(5’-GAGCCCTTAGAAATAACGTTCACC-3’)。PCR电泳鉴定结果见图2，且PCR产物都通过测序确定其扩增目的序列的正确性。同时，对整只转人神经生长因子基因的小鼠通过活体荧光蛋白观察***LivingOrganism’sFluorescentProteinObservationSystem(Model:FBL,BLSLtd.,Hungary)观察EGFP表达情况，并对转人神经生长因子基因的小鼠的前爪组织的EGFP表达通过将荧光显微镜观察和拍照鉴定，鉴定结果见图3。
通过PCR分析35只原代小鼠的尾巴基因组DNA，发现其中18只携带hNGF和EGFP基因(结果见图2)。这18只经PCR鉴定的原代转人神经生长因子基因的小鼠在其前爪组织中表达不同水平的EGFP(结果见图3)，这可能与EGFP基因在每只原代转人神经生长因子基因的小鼠基因组中整合的位置和拷贝数有关。
3、外源基因在不同转人神经生长因子基因的小鼠家系中的整合模式及表达水平比较。
将PCR鉴定为阳性的18只转人神经生长因子基因的小鼠抽提各组织样的总蛋白，再通过Bradford法测定各样品的蛋白浓度。对于每个转基因样品及与其对应的野生型样品，相同的总蛋白(15-30μg)被上样到10％的SDS-PAGE胶进行电泳。电泳分离后蛋白被从胶上转移到PVDF膜上。膜上的hNGF检测分析利用大鼠抗人NGF单克隆一抗(#MAB2562,R&Dsystems),HRP共轭的山羊抗大鼠二抗(JacksonImmunoResearch)及化学发光显影剂SuperSignalWestPicoChemiluminentSubstrates(ThermoFisherScientific)完成。所有操作根据抗体和试剂的说明书进行。对原代转人神经生长因子基因的小鼠基因组DNA的Southernblot进行分析，Southernblot分析使用的HindIII酶的切割位点和EGFP探针在pmPSP-hNGF质粒上的位置见图1。Southernblot分析结果显示每只原代转人神经生长因子基因的小鼠携带约1-5拷贝的外源基因(结果见图4)。虽然原代转人神经生长因子基因的小鼠558，566和567的Southernblot结果只显示一条带，但它们的条带信号比553，556，568和569强，并且其条带信号强度接近于3个拷贝的阳性对照(结果见图4)，所以558，566和567实际携带不止1个拷贝的外源基因。
同时，将PCR鉴定为阳性的18只转人神经生长因子基因的小鼠腮腺组织样的总RNA通过试剂盒E.Z.N.A.TMTotalRNAKitI(OMEGA)抽提。cDNA通过试剂盒RTreagentKitWithgDNAEraser(TaKaRa)合成。hNGF、mNGF和GAPDH基因分别通过以下三对引物经过反转录PCR扩增而获得各自的cDNA。引物对4：P3(5’-GACCCAAATCCCGTTGACAGC-3’)+P4(5’-ATGGCTGGCAACTAGAAGGCACA-3’)；引物对5：mNGF-F(5’-TCCAATCCTGTTGAGAGTGGGTG-3’)+mNGF-R(5’-GCCTGCTTCTCATCTGTTGTCAAC-3’)；引物对6：GAPDH-F(5’-CTCCCACTCTTCCACCTTCG-3’)+GAPDH-R(5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’)。获得的cDNA再进行定量PCR反应，定量PCR通过仪器EcoTMReal-timePCRsystem(Illumine)及试剂PremixExTaq(TaKaRa)扩增，且相对的基因表达量通过2-ΔΔCt法计算。定量PCR结果表明18只原代转人神经生长因子基因的小鼠腮腺组织中的hNGFmRNA相对表达量各不相同，结果见图5。
进一步地，为了筛选出表达hNGF蛋白最高的转人神经生长因子基因的小鼠家系，将18只原代转人神经生长因子基因的小鼠唾液中的hNGF蛋白浓度通过hNGFELISA试剂盒测定(Catalogno:E0105h,EIAabScienceCo.,Ltd,Wuhan,China)。小鼠唾液中的内源mNGF蛋白浓度通过mNGFELISA试剂盒测定(Catalogno:E0105m,EIAabScienceCo.,Ltd,Wuhan,China)。具体操作根据试剂盒的说明书进行。通过ELISA分析了9个表达水平相对较高的hNGFmRNA的家系(包括558、559、560、561、562、566、552、553和567)的转人神经生长因子基因的小鼠唾液中hNGF蛋白浓度。结果显示553家系的转人神经生长因子基因的小鼠唾液中hNGF蛋白浓度达到1.36±0.06μg/ml，在所有检测家系中最高(结果见图6)。转人神经生长因子基因的小鼠唾液中也分泌低水平的内源mNGF，其浓度(0.04-0.06μg/ml)与野生型小鼠唾液中的内源mNGF浓度(0.07±0.02μg/ml)相似(结果见图6)。由于553家系的转人神经生长因子基因的小鼠唾液中分泌的hNGF浓度最高，并且Southernblot结果显示553家系只携带1个拷贝的外源基因(结果见图4)，这使得外源基因在传代过程中不会发生分离现象。因此，选择553家系的转人神经生长因子基因的小鼠用于后续的试验。
4、外源基因在553家系转人神经生长因子基因的小鼠基因组中整合位置的分析。
进一步地，为了确定单拷贝外源基因在553家系转人神经生长因子基因的小鼠基因组中的整合位置，我们用反向PCR分析了原代转人神经生长因子基因的小鼠553的基因组DNA，所使用的引物为P5(5’-CACTTCGCCCAATAGCAG-3’)和P6(5’-ATACAGACCGATAAAACACATG-3’)，其在pmPSP-hNGF质粒上的位置见图1。通过对反向PCR产物进行测序及对测序结果分别与pmPSP-hNGF质粒和小鼠基因组序列比对，我们发现原代该转人神经生长因子基因的小鼠553携带的单拷贝外源基因是通过piggyBac转座方式整合在第5号染色体的quaninenucleotide-bindingproteinsubunitalpha-12基因与caspaserecruitmentdomain-containingprotein11基因间的非编码间隔序列上的一个“TTAA”位点中，且quaninenucleotide-bindingproteinsubunitalpha-12与caspaserecruitmentdomain-containingprotein11基因是小鼠第5号染色体上的已知公开基因，鉴定结果见图7。
5、hNGF在553家系转人神经生长因子基因的小鼠中的表达模式分析。
为了确定hNGF在转人神经生长因子基因的小鼠中表达的组织特异性，我们用反转录PCR分析了hNGF在转人神经生长因子基因的小鼠的3个唾液腺组织：腮腺(Pa)、舌下腺(Sl)和颌下腺(Sm)，肌肉组织(Muscle)，肝脏组织(Liver)，肺组织(Lung)，脂肪组织(Fat)和睾丸组织(Testis)的表达情况。结果显示hNGF只在3个唾液腺组织中特异表达(结果见图8)，但在腮腺(Pa)中的表达水平远比颌下腺(Sm)和舌下腺(Sl)高(结果见图9)。标记基因EGFP在553家系传代过程中可稳定地遗传和表达(结果见图10)。转人神经生长因子基因的小鼠与野生型对照小鼠一样，只在其颌下腺(Sm)中表达内源mNGF，结果见图11。
6、来自553家系的转人神经生长因子基因的小鼠唾液腺组织中的hNGF蛋白表达分析及其唾液中纯化的hNGF蛋白分析。
通过Westernblot分析发现转人神经生长因子基因的小鼠553家系的腮腺(Pa)中表达高水平的hNGF蛋白，转人神经生长因子基因的小鼠的唾液中也含较高水平的hNGF蛋白，并且从转人神经生长因子基因的小鼠唾液中分离纯化的hNGF成熟肽符合所预测的13.5kD分子量，鉴定结果见图12。
7、转人神经生长因子基因的小鼠唾液的收集及纯化分析。
小鼠通过腹腔注射“犬眠宝”药物进行麻醉，注射剂量根据该药物说明书和小鼠体重确定。小鼠被麻醉后，腹腔注射100μg/mL盐酸毛果芸香碱(0.5μg/克体重)刺激唾液分泌，然后用带枪头的移液液器从小鼠口腔中反复吸取唾液。在20分钟内，从每只小鼠约可收集100-200μl唾液。收集好的唾液放-80℃保存待用。一共从约100只成年转人神经生长因子基因的小鼠中收集约500mL唾液。并通过Westernblot分析发现转人神经生长因子基因的小鼠的腮腺中表达高水平的hNGF蛋白，转人神经生长因子基因的小鼠的唾液中也含较高水平的hNGF蛋白，并且从转人神经生长因子基因的小鼠唾液中分离纯化的hNGF成熟肽符合所预测的13.5kD分子量，鉴定结果见图12。
8、从553家系转人神经生长因子基因的小鼠唾液中纯化的hNGF蛋白与mNGF药品对人TF1细胞增殖作用的比较。
TF1细胞为NGF受体细胞，其在含10％胎牛血清和2ng/mlrhGM-CSF(R&DSystem)的RPMI-1640培养液中培养1周后，细胞被洗脱，重悬在含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，以420000个细胞/ml接种于96孔板中(30ml/孔)。接种1小时候，去除原培养液，每个孔分别添加含10％胎牛血清及0、1.6、3、6、25、50ng/ml纯化的hNGF或mNGF药品(苏肽生，北京舒泰神公司)的RPMI-1640培养液100μl。每个处理有3个重复孔。在37℃,5％CO2条件培养40小时后，去除原培养液，每孔添加含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液50μl，添加“CellTiter96AqueousOneSolutionCellProliferation”(Promega)试剂20μl。培养板放37℃,5％CO2条件下培养3小时，用酶标仪测定每个孔在490nm的OD值。结果显示从转人神经生长因子基因的小鼠唾液中纯化获得的hNGF对人TF1细胞的增殖有明显的促进作用，并且其生物活性显著(P<0.05)高于mNGF药品，鉴定结果见图13。
由此表明，人源NGF基因序列整合在转人神经生长因子基因的小鼠第5号染色体且定点***第5号染色体quaninenucleotide-bindingproteinsubunitalpha-12基因与caspaserecruitmentdomain-containingprotein11基因间的非编码间隔序列上的一个“TTAA”位点中时，从该转人神经生长因子基因的小鼠唾液中分离纯化的人源NGF药物具有更好的生物活性，对人类相关疾病的治疗具有更好的效果。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种转人神经生长因子基因的小鼠，其特征在于，所述转人神经生长因子基因的小鼠的基因组中包含人神经生长因子基因序列，所述转人神经生长因子基因的小鼠的唾液腺特异表达人神经生长因子。
2.根据权利要求1所述的转人神经生长因子基因的小鼠，其特征在于，所述人神经生长因子基因序列如SEQIDNO:1所示。
3.根据权利要求2所述的转人神经生长因子基因的小鼠，其特征在于，所述人神经生长因子基因序列整合在所述转人神经生长因子基因的小鼠的第5号染色体上。
4.根据权利要求3所述的转人神经生长因子基因的小鼠，其特征在于，所述人神经生长因子基因序列整合在所述转人神经生长因子基因的小鼠的第5号染色体的quaninenucleotide-bindingproteinsubunitalpha-12基因与caspaserecruitmentdomain-containingprotein11基因间的非编码间隔序列上的一个“TTAA”位点中。
5.一种转人神经生长因子基因的小鼠的制备方法，所述转人神经生长因子基因的小鼠通过转基因技术将人神经生长因子基因序列整合到小鼠基因组中，并能在所述转人神经生长因子基因的小鼠后代中稳定的遗传，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)构建转座子载体，所述转座子载体包含如SEQIDNO:1所示的人神经生长因子基因序列、如SEQIDNO:5所示的腮腺分泌蛋白基因启动子序列、如SEQIDNO:6所示的转座子piggyBac5’末端重复序列和如SEQIDNO:7所示的转座子piggyBac3’末端重复序列；
(2)将构建好的转座子载体注射至小鼠受精卵的雄原核，然后将注射后的小鼠受精卵移植至***母鼠的子宫内，饲养***母鼠至小鼠出生；
(3)对出生的小鼠进行检测，筛选出人神经生长因子基因能在后代中稳定遗传的转人神经生长因子基因的小鼠。
6.根据权利要求5所述的转人神经生长因子基因的小鼠的制备方法，其特征在于，所述转座子载体的序列如SEQIDNO:8所示。
7.根据权利要求6所述的转人神经生长因子基因的小鼠的制备方法，其特征在于，所述转座子载体整合在所述转人神经生长因子基因的小鼠的第5号染色体的quaninenucleotide-bindingproteinsubunitalpha-12基因与caspaserecruitmentdomain-containingprotein11基因间的非编码间隔序列上的一个“TTAA”位点中。
8.一种制备人神经生长因子药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)根据权利要求5-7任一项所述的方法培养转人神经生长因子基因的小鼠，所述转人神经生长因子基因的小鼠为根据权利要求1-4任一项所述转人神经生长因子基因的小鼠；
2)从步骤1)中所述转人神经生长因子基因的小鼠的唾液中分离纯化出人神经生长因子药物。
9.根据权利要求8所述的制备人神经生长因子药物的方法，其特征在于，所述的人神经生长因子药物能够促进神经生长因子受体细胞增殖。
10.根据权利要求9所述的制备人神经生长因子药物的方法，其特征在于，所述的人神经生长因子药物能够做成制剂用于人类疾病的治疗。
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|---|---|
| CN (1) | CN105671079A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107179407A (zh) * | 2017-04-14 | 2017-09-19 | 华南农业大学 | 用于提高转基因鼠生产hNGF效率的注射液及其应用 |
| CN109628487A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-04-16 | 华南农业大学 | 一种利用转基因猪唾液腺制备人神经生长因子的方法 |
| CN111206075A (zh) * | 2020-02-26 | 2020-05-29 | 北京华安科创生物技术有限公司 | 用于检测重组人神经生长因子基因拷贝数的方法及引物 |
| CN111500641A (zh) * | 2020-05-13 | 2020-08-07 | 华南农业大学 | 转人神经生长因子基因猪的制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103509812A (zh) * | 2013-08-07 | 2014-01-15 | 吴珍芳 | 唾液腺组织特异性的转基因载体及其构建方法 |
| CN103695451A (zh) * | 2013-08-07 | 2014-04-02 | 吴珍芳 | 唾液腺组织特异性表达外源蛋白的转基因载体和转基因猪及其构建方法 |
| CN104561095A (zh) * | 2015-01-27 | 2015-04-29 | 长春力太生物技术有限公司 | 一种能够生产人神经生长因子的转基因小鼠的制备方法 |
-
2016
- 2016-02-26 CN CN201610109183.XA patent/CN105671079A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103509812A (zh) * | 2013-08-07 | 2014-01-15 | 吴珍芳 | 唾液腺组织特异性的转基因载体及其构建方法 |
| CN103695451A (zh) * | 2013-08-07 | 2014-04-02 | 吴珍芳 | 唾液腺组织特异性表达外源蛋白的转基因载体和转基因猪及其构建方法 |
| CN104561095A (zh) * | 2015-01-27 | 2015-04-29 | 长春力太生物技术有限公司 | 一种能够生产人神经生长因子的转基因小鼠的制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| MIAORONG HUANG等: "Co-expression of two fibrolytic enzyme genes in CHO cells and transgenic mice", 《TRANSGENIC RESEARCH》 * |
| SERGUEI P. GOLOVAN等: "Transgenic mice expressing bacterial phytase as a model for phosphorus pollution control", 《NATURE BIOTECHNOLOGY》 * |
| 张雅林: "《资源昆虫学（第1版）》", 30 April 2013, 中国农业出版社 * |
| 钱秋杰等: "piggyBac转座***的功能改进及在哺乳动物中的应用", 《遗传》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107179407A (zh) * | 2017-04-14 | 2017-09-19 | 华南农业大学 | 用于提高转基因鼠生产hNGF效率的注射液及其应用 |
| CN109628487A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-04-16 | 华南农业大学 | 一种利用转基因猪唾液腺制备人神经生长因子的方法 |
| CN111206075A (zh) * | 2020-02-26 | 2020-05-29 | 北京华安科创生物技术有限公司 | 用于检测重组人神经生长因子基因拷贝数的方法及引物 |
| CN111500641A (zh) * | 2020-05-13 | 2020-08-07 | 华南农业大学 | 转人神经生长因子基因猪的制备方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160615 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |