JPS59501533A

JPS59501533A - 蛋白質様物質の製造における真生核促進体連鎖の使用

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Publication number: JPS59501533A
Application number: JP83502984A
Authority: JP
Inventors: アクセル・リチヤ−ド
Original assignee: ザ　トラステイ−　オブ　コロンビア　ユニバ−シテイ−　イン　ザ　シテイ　オブ　ニユ−　ヨ−ク
Priority date: 1982-08-10
Filing date: 1983-08-10
Publication date: 1984-08-30
Also published as: EP0116631A1; EP0116631A4; AU2038283A; WO1984000775A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】蛋白質様物質の製造における真生核促進体連鎖の使用本発明は１９８０年２月２５日出願の米国特許出願第１２４、６０１号の一部継続出願である。

発明の分野本発明は実生核細胞、即ち植物界および動物界の生物を含む超勤植物真生核生物として分類された生物の細胞の中へ、遺伝子またはそれに対してコードを有する遺伝子を含み実生核細胞の中への蛋白質様物質の生成を調整さもなければ影響を及ぼすＤＮＡの導入に関するものである。か＼る遺伝的干渉は一般に遺伝子工学と呼ばれ、そしである面では組み換えＤＮＡ技術の用途を含むものである０開示される本発明は特にバクテリアを含む超勤植物原始核生物の中へＤＮＡを導入することとは区別されるべきである。この区別は実生核細胞と原始核細胞との基本的な相違による面に基づくもので、前者は核外被および減数***によって形成された真生核によって特徴づけられ、後者は輪かくの明瞭な核の不在および減数***の不在によって特徴づけられる。更に遺伝レベルでは真生核生物の多くの遺伝子は連続した同一線状でないコードしてない連鎖によって***せられ、一方原始核生物においては遺伝子は連続した同一線状である。

発明の背景殆んどの部分に関連する原始核生物、特にバクテリアについての理解は真生核生物の理解における進歩とは独立して進歩したけれども、原始核生物を含むある種の発展を述べることは本発明の評価にとって助けになることであろう。

１９４４年に、Ａｖｅｒｙは細胞遺伝子のＤＮＡ仲介転移を用いた原始核細胞の変転を報告した。Ａｖｅｒｙ＋　Ｏ−Ｔ・等、Ｊ・Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　７９　：　１３７−１５８（１９４４）、その後、文献において原始核変転の報告が現われた。１９７５年に、Ｃｏｈｅｎ等はプロカリオテ、ニジエリチア弓りの第１変転、次いで共変転を含む結果を報告したＯ　Ｋｒｅｔｓｃｈｍｅｒ　、　Ｐ、　Ｊ、等。

Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１２４：　２２５〜２３１（１９７５）、これらの実験において、著者等は腸内バクテリアの多くの種類のものにおいて自然に生じるグシスミドＤＮＡ　、即ち染色外、ＤＮＡを用いた原始核細胞の共変転を開示しだ。これらの実験においては、ＣａＣｌ２−処理のバクテリア集団における特殊な細胞は優先的に変転を起すことが見出された。しかしながら、プラヌミドは染色体ＤＮＡの中に取入れられない公算が大きいために変転の頻度および得られた変転体の安定性は低い。結果として、数世代の後にば共変転体は獲得した形質を失なった。加うるにこれら実験は発現を得るためには変転ＤＮＡに対する遺伝子促進体の添加を必要とする。

その間に実質的に独立して実生核細胞による実験が進められた。１９６２年に５ｚｙｂａｌｓｋａ＋　Ｅ、　Ｈ，と５ｚｙｂａｌｓｋｉ　。

Ｗ、　ＰＮＡＳ　４８　：　２０２６　（１９６２）はぼにゅう動物細胞の変転、しかしながら自然的な隔世遺伝を受けただけの細胞と変転体表を区別することが不可能な程度の低い頻度の変転を報告した。再び原始核細胞によるのであるが、真生核変転の報告が更に文献に現れだが、しかし屡々他の人々によって再現せられ得なかった。加うるに、変転の低頻度、遺伝発現に対する分子的基礎の理解の不足、そして分子交配探子の不足はこの領域における進歩の不足の因をなすものである。結果として実生核細胞の変転についての研究は本質的にウィルス遺伝子に限られていた。

Ｇｒａｈａｍ＋Ｆ、Ｌ、等、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ＋Ｂｉｏ１．３９：　６３７〜６５０（１９７５）およびＭｃＣｕｔｃｈｅｎ、　＋Ｊ’、　Ｈ，およびＰａｇａｎｏ、　Ｊ−ｓ’ｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、４１：３５１〜３５７（１９６８）。

より最近、真中核細胞、特にほにゆう動物細胞は選択し得る表現型に対するコードを有する外部ＤＮＡにより変転されたＯ　Ｗｉ　ｇ　ｌ　ｅ　ｒ　、Ｍ−等、　Ｃｅ１ｌ　１１　：２２３〜２３２（１９７７）。

この仕事は拡張され真中核細胞が共変転されることが出来、真中核細胞の核の染色体ＤＮＡの中に統合される外部ＤＮＡを有する変転体を得るインターアリアが発見されると云う本発明が結果として生じた。更に予期せざることであるがこのような外部ＤＮＡは共変転体によって発現されることが出来、官能性の蛋白質を生ずることが発見された。加うるに原始植生物と対照してみると、外部ＤＮＡは数百の世代にわたって着実に発現せられ、その結果は外部ＤＮＡを染色体ＤＮＡの中に統合することによるものと考えることが出来る。

本発明は蛋白質様物質、特に例えばインターフェロン蛋白質、抗体、インシュリンのような真生核原質の蛋白質の商業的調製におけるバクテリアシステムを抱括する大いなる進歩を提供する。このような利点は前駆物質に対するコードを有する不変遺伝子を使用する能力を含む。

細胞の合成の後、該前駆物質は真中核細胞の中において処理せられ、または転換せられて生物学的物質隼の所望の分子を生成する。この現象は活性インシーリンに転換するプレプロインシュリンとして真中核細胞において最初に造られるインシュリンに対してよく知られている。

原始核細胞はプレプロインシュリンをインシーリンに転換するだめの必須細胞機構が不足しているので、インシーリンに取込まれた真生核遺伝子の原生核細胞中への挿入は結果としてインシーリンではなくプレプロインシーリンの製造をきたすであろう。比較的小さくそしてよく特徴づけられた蛋白質であるインシーリンの場合、この困難性は適当な遺伝子の化学的合成によって打ち勝つことが出来る。しかし、このようなアプローチは所望の蛋白質のアミノ酸連鎖の理解の水準によって本質的に制限される。かくして正確なアミノ酸連鎖がまだ知られていないインターフェロン蛋白質、凝固因子、抗体およびよく特徴づけられていない蛋白質に対しては、原生核システムは多分満足に証明されてはいないであろう。対比すれば、真生核システムは真中核細胞が必要な処理機構を有しているので、このよプな障害は伴なわない。かくして本発明の一つの重要な目的はアミノ酸系列の詳細な分子の理解を必要としない。例えばインターフェロン蛋白質、インシーリン、抗体等のような所望の蛋白質様物質を製造する方法を提供することである。

活性蛋白質を製造するためには取除かれねばならない余分のアミノ酸を有する前駆物質の問題に加えて、重要な生物学的物質が合成および開裂の後の化学的付加によって変性されるであろう。かくして例えば人間において造られるインターフェロンは蛋白質に加えて糖分子を含むグリコプロティンである。もしノくクチリア細胞において製造されるならば、インターフェロンは人間細胞においてインターフェロンが造られる場合に付加される糖分子は欠如している。結局ノくクチリアの中において造られる蛋白質はもし該蛋白質が有意な純粋化なくしてほにゆう動物に与えられるならば炎症金起し得るであろう内毒素を含む。対比すれば、真中核細胞において造られるインターフェロンは内毒素を含んでいないであろう。

それ故に本発明の他の重要な目的はノくクチリア細胞では造られることの出来ない、例えばグリコプロティンのような非蛋白質様物質および蛋白質様物質を含む化合物を製造する方法を提供することにある０発明の要約誘引可能な促進体ＤＮＡ　Ｉｌｌ連鎖が詰合されている外部ＤＮＡ　Ｉは細胞を外部ＤＮＡ　ＬとＤＮＡ　’　Ｉ［［の組合せを含むＩ）ＮＡ分子で共変転することによって真生核訓胞によって発現せられるものではない選択し得る表現型に対してコードを有する連結していないＤＮＡ　ＩＩを適当な真中核細胞の中へ導きうる。

この共変転は適当な条件のもので、そして選択し得る表現型を獲得した真中核細胞が生き残ることまたけ識別が出来るように選択された条件の存在下において行われるＯ蛋白質及び蛋白質含有物質は前述したように真中核細胞を共変転すること、該共変転細胞をＤＮＡ　Ｉが繰返しｍＲＮＡを形成するために転写されそしてかくして形成せられたｍＲＮＡが蛋白質まだは蛋白質含有物質を形成するために翻訳されるように促進体ＤＮＡ　Ｉ［連鎖の誘引が可能である試薬の存在を含む適当な条件の下で維持することにより製造される０外部ＤＮＡ　Ｉおよび促進体ＤＮＡ　ＩＩＩを含むＤＮＡ分子の共変転は真中核細胞によって発現せられない優性の選択し得る表現型に対する増幅可能な遺伝子としてＤＮＡ　ＩＩを用いる遺伝子増幅と結合せられるであろう。共変転は適当な条件において、そして優性の選択し得る表現型を獲得した真中核細胞が生き残ること、まだは識別が出来るようにする拮抗体の存在において、そして促進体ＤＮＡ　ＩＩ［に対する誘起試薬の存在において行なわれる。

最後に、本発明は遺伝的に欠陥を有する真生核細胞の治療学的措置ｊ−′−よび遺伝的な原因の疾病にかかった患者の治療のだめの方法を提供するＯ図面の簡単な説明第１図は共変転過程を説明する略式過程図である０第２図は二重選択技法を用いて共変転され培着されている細胞から外部ＤＮＡを回収する方法を説明する略式過程図である。

第３図。組み換えｈＧＨクローン０λ２ＯＡは１４ｋｂＥｃ。

ＲＩ断片を有するシャロン４Ａクローンである。黒色ブロックは塗りつぶしたバーによって示される。連続せられた２、　６　ｋｂ　Ｅｃｏ断片’ｗｔＧＦＩ’ のより詳細な地図はイントロンＡ−Ｄによって妨害される５個の斜線ブロック（斜線を施したバー）によって示される。

第４図。組み換えプラスミドｐＧＨｔｋはｈＧＨ融合遺伝子を含んでいるＯゲラスミｔＨ”ｐＧＨｔｋはｔｋ促進体を置き換えるｐｔｋのＢｇｌ　１１位置に挿入されているｈＧＨ（ロコ）（２，６ｋｂＥｃｏ　ＲＩ断片の５′末端から）のＯ，，５ｋｂ　Ｅｃｏ　ＲＩ　／　ＢａｍＨＩ断片を含んでいる。Ｔｋ情報は３ ′側面ＤＮＡ連鎖（ロ）の１．７ｋｂと同様にｔｋ遺伝子（■■）の完全にコードしている連鎖に含まれる。イニシエータ−ＡＵＧはＢｇｌｌ［位置に対する５０ヌクレオチド３に位置せしめられる。推定されている促進体を含むｈＧＨ断片のＢａｍＨＩ位置はｈＧＨの転写開始位置を超えだ３ヌクレオチドである。ＤｅＮｏ　ｔｏ　、　Ｆ、　Ｍ、等、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９：　３７１９−３７３０（１９８１）。

発明の詳細な説明本発明を説明するに先立ち、以後に用いられるべき幾らかの術語の定義を述べることは本発明の理解を助けるものであろう。

変転とは純粋化されたＤＮＡの導入によって仲介される受理細胞の遺伝型の変換のだめの方法を意味する。変転は典型的には該受理細胞の生化学約１たは形態学的性質のいずれかにおける変更が結果として起る受理細胞の表現型における安定な遺伝性の変化によって検知される。

共変転とは一つ以上の異なった遺伝子によって受理細胞の変転を行なうための方法を意味する０共変転は連結されていない遺伝子かまたは連結されている遺伝子のいずれかに相当するＤＮＡの導入によって仲介される受理細胞の遺伝型における同時的力変化および連続的な変化の双方を含む。

蛋白質様物質はアミノ酸から形成される如何なる生体高分子をも意味する０遺伝型とはその物理的外観から区別されるようなある生物の遺伝的構成を意味する０表現型とは環境と同時に遺伝型によって造られるようなある生物の観察し得る性質を意味する。

選択し得る表現型とは表現型を所有しないすべての生物を絶滅させる条件下で生物に生存する能力を与える表現型である。例としては医薬品耐性、まだは与えられた成育媒体において細胞代謝に必要ないくらかの分子を合成する能力を含む。

ここに用いられるように、選択し得る表現型は１だ、例えば細胞を通過するまたは細胞によって分泌せられる、そして官能性の検定免疫学的な検定または生化学的な検定のいずれかによって新しい表現型として検知されることが出来る物質の製造のような識別し得る表現型を含む。

インターフェロン蛋白質とはグリコプロティンインターフェロンの蛋白質様部分、即ち糖部分の除去の後に残った部分を意味する０それは人間の白血球、繊′維芽細胞、またはリンパ胞胚細胞から誘導されるインターフェロンの蛋白質部分を含む。

染色体ＤＮＡとは真生核細胞の核の中に存する染色体の形状において正常にヒストンと結合されたＤＮＡを意味するＯ転写とはＤＮＡの中に含まれる遺伝情報によるＲＮＡ鎖の形成を意味する０翻訳とはｍＲＮＡ分子の中の遺伝情報がそれによって蛋白質合成の間に蝉定のアミノ酸の順序を指示する過程を意味する。

本発明によれば、外部ＤＮＡ　Ｉは変転によって獲得されることなくして細胞によって発現せられない選択された表現型に対する遺伝コードを有することを含むＤＮＡ　ｌで、そして連結されていない外部ＤＮＡ　Ｉ［で細胞を共変転することによっていかなる真生核細胞の中へも外部ＤＮＡ　Ｉが挿入され得る。該共変転は適当な成育媒体において、そして生き残るか、さもなければ改変される細胞のみが選択し得る表現型を獲得した細胞であるような選択された条件の存在において行われる０第１図参照０以後に検討される実現（１例えば人間血液細胞、マウス繊維芽細胞、チャイニズノ・ムスター卵巣細胞、およびマウス奇形がん腫細胞のようなほにゆう動物系統の培養された実生核細胞に関するものであるけれども、記述される方法は一般に例えば鶏のような鳥類からの細胞、イーストおよび菌の細胞、穀物や花を含む植物からの細胞のようなすべての実生核細胞に対して適用出来ることが明らかである。それ故に本発明は終局的にほぼにゆう動物の細胞の共変転において最も有用ではあろうけれど本発明はすべての実生核細胞を包含するものと理解されるべきである。

本発明は選択され得る表現型に結合していない蛋白質様物質に対するコードを有する遺伝子を含む外部ＤＮＡの実生核細胞の中への挿入に関係して特に有用である。このような蛋白質様物質はこれらが選択し得る表現型と結合されていないという事実によって特徴づけられているので、コードを有するＤＮＡを含む細胞はそれ故に変転された細胞の破壊とその含有量の測定による以外には識別されることは出来ない。

蛋白質様物質の例としては共変転方法を用いて実生核細胞の中へ挿入せられそして発現せられる遺伝子はインターフェロン蛋白質、インシュリン、成長ホルモン、凝固因子、ウィルス抗原、酵素および抗体を含む。

ある場合にはＤＮＡ　ＩとＤＮＡ　ｌｔは統合と発現とを得るために純粋化せられる必要はないけれども、該ＤＮ４が共変転細胞において用いられるに先立って純粋化せられることは屡々好ましい。このような純粋化は不純物の存在のために不正の結果の可能性を制限し、そして共変転細胞が識別されそして安定に培養され得る確率を増加する。

また本質的ではないけれども、ＤＮＡ　Ｉおよび／またはＤＮＡ　Ｉが例えば真中核染色体ＤＮＡのエンドヌクレアーゼ開裂の制限のように染色体供与ＤＮＡのエンドヌクレアーゼ開裂によって得られていることは時には望ましいことである。加うるに、共変転真生核細胞において用いられるに先立ってＤＮＡ　ＩとＤＮＡ　ｌが燐酸カルシウムで処理されることは望ましい。ＤＮＡを燐酸カルシウムでこのように処理するための方法は以下により完全に記述される。

最後に、外部ＤＮＡ　ＩはＤＮＡ　Ｉの超過量を構成する選択し得る表現型に対するコードを有するＤＮＡ　ｎと比例した量、例えば約１：１から約１００，０００　：　１の範囲の量で存在することが望ましい。

本発明の好ましい実施例において、外部ＤＮＡ　Ｉおよび／または外部ＤＮＡ　Ｉは共変転真生核細胞において使用するニ先立ちバクテリアのプラスミドまたはファージＤＮＡと接触させられる。特に前途有望な実施例においては、外部ＤＮＡ　Ｉおよび／またはＤＮＡ　ｌはファージＤＮＡと接触せられ、そしてそれから共変転に先立ってファージ粒子の中へ包含される。

選択され得る表現型に対するコードを有するいかなるＤＮＡ　ｌｔも本発明の変転方法においては有用であろうけれども、記述される実験の詳細は特にヘルペス単純ウィルスから得られたチミジン　キナーゼに対する遺伝子の使用と７デニン　ホヌホリボンル　トランヌフェラーゼに対する遺伝子の使用とに関する。加うるに医薬品耐性に結合された選択し得る表現型に対するコードを有する遺伝子、例えば細胞にメＩ・トレキセイトに対する耐性を与える突然変異種のジハイドロフォレイト　リダクターゼ遺伝子を含むＤＮＡ　ＩＩは方法の適用可能性を拡張する。

好ましい実施例によれば、共変転は物理的にそして化学的にＤＮＡ　ＩＩに連結されていないＤＮＡ　Ｉを含み、そして該ＤＮＡ　ｌは共変転された実生核細胞の核の中において染色体ＤＮＡの中へ安定に統合される。

本発明による共変転は媒体にお：／−１で共変転された細胞が牛き残ることが出来、そして／または識別され得ることが出来ることにおいてのみ制限されるいかなる適当な媒ｆ４においても行われてよい。単に例のためだけによれば、７／− ミシン　−７ナーゼ遺云子を獲得したマウ２、繊維芽、ｉｌ■ｌｊ←ｌに対−１「る適当な媒体は以後により完全に記述される［Ａ’ｒ−ｃらる５−、また、共変転は遅ｉ択し得る表現型を獲イ４）シたこれら細胞の生き残ることの出来る、そして／または識別され得る選択された条件の存在下において行なわれる。このような条件は養分、医薬、または他の化学的拮抗剤、温度等の存在を含むであろう。

本発明によって共変転される実生核細胞は該技術においてよく知られた手法を用いて該細胞から回収せられることが出来る所望の物質にコードを有する外部ＤＮＡ　Ｉを含む。加うるに、該細胞はＤＮＡ　Ｉを転写して再びよく知られた手法を用いて回収せられる蛋白質または他の所望の物質を形成することを可能にし得る。最後に、該細胞は培地において成長せられ、そしてそれから蛋白質や他の所望の物質を回収して得ることが出来る。

以上に識別された所望の蛋白質様物質は天然物質であるけれども、合成遺伝子が組みたてられる合成生体高分子の製造においても該方法は等しく有用であり得る。かくして本発明はまだ存在していない新規な蛋白質を製造する方法を提供する。加うるに、本発明はそれらが現在存在しているけれどもそれらの単離および／または識別が特別に成就されることが出来ないかのような極めて僅かの量捷たは不純な形状において行なう蛋白質り製造方法を提供する。最後に大発明によ例えばグリコプロティンおよび他の産物のような部分的に蛋白質様の物質に製造方法を提供し、との物質の合成は遺伝的に指示される。

本発明の他の面は細胞の中において形成される遺伝子産物の計を増加するために実生核細胞の中へ遺伝子の複合コピーを挿入する方法を含む。外部ＤＮＡ　１分子の多数を実生核細胞の中へ挿入する一つの方法は複合ＤＮＡ　１分子でおよび別段細胞によって発現せられない優性の選択し得る表現型に対して増幅可能な遺伝子の複合コピーに相当する連結していない複合外部ＤＮＡ　１分子で細胞を共変転することからなる。この共変転過程は適当な媒体において、そして優性の選択し得る表現型を獲得する細胞が生き残ること、そして／または該細胞を識別することが出来る試薬の存在において行なわれる。望ましくは、増幅し得る優性遺伝子（ＤＮＡ　ＩＩ　）の最高の数を獲得したこれら細胞が只生き残シそして／または識別されるが故に、これはこのような試薬の連続してより高濃度の存在下になされる。これら細胞はそれからまたＤＮＡ　Ｉの複合コピーヲ含ム。このアプローチは例えばメトトレキセイトに対する耐性を細胞に与える突然変異種ジハイトロフォレイトリダクターゼ遺伝子のように細胞に医薬品耐性を与える増幅し得る遺伝子の複合コピー挿入に対して特に適している。

ＤＮＡ　Ｉの複合コピーを獲得した変転された真゛生核細胞はそれからＤＮＡ　Ｉが上記したと同じ方法においてコードを有する遺伝子産物の増大された量の製造に用いられる。

これに代えて、外部遺伝子の複合コピーが発生せられ得、そして終局的にはＤＮＡ分子で実生核細胞を変転することによって実生核細胞によって発現せられ、そして各各のＤＮＡ分子は外部ＤＮＡ　Ｉを実生核細胞によって正常に発現せられない優性の選択し得る表現型に対する増幅し得る遺伝子に相当する外部ＤＮＡ　ｎに連結することによって形成せられている。ＤＮＡ　ＩとＤＮＡ　Ｉｔとの連結は望ましくは化学結合、特にリガーゼによる酵素処理の結果として形成せられる結合の形状である。このように形成される雑種ＤＮＡ分子による変転はそれから適当な成長媒体において、そして例えば増幅し得る遺伝子のコピーの充分に大きな数を獲得したこれら実生核細胞が生き残ることの出来る、そして／または該細胞を識別することが出来る試薬のモ）Ｌｙｆ基準としてｌ：１から１０，０００：１の範囲の量の連続的に上昇する濃度の存在において行われる。

このアプローチを用いて、別段細胞によって発現せられない優性の選択し得る表現型に対して増幅可能な遺伝子の複合コピーを獲得した実生核細胞はそうでもなければ細胞を識別するために死亡または無能が結果として生じる増幅可能な遺伝子を補足しうる試薬の上昇せられた濃度の存在下において生存しそして／または識別することができる。

優性の選択し得る表現型に対する種々の増幅可能な遺伝子は本発明の実際において有用であるけれども、例えばメ））レキセイトに対する耐性を細胞に与えるジヒドロフォレイト　リタクターセに対する遺伝子のような医薬品耐性を有する遺伝子は特に適している。

丁度述べた二つのアプローチのいずれかを用いることによって、蛋白質様または他の所望の分子の複合コピーは実生核細胞の中において造られることが出来る。

かくして、例えばインターフェロン蛋白質、インシュリン、成長ホルモン、凝固因子、ウィルス抗原、または抗体、またはインターフェロンそれ自体の複合分子は雑種ＤＮＡを用いて変転せられている。または以下に述べる方法で燐酸カルシウムで処理されている純粋化されたＤＮＡ　ｅ用いて共変転せられている実生核細胞、特にほにゅう動物の細胞によって製造せられ得る。かくして本発明は従来の手法を用いては得られないような濃度において高度に望まれている、稀な、そして高価な蛋白質様および他の生物学的物質を製造する方法を提供する。

本発明の更に他の面は例えば部分的に蛋白質で、しかし糖、リボ核酸、ヒヌトン等のような他の化学種を°更に含んでいるインターフェロンを含むグリコプロティンのような正常に実生核細胞の中においてごく僅かな量製造せられている物質の調整を含む。例えばグリコプロティンのような細胞質物質によって細胞の合成が複雑にされている一つの方法または複数の方法は僅かしか理解されていないけれども、本発明の方法を用いることによって、商業的に有用な量でこのような物質を合成することが可能になるであろうことは予期されることである。特に、非蛋白質部分を含む例えばグリコプロティンのような細胞質物質の蛋白質部分に対して一つの遺伝子または複数個の遺伝子を正常にこのような物質を造る実生核細胞の中へ挿入した後、該細胞は相当する蛋白質様物質を製造するだけでなく、もし必要性が拡がったら既に存在する細胞機構を有用化して蛋白質様物質を処理するであろうし、また適した非蛋白質様物質を添加して完全に生物学的に活性の物質を形成するであろう。かくして例えば、完全に生物学的に活性を有するグリコプロティン、インターフェロンが上記の方法で先ずインターフェロン蛋白質を合成し、加うるに細胞にインターフェロンの非蛋白質部分または糖部分を製造させ、そしてそれから真のインターフェロンを合成または集結させることによって調整されることが出来た。このようにして調整されたインクーフエロンはそれから従来の手法を用いて回収される。

本発明における、そして以下によシ完全に記述されるが、実生核細胞は選択基準が存在しない正確に定義された原始核遺伝子および真中核遺伝子によって安定に変転されている。

純粋化でれたウィルスのチミジン　キナーゼ（ｔｋ）遺伝子をこの遺伝子が欠如しているマウスの細胞へ添加することは、ＨＡＴ媒体において成長するそれらの能力によって選ばれることが出来る安定な変転の出現を結果として生ずる。これら生化学的変転は一般的な集団よりも高い頻度で他の連結されていない遺伝子を多分統合するであろう十分な能力を有する細胞の従属集団に相当するので、共変転実験はウィルスｔｋ遺伝子、およびバクテリオファージ　φＸ１７４、プラスミドｐＢＲ３２２、または分枝された染色体の人間またはラビットのβ−グロビン遺伝子連鎖によって行なわれた。Ｔｋ変転は汚染雑種交配によって更なるＤＮＡ連鎖の共変転に対して分枝されそして分析される。この方法においてはマウス細胞系統はφＸ。

ｐＢＲ３２２，ｔたは人間およびラビットβ−グロビン連鎖の複合コピーを含んでいるものとして識別された。１回から５０回以上共変転された連鎖は独立なりローンから単離された高分子量ＤＮＡの中へ統合される。従属クローンの分析は共変転されたＤＮＡが培養地における多くの世代にわたって安定であることを実証する。この共変転システムは事実上いかなる定義された遺伝子をも培養された実生核細胞の中へ導入そして安定に統合することを可能ならしめる。ウィルスペクト／ｌ／または選択し得る生化学的マーカーのいずれかに対する結紮も必要とされないＯ優性に動らくマーカーによる共変転は原則として事実上いかなる分枝された遺伝的要素を野生型の培養された実生核細胞に導入することを可能ならしめる。この終りに、ＣＨＯＡ２９　細胞からの優性に働らく、メ））レキセイト耐性の、ジハイドロフォレイト　リダクターゼ遺伝子は野生型の培養されたマウス細胞に変転された。変転体においてＣＨＯＤ）ｉＦＲ連鎖の存在を実証することにより、遺伝子変転に対する決定的な証拠が証明せられた。

メトトレキセイトの上昇せられたレベルに対してこれら細胞を曝露することは結果としてこの医薬品に対する高められた耐性を新規に変転された遺伝子の増幅をともなって生ずる。突然変異種ＤＨＦＲ遺伝子は、それ故に、変転に先立ってＣＨＯＡ２９細胞ＤＮＡをｐＢＲ３２２連鎖へ結紮することによって、真中核ベクトルとして用いられている。該ＤＨＦＲ連鎖の増幅は該ｐＢＲ３２２連鎖の増幅を結果として生ずる。実生核細胞における優性に働らくベク）　／Ｌ／としてのこの遺伝子の使用はもはや研究に利用出来る突然変異種に対するこれら種族を制限することなしに、潜在的に変転可能な細胞のレパートリ−を拡大するであろう。

記述された手法を用いて、分枝された染色体のラビットのβ−クロビン遺伝子はＤＮＡ−仲介遺伝子変転によって一７ウス繊維芽細胞の中へ導入されている。この遺伝子を含む共変転されたマウス繊維芽細胞は異種構造の宿主において発現と、これら連鎖の後処理を研究するための特有な機会を提供する。ＲＮＡ汚染手法に協調する溶液雑種交配実験は少くとも１回変転された細胞系統においてラビット　グロビン連鎖がポリアデニン化された９８種としてチトプラズム中に発現されることを示す。これら９Ｓ連鎖は、結果として完全な継ぎ合わせおよび該二個の間に入る連鎖の移転から生じる。しかしながらこれら結果は異種構造の種族からの非赤血球細胞はそれらの発現が通常赤血球細胞に限定せられているラビット遺伝子の間に入っている連鎖を正確に処理するために必要な酵素を含んでいるということを暗示する１つ驚ろくべきことには、しかし７なから、成熟したラビットのｒｒ、ＲＮＡの５′末＞’ｌｆｊ　ｒζＮ在する４５のヌクレオ−トドは該変転試験のチトフ。

ラズム中に検出される該グロビンｍＲＮＡ連鎖には存在しない。これらの研究は真中核遺伝子の発現の分析において共変転システムのポテンシャル値を示す。野生型遺伝子を固有の、そして試験管内で組立てられた突然変異種遺伝子と一緒に培養された細胞中に導入することは連鎖組織の官能的有意性のための一つの検定を提供する。

組み換えＤＮＡ手法は雑種交配探子が用いられ得る幾つかのよシ高度な実生核細胞の単離を容易にする。例えば基礎代謝機能に対するコードを有するこれらの遺伝子のような細胞に対して１個から２０個のコピーに存在するｍＲＮＡ転写によって異常に低いレベルで発現せられる遺伝子はｃＤＮＡクローンの組み立てを含む従来の手法および再結合ライブラリーの終局的なヌクリーニンクによっては単純には、単離されることが出来ない。このようなまれにしか発現されない遺伝子の単離に対する改良されたアプローチはそれ故にプラスミド救出として知られている処置と協調して変転を利用することを開発した。研究室において現在進行中であるこの概要は以下にあらまし述べられる。鶏のａｐｒｔ遺伝子は酵素、ＨｉｎｌまたはＸｂａによって開裂されず、そしてこれら酵素で消化される細泡質ＤＮＡでａｐｒｔ−マウス細胞を変転することは鶏のａｐｒｔ遺伝子を発現するａｐｒｔ　クローンを結果として発生させる。Ｈｉｎｌ［［で開裂された鶏のＤＮＡをＨｉｎｌで開裂されたプラヌミドｐＢＲ３２２に結紮することはａｐｒｔ遺伝子が今やプラスミド連鎖に隣接している雑種ＤＮＡ分子の形成を結果として生じる。ａｐｒｔ−細胞の変転は今やこのＤＮＡによって行われる。変転体はマウヌ細胞において高分子量のＤＮＡの中に統合されているこの完全な複合体とともにｐＢＲ３２２に共有的に連結している該ａｐｒｔ遺伝子を含むべきである。この最初の細胞変転は他のひなの連鎖の非常に多数のものから鶏ａｐｒｔ遺伝子を除去する役目をする。この変転せられた細胞ＤＮＡは今やｐＢＲ３２２捷たけ該ａｐｒｔ遺伝子のいずれをも開裂しない酵素、Ｘｂａ（で処理される。結果として得られた断片はそれがら結紮によって回送される。

このような断片の−っは模写の原形およびアンピシリン耐性マーカーに対するコードを有するｐＢＲ３２２連鎖と共有的に連結された該ａｐｒｔ遺伝子を含むべきである。

例えばＥ、ｃｏｌｉ　のようなバクテリアをこれら回送マーカーで変転することは今や鶏のａｐｒｔ連鎖に連結されている真中核ＤＮＡからプラスミド連鎖を選択する。この二重選択手法は雑種交配探子が容易に得られない真生核細胞において低いレベルで発現する遺伝子の単離を可能ならしめる。

高度に分化せられた機能に対するコードを有する遺伝子をこれら機能を正常には発現しないマウヌの繊維芽細胞の中へ導入することは量的にも質的にも不適当である低いレベルの変転を結果として生じることが次第に明らかとなった。遺伝子発現の調節における特定の連鎖の役割の研究はそれ故に遺伝子をより適当な細胞環境の中へ導入することを必要とされるであろう。この終りに、人間グロビン遺伝子を培養せられたねずみ科の赤白血病細胞の中へ導入するための試みが進行中である。グロビン遺伝子がＤＭＳ　Ｏの存在において、そして全ｍＲＮＡの２０チ以上に相当する完全に誘引される状態において誘引され得るので、特にこの系統はこの種類の実験作業の適用を受ける。予備の研究においては、分枝された人間のグロビン遺伝子による共変転の研究の遂行を容易にするＭＥＬ細胞のいくつかのｔｋ−誘導体が創作せられた。該ｔｋ−と親しい細胞は分枝されたウィルスｔｋ遺伝子での変転が甚しくしに＜＜、そしてマウスＬ細胞において観察せられる頻度１０　から１０　のレベルでのみ変転させることが出来ることが観察されている。それにもか＼ゎらず、この困難性は克服せられ、そして優性ウィルヌ遺伝子を保持し発現する多数の変転体が得られた。より最近、一連の共変転実験は成人グロビン遺伝子と５〜１０ｋｂの５′および３′の側鎖に配列している情報を含んでいるぷ始型の染色体クローンによって行なわれている。現在人間のβグロビン遺伝子の１回から５回のコピーを含む一連のマウス共変転体が識別されている。この人間遺伝子がこれらねずみ類の細胞の中に誘引された後に発現せられるかどうかを測定するために一連の実験が現在性われている。もしこれら異種構造の人間グロビン遺伝子がこのシステムにおいて発現されるならば、一連のことのほか興味深い実験が（ａ）誘引過程における５′および３′側鎖の連鎖の役割、（ｂ）遺伝子発見の調節におけるこの場所において観察せられる連結せられた遺伝子配列の意義、および（ｃ）αおよびβサラセミツク状態の種類における代謝性質の欠陥、を測定するためにサフセミノクな個体から誘導された遺伝子の天然の突然変異種と共に試験管内で組立てられた突然変異種を利用することを遂行可能にした。

カくシて、ＤＭＳＯの存在下においてグロビンに対するコードを有するＲＮＡの増大せられた合成を仲介するグロビン遺伝子に対する促進体ＤＮＡ連鎖を識別し、そして別々に回収することが可能となるであろう。もしそうならば例えばインシュリンに対するコードを有する遺伝子のような所望の遺伝子、インターフェロン蛋白質等がもし促進体連鎖に直結せられるならば真生核細胞の共変転において使用せられるであろう。共変転された細胞はそれから遺伝子がＤＭＳ　Ｏの存在下にコードを有する蛋白質の顕著に上昇されたレベ／’ｆ造り出すであろう。

更にこのアプローチを以下に述べられる遺伝子増幅のアプローチと結合することが可能であろう。かくして、所望の遺伝子と合併した該促進体連鎖は医薬品耐性に対する増幅可能な遺伝子による共変転において用いられるであろう。それらは例えば真生核細胞を共変転するための抗体に対する一つの所望な遺伝子と共に用いられるであろう。該共変転せられた細胞はそれから蛋白質様または他の物質の高レベルを造るために適当な医薬品の連続的に上昇せられる濃度の存在において、およびＤＭＳ　Ｏの存在において、培養せられるであろう。

可能な誘引し得る促進体連鎖の他の説明は人間成長ホルモン遺伝子である。脳下垂体細胞中の人間成長ホルモンはチロイドホルモンとコルチコヌテロイドの夫夫のレベルによって厳密に調節されている。これら二つのホルモンの添加は少くとも部分的に翻訳し得るｍＲＮＡの出現における非常に大きな増大によって反映せられるドラマチックな誘引効果を結果として生じる。しかしながらホルモンの誘引に対して原因となる分子機構にはあいまいさが残る。試験的な証拠は誘引は少くとも部分的に特定のホルモン受入体複合物と染色体との間の転写活性化を結果として生じる相互作用から結果として生じることを暗示する。しかしながら、この誘引仮説を支持する強い証拠は現在では壕だ存在しない。変転は特定の連鎖がホルモン誘引に対して敏感なこれら遺伝子を与えるように構造遺伝子に接近して存在するかどうかを見つける手段を提供するであろう。我々の研究所における研究にもとづく例証となるシステムは人間成長遺伝子の誘引である０ラツトの脳下垂体細胞、ＧＨ−３はコルチコヌテロイドまたはチロイドホルモンの添加に応じてラット成長ホルモンの増大された量を合成する。それ故に分枝された人間成長ホルモン遺伝子をこれら細胞に導入し、この異種構造の遺伝子がホルモンの調節のもとにその新らしい環境の中に置かれるかどうかを測定するための試みがなされるであろう。もしこれが影響され得るならば、ホルモンの誘引がこれら削除された突然変異種部分に維持されているかどうかを見付けるために転写の５′および３′末端から一連のＤＮＡを削除することを行なう遺伝子の改良が手掛けられ得る。この方法において、ホルモン作用に応じて遺伝子を与えるいかなる潜在的な連鎖もある区域に限定せられるであろう。もしこのような連鎖がある区域に限定せられ得るならば、これら連鎖はそれから例えばグロビン遺伝子のような他の遺伝子上の適当な位置に遺伝的に移植せられ、そしてこの方法で遺伝子発現のこのような連鎖を規則的に整列させる効果を最終的に証明する。

かくしてこのシステムは上に述べた方法で増幅し、あるいは増幅することなくしてホルモンの存在において誘引し得、そ１，２て共変転において用いられることが出来る。

最後に、共変転は遺伝的治療法に対するアプローチを提供する。特に選択し得るマーカーに対する遺伝子および遺伝的修正遺伝子によって欠陥のある細胞を共変転することによって症候を和らげるために遺伝的に欠陥のある実生核細胞を治療法上の処置をしたり、そして／捷たけ直したりすることが可能である。

かくして例えば、遺伝的な原因による欠陥細胞を患者の骨髄から除去することによって人間のがま状細胞の貧血症を処置することが可能である。欠陥のある細胞はそれから有能なグロビン遺伝子およびマーカーとして医薬品耐性を与える遺伝子によって共変転せられ、そして該共変転は医薬品の存在下で行われる。これらの細胞は患者の中へ移植して戻され得る。患者はそれから只変転された細胞のみが生き残るように医薬品の投与を維持せられる。細胞は付加される遺伝子を除いてはすべての点で同一であるから変転された細胞は外部細胞を用いる移植による場合のように拒絶されることはない。′）まくいけば、このアプローチはかま状細胞貧血症および他の遺伝的な原因の病気を治すことを導くであろう。

本発明のより良い理解を助けるために、種々の実験の結果がここに記載される。

実験の詳細実験の第１シリーズ選択可能なマーカーに対するコードを有する遺伝子によって変転せられた細胞の識別と単離は現行の変転方法が高度に非能率であるから問題がある。刀・クシて実験は二個の物理的に連結していない遺伝子によって細胞を共変転する実現性ン：測定するために企てられた。これらの実験において、共変転された細胞が遺伝子の一つが選択可能なマーカーに対するコードを有する時、識別されそして単離されることが出来ることが測定された。ウィルス　チミジン　キナーゼ遺伝子は安定に細胞ＤＮＡの中へ統合されるハタ′／２リオフ７−シ　φＸ１７４、プラヌミドｐＢＲ３２２、゛または分枝されたラヒットのβ−グロビン遺伝子連鎖と共に選択可能なマーカーとして用いられたＯこれら実験の結果は捷たＷｉｇｌｅｒ、Ｍ、等、　Ｃｅ１ｌ　１６：７７７−７８５　（１９７９）およびＷｏ　ｌ　ｄ　＋　Ｂ等、　ＰＩ−ＱＣ，Ｎａｔ　１．λｒＢｄ、ｓｃｉ。

７６：５６８４〜５６８８（１９７９）に記載されるが次の通りである。

実験の計画ヘルペス単純つィルヌからの純粋化されたチミジンキナーゼ（ｔｋ）’ｅ　ｔｋのない突然変異種マウス細胞へ添加することはこれらの能力によって選択されることが出来ＨＡＴにおいて成長するウィルス遺伝子を発現する安定な変−転体の出現を結果として起こす。Ｍａｉｔｌａｎｄ、　Ｎ、　Ｊ、およびＭｅ　Ｄｏｕｇａｌｌ　Ｊ、　Ｋ、、　Ｃｅ　１１．１１：２３３−２４１　（１９７７）　；Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ、等Ｃｅ１ｌ、１１：２２３−２３２　（１９７７）ｏ共変転体を得るために、培養地は雑種交配探子が用いられ得る。

よく定義されたＤＮＡ連鎖の過剰の存在においてｔｋ遺伝子に対して曝露される。

Ｔｋ変転体は分子雑種交配によって付加ＤＮＡ連鎖の共変転のために単離されそして獲得せられた。

φＸ１７４ＤＮＡによるマウス細胞の共変転φＸ１７４ＤＮＡは選択可能なマーカーとしてのｔｋ遺伝子と共に共変転実験において最初に用いられた。φＸ　ｔｉ祈写形ＤＮＡはＰｓｔｌで開裂せられ、そ１．てそ′？１．は環状・２□２ノ −ムにおける単一の場所を認識する。３ａｎｇｅｒ、　Ｆ、等。

Ｎａｔｕｒｅ　２６５：６８７〜６９５　（１９７７）ｏ純粋化されたｔｋ遺伝子の５００ρｇはＰｓｔ−開裂されたφＸを複年形ＤＮＡの１〜１０μｇと混合せられる。このＤＮＡはそれから下記する方法と材料のもとの変転条件を用いてマウヌＬｔｋ−に添加せられた。選択された媒体（ＨＡＴ）における２週間の後 ’１　ｔｋ”変転体は純粋化された遺伝子の２０ρｇについての１０個の細胞について１つの集団の頻度で観察された。クローンは取出されマウヌ培養地で成長させられた。

それからｔｋ　変転体がまたφＸ　ＤＮＡ連鎖を含むかどうかを調べられた。変転体からの高分子量ＤＮＡはエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩの制限のもとに開裂せられ、そしてそれはφＸゲノームにおけるいかなる位置にも認められなかった。該ＤＮＡはアガロース　ゲル電気泳動によって分別せられ、そしてニトロセルロースフィルタ−変えられ、これらのフィルターはそれから遷移翻訳され３また　Ｐ−φＸＤＮＡ（汚染異種交配）と共にアニーリングされた．）　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ．　Ｅ．　Ｍ．、　Ｊ．　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ．　９８：５０３　〜５１７　（１９７５）：Ｂｏｔｃｈａｎ，　Ｍ．　等，　Ｃｅｌｌ　９：２６９　〜２８７（１９７６）；Ｐｅｌｌｉｃｅｒ，　Ａ．　等，　Ｃｅｌｌ　１４：１３３−１４１（１９７８）。これらのアニーリング実験は７個の変転体のうち６個はバクテリオファージ連鎖を獲得したことを実証する。該φＸゲノームは酵素ＥｃｏＲＩによっては切断されないので、観察されたバンドの数はφＸに対する情報同族体を含む真中核ＤＮＡの最少の数を反映する。クローンはφＸ連鎖の一定していない量を含む。クローンφＸ１とＸ２は該φＸゲノームより小さい単一のアニーリング断片を出現させる。これらクローンにおいて、それ故に、只変転連鎖の部分のみが残る。検出されないφＸ連鎖と共にｔｋ変転体（クローンφＸ３）がまた観察される。クローンφＸ４、５、６および７は数えるには接近しすぎる間隔を置いたこれらクローンが複合φＸ−特定断片を含むことを示す多数の高分子量バンドを出現させる。これらの実験は培養されたほにゅう類細胞のウィルスｔｋ遺伝子およびφＸ　ＤＮＡによる共変転を実証する。

φＸ変転体の識別に必要な選択次いでφＸ　ＤＮＡによる変転がｔｋ細胞の集団を制限するかどうか、または原培養物の有意な集団が今φＸ連鎖を含んでいるかどうかを考察した。培養物はｔｋ遺伝子とφＸ　ＤＮＡ　Ｏ　七ル比テ１　’：　２．０００または１　：　２０，０００ｔ７）混合物に曝露された。培養物の半分は選択した条件の下におかれ、一方他の半分はクローンを促進するために低密度で中性媒体の下におかれた。選択された（ｔｋ＋）と選で成長せられφＸ連鎖の存在を記録された。この一連の実験において、９つのｔｋ選択された集団の中８つがファージ情報を含んでいた。前の実験におけるように、クローンはφＸ　ＤＮＡの一定でない量を含んでいた。反対に中性媒体からアトランダムに摘出された１５のクローンの中でいかなるφＸ情報を含むものもなかった。かくして、選択可能なマーカーの添加は φＸ　ＤＮＡを含むこれらの細胞の識別を促進する。

φＸ連鎖は細胞ＤＮＡの中へ統合されるＥｃｏＲＩによるφＸ変転体からのＤＮＡの開裂はφＸＤＮＡを含む一連の断片を生ずる。これら断片は複合統合という出来事を反映するであろう。これに代えて、これら断片は細胞ＤＮＡの中−、統合されない完全な捷たは部分的なφＸ連鎖の縦に連なった整列から結果として生じる。

これらの可能性を区別するために、変転細胞ＤＮＡはＢＡＭＨＩまたはＥｃｏ　Ｒ１で切断され、そしてそのどちらもがφＸゲノームを開裂しない。もし該ＤＮＡ連鎖が結合されていなければ、これら酵素のうちのいずれもがφＸ断片を開裂しないだろう。同一のパターンは消化されないＤＮＡから、そしてこれら酵素のいずれによって為開裂ているならば、しかしてＢＡＭＨＩおよびＥｃｏ　Ｒ１は側鎖に配列する細胞ＤＮＡにおいて異なった位置に認められ、そして独特の制限パターンを生ずるであろう。クローンφＸ４とφＸ５からのＤＮＡはＢＡＭＩＩまたはＥｃｏＲｌによって開裂せられ、そしてサザーン雑種交配によちて分析される。各々の例において、Ｅｃｏ　Ｒ１断片によるアニーリングパターンはＢＡＮＨＩ断片によって観察せられるそれとは異なっていた。更に、消化されないＤＮＡによって得られた外形は観察される別々の断片なくして非常に高い分子量においてのみアニーリングを出現する。クローンφＸＩにもとづき同様な観察がなされた。かくしてこれら三つのクローンのうちφＸ連鎖の殆どのものが細胞ＤＮＡの中へ統合された。

φＸ連鎖の細胞内における集中化変転された細胞におけるφＸ連鎖の位置は亜細胞分別によって測定せられた。核およびチトプラズマフラクションが調製され、そして各々のφＸ　ＤＮＡ連鎖含量が汚染異種交配によって検定せられた。データはφＸ連鎖の９５係が核の中に位置せられることを示す。高いそして低い分子量の核ＤＮＡはハート分別によって調製せられた。

Ｈｉｒｔ，　Ｂ．　Ｊ．、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ．　２６：３６５　〜３６９（１９６７）ｏこれら二つのフラクションからのＤＮＡによる異種交配は高分子量のＤＮＡフラクションと共に９５％以上のφＸ情報が純化することを示した。上澄フラクションにおいて観察された異種交配の少量は高分子量ＤＮＡのそれと同一な外観を出現し、そしてそれはこのフラクションの高分子量ＤＮＡの汚染を暗示する。

φＸゲノームの連鎖表現の拡張 φＸゲノームを開裂しない酵素によって消化された変転クローンからのＤＮＡのアニーリングパターンはφＸ連鎖の統合が生じた証拠を提供し、そして我々に統合されたφＸ連鎖の数を評価させる。φＸゲノームの中において開裂させる酵素によって消化された変転クローンからのＤＮＡのアニーリングパターンは我々がゲノームの調和が存在すること、そしていかにしてこれら連鎖が配列せられ次いで統合せられるかを測定することを可能ならしめる。Ｈｐａｌ酵素によるφＸの開裂は各々の統合の出来事に対して三つの断片：夫々９０％のφＸゲノームからなる３、７および１．３　ｋｂの二つの内部断片と、ＰｓｔＩ開裂位置にかかる０、５ｋｂの一つの橋架は断片とを生ずる。

Ｈｐａ　ｌによってクローンφＸ４が消化される時観察せられるアニーリングパターンにおいて、二つの強い夕くンドが３．７と１．３ｋｂに観察せられる。高分子量のより小さな強度の一連のバンドがまた観察せられ、それらのうちのいくらかは細胞ＤＮＡに近接したφＸ連鎖を多分表わすものである。これらの結果は少くとも９０チのφＸゲノームはこれら細胞の中に存在することを示す。内部１．３　ｋｂＨｐａ（断片がＨｐａ１位置によってＰｓｔｌ開裂位置からたったの３０ｂｐ飛び上らせられることは価値のないことである。内部バンドの強度をＨｐａｌ−開裂されたφＸ　ＤＮＡの知られた量と比較することはこのクローンが φＸゲノームの約１００個のコピーを含んでいることを暗示する。

Ｈｐａ　［によって開裂せられるクローン５　ＤＮＡのアニーリングパターンはもっと複雑である。もし内部断片が存在していればそれらは顕著に強度を減少させられるが、その代り種々の分子量の複合バンドが観察される。Ｐｓｔ　１開裂位置に橋架けを行なう０．５ｋｂのＨｐａｌ断片はクローンφＸ４またクローン φＸ５のいずれに対しても観察されない０クローンφＸ４とφＸ５の同様な分析は酵素Ｈｐａ　ｌによって行われた。この酵素はφＸゲノームを５回開裂し、かくしてＰｓｔ　（開裂位置にかかる１、７　、０．５　、０．５および０．２ｋｂ。

そして２．６ｋｂの橋架けの４つの「内部」断片をかくして生ずる。φＸクローン４および５からのＨｐａ　ｌ−開裂されたＤＮＡに対するアニーリングパターンは夫々少くとも二つの内部Ｈｐａ１位置の保持力と一致した１、７　ｋｂ強度のバンドを示す。０．５　ｋｂ内部断片はまた観察せられるが、しかしこれらはこのゲル上には出て来ない。多くの付加断片、その殆どは高分子量であるが、また夫々のクローンの中に存在する。これらはたぶん細胞ゲノームにおいてφＸ　ＤＮＡの複合統合位置を反映する。しかしながらＰｓｔ−開裂位置に橋架けする２、６　ｋｂの断片はクローンφＸ４には存在しない。２．６　ｋｂ　Ｈｐａ　ＩＩ橋架は断片と共に移住するアニーリング断片の減少された量はクローンφＸ５において観察される。同様な観察は酵素Ｈａｅｌｌｌによる実験においてなされた。これらのクローンからのＨａｅ　ｌ［−消化されたＤＮＡのアニーリングパターンが測定された。

前のデーグーによれば、Ｐｓｔ位置にかかる０、８７ｋｂのＨａｅ　ｍ橋架は断片は変転細胞ＤＮＡにおいて減少された量で存在するか捷たは存在しない。かくして一般的にはφＸの「内部」断片はこれら変転体において発見されるが、一方Ｐｓｔ　Ｉ開裂位置にかかる「橋架け」断片は減少せられるかまたは存在しない。

変転された遺伝型の安定性選択可能の生化学的マーカーの変転の以前の観察は変転された表現型がもし細胞が選択された圧力下に維持されるならば数百世代にわたって安定に残ることを示している。もし中性媒体中に維持されれば、変転された表現型は世代あたり０．１から３０％程度の高率の範囲にわたる頻度で失われる□　Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ、等、　Ｃｅ１ｌ　１１：２”２３−２３２（１９７７）：Ｗｉｇｌｅｒ、Ｍ　等、　ＰＮＡＳ　７６：５６８４−５６８８（１９７９）。

外部遺伝子の発現を研究するために変転を用いることは変転された遺伝型の安定性に依存する。これはそのために選択能力ある基準が用いられない遺伝子については重要な考慮である。変転体においてφＸ　ＤＮＡの存在が選択能力ある利点を受入れ細胞に与えないことは当然のことと思われる。それ故にφＸ表現型の安定性は培養地における多くの世代の後二つのクローンの子孫において試験された。双方がφＸ　ＤＮＡの複合コピーを含んでいるクローンφＸ４とφＸ５は副分枝され、そして各々のクローンから６つの独立したサブクローンが摘出されそしてマス培養地で成長させられた。各々原クローンからのこれらサブクローンの各々からのＩ）ＮＡが摘出されマス培養地で成長させられた。これらサブクローンの各々からのＤＮＡはそれからＥｃｏＲＩまたはＨｐａｌのいずれかで消化せられ、φＸを含む断片のアニーリング外形は原親クローンのそれと比較された。６つのφＸ４サブクローンの４つに対シて観察されたアニーリングパターンは親のそれとほとんど同一である。二つのサブクローンにおいて、付加ＥｃｏＲ１断片は両方共に同一の分子量であるように見える。これは副分枝するに先立ち族クローンにおいて遺伝型の異種構造から結果として生じた。φＸ５のサブクローンに対して得られたパターンは親のアニーリング外形と再び殆ど同一である。これらのデータはＤＮＡが重要な損失または位置転移または情報なくして多くの世代に対して試験された１０のサブクローンの中において維持されていることを示す。

ｐＢＲ３２２のマウス細胞の中への統合共変転における観察はＥＫ２−受入れバクテリアベルト、プラスミドｐＢＲ３２２に対して拡張された。ＢＡＭ　Ｈｌで線状化されたｐＢＲ３２２は１，０００　：　１のモル比で純粋化されたウィルヌｔｋ遺伝子と混合された。ｔｋ変転体は選択せられ、ｐＢＲ３２２連鎖の存在に対して記録せられた。

ＢＡＭＨＩ線状化されたＩ）ＢＲ３２２をＢｇｌ　ｌで開裂することは２．４および０．３ｋｂの二つの内部断片を生じる。ｐＢＲ変転体の連鎖含有量は変転された細胞ＤＮＡをＢｇｌ　ｌで消化シ、次イで　ＰでフヘルされたプラスミドＤＮＡ　テア、ニーリングすることによって測定せられた。篩別さ′れた５っのクローンのうち４つが２．４ｋｂの内部断片を含んでいた。

０．３ｋｂの断片はこれらゲルにもとすいて検出されなかった。標準と比較して２．４ｋｂバンドの強度から我々は、この断片の複合コピーはこれら変転体の中に存在すると結論する。他のバンドが観察され、そしてそれらは細胞ＤＮＡに付いているｐＢＲ３２２のセグメントヲ表わしていると推定される。

マウス細胞のラビットβ−グロビン遺伝子による変転純粋化された真中核遺伝子による変転は異種構造宿主における分枝された遺伝子の発現の研究の手段を提供するであろう。共変転実験はそれ故にラビット染色体ＤＮＡのクローンライブラリーから単離されたラビット巨大グロビン遺伝子によって行なわれた。（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、等Ｃｅ１ｌ　１５：６８７〜７０１　（１９７８）’）　ｏ　ＲβＧ−１で消化された一つのβ−グロビンクローンはバクテリオファージクローンベクトルシャロン４ａ上に担われた１５ｋｂラビットＤＮＡ断片からなる。このクローン（ＲβＧ）からの損傷を受けないＤＮＡはモル比１００　：　１でウィルヌｔｋ　ＤＮＡと混合され、そしてｔｋ変転体は単離されそして完全なラビットβ−グロビン連鎖の存在を試験される。酵素Ｋｐｅ　ｌによるＲβＧ− １の開裂は完全なラビットβ−グロビン遺伝子を含む４．７ｋｂ断片を生ずる。

この断片はゲル電気泳動によって純粋化せられ、遷移翻訳せられて次に来るアニーリング実験のための探子を生ずる。我々の実験条件の下ではＫｐｎ−開裂されたマウスＤＮＡでラビットβ−グロビン探子をアニーリングすることは観察されていないけれどもマウスとラビットβ−グロビン遺伝子は部分的に一致する。これに反して、Ｋｐｅ　Ｉによるラビット肝臓ＤＮＡの開裂は予期される４、７ｋｂグロビンバンドを生ずる。

酵素Ｋｐｎ　ｌで変転された細胞ＤＮＡを開裂することは実験された８つのｔｋ変転体のうちの６つにおけるグロビン−固有情報を含む４．７ｋｂ断片を生ずる。該クローンの二つにおいて、付加ラビットグロビンバンドが観察され、そしてそれは変転の間Ｋｐｎ位置の少くとも一つの損失から結果として多発生じるであろう。これら変転において統合せられたラビットグロビン遺伝子のいくらかのものは価値がある。対照と比較すると、幾らかのクローンは遺伝子の単一コピーを含んでいるが、一方その他のものはこの異種構造の遺伝子の複合コピーを含んでいる。これらは分枝された真中核遺伝子が共変転によって培養せられたほにゅう類の細胞の中へ導入されることが出来ることを結果として実証する。

変転能力は安定に継承されない我々のデータは総細胞集団の中において変転能力のある細胞の副集団の存在を暗示する。もし能力が安定に継承された特質であるならば、変転に対して選択された細胞はそれから彼等の親の細胞よシも続いて行われる遺伝子変転実験においてよシよい受入体となるであろう。原生核生物におけると同様に二つの結果は能力が安定に継承されないことを示す。実験の第１シリーズにおいて、重複突然変異種、Ｌｔｋ　ａｐｒｔ　（ｔｋ、ｌ！：ａｐｒｔの双方が欠如した）は供与体として細胞ＤＮＡを用いてｔｋ　ａｐｒｔ−またはｔｋ　ａｐｒｔ＋表現型のいずれにも変転された。Ｗｌ　ｇ　１６　ｒ。

Ｍｏ等、　Ｃｅ１ｌ　１４ニア２５−７３１　（１９７８）；Ｗｉｇｌｅｒ、Ｍ、等。

ＰＮＡＳ　７６：５６８４〜５６８８　（１９７９）。これらクローンはそれからｔｋ　ａｐｒｔ表現型に変転される。第２の変転の頻度は第１のそれよシも有意に高くはない。他の一連の実験において、クローンφＸ４とφＸ５はメトトレキセイト（ｍｔｘ）に対して耐性のある受入れ細胞を与える突然変異種フォレイｌ−’Ｊダクターゼ遺伝子の変転に対して受入体として用いられた。細胞系統Ａ２９ＭｔｘＲ”はジハイドロフォレイトリダクターゼに対する構造遺伝子における突然変異を含み、そしてそれはメ））レキセイトに対するこの酵素の親和力を減少させるＯ　Ｆｌ　１ｎｔｏｆｆ　、　Ｗ、　Ｆ、等、　ＳｏｍａｔｉｃＣｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　２：２４５−２６１　（１９７６）ｏこの系統からのゲノミックＤＮＡはクローンφＸ４およびφＸ５およびＬｔｋ−細胞の変転に用いられた。φＸクローンに対するｍｔｘ耐性の変転の頻度は親のＬｔｋ−細胞で観察されたそれと同一であった。それ故に能力は安定な遺伝性の特質ではなく、そして細胞の一時的な性質であろうと結論される。

考　察これらの研究において、我々は選択能力のある基準が存在しない正確に定義された原生核および真中核遺伝子でほにゅう動物の細胞を安定に変転してきた。小さなしかし選択可能の細胞の副集団は変転する能力を有することが示されるバクテリアにおける変転の研究から我々によって選択される計画が誘導される。Ｔｈｏｍａｓ、　Ｒ。

Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　１８：４６７〜４８１　（１９５５）；Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ、　Ｒ，ＰＮＡＳ　４０：４９〜５５　（１９５９）；Ｔｈｏｍａｓｚ、Ａ。

およびＨｏｔｃｈｋｉｓｓ、　Ｒ，ＰＡＮＳ、　５１：４８０〜４８７　（１９６４）；５ｐｉｚｉｚｅｎ、　Ｊ、等、　Ａｎｎ　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２０：３７１〜４００（１９６６）。もしこれはまた動物細胞にとっても真実ならば、かくして生化学的変転体は一般の集団よりも高い頻度で他の連結していない遺伝子を多分統合する能力ある細胞の副集団を表現するであろう。かくして、選択能力のある特質を提供しない遺伝子を含んでいる変転体を識別するために、培養物は選択可能なマーカーを提供する物理的に連結されていない遺伝子によって共変転される。

この共変転システムはいかなる定義された遺伝子の培養細胞の中へ導入しそして安定な統合を実質的に可能ならしめる。ウィルスベクトルまたは選択可能な生化学的マーカーのいずれに対する結紮も不要である。

共変転実験は選択し得る生化学的マーカーとしてＨ８Ｖ　ｔｋ遺伝子を用いて行なわれた。この純粋化されたｔｋ遺伝子をチミジン　キナーゼが欠如しているマウス細胞に添加することはＨＡＴにおける成長のだめのそれらの能力によって選択されることが出来る安定な変転体の出現が結果として生ずるｏ　Ｔｋ＋変転体は付加ＤＮＡの共変転のための汚染異種交配によって分枝され分析された。

この方法では、我々はφＸ、ｐＢＲ３２２およびρ−グロビン遺伝子連鎖の複合コピーを含むマウス細胞系統を組立てた。

これらの観察が我々の培養物において原生核細胞を汚染することから結果として生じ得るという暗示は殆どあシそうにない。少くとも一つのラビットβ−グロビンマウス変転体が個々の９８チトプラスミノク種としてポリアデニル化されたラビットβ−グロビンＲＮＡ連鎖を発現する。９Ｓ　グロビンＲＮＡを正確に生ずることを要求される入念な処理の出来事は原生植生物においては起りそうにもない。

該φχ共共転転体非常に詳細に研究された。共変転の頻度は高く、１６ｔｋ＋変転体の中で１４がφＸ連鎖を含む。

φＸ連鎖は高分子量核ＤＮＡの中へ統合される。統合という出来事の数は独立クローンにおいては１から５０以上に変化する。与えられた変転体の中において存在するバクテリオ　ファージ　ゲノームの範囲はまた価値があり、−−Ｓいくらかのクローンはゲノームの半数までも損失し、他のクローンはφＸ連鎖の９０％以上を含む。サブクローンの分析はφＸ遺伝型が培養地中において多くの世代を通して安定であることを実証する。同様な結論はｐＢＲ３２２とグロビン遺伝子共転転体の特徴づけから出てくる。

限定エンドヌクレアーゼ−開裂された変転された細胞ＤＮＡの雑種交配分析は統合中間物の性質におけるいくらかの予備的陳述を可能ならしめる。只二つのφＸクローンが詳細に調べられた。双方のクローンにおいて、供与ＤＮＡはＰｓｔ　ｌ−線状化されたφＸ　ＤＮＡであった。線状または環状中間物の統合を区別するだめの試みがなされた。

もし正確な環状化または線状の連鎖体の形成のいずれかに沿って統合がアトランダムな点で生じたならば、変転細胞ＤＮＡの開裂地図が環状φＸ地図を反映して予想されるであろう。しかしながら橋架は断片は変転された細胞ＤＮＡの三つの異なった制限のエンドヌクレアーゼによる消化において減少された量で存在するかまたは観察されない。断片は線状分子としてφＸＤＮＡが統合するモデルによって観察される。それに代えて、φＸＤＮＡの分子内再結合が生じ、結果としてＰｓｔ末端における削除による環状化を生ずｒｏ　Ｌａｉ、　Ｃ，Ｊ−およびＮａｔｈａｎｓ　、　Ｄ　。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ。

３９：　５３〜６０（１９７４）ｏこの環状分子のランダムな統合はクローンφ Ｘ４　およびφＸ５　に対して観察せられたと同様に限定地図を生ずるであろう。統合の前に、その間に、またはその後に起る出来事の他のより複雑なモデルはまた考慮されることが出来るｏ　ＤＮＡの価値ある量は変転の間に末端から削除されるであろうけれども、クローンφＸ４　における統合されたφＸ連鎖の殆どのコピーはＨｐａ　１位置を保持し、そしてそれはＰｓｔ　Ｉ開裂位置から単に３０ｂｐである。統合のモードがどのようなものであれ、細胞は供与ＤＮＡの長い広がりで安定に変転されることが出来るように思われる。変転体は供与ＤＮＡの５０ｋｂ長の連続した長い広がりを含むことが観察されている。

選択能力ある圧力の存在しない場合におけるφＸ連鎖により変転された細胞を識別する試みがなされている。

培養物はφＸとｔｋＤＮＡ　に曝露されそして細胞は選択能力のない条件下で分枝される。φＸ連鎖は摘出されるすべての１５のクローンには存在しない。これに反してｔｋ＋表現型に対して選ばれた１６のクローンのうちで１４がφＸＤＮＡを含んだ最も単純な解釈は培養地の中において細胞の副集団はＤＮＡの理解と統合における能力を有するということである。この細胞の副集団において、二つの物理的に連結された遺伝子が高い頻度によって同じ細胞の中へ導入されることが出来る。現在では能力の生物学的基礎にもとづいてのみ推測することが出来る。

能力を有する細胞は培養地の中において遺伝的な変種であるが、しかしながら、これらの研究は能力ある表現型は安定に承継されない。もし原生核生物における研究から外挿出来るならば、能力の現象は恐らく細胞の代謝状態を反映する複雑な一時的な性質であるとされる。

共変転は少くともｔｋ遺伝子の一つのコピーとφＸＤＮＡの種々の量を含む。変転は１，０００　：　１のモル比のφＸとｔｋ　連鎖によって行なわれたけれども、変転体において観察された連鎖比率は１００：　１を決して越えることはない。細胞が耐え得る統合の出来事の数には上版があるかも知れず、それを越えると致死量の突然変異が起こる。

それに代って、変転の能率は変転する断片の性質に依存するであろうことが可能である。ｔｋ遺伝子はそれ故にファージＤＮＡより大きな能率の変転試薬であるといえるであろう。

研究のために供与体としてａｐｒｔ＋細胞ＤＮＡと選択可能なマーカーとしてａｐｒｔ　を用いてプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡをＬｔｋ　ａｐｒｔ−細胞の中へ共変転することが実証せられた。更に医−薬品耐性を与えることが出来る突然変異種遺伝子として作用する優生因子の使用は実質的にいかなる培養された細胞への共変転のための宿主範囲を拡張するであろう。

はにゅう動物細胞へのφＸ　ＤＮＡ　系統の安定な転換は選択能力のある基準が存在しない定義された遺伝子の導入のためのモデルシステムとして役立つ。ｔｋ共変転システムはバクテリア　プラスミド　ｐＢＲ３２２とクローニンラビット β−グロビン遺伝子による細胞の変転に用いられてきた。ｐＢＲ変転体のいくらかのものが模写の原型とアンピリジン耐性（β−ラクタマーゼ）に対スルコードを有する遺伝子を含む邪魔をされない連鎖を含むことを示す実験はアンピシリン耐性をＥ、Ｃｏ１１　に転換するであろう。予備的ではあるけれども、これらの研究は真中核遺伝子発現の分析における共変転の可能性ある価値を示す。

実験の第２シリーズラビットβ−グロビン遺伝子を含んでいる共変転された繊維芽細胞は異種構造宿主における発現とこれら連鎖を処理することの研究の機会を提供する。これらの実験において、我々はグロビンＲＮＡの個々のポリアデニル化された９８種を発生する変転されたラビットβ−グロビン遺伝子の発現を実証する。とのＲＩ’ｙＪＡは双方の間に入る連鎖を正確に処理することから結果として生ずるが、成熟したラビットのβ−グロビンｍ　ＲＮＡの５′末端に存在する約４８個のヌクレオチドが欠如している。

ラビットβ−グロビン遺伝子によるマウス細胞の変転状々は染色体の成長したラビットのβ−グロビン遺伝子による変転実験を生化学的マーカーとして純粋化されたヘルペスウィルスｔｋ遺伝子を用いて行なった。突然変異種Ｌｔｋ−マウス繊維芽細胞の添加はヒポキサンチン／アミノグチリン／チミジン（ＨＡＴ　）媒体において成長するだめにそれらの能力によって選択されることが出来る安定な変転体の出現を結果として生ずる。細胞はβ−グロビン遺伝子クローンで指名されたＲβＧｌ　によって共変転され、そしてそれはバクテリオファージλ分枝したベクトルシャロン４Ａにおいて担われるラビットＤＮＡの１５．５−ｋｂｐ挿入物からなる。純粋化されたｔｋ遺伝子はクローンＲβＧｌ　からの損傷していない組み換えＤＮＡの過剰量１００　倍モルと混合された。このＤＮＡはそれから方法と材料のところで記載される変転条件の下にマウスＬｔｋ−に曝露された。選択能力ある媒体においての２週間後、ｔｋ変転体はｔｋ遺伝子の２０ｐｇ当シの１０６個の細胞当シ一つの集団の頻度で観察された。クローンは摘出されマス培養地の中で成長せられた。

ｔｋ＋変転体がまたラビットβ−グロビン連鎖を含むがどうかが調べられた。８つの変転体からの高分子量ＤＮＡは限定エンドヌクレアーゼＫｎｐ　ｌ　によって開裂された。

該ＤＮＡはアガローズ　ゲル電気泳動によって分別され、ニトロセルロースフィルターに移転せられ、そしてこれらフィルターはそれから遷移翻訳されたグロビン〔３２Ｐ〕ＤＮＡ汚染異種交配によってアニーリングされた。

５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｆ：ｒｌＭ、、Ｊ−Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、９８：５０３〜５１７（１９７５）。酵素Ｋｐｎ　ｌによるこの組み換えファージの開裂は５′ 側鎖に配される情報の２．０　ｋ　ｂ　ｐ　と共に完全に成長したβ−グロビン遺伝子を含む４．７−ｋｐｂ　断片を生する。この断片はゲル電気泳動によって純粋化され、そして遷移翻訳されて異種交配探子を生ずる。汚染異種交配実験はグロビン遺伝子を含む４．７−ｋｂｐ　ｋｐｎ断片が８つのｔｋ＋変転体の６つのＤＮＡの中に存在していることを示した。３つのクローンにおいて付加ラビット　グロビン　バンドが観察され、そしてそれは多分変転の間にＫｐｎ　１　位置の少くとも１つの損失から結果として生じたであろう。これら変転体に統合されるラビット　グロビン遺伝子のいくらかは価値があシ、他のものが異種構造遺伝子の２０のコピーまでを含む一方、いくらかのクローンは遺伝子の単一コピーを含んでいた。マウスおよびラビットのβ−グロビン遺伝子が部分的に一致していることは注意せられるべきである。しかしながら、恐らくマウスＤＮＡのＫｐｎ開裂がこれらの実験において容易には検知されない過大な分子量の断片においてβ−遺伝子群を残すために、我々はＫｐｎ−開裂されたマウスＤＮＡに対するラビットβ−グロビン探子の異種交配を観察しなかった。これらの結果は分枝された染色体のラビ１．／）β−グロビン転換の導入を実証する。

ラビットβ−グロビン連鎖はマウス変転体において転写される我々が開発した共変転システムはもしそれらの遺伝子が異種構造受入細胞において発現さハるならば、分枝された真中核遺伝子に対する官能的検定を提供する。

６つの変転された細胞クローンはそれ故にラビットβ−グロビンＲＮＡ連鎖の存在について分析された。最初の実験においては、溶液異種交配反応は我々の変転においてラビット　グロビン写しの細胞濃度を測定するために行われた。純粋化されたラビットα−およびβ−グロビンｍＲＮＡの透射性ｃＤＮＡは細胞ＲＮＡの非常に大きな過剰量によってアニーリングされた。マウスとラビットのグロビン連鎖の間に相同関係が存在するためにラビット　グロビンｃＤＮＡがマウス　グロビンｍＲＮＡと安定な雑種を形成しないよう、しかし相同のラビット連鎖と完全に反応するような実験条件を定めることが必要であった。

０．４Ｍ　食塩存在下において７５℃　で８０％　以上の異種交配がラビット　グロビン　ｍＲＮＡによって観察せられ、一方純粋化されたマウス　グロビン　ｍＲＮＡとの異種構造反応は１０％　の異種交配を越えることはない。相同異種交配反応のＲｏｔ／２は、状状のｃ　ＤＮＡ探子におけるα−プラスβ−グロビン連鎖によって寄与される１　、　２５０のヌクレオチドの複雑さと一致した値である。６Ｘ１０’であった。ＡＸｅｌ、Ｒ６２等、Ｃｅ１ｌ　７：２４７〜２５４（１９７６）。

このラビット　グロビンｃ　ＤＮＡは６つの変転された細胞系統から単離された全ＲＮＡとの異種交配反応において探子として用いられた。変転されたクローン６からの全ＲＮＡは完成時にラビットｃＤＮＡの４４％　を保護するが、この値はもし只β−遺伝子転写のみが存在するかどうかを予測する。この反応はＲｏｔｅの２Ｘ１０８　で仮の第１順序動力学を陳列する。第２変転体はＲｏｔ／２の８×１０３　と反応した。４つの付加変転体からの全ＲＮＡ調整物によるＲｏｔｓ≧１０４ではいかなる有意な異種混合も観察されなかった。

我々はクローン６からのＲＮＡを最も詳細に特徴づけた。

この変転体からのＲＮＡのラビット　グロビンＲＮＡの細胞内局部化を測定するために核およびチトプラズム集団に分別された。チトプラズムＲＮＡは更にオリゴ（ｄＴ）−セルローズ　クロマトグラフィーによってｐｏｌｙ（Ａ）＋およびｐｏｌｙ（Ａ）　ＲＮＡに分別される○クローン６からのｐｏｌｙ（Ａ）＋　チトプラズムＲＮＡはＲｏｔ　′／２の２５によってラビットｃＤＮＡと異種交配した。この値は全細胞ＲＮＡによって観察せられたＲｏｔｋの鴇であり、ｐｏｌｙ（Ａ）＋チトプラズムＲＮＡがマウス細胞において全ＲＮＡの１〜２％であるという観察と一致する。異種交配は夫々Ｒｏｔ値の１×１０４および２　Ｘ　１０’における核ＲＮＡまたはチトプラズムポリ（Ａ）−ＲＮＡのいずれかによシ検知出来ない。我々の変転体に存在するラビットβ−グロビンＲＮＡの一定の状態濃度はＲ８上１／２から細胞あたり約５つのコピーであると計算されることが出来、チトグラズム中・に局部化される９０％のものよシ犬である。

幾つかの独立した実験は検知されたグロビンＲＮＡはこの変転体に存在するラビットＤＮＡ連鎖の転写から誘動することを示す：　（ｆ）　ｃＤＮＡは純粋化された９Ｓマウス　グロビンＲＮＡから調整された。このｃＤＮＡはラビット　グロビンｃＤＮＡとの反応が完全に行われるＲ８を値でクローン６からのポリ（Ａ）”ＲＮＡと異種交配しない。（１１）ラビットグロビンｃＤＮＡは１０４以上のＲ８を値でｔｋ＋グロビン−変転体によって得られた全細胞ＲＮＡと異種交配しない。（ｉｉｌ）観察された異種交配は我かもの顔にＲＮＡ調整物を汚染するラビット　グロビンＤＮＡとの複式形成から結果として起らない。ラビットｃＤＮＡはクローン６からの全細胞ＲＮＡによってア二一リン、グされ、その反応生成物はＳ１ヌクレアーゼによって処理され、そして分離したＤＮＡ−ＲＮＡが複式ＤＮＡから異種交配する条件の下において、硫酸セリウム中での手術密度遠心分離をうけ、乙。該Ｓｌ−耐性ｃ　ＤＮＡはＤＮＡ　−ＲＮＡ雑種構造から予想されるように、５６１．５４　’／ｌｒｉの密度のバンドになった０これらのデータはグロビンＲＮＡがポリアデニル化されていることの観察とともに、ＲＮＡ調整物で観察された異種交配はＤＮＡ連鎖を汚染することから結果として起る０変転された細胞におけるラビット　グロビン転写の特徴づけラビット　エリア０ブラスト核において、β−グロビン遺伝子連鎖は二つの間にはいる連鎖の転写を反映し、該連鎖は次いでこの分子から除去されて９ＳメツセンジヤーＲＮＡを生ずる。それ故にマウス繊維芽細胞によって転写されるラビット遺伝子の適当な***を多分反映しているのであるが、検知されたグロビン転写が個々の９Ｓ種に存在するかどうかを測定することは太いに興味あることであるＯクローン６からのチトプラズムボリ（Ａ）−含有ＲＮＡはメチル−水銀／アガローズ　ゲルにおいて電気泳動され、Ｂａ１ｌｅｙ、　Ｊ−およびＤａｖｉｄｓｏｎ　、　Ｎ、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、７０：　７５−８５（１９７６）ｏそしてジアゾ化セルロース紙に転移された。Ａｌｗｉｎｅ　、　Ｊ、　Ｃ，等＋　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ−Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４　：　５３４０〜５４５４（１９７７）Ｏ転移の後、フィルター上の該ＲＮＡはプラスミド　ｐβＧｌからのＤＮＡと異種交配され、そしてそ５７　特表昭５９−５０１５３３０９）れはラビットβ−グロビンｃＤＮＡ連鎖を含んでいる。

Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、等、　Ｃｅ１ｌ　８：１６３〜１８２（１９７６）。

この　Ｐ−レベルした探子を用いて、ＲＮＡの個々の９Ｓ種が変転体のチトプラズム中に観察せられ、そしてそれはラビット　エリア０ブラストから単離されたラビットグロビンｍＲＮＡと共に移転する。９ＳＲＮＡ種に対する異種交配はラビット　グロビン遺伝子を含むｔｋ＋変転体からの純粋化されたマウス９Ｓ　グロビンＲＮＡまたはポリ（Ａ）−含有チトプラズムＲＮＡのいずれかを含む平行な道筋の中には観察されない。

これらの実験において、変転体からの核ＲＮＡ集団中の１４８　前駆物質の存在を検知することは不可能であった。

これは核ＲＮＡにおいて予期され、観察されたチトプラズマ濃度を与えられたレベルは恐らくこの手法の検知の限界以下である筈だから驚ろくにあたらない。変転された繊維芽細胞中に内部処理位置と共に発現されるラビットグロビン連鎖の５′　および３領域はこのＲＮＡと分枝されたＤＮＡとを異種交配し、次いでＳ１核消化し、そして次いで該ＤＮＡ産物のゲル分析を行なうことによってより正確に定義されることが出来る。Ｂｅｒｋ、Ａ、Ｊ、および５ｈａｒｐ、　Ｐ−Ａ −、Ｃｅ１ｌ　１２ニア２１〜７３２（１９７７）ｏラビット　エリスロイド細胞からβ−グロビンｍＲＮＡが適当な条件下でｃＤＮＡクローンｐβＧｌ　と異種交配された時、ｃＤＮＡの完全な５７ローベース　ベアー挿入はＳｌヌクレアーゼの作用から保護される。該ｃＤＮＡクローンは我々の変転からのＲＮＡと異種交配された時、驚ろくべきことには、個個のＤＮＡバンドは５２５−ベース　ペアーに観察されるけれども、５７ローペース　ペアーには観察されない。これらの結果はこの変転において、５′　または３′　末端でグロビンｍＲＮＡ連鎖の部分において削除を有するラビット　グロビンＲＮＡ分子が存在することを暗示する。これらの可能性を区別するために、染色体ラビットβ−グロビン連鎖を含むλクローン、ＲｐＧ　Ｉ　のＤＮＡは変転された繊維芽細胞ＲＮＡと異種交配した０形成された該雑種はＳｌヌクレアーゼで処理され、そして保護されたＤＮＡ断片はアルカリ　アガローズ　ゲル電気泳動によって分析せられ、サザーン汚染方法によって識別されたＯ　５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ−Ｍ、、ＪｌＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、９８：５０３〜５１７（１９７５）。ラビット遺伝子は二つの間に入る連鎖によって妨害されるから成熟ラビットｍＲＮＡのＲβＧＩ　ＤＮＡへの異種交配はこの種の分析において３つのＤＮＡ断片　小さな間に入る連鎖の結合と５ ′　末端にかかる１４６−ベース　ペアー断片、小さい間に入る連鎖と、大内部断片、およびｍＲＮＡ分子の３′末端と大きな間に入る連鎖の３′結合とにかかる２２１−ベース　ペアー断片、とを生ずる。変転さｈ６たＲＮＡがこの断片において分析され＆時、２２２−ベース　ペアー断片は１００−ベース　ベアーの異常断片と同様に観察されるが、１４６−ベース　ペアー断片は観察されない。

特定５′探子との異種交配は内部２２２−ベース　ペアー断片が存在することを示した。

保護される長さの合計はｃＤＮＡクローンを用いることによって保護されるＤＮＡ断片の長さに等しい。共に取り上げれば、これらの結果は変転されたマウス繊維芽細胞の中に発現せられる間に入る連鎖は正確にＲＮＡ転写から除去されるけれども、観察されるチトプラズム転写の５′末端はラビット　エリア０ブラストの成熟９ＳＲＮＡに存在する約４８±５のヌクレオチドを含んでいないことを示す０考　察これらの研究において、マウス細胞系統は組立てられ、そしてそれはラビットβ −グロビン遺伝子を含む。マウス繊維芽細胞受入体がこの異種構造遺伝子を転写しそして処理する能力がそれから分析された。ＲＮＡ汚染手法と協調する溶液異種交配実験は少くとも一つの変転細胞系統においてラビット　グロビン連鎖がポリアデニル化９８種と同様にチトプラズム中に発現されることを示す。

ラビットβ−クロビン遺伝子の適正な処理はまたグロピントｔｋプラスミドが変転に先立って結紮さ引、ているｔｋ＋マウス細胞細胞体転体いて観察された。Ｍａｎｔｅｉ。

Ｎ、１等、Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ　）　２８１　：　４（１−４６（１９７０Ｊ　□同様な結果が猿の細胞の中ヘラビット　グロビン遺伝子を導入子るためにウィルス　ベクトルを用いることによって得られた。）　Ｈａｍｅｒ、Ｄ、Ｈ，およびＬｅｄｅｒ、Ｐ＋Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ　）、２８１　：　３５〜３９　（１９７９ン。

Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｒ，Ｃ，ｒ　等、Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ　）　２７７：１０８〜１１４ｒ１９７９）。共に取上げれば、これらの結果は異種構造の種からの非エリスロイド細胞はエリヌロイド細胞で通常限定される発現を有するラビット遺伝子の間に入る連鎖を適正に処理するために必要な酵素を含むことを暗示する。

変転体中のラビット　クロビン連鎖の発現のレベルは低い：クロビンＲＮＡの５つのコピーは各々の細胞のナトプラズマ中に存在する。結果は原グロビン転写の中に存在する二つの間に入る連鎖は処理され、そして判別出来ない因子座で、ラビット　エリノロイド細胞中に観察されると力、らから除去される。驚ろくべきことは、成熟しタラヒラトノｍＲＮＡの５′末端に存在する４５のヌクレオチドは、試験せられた変転体のチトプラズムにおいて検知されるβ−グロビンＲＮＡ連鎖には存在１−ない。転写の不適正な開始はこのマウス細胞系統ではグロビン遺伝子のまわりで起ることが可能である。それに代えて、検知されるグロビン連鎖は成熟した９８種を生じるために終局的に５′　処理を進行しなければならない長い前駆物質の転写から結果として生じる。マウス繊維芽細胞中の５′　末端での不適正な処理は、結果に対する原因となシ得る。現在では、これらの改変体を区別することは難がしい。分析は単一変転に限られるので、これらの観察がグロビン遺伝子を発現するすべての変転体に共通なものか、まれなしかし興味ある異常現象を反映しているのかは知られていない。しかしながらワイスマンと彼の仲間による同様な実験において、Ｍａｎｔｅｉ　、Ｎ、等。

Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ　）　２８１　：４（１〜４６（１９７９）ｏ　変転されたマウスの繊維芽細胞中に転写されるラビット　グロビンＲＮＡ分子の少くとも一部が適正な５′末端を保持することは注意せられるべきである。

幾つかの改良された説明が変転された繊維芽細胞中のグロビン連鎖の発現について提案されることが出来る。

エリクロプラストにおいて観察されたレベル以下５から６オーダーの大きさのレベルでグロビンＲＮＡの構造的合成は培養された繊維芽細胞中で起る。Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ　、Ｓ。

等ｒ　Ｃｅ　ｌ　ｌ　７　：　２６７〜２７７　（１９７６）ｏ　２０付加グロビンＤＮＡ型の導入は単に変転において観察されたレベルにこの構造的転写を増大するであろう。それに代えて、相同なグロビン遺伝子は２０の付加グロビン遺伝子の導入によって提供される遺伝子投薬効果によって部分的に打克たれる因子によってコピーが作られることは可能である。

最後に、繊維芽細胞中のグロビン遺伝子の正常なコピーを作ることは染色体におけるこれら連鎖の位置に依存する。新しく導入された遺伝子の少くとも幾つかは多分存在するマウス　グロビン遺伝子から遠い因子座に存在する。これらはずれた位置の幾つかは低いレベルの転写をささえているであろう。最近のデータはこれらおよびその他の改変は区別することが出来ない。

与えられた転写におけるラビット　グロビン遺伝子の幾つかはヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン中の培養物の百世代以上にわたり安定に残るけれども、これらの連鎖は受入細胞ＤＮＡの中へ共有結合的に統合されることを証明することは不可能である。以前の研究において、しかしながら、φＸ　１７４　またはプラスミドＩ）ＢＲ３２２のいずれかの共変転は高分子量ＤＮＡの中へのこれらの連鎖の安定な統合を結果として生ずる０最近の研究では、グロビン遺伝子は変転に用いられた高分子量の連鎖状ファージＤＮＡの小さな内部セグメントを表現する。

供与体ＤＮＡに共有的に連結している統合位置の分析はそれ故に難かしいｏ　ＤＮＡ汚染実験において探子として放射性λ連鎖を用いた予備的研究は幾らかの細胞系統において、最小長５０ｋｂｐ　の再結合ファージの近接した拡がりが導びかれた〇変転体のチトグラズム中の９８グロビンＲＮＡの存在はとのＲＮＡが翻訳されラビットβ−グロビン　ポリペプチドを与えることを暗示する。純粋化し、た抗− ラビットβ−グロビン抗体を用いて細胞クセイト中のこの蛋白質を検知する試みはかくして全く不成功であった。変転体中のグロビンＲＮＡは官能的にリポゾームを結合している位置がないために翻訳されないか、捷た非常に低い能率で翻訳される。変転体中のチトプラズム　グロビン転写は翻訳されない５′連鎖の約４８のヌクレオチドが欠如して２す、そしてぞれはヌクレアーゼ保護研究において４０８リボゾームザブユニットと相互作用することが知られるβのヌクレオチドを含んでいる。Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ　、Ａ。

等、Ｃｅ１ｌ　１０：５７１〜５８５（１＜１７７）；　Ｌｅｇｏｎ、Ｓ−。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１０６：３７〜５３（１９７６）ｏ例え正常な能率で翻訳が行われても、グロビンＲＮＡの低水準とヘムそしてヘモグロビンの存在しない場合はβ−グロビンの半生は３０分以下であろうという観察のために蛋白質は免疫学的検定の検知の限界以下のレベルで多分存在するであろうｏ　Ｍｕｌｌｉｇａｎ、ＲｏＣｏ等、　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２７７　：１０８〜１１４（１９７９）。

この研究は真中核遺伝子発現の分析において共変転システムのポテンシャル値を示す。原生のそして試験管内で組立てられた突然変異種遺伝子と共に野生型遺伝子を培養された細胞の中へ導入することは連鎖機構の官能的有意性に対する検定を提供する。これらの研究からこの分析は共変転の一般化は例えばねずみ科エリクロロイクミア細胞のような受入れ細胞系統に拡張する可能性によって促進されること、異種構造グロビン遺伝子発現の研究のためにより適当な環境を提供することは明らかである０実験の第３シリーズマウス細胞をラビットβ−グロビンによって、およびグラスミドｐＢＲ３２２と φＸ−１７４　によって変転することを含む共変転実験は続けられ、拡張せられ、次の結果を得た。

φＸ　ＤＮＡ　は選択可能なマーカーとしてのｔｋ遺伝子とともに共変転実験において用いられた。φＸ模写型ＤＮＡはＰｓｔ　Ｉで開裂せられ、そしてそれは環状ゲノーム中の単一位置に認められる□　Ｓａｎｇｅｒ、Ｆｏ等、　Ｎａｔｕｒｅ２６５　：　６８７〜６９５（１９７７）ｏ　純粋化せられたｔｋ遺伝子は１〜１０μｔのＰｓｔ−開裂されたφＸ模写型ＤＮＡと混合せられた。このＤＮＡはそれからここに述べられ、Ｗｉｇｌｅｒ、Ｍ、　等、Ｃｅ１ｌ　１６：７７７〜７８５（１９７９）に述べられる変転条件を用いてマウスＬｔｋ−に添加された。

選択能力のある媒体（ＨＡＴ）における２週間の後、ｔｋ”変転体は純粋化された遺伝子の２０ｐ？　＠たシの１０６　細胞あだ）１つの集団の頻度で観察された。クローンは摘出されマス培養地で成長せられた。

ｔｋ＋変転体がφＸ　ＤＮＡ　連鎖を含んでいるかどうががそれから調査された。変転体からの高分子量ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ　Ｒ１で開裂せられ、そしてそれはφＸゲノームにおいていずれの位置にも認められない。

ＤＮＡはアガローズ　ゲル電気泳動によって分別せられ、ニトロセルロースフィルターに移転せられ、そしてこれらのフィルターはそれから遷移翻訳せられた３２Ｐ−φＸＤＮＡでアニーリングされる（汚染異種交配）。

中性媒体からアトランダムに摘出され、次いでｔｋ−およびφＸ　ＤＮＡ　に曝露された１５のクローンのいずれもφＸ情報を含まないことは注意されるべきである。それ故にφＸによる変転はｔｋ＋　変転体の副集団を制限する。

それ故に選択可能なマーカーの添加は変転の識別を促進する。

ラビットβ−グロビン遺伝子によるマウス細胞の変転純粋化されん真中核遺伝子：てよ乙変転は異種構造宿主における分枝された遺伝子の発現の研究のための手段を提供する。共変転実験はラビット染色体ＤＮＡの分枝されたライブラリーから単離されたラビットβ巨大グロビン遺伝子によって行われた一つのβ−グロビン　クローン、指定されたＲＧＩはバクテリオファージλ分枝ベクトルシャロン４Ａ上に担われた１５ｋｂラビットＤＮＡ断片からなる。このクローン（ＲβＧ −１）からの損傷されていないＤＮＡは１００　：　１モル比でウィルスｔｋＤＮＡと混合され、ｔｋ＋　変転体は単離され、ラビット　グロビン連鎖の存在について調べられた。酵素Ｋｐｎ　Ｉ　によるＲβＧ−１の開裂は完全なラビット β−グロビン遺伝子を含む４．７　ｋ　ｂ断片を生じる。この断片はゲル電気泳動によって純粋化せられ遷移翻訳されて副連鎖アニーリング実験のための探子を生ずる。マウスとラビットのβ−グロビン遺伝子は部分的に相同であるが、けれども我々は恐ら＜　Ｋｐｎが非常に大きなグロビン−特定断片を生じるためにＫｐｎ−開裂されたマウスＤＮＡによるラビットβ−グロビン探子のアニーリングは観察しなかった。これに反してＫｐｎ　Ｉ　によるラビット肝臓ＤＮＡの開裂は予期された４、７ｋｂグロビ／　バンドを生じる。酵素Ｋｐｎ　ｌ　による変転細胞ＤＮＡの開裂は試験された８つのｔｋ＋　変転体のうち６つにおいてグロビン特定情報を含む４．７　ｋ　ｂ断片を生ずる。これら変転体中に存在するラビット　グロビン遺伝子の数は変化する。対照と比較すると、クローンの幾つかのものは遺伝子の単一コピーを含み、一方その他はこの異種構造の２０コピーと同数を含む。

ラビットβ−グロビン連鎖はマウス変転体において転写されるもし異常構造受入細胞の中にこれら遺伝子が発現されるならば開裂された共変転システムは分枝された真中核遺伝子のための官能的検定を提供する。６つの変転された細胞クローンはラビット−グロビンＲＮＡ連鎖の存在について分析された。最初の実験においては、溶液異常交配反応（ｄ変転体釦おいてラビ、・ト　グロビン転写の細胞濃度を測定するために行われた。

純粋化されたラビットαおよびβ−グロビンｍＲＮＡの放射性ｃＤＮＡコピーはラビット　グロビンｃＤＮＡがマウス連鎖と安全な雑種を形成しないよりな実験条件下において変転体からの全細胞ＲＮＡの極めて過剰な量でアニーリングされた。変転されたクローン６がもの全ＲＮＡは完成時点でラビットｃＤＮＡの４４％を保護し、その値はもし単にβ遺伝子転写が存在するならば予期される。この反応はＲ６ｔ　８の２×１０３　による仮第１順序動カ学を陳夕１ける。第２変転体（クローン２）はＲ８上　３／２の８×１０３　と反応する。いかなる有意な異種交配も４つの他の変転体から全ＲＮＡを調製することによっては観察されない。クローン６の更なる分析は実質的にこの変転体において検知されるラビットβ−グロビンＲＮＡのすべてはポリアデニル化され、そしてチトプラズム中に局部化される連鎖の９０チ　以上と共に細胞あたりで約５．っのコピーの一定の状態の濃度に存在することを実証する。

変転された細胞における個々の９ｓ種としてのグロビン連鎖の存在ラビット　エリクロブラスト核において、β−グロビン遺伝子連鎖は二つの間に入る連鎖の転写を反映し、その連鎖は次いでこの分子から重ね継ぎされて９８メツセンジヤーＲＮＡを生ずるところの１４Ｓ　前駆物質ＲＮＡとして検出される。我々の溶液異種交配実験は只ポリアデニル化されたラビット　グロビンＲＮＡ連鎖がマウス変転体の中に存在することを示す。それ故に恐らくマウス繊維芽細胞によるラビット遺伝子転写の相応する重ね継ぎを反映するであろう我々が検出したグロビン転写が個々の９Ｓ種に存在するかどうかを測定することは興味あることである。クローン６からのチトプラズム　ポリＡ−含有ＲＮＡｆｄ７０℃　で６Ｍ尿素によって処理され、１％酸−尿素−アガローズ　ゲルにて電気泳動せられそしてジアゾ化されたセルロースペーパーに転移される。転移についで、該ＲＮＡフィルターはラビットβ−グロビンｃ　ＤＮＡ連鎖を含むプラスミドＲβ Ｇ−１からのＤＮＡによって異種交配される。この８２Ｐ−ラベルされた探子を用いて、チトプラズムＲＮＡの個々の９ｓ種がみられ、そしてそれはラビット　エリスロブラストから単離されたラビットグロビンｍＲＮＡと共に移転する。９ＳＲＮＡ種に対する異種交配は純粋化されたマ・ウス９ｓ　グロビンＲＮＡまたはラビット　グロビン遺伝子を含んでいないｔｋ＋変転体がらのポリアデニル化されたチトブラズムＲＮＡのいずれかを含む平行な道筋の中には観察されない。

変転体からの核ＲＮＡ集団の中の１４８　前駆物質の存在を測定することはこれらの実験では不可能である。これは核ＲＮＡにおいて予期され、観察されるチトプラズム濃度を与えられたレベルが多分この手法の検知の限界以下であるから驚くことではない。けれども、チトプラズムＲＮＡによる結果はマウス繊維芽細胞がラビットβ−グロビン遺伝子の転写を処理してラビット　エリメロブラスト中のβ−グロビンｍＲＮＡとは区別出来ない。９Ｓポリアデニル化された種を生ずることが出来ることを強く示唆する。

変転されたマウス細胞からｐＢＲ３２２ＤＮＡの救助共変転における観察はＥＫ −２承認されたバクテリアベクトル、プラスミドｐＢＲ３２２へと拡張された。

ここに概略を説明される共変転を用いて、細胞系列はｐＢＲ３２２ゲノームの複合コピーを含んで組立てられた。汚染異種交配分析は有意なプラスミドＤＮＡの損失なくして細胞ＤＮＡの中へｐＢＲ３２２連鎖が統合することを示す。

ヒント■またはバムＨ１のいずれかで線状化され、テトラチクリン耐性遺伝子を破壊するｐＢＲ３２２ＤＮＡはプラスミド模写原型およびアンピシリン耐性（β −ラクタマーゼ）遺伝子の双方の保持によってマウスＤＮＡの中へ統合する。それ故にこれらプラスミド連鎖がバクテリア細胞の第２変転によってマウス　ゲノームから救助され得るかどうかが調べられた。

選択された実験的アプローチは第２図に概略が示される。線状化せられたｐＢＲ３２２ＤＮＡは選択可能なマーカーとしてｔｋ遺伝子を用いて共変転を介してマウス繊維芽細胞の中へ導入せられる。ＤＮＡは変転体から単離されそしてｐＢＲ３２２連鎖の存在に対して篩別される。

供与プラスミドは線状化され、テトラチクリン耐性遺伝子を邪魔しているので、変転細胞ＤＮＡは模写原型とマウス細胞ＤＮＡに共有的に連結されているβ−ラクタマーゼ遺伝子からなるプラスミドＤＮＡの線状拡がりを含む。このＤＮＡはプラスミド　ゲノームを消化しない酵素、例えばＸｈｏ　ｌ　によって開裂される。得られた断片はりガーゼ存在下で低いＤＮＡ濃度で培養せられる。プラスミドＤＮＡを含む環状分子はＥ、Ｃｏ１１種ｘ　１７６６の変転によって真中核類の著るしい過剰から選択される。

このシリーズの実験は行われ、そして再結合プラスミドは次の性質を陳列する変転マウス細胞ＤＮＡから単離される＝１）救助されたプラスミドはアンピシリン耐性であるが、供与ｐＢＲ３２２がテトラチクリン耐性遺伝子の中においての開裂により線状化されるという事実を一致するテトラチクリン感受性でもある。２）救助プラスミドはｐＢＲ３２２よりも１．９　ｋ　ｂ大きく、それ故に付加ＤＮＡを含む。３）救助されたプラスミドは汚染異種交配をＥｃ。

Ｒ１−一開裂されたマウス肝臓ＤＮＡにアニーリングし、ぞしてそれはプラスミドが単一コピーマウスＤＮＡの挿入をよむことを暗示する。これらの観察は変転を汗してマウス　ゲノームの中へ不変的に統合されるバクテリアのプラスミドがこの不自然な環境から救助され得、そしてバクテリア宿主の中の官能性に対してこれらの能力を保持することが出来ることを実証する。

この結果は直接的に選択能力ある成長基準が適用され得るいかなる細胞遺伝子をも実質的に単離するためにプラスミド救助を利用する改変された案を暗示する。

鶏のａｐｒｔ遺伝子はＨｉｎｄｌｌまたはＸｈｏｌ　によっては開裂されず、そしてこれら酵素によって消化された細胞ＤＮＡによるａｐｒｔ−マウス細胞の変転は鶏ａｐｒｔ遺伝子を発現するａｐｒｔ＋　集団の世代の結果として生ずる。

Ｈｉ　ｎｄ■開裂された鶏ＤＮＡをＨｉｎｄ　ＩＩ　開裂されたｐＢ’Ｒ３２２で結紮することはそこにおいてａｐｒｔ遺伝子は今プラスミド連鎖に接近している雑種ＤＮＡ分子の形成を結果として生ずる。ａｐｒｔ−細胞の変転は今このＤＮＡによって行われる。変転体はｐＢＲ３２２に共有的に連結せられ、マウス　ゲノームの中に統合されるａｐｒｔ遺伝子を含むであろう。この変転細胞ＤＮＡはｐＢＲ３２２＃、　ａｐｒｔ遺伝子もいずれも開裂し左い酵素によって処理きれ、そしてその結果得られた断片は結紮によって環化される。これら環状分子でＥ、ｃｏｌｉ　を変転することは真中核ＤＮＡからプラスミド連鎖と選択しそして鶏ａｐｒｔ　連鎖を非常に多く含むであろう・。この二重選択手法は真生核細胞において低レベルに発現し、そして異種交配探子が容易には得られない遺伝子の単離を可能ならしめる。

考　察ＤＮＡが能力ある細胞の中へ安定に導入される頻度は高い。更に、共変転された連鎖は高分子音量ＤＮＡの中に統合されて出現する。統合の出来事の数は変転されたクローンとは独立して１から５０以上で変化する。現在正確な説明は統合仲介物の性質に関してはされることが出来ない。φＸのデーターは線状分子としてその中にφＸＤＮＡが統合するモデルによるのであるけれども、環状仲介物を生ずるより複雑な分子内再結合の出来事は統合過程に先立ち、もしくはその間に起ったであろうことは可能性がある。統合のモードが同であろうとも、細胞は供与ＤＮＡの長い拡が９によって安定に変転されることが出来るように思われる。変転体は供与ＤＮＡの５０ｋｂ長の近４接する拡がりを含んでいることが観察された。更に培養物の中の有能な細胞の頻度はまた高い。少くとも１係のマウスＬｔｋ−細胞受入体はｔｋ＋表現型に変転され得る。

自然の変転の頻度は知らり、でいないけれども、この過程は深甚な物理的、そして進化的な結果を有するであろう。

分枝された真中核遺伝子を動物細胞に導入することはＤＮＡ連鎖機構の種々な様相の官能的有意性を研究するだめの生体内系を提供する。この研究において、ラビソ）β−クロビン遺伝子の２０までのコピーを含む安定なマウス細胞系統が組立てられた。マウヌー繊維芽細胞受入体の転写能力とこの異種構造遺伝子を処理する能力とが分析さり、た。ＲＮＡ汚染手法と協調する溶液異種交配実験は少くとも一つの変転された細胞系において、ラビットグロビン連鎖が成熟したラビット　エリクロプラストのメツセンシャーＲＮＡから区別されることの出来ない９８種としてチトプラズム中に発現されることを示す。これらの結果はマウス繊維芽細胞が転写に必要な酵素を含み、そしてその発現が真生核細胞に正常に限定されるラビット遺伝子を正確に処理することを暗示する。同様な観察がラビット　グロビン遺伝子を猿の細胞に導入するためにウィルスベクトルを用いて他の人々によってなされた。

真中核遺伝子発現の分析において共変転システム゛のポテンシャル値を示す。天然および試験管で組立てられた突然変異種遺伝子と共に野生型遺伝子を培養された細胞の中へ導くことは連鎖機構の官能的有意性のための検定を提供する。これらの研究から、例えばねずみ類のエリクロロイケミア細胞のような異種構造グロビン遺伝子発現の研究のためのより適当な環境を提供する受入細胞系統に共変転の一般法則を拡張する可能性によってこの分析が促進されるであろうことはこれらの研究から明らかである。

実験の第４シリーズ培養された細胞の中へ純粋化された遺伝子を転移する能力は変転された宿主における外因性遺伝子の官能性および物理的状態を研究するための独特な機会を提供する。

Ｈ８Ｖチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を突然変異種マウス細胞へ転移するためのシステムの開発ハ、Ｗｉｇｌｅｒ　、Ｍ。

等、Ｃｅ１ｌ　１１：２２３〜２３２（１９７７）、これら研究が独特な細胞遺伝子に拡張され、ることを可能にした。Ｗｉｇｌｅｒ。

Ｍ、　等、Ｃｅ１ｌ　１４ニア２５〜７３１（１９７９）ｏ　ｔｋ＋組織から得られそして真中核組織の変種からの細胞によって培養された高分子−量ＤＮＡはこの酵素において欠けている突然変異種マウス細胞にｔｋ　活性を転移するために用いられることか出来る。変転過程の一般化は細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ａｐｒｔ）遺伝子とヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）遺伝子の連続的な転移によって実証された。Ｗｉｇｌｅｒ。

Ｍ、等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ−Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７６：１３７３〜１３７６（１９７９）：　Ｗｉｌｌｉｃｋｅ、に、等。

Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ−Ｇｅｎｅｔ、１７０：１７９〜１８５（１９７９）　：Ｇｒａｆ、　Ｌ−Ｙ−等Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　、印刷中（１９７９）。

より最近、選択可能な生化学的マーカーに対するコードを有する遺伝子で変転された細胞はまた高頻度で他の物理的に連結されていないＤＮＡ断片を統合することが実証された。この方法ではｔｋ遺伝子は定義された原生核および真中核遺伝子によって培養されたほにゆう動物細胞の中へ共変転せられたほにゆう動物細胞を識別するためのマーカーとして用いられた。Ｗｉｇｌｅｒ　、　Ｍ、等。

Ｃｅ１ｌ　１６：７７７〜７８５（１９７９）。

遺伝子転換の検出は過去には広範囲にわたって適当な突然変異種細胞系統の供用にたよっていた０ある場合には代謝阻害物に対する細胞耐性は優性に作用する突然変異種遺伝子を含む。優性に作用するマーカーによる共変転は原則としていかなる分枝された遺伝的要素、をも野性型培養された細胞の中へ導入することを実質的に可能ならしめる。この研究においては、細胞は細胞耐性にメトトレキセイト（ｍｔｘ）の高濃度を与える突然変異種ジハイドロフォレイト　リダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子に対するコードを有する遺伝子によって変転される。’　Ｆｌｉｎｔｏｆｆ　。

Ｗ、Ｆ、　、等＋　Ｃａ　ｌ　ｌ　２　：　２４５〜２６２　（１９７６）。

培養されたほにゅう動物細胞はフォレイト拮抗体であるメトトレキセイトに対して非常に鋭敏である。Ｍｔｘ耐性細胞系統は識別せられて三つのカテゴリーに入れられた゛　１）この医薬品の減少された移送を伴なう細胞Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｇ −Ａ−Ｂｉｏｃｈｅｍ−Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、１１：１２３３〜１２３７（１９６２）　；　５ｉｒｏｔｕａｋ、Ｆ、　Ｍ、　、等。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　、２８ニア５〜８０（１９６８）：　２）メトトレキセイトに対するｄｈｆｒの親和性を低下せしめる構造的突然変異を伴なう細胞Ｆｌｉｎｔｏｆｆ　、　Ｗ、Ｆ、　、等、Ｃｅ１１２：２４５〜２６２（１９７６）　：　および３）異常に高いレベルのｄｈｆｒ　を生産する細胞Ｂｉｅｄｌｅｒ、Ｊ、Ｌ、　、等。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　、３２：１に３〜１６１（１９７２）　：　Ｃｈａｎｇ。

Ｓ、　ＥおよびＬｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ、Ｊ−Ｗ−、Ｃｅ１ｌ　１：３９１〜３９６（１９７６）ｏ　彼等の実験において、ｄｈｆｒ　の高レベルを生産する細胞はｄｈｆｒ遺伝子の上昇されたレベルを含むことが見出された。Ｓｃｈｉｍｋｅ、Ｒ−Ｔ−Ｐ　等。

５ｃｉｅｎｃｅ　２０２：１０５１〜１０５５（１９７８）。

興味あるメトトレキセイト耐性変種細胞系統（Ａ２９）はメトトレキセイトに対する減少させられた親和力により突然変異種ジハイドロフオレイト　リダクターゼの上昇されたレベルを合成することを確認された□　Ｗｉｇｌｅｒ　。

Ｍ、２等ｔ　Ｃｅ１ｌ　１６　ニア７７〜７８５（１９７９）ｏこの細胞系統からのゲノームＤＮＡは実験においては突然変異種ｄｎｆｒ遺伝子をｍｔｘ感受性細胞に転移するための供与体れたレベルに曝露することは転移された遺伝子を増幅した細胞を選択する。この方法では、実質的に培養されたほにゆう動物細胞中のいかなる遺伝的要素をも転換しそして増幅することを可能ならしめる０マウス細胞への突然変異種ノ・ムスタージノ・イドロフオレイト遺伝子の転移高分子量細胞ＤＮＡは野生型ｍｔｘ感受性ＣＨＯ細胞およびＡ２９　細胞、突然変異種ｄｈｆｒ　の増大されたレベルを合成するｍｔｘ耐性ＣＨＯ誘導体から調製された。Ｆｌｉｎｔｏｆｆ　。

Ｗ、Ｆ、　、等、Ｃｅ１ｌ　２：２４５〜２６２（１９７６）ｏ　ｄｈｆｒ遺伝子またはｔｋ遺伝子の−いｆｉか”、−ｔｋ−マウスＬ細胞（Ｌｔｋ　ａｐｒｔ　）に転移することに対するこれら、ＤＮＡ調製物の能力が燐酸カルシウム共沈澱法の変型を用いてテストされたｏ　Ｗｉｇｌｅｒ　、　Ｍ、等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　７６：１３７３〜１３７６（１９７９）ｃ突然変異種Ａ２９　および野生型ＣＨＯ細胞の双方からのＤＮＡはｔｋ　遺伝子をＬｔｋ　ａｐｒｔ−細胞に転移することにおいて有能であった。

メトトレキセイト耐性集団はＡ２９　からのＤＮＡによる細胞の以下に示す処理のみによって観察された。得られたデーターはＡ２９　でのメトトレキセイト感受性細胞の処理は突然変異種ｄｈｆｒ遺伝子の転移と発現を結果として起こす。

この仮説を直接的にテストするために、分子異種交配研究が行われ、推定せられた変転体からのＤＮＡ中にハムスタ丁ｄｈｆｒ遺伝子の存在することが実証された。ハムスターｄｈｆ　ｒ遺伝子の構造的遺伝子連鎖と相同性を有するマウスｄｈｆｒ　ｃＤＮＡクローン（ｐｄｆｒ−２１）　、　Ｃｈａｎｇ＋Ａ−Ｃ−Ｙ、　、等、　Ｎａｔｕｒｅ　２７５：６１７〜６２４（１９７８）は我々の変転においてこの遺伝子の存在を検知するために用いられた。Ａ２９　からの、推定せられた変転体からの、そして増幅されたマウス細胞からのｄｈｆｒ遺伝子の限定分析は汚染異種交配によって行われた。５ｏｕｔｈｅｒｎ　。

Ｅ、　Ｍ−、ＪｏＭｏｌ、Ｂｉｏｌ−９８：５０３〜５１７（１９７５）。

ＤＮＡは限定エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ　ｍによって開裂せられ、アガロ−ズ　ゲルによって電気泳動せられ、そしテニトロセルロース　フィルターに移転せられた。これらのフィルターはそれから３２Ｐ−ラベルされた遷移翻訳されたｐｄｈｆｒ　−２１の高い特定活性によって異種交配せしめられ、そして自動放射線写真術によって現像せられる：この方法ｕ　ｄｂｆｒ探子に相同するゲノームＤＮＡの限定断片を視覚化せしめる。顕著なバンドはマウスＤＮＡに対して１５ｋｂ、　３．５ｋｂおよび３ｋｂ　、ハムスターＤＮＡに対して７．９ｋｂ　、　３．７ｋｂおよび１．４　ｋｂに観察される。これら二つの種の間の限定プロフィールは充分大きく相違しており内生マウス遺伝子の存在下でハムスター遺伝子を区別することを可能ならしめる。メトトレキセイトに対する５つのし細胞変転体耐性はそれ故に汚染異種交配によって試験される。各各の変転された細胞系列において、内生マウスｄｈｆ　ｒ遺伝子の開裂から得られるバンドと分子量が・・ムスターＤＮＡの開裂にもとすいて観察せられるそれらと同一である更なるバンドの一連との予期されるプロフィールが観察された。ハムスターＤＮＡにおいて観察された１７．９ｋｂ、　７．９ｋｂおよび１．４　ｋｂバンドはハムスターｄｈｆｒ遺伝子の存在の診断に役立ち、そしてすべての変転体に存在する。

最初の実験において、メトトレキセイトの最低濃度（０，１ｐｇ　／ｄ　）が選ばれ、それはＬｔｋ−ａｐｒｔ−細胞の生１丁を１０−７以下に減少する。先の研究、Ｆｌｉｎｔｏｆｆ　＋　ｗ、Ｆ、１等、　Ｃｅ１ｌ　２　：　２４５〜２６２（１９７６）、は単一突然変異種ｄｈｆ　ｒ遺伝子の存在はメ））Ｌ／キセイトのこの濃度に対する細胞耐性を与えることが出来ることを暗示した。変転された細胞ＤＮＡのハムスターｄｈｆｒ遺伝子断片の強度と野生型ハムスターＤＮＡの強度との比較は我々の変転がメ）ルキセイト耐性ハムスター遺伝子の一つかせいぜい数個を含むことを示唆する。比較により、突然変異種ｄｈｆｒの上昇されたレベルを生ずることが示された供与Ａ２９細胞、Ｆｌｉｎｔｏｆｆ、Ｗ、Ｆ、等＋　Ｃｅ１ｌ　２：２４５〜２６２（１９７６）はこの遺伝子の複合コピーを含んでいるように思われる。

転移せられたｄｈｆｒ遺伝子の増幅最初の変転体は比較的低いレベルのｍｔｘ　（０，１μｇ／ｒｌ　）に対する耐性に対して選択された。すべてのクローンに対して、しかしながらこの医薬品の連続的に増加せられている濃度に対してマス培養地を曝露することによってｍｔｘの上昇せられたレベルに対して細胞耐性を選択することは可能である。この方法において、我々は最初０．１μｇＡｌに対する耐性体であったクローンからスタートしてメトトレキセイトの４０μｇ／＊ｌｉでに対する培養耐性体を単離した。我々は次いで、これら変転体におけるメトトレキセイトに対する増加された耐性体がｄｈｆ　ｒ遺伝子の増幅に関係しているかどうか、そしてもしそうであれば、内生マウスまたは新らしく転移されたノ・ムスター遺伝子が増幅されたかどうかを調べた。４つの独立した単離からのＤＮＡおよびそれらの耐性誘導体が汚染異種交配によって試された。各々の例において、メトトレキセイトに対する高められた耐性はノ・ムスター遺伝子のコピー数における増加によって伴われた。これは１．５ｋｂ　ノクンドの強度を比較することによってもつとも容易にみられる。いずれの例においても、我々は内生マウスｄｈｆｒ遺伝子の増幅を検出しなかっだ０最後に、メトトレキセイト当量濃度で選択されたすべての系統が同じｄｈｆｒ遺伝子コピー数を持つとはいえないことに注意するべきである〇一般化変転ベクトルとしてのｄｈｆｒ遺伝子選択可能な遺伝子は他の遺伝的要素を培養された細胞の中へ導入するん４めのベクトルとして用いることが出来る。

以前の研究において、ｔｋ遺伝子で変転された細胞が恐らぐ他の連結されていない遺伝子と併合するであろ　″うことか実証された。Ｗｉｇｌｅｒ＋　Ｍ−＋等　Ｃｅ１ｌ　１６：７７７〜７８５（１９７９）ｏ　このアプローチの一般化は選択可能なマーカー、突然変異種ｄｈｆｒ遺伝子に対してテストされた。

Ａ２９からの全細胞ＤＮＡの２０μｇがＨｉｎｄ　Ｉ−線状化せられたｐＢＲ３２２ＤＮＡの１μｇと混合された。受入れ細胞はこのＤＮＡ混合物に曝露され、そして二週間後にメトトレキセイト耐性体集団が摘出されたつ変転体からのゲノームＤＮＡが単離せられ、Ｈｉｎｄｌｌ［で開裂せられ、ｐＢＲ３２２連鎖の存在に対して分析せられた。２つの独立した単離体はこの方法で試験され、そして両方共の場合において、ｐＢＲ３２２連鎖の複合コピーはこれらメトトレキセイト変転体の中に存在した。

一般化された変転に対する改良したアプローチは選択可能な遺伝子に対する選択可能でないＤＮＡ連鎖の結紮を含む。突然変異種ｄｈｆｒ遺伝子は医薬品耐性因子に作用する優性であるから、この遺伝子は一つのアイデアルベクトルである。

更に、上昇せられたレベルのｍｔｘに対して細胞耐性を選択することによってこのベクトルを結紮されたいかなる遺伝要素をも増幅することは可能である。

この可能性を調べるために、Ａ２９のｄｈｆｒ遺伝子を破壊しない、限定エンドヌクレアーゼは変転検定によって識別された。一つのこのような限定：−ンドヌクレアーゼＳａ　ＩＩはＡ２９ＤＮＡの変転能力を破壊しない。Ｓａｌ　Ｉ　− 開裂されたＡ２９ＤＮＡはそれ故にＳａｌ　ｌ−線状化されたｐＢＲ３２２の等しい量と結紮された。この結紮生成物は次いで変転実験に用いられた。メトトレキセイト耐性集団は摘出され、そして０１μｇメトトレキセイト／ｌｎｌでマス培養地の中で成長された。マス培養物は次いで増加された濃度のメトトレキセイトに曝露された。

ＤＮＡは０．１，２．１０および４０μｇ／ｎｌメトトレキセイトに対するマス培養物耐性体から得られ、ｐＢＲ３２２およびｄｈｆ　ｒ連鎖のコピー数が汚染異種交配によって測定された。６つの独立した変転された系統はこのやり方で試験された。５つのこれら系統はｐＢＲ３２２連鎖と相同な複合バンドを現わしだ。これら変転されたクローンの４つにおいて、少くとも一つのｐＢＲ３２２−特定バンドがｄｈｆｒの増幅において強度を増大した。５ｓ−１において、二つのｐＢＲ３２２−特定バンドが０．１μｇ／ｄメトトレキセイトに対して細胞耐性体からのＤＮＡにおいて観察された。これらのバンドは２μｇ／ｌｌに対する細胞耐性における強度において数倍増加する。しかしながら４０μｇ々ｌに対する耐性に対して選ばれた細胞においてはいかなる強度の増加も観察されなかった。

第２の系統では０．１μｇ／ｌｔｌに存在する５Ｓ−６、すべてのｐＢＲ３２２のバンドは細胞がまずメトトレキセイトの２μｇＡｌで選択され、次いで４０μ ｇ／１ｔｔｌで選択されるにつれで強度を増加し続ける。奇妙なことには、新らしいｐＢＲ３２２−特定バンドは高いメトトレキセイト濃度での選択の後に現れる。この細胞の系統ではｐＢＲ３２２連鎖に対するコピー数においては少くとも５０倍の増加があることが評価せられた。第３の細胞系統においては、ＨＨ−１，、二つのｐＢＲ３２２−特定バンドが増幅にもとすいて強度を増加し、その他は一定に残るかまたは強度を減少する。かくしてこれらの細胞において観察され −るｐＢＲ３２２連鎖の増幅のパターンは全く変化することが出来る。けれども、突然変異種ｄｈｆ　ｒ遺伝子は培養された動物細胞の中へ定義されたＤＮＡ連鎖を導入しそして増幅するだめのベクトルとして用いることが出来る。

考　察真中核遺伝子発現の研究におけるＤＮＡ−仲介された変転の可能性のある有用性はその一般化にもとすく大きな広がりに依存する。選択可能な生化学的官能性に対するコードを有する細胞遺伝子は予め突然変異種の培養された細胞の中へ導入せられる。Ｗｉｇｌｅｒ　、　Ｍ、等、　（：ｅｌ１１４　ニア２５〜７３１　（１９７９）　；　Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ、等＋　Ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７６：１３７３〜１３７６（１９７９）；Ｗｉ］１ｅｃｋｅ。

Ｋ、９等、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１７０：１７９〜１８５（１９７９）；Ｇｒａｆ＋　Ｌ　−Ｈｌ、等、　Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、印刷中（１９７９）ｏ　最近の研究では、優性に作用するメトトレキセイト耐性ｄｈｆｒ遺伝子は野生型の培養された細胞に転移された。共変転システムにおけるベクトルとしてのこの遺伝子の使用は今やいかなる遺伝的要素を新らしい細胞環境の宿主の中へ実質的に導入することを可能ならしめるであろう。

最初の実験では、Ａ２９細胞からのＤＮＡ、突然変異種ｄｈｆｒを合成するメトトレキセイト耐性ＣＨＯ誘導体はマウス変転体の培養物に対して添加せられた。

メトトレキセイト耐性集団は１から１０集団１５Ｘ１０”細胞／２０μｇ細胞ＤＮＡの頻度で現れた。いかなる集団も野生型メトトレギセイト感受性細胞から得られたＤＮＡによる変転にもとすいて観察されないけれども、このＤＮＡはチミジンキナーゼ遺伝子の有能な供与体であった。我々が突然変異種ハムスターｄｈｆｒ遺伝子の転移をもたらした決定的な証拠はマウス変転体の中のノ・ムスター遺伝子の存在を実証したことによって得られた。マウスと７・ムスターのｄｈｆｒ遺伝子の限定地図は顕著に相違しそして汚染異種交配実験においてこれら遺伝子を区別することを可能ならしめる。試験されたすべての変転において、マウスｄｈｆｒ　ｃＤＮＡクローンと相同な限定断片の二つの組、内生マウス遺伝子の特徴を有する一連のバンド、および供与体ハムスター遺伝子の特徴を有する第二の一連のバンドが観察される。

ｄｈｆｒの所在する場所の変転の有用性は変転の、およびｍｔｘに対する自然の耐性の双方の相対頻度の関数である。摘出されたすべてのｍｔｘ耐性り細胞は内生遺伝子の増幅よりもむしろ変転から結果として生じることの実証はｄｈｆｒの増幅がこの細胞系においては稀な出来事であることを示唆する。マウス　テラトーマとラット肝臓細胞を含む他の細胞系統を変転させるだめの試みがなされ、そしてこの例においては異種交配研究がｍｔｘ耐性の獲得は内生ｄｈｆｒ遺伝子の増幅から結果として生じることが明らかとなる。純粋化せられたｄｈｆｒ遺伝子の使用は多分変転の頻度を著るしく増大することによるこれら困難性に打克つことにある。

最初の変転体において観察せられるｄｈｆｒコピー数は低い。この観察は単一突然変異ｄｈｆｒ遺伝子が選択された基準（０，１μｇ／ｎτｍｔｘ　）の下で細胞ｍｔｘ耐性の与えることが出来ることを示唆する以前の研究Ｆｌｉｎｔｏｆｆ　、　Ｗ、　Ｆ。

等、　Ｃｅ１ｌ　２：２４５〜２６２（１９７６）と一致する。コれら最初の耐性変転体の医薬品濃度を段階的に増すことに対して曝露することは新らしく転移された突然変異種ノ・ムスターｄｈｆｒ遺伝子の増幅から生ずる　高められたｍｔｘ耐性による細胞の選択を結果として起す。いかなる変転体においても、内生マウス遺伝子の増幅は選択された圧力に応じて観察されなかった。単一の突然変異種遺伝子は多分単一野生型遺伝子よりも与えられた濃度のｍｔｘに対する顕著に大きな耐性を与える。もし増幅の頻度が低ければ単に増幅という出来事の最少数を有する耐性変種を選択することになる。新しく転移された遺伝子は内生遺伝子よシも容易に増幅されるであろう。

突然変異種ｄｈｆｒ遺伝子は選択され得ない遺伝的要素を培養された細胞へ導入するだめの優性転移ベクトルとして用いられた。一つの実験的アプローチは有能な細胞が高頻度で他の物理的に連結されていない遺伝子を統合するという以前になされた観察、Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ−等。

Ｃｅ１ｌ　１６：７７７〜７８５（１９７９）を開発する。　ｐＢＲ３２２ＤＮＡに曝露された培養物は突然変異種ｄｈｆｒ遺伝子を含む遺伝性ＤＮＡと共にバクテリアのプラスミドの複合コピーを含むｍｔｘ耐性細胞系統の因となる０遺伝的ベクトル付けに対する改変されたアプローチはｐＢＲ３２２連鎖を変転に先立って選択可能のｄｈｆｒ遺伝子に結紮することを含む。この産物はまた複合ｐＢＲ３２２連鎖を含む変転を生ずる。ｄｈｆｒの増幅はｐＢＲ３２２連鎖の増幅を結果として生ずるが、しかし増幅のパターンは細胞系統によって異なる。一つの例においてはすべてのｐＢＲ３２２連鎖はｍｔｘ濃度の増加によって増幅する。他の系統では、連鎖のサブセットが増幅する。また他の系統では連鎖は失われたかもしくは再配列されたように思われる。いくらかの系統では、増幅は４０ μｇ／ｓｌまでのｍｔｘ濃度を増加することにともなって進行するが、一方他のものでは、増幅は２μｇ／ｙｒｔｌで中止する。現在、増幅過程は理解されてもいないし、また増幅単位が定義されてもいない。これら複雑な出来事に対する原因となるいかなる機構も、それらが培養された細胞の中へ導びかれるいかなる遺伝子の投与を実質的に調節するために開発され得ることは明らかである。

実験の第５シリーズマウス　テトラト力ルシノーマ（ＴＣＣ）ステム細胞は特定の、予定せられた遺伝的変化をマウスの中へ導入するための独特なベクトルを提供する。Ｍｉｎｔｚ、Ｂ−および１１１ｍｅｎｓｅ、　Ｋ−＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、７２　：　３５８５〜３５８９（１９７５）：Ｍｉｎｔｚ、　Ｂ、、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ　Ｓｙｍｐ、　Ｂｉｏｌ。

２９　：　８２〜８５（１９７７）。これらの細胞は初期エンブリオの環境中に置かれた時、ネオプラスティックな性質を失ないそして正規の分化を受ける。そこでそれらは供与−および宿主−誘導された細胞の双方からなるモザイク動物におけるすべての体組織の形成と、そしてまたそれから出た子孫がそれらのすべての細胞において腫瘍血統の遺伝子を有する細菌系統に寄与する。かぐして培養地中のＴＣＣステム細胞の最初の繁殖の間、クローンは実験的に選択された核、Ｄｅｗｅｙ、　Ｍ、　Ｊ、　等ｒ　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　７４：５５６４〜５５６８（１９７７）、とチトプラズム遺伝子。

Ｗａｔａｎａｂｅ＋　Ｔ、等＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　９５：５１１３〜５１７７　（１９７８）、の突然変異が得られ、そしてその細胞は胚形成において参加する能力を有することが証明せられた。

分化の間に遺伝子の発現の調節を探子することにおけるこのシステムの有効な応用は、Ｍｉｎｔｚ　＋　Ｂ、、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉ　−ａｔｉｏｎ　１３　：　２５〜２７（１９７９）に提供されているように正確に定義された遺伝子が、もし生来のまたは変形された形のいずれにおいても、知られている合併された連鎖によって、それらの生体内における進化に先立って全能のＴＣＣ細胞の中へ進化的に導入され得るならば大いに価値を高められよう。培養されたマウス細胞の中へのＤＮＡ仲介された遺伝子の転移は今やウィルスおよび選択可能な生化学的官能性に対するコードを有する細胞遺伝子について報告された。純粋化されたウィルス　チミジン　キナーゼ（ｔｋ：　ＡＴＣ：チミジン５′−ホスホトランスファラーゼ、ＥＣ２，７，１，２１）遺伝子は遺伝子転移のためのモデルシステムを提供し、Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ、等、Ｃｅ１ｌ　１１：２２３〜２３２（１９７７）、そしてチミジン　キナーゼに対するコードを有する細胞遺伝子のＤＮＡ −仲介された転移によって従われた。Ｗｉｇｌｅｒ２Ｍ、１等、Ｃｅ１ｌ　１４ニア２５〜７３１（１９７８）。ヒポキサンチン　ホスホリボシルトランスファラーゼ、　Ｗｒｌ　１ｅｃｋｅ　、　Ｋ、等、　Ｍｏ１ｅｃ−Ｇｅｎ−Ｇｅｎｔ。

１７０：１７９〜１８５（１９７９）：　Ｇｒａｆ、　Ｌ、Ｈ−等、Ｓｏｍａ　ｔ、　Ｃｅ　１１Ｇｅｎｅｔ、印刷中（１９７９）、アデニンホスホリボシルトランスファラーゼ、　Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ−等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

５ｃｉ−ＵＳＡ、　７６：１３７３〜１３７６（１９７９）ａおよびジハイドロフォレイト　リダクターゼ、　Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ９等、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、印刷中（１９８０）；　Ｌｅｗｉｓ、　Ｗ、　Ｈ−等。

Ｓｏｍａｔ、　Ｃｅ１１．　Ｇｅｎｅｔ、、印刷中（１９７９）　、この報告において、分枝されたヘルペス　シンプレックス（Ｈ８Ｖ）　ｆ　ミジン　キナーゼ遺伝子の人間β−グロビン遺伝子と共に突然変異種（ｔｋ−）テトラカルシノーマステム細胞の中への共変転が実証せられた○これら変転された細胞はマウスの中へ皮下接種することによってテストされた時、生産される腫瘍においてそれらの進化能力を保時し、そして生体内において多くの細胞世代にわたってウィルス−特定ｔｋ酵素的活性を示す。

ｔｋ−テトラト力ルシノーマ細胞の変転付属されるマウスＬｔｋ−細胞に対するＨ８Ｖチミジン　キナーゼ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡの添加は５　Ｘ　１０細胞あた。？　ＤＮＡの１００ｐｙあたり１つの集団の頻度でＨＡＴ中でＬｔｋ＋変転体を得る。同一の変転方法において、ｔｋ−テトラト力ルシノーマ細胞はきわたって低い変転効率を示した。三つの独立した実験の平均にもとすいて、一つの生残り集団は５×１０細胞あだシブラスミドＤＮＡの４μｇについて得られ、その値はＬｔｋ−細胞のそれの４から５オーダーの大きさ以下である。この比較的低い効率は該ＤＮＡがＴＣＣｔｋ−細胞にサスペンションとして添加せられた時に確認せられる。１３ａｍＨ１−限定されたｐｔｋ−ＩＤＮＡの１０μｇの７×１０細胞に対する添加はＨＡＴ中においてたった４つの変転を結果として起した。同一の変転条件では、Ｌｔｋ−Ｉ　ＤＮＡの１５μｇあたシ１０細胞あたり３Ｘ１０３ｔｋ集団を与えた。遺伝子の高濃度はかくしてこのテトラトカルシノーマ細胞系統において変転に影響することを要求されるが、けれども分枝されたＤＮＡの有用性は多くのｔｋ＋変転体が得られることを可能にする０変転されたテトラトカルシノーマ細胞におケルＨ８Ｖｔｋ活性の発現ＴＣＣクローンのｔｋ＋表現型がウィルスｔｋ遺伝子の発現に本当によるものかどうかを確かめるために、７つの集団が独立した培養地器から摘出され、テストのためにマス培養地の中で成長させられた。５つのクローンの活性は血清学的なそして２つのものは生化学的な手法によって特徴づけられた。ｔｋのヘルペス型抗原の識別は酵素活性を中和するためにＨ８Ｖ−ｔｋ−特定抗体の能力を検定することによって確かめられる。ｔｋ活性の９０％以上の阻害が事実抗体血清が選ばれた５つの変転されたクローンの各々の抽出物と反応する時、観測せられた。

変転された細胞抽出物の中和の後に残る低い残存活性はそれ自身ＨＡＴにおいて生き残ることを与えることが出来ないミトコンドリアのｔｋ活性を表わす。選択された他の二つのクローンからの細胞抽出物はマウスとＨ８Ｖ　ｔｋ酵素との著るしい相違のためにｔｋ電気泳動易動度についてテストされた。予期されたように、Ｔｃｃｔｋ一対照は活性の大きなピークを示さないのに反して該変転体は１つのクローンについてみられるように、Ｒｆのｏ、４５に移動するＨ８Ｖ　ｔｋの特徴あるピークを有する。

第１表変転体におけるヘルペス　チミジン　キナーゼの特定中和細胞　系統　前免疫血清による活性　抗血清による活性ＴＣＣｗｔ＊２．８　３．０　１０７．０ＴＣＣｔｋ−”　０．０５　０．０６　１００．０ＬＨＢ　２ｂ場　３．４　０，０６　２．０ＴＣＣｔｋ−１＠２．１　０，１７　８．０ＴＣＣｔｋ−３５，５０，４３８，０ＴＣＣｔｋ−４６，１０，１５２，５ＴＣＣｔｋ−５３，７０，２１６，０示された細胞系統からの相同体（Ｓ−３０）の３０，０００Ｘ１ｉ’上澄液が前免疫血清または抗血清とともに純粋化Ｈ８Ｖ−ｌｔｋに対して混合せられ、そしてｔｋ活性は材料と方法において記述させるように検定された０＊ＴＣＣｗｔはｔｋ＋（野生型）表現型をともなうマウステトラト力ルシノーマ供給体−独立細胞である。

＋ＴＣＣｔｋ−はＢｒｄ　Ｕｒｄ　に耐性を有しｔｋの欠如体である。

’％ＬＨＢ２ｂはヘルペス　チミジン　キナーゼ遺伝子によｐ　ｔｋ＋表現型に変転されたマウスＬｔｋ−細胞系統である。

ｆｉ　ＴＣＣｔｋ−Ｌ−３，−４および−５はヘルペス　チミジン　キナーゼ遺伝子による変転の後ＴＣＣｔｋ−から誘導されたＨＡＴ−耐性テトラトカルシノーマクローンである０変転されたテトラト力ルシノーマ細胞における遺伝子の物質的状態ウィルスｔｋ遺伝子断片の数と独立の変転体におけるこれら断片の位置はサザーンの汚染異種交配手法を用いて試験されたｏ　５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、　ＮＬ　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、＋９８：５０３〜５１７（１９７５）ｏ供与体ＤＮＡはＢａｍ　ＨＩによって完全に消化される組み換えプラスミド、ｐｔｋ−Ｉであった。このグラスミドはｐＢＲ３２２のテトラチクリン耐性遺伝子の中において単−Ｂａｍ　Ｈ１位置に挿入されるウィルスｔｋ遺伝子とともに３．４　ｋｂ断片を含んでいる。Ｂａｍ　−開裂されたｔｋ　ＤＮＡによる変転は３．４　ｋｂ断片の末端のＢａｍ位置の損失による統合を結果として起す。変転体からの高分子量ＤＮＡはＢａｍ　ＨＩによって開裂せられ、アガローズ　ゲル電気泳動によって分別せられ、そしてニトロセルロースフィルターに移された：該フィルターはそれから遷移翻訳された　Ｐ−ｔｋＤＮＡによってアニーリングされた。各々の細胞クローンにおいて、単一アニーリング断片がみられた；それ故に各々のクローンは少くとも１つのウィルス　ｔｋ遺伝子を含んでいる。予期されることではあるが、各々のクローンは３．４　ｋｂよりも大きな分子量のバンドに現われる。アニーリング断片の分子量は変転されたクローンによって異なり、結果は統合が夫々の変転体のＤＮＡの中において異なった位置で起ったことを示唆している。

培養地中の変転された表現型の安定性選択性のある圧力が存在しない状態の下で培養地の中で供与体ｔｋ遺伝子の発現を与えるＴＣＣ変転体の能力をテストするために、ＨＡＴ選択性のある媒体においてマス培養地の中で成長せられた個々のクローンは選択性のある試薬の存在しない状態の下で種々の期間にわたって副培養された。ｔｋ＋表現型を保持した細胞のフラクションは選択性および非選択性の媒体中で分校効率を測定することによって測定された。クローンによって広い相違が明らかとなった。（第２表）第２表、テトラト力ルシノーマ細胞中の変転された表現型の試験管内での安定性クローン　実験　選択性の　選択性の　ｔｋ＋の損の細胞系　ない媒体１　ない媒Ｃ失率世代ゝ列　中での世　中での相　当りの表代　対分枝効　現型率ＴＣＣｔｋ−１１２８０，４５２１５００，５０＜ｏ−ｏｏｔＴＣＣｔｋ−２１２８０，２３２１５００，０２０，０１７ＴＣＣｔｋ−３１２８０，４７２１５００，２７０，００２ＴＣＣｔｋ−４１２８０，２６２１５００，１６０，００３ＴＣＣｔｋ−５１２８０，１４２１５００，０１０，０２１＊　クローンは摘出され、そしてＨＡＴ選択性媒体において４０細胞世代にわたって成長させられた。細胞はそれから選択性および非選択性条件下でそれらの分析効率を測定するに先立ち非選択性媒体において２８またＩ′１１５０世代にわたって成長させられた。

１００の細胞がＨＡＴ選択性および非選択性媒体の中へ三重化して薄くかぶせられた。選択性媒体における相対分枝効率は選択性ある条件下の分校効率と選択性のない条件下の分枝効率との比（５０〜７０％）として定義される。

これら計算において、いかなる与−えられた細胞系統に対しても、ｔｋ表現型の損失の比率は各々の細胞世代において一定である世代あたりの損失の比率は方程式Ｆ’Ｍ（１−Ｘ）Ｎ−“十ＦＮ’から計算される。ここにＦＭは選択性媒体と非選択性媒体におけるＭ世代後の相対分枝効率、ＦＮはＮ世代にわたって同様に定義され、そしてＸは細胞世代あたシの損失比率である。

例えばＴＣＣｔｋ−１のような幾つかの細胞系統は比較的安定であり、非選択性媒体において世代あた１、１％より低い頻度でｔｋ＋表現型を損失する。他の安定性の小さい系統（ＴＣＣｔｋｌおよびＴＣＣｔｋ−５＞は選択性のない状態において世代あたり２％でｔｋ＋発現を損失する。

腫瘍中の組織分化の間に生体内におけるＨ８Ｕ　ｔｋ遺伝子の維持と発現選択性のない状態において生体内でＴＣＣ細胞分化の間、外部遺伝子の保持とその発現のより重要な問題が固体腫瘍において検討された。腫瘍は同じ５つの変転されたクローンの各々からの１０７の細胞とともに有性宿主（通常クローンあたり２つの宿主）に皮下的に接種することによって形成された。これら腫瘍からのＤＮＡは汚染異種交配によって分桁せられたｏ　ｔｋ酵素の無効化検定と電気泳動易動度試験はまたウィルス遺伝子の発現を識別するために行なわれた。加うるに、同じ腫瘍のサンプルは固定されそして分化の証拠のために組織学的に試験された。

ウィルスｔｋ遺伝子の限定断片プロフィールは遺伝子が分析されるすべての９つの腫瘍において保持されることを実証した。各々の腫瘍＜　ＨＡＴ選択性なくして成長させられる、）はその原種（ＨＡＴ選択性圧力下に培養された）の細胞系列と比較された時、７つの腫瘍におけるアニーリング断片の数と位置は推当する細胞系列のそれと同一であった。かくして導入されたｔｋ遺伝子は殆どの場合、有意な損失または転位なくして生体内に少くとも三週間の期間にわたって多くの細胞世代に維持された。

しかしながら二つの例では、原　ｔｋ−含有断片の損失と１００異なった分子量の新しい断片の出現とから結果として生じる遺伝子再配列が起った。これら二つの腫瘍は最高頻度で試験管内においてｔｋ＋表現型を損失する二つのＴＣＣクローンから生産されることは興味あることである。（第２表）Ｈ３Ｖ−ｔｋ−特定抗血清による無効化試験の結果は少くとも９つの腫ｆｌＪ　（ＴＣＣｔｋ−１クローンからの１つを含む）のうち３つがウィルス型ｔｋ活性を有していることを実証した。（腫瘍中の宿主細胞の存在は多分残余の場合において非無効化マウス　ｔｋの実質的な量に寄与する）。

ＴＣＣｔｋ−１系統から誘導された腫瘍の他の試料はまたＨ３Ｖ　ｔｋ活性に対して電気泳動的に分析された；ウィルス酵素を特徴づけるＲｆの０．４５で移転する他よシも優勢なピークが観察された。

腫瘍の各々からの組織学的標本は調製されそして試験された。ＴＣＣステム細胞に加えて腫瘍は、変転しない形のＴＣＣｗｔと原種のＴＣＣｔｋ−細胞系列からの腫瘍中の配列と同様な分化された組織の配列を含んでいた。筋肉神経組織、脂肪組織、ある種の骨、鱗状角質化エビチリウムそして他のエビテリア、導管、細管等が含まれる。

人間β−グロビン遺伝子によるテトラト力ルシノーマ細胞の共変転マウスＬの生化学的変転体は一般的な集合におけるよシは高い頻度で連結されていない選択可能遺伝子とともに、選択不能遺伝子を導入することが出来る有能な副集合を構成するであろうＯＷｌｇ　］、　ｅ　ｒ　ｒ　Ｍｏ等、ＣｅＨ１６：７７７〜７８５（１９７９）。共変転実験はそれ故に行われ、そしてそれにおいてヘルペス　ウィルスｔｋ遺伝子が選択可能マーカーとして用いられ、ｔｋ’　ＴＣＣ細胞中に人間β−グロビン遺伝子を導いた。β−グロビン遺伝子（プラスミドｐｈβ−８）を含む人間染色体ＤＮＡの分枝されたＨｉｎｄ　Ｉｆ限定エンドヌクレアーゼ断片は酵素Ｈｉｎｄ　ｍで開裂せられそしてＨｉｎｄ　ｍ−線状化されたｐｔｋ−１と混合された。ＴＣＣ細胞がこれらの遺伝子に曝露された後、それらはＨＡＴ選択性媒体において２週間成育せられそしてｔｋ＋変転体はクローンされそして人間β−グロビン系列の存在に対して汚染異種交配によって分析された。損傷されない人間β−グロビン遺伝子を含むＡ４．３ｋｂ　Ｂｇｌ　ｌ限定断片は供与体ｐＨ−８ダラスミドの中において全体物に含まれる。変転体からの高分子量ＤＮＡはそれ故に８ｇｌｌ酵素で開裂され、そしてアニーリング探子としての３２ｐ−ラベルされた４、３ｋｂ　Ｂｇｌ　ｌ断片を用いた汚染異種交配において分析される。

０２試験された１０のＴＣＣ変転体の２つにおいて、人間β−グロビン系列が検知された。変転体の一つは４．３　ｋｂＢｇｌｌ［断片の１つから３つを含む；それ故にこの細胞系列において、グロビン遺伝子は明らかに損傷されていない０人間 β−グロビン遺伝子を含んでいる他のＴＣＣ単離物は異常に高い分子量のアニーリング断片を陳列し、結果はＢｇｌｌ断片の中において開裂や統合が起ったことを示唆する。これらのデーターはｔｋ遺伝子の理解や発現に有能なこれらＴＣＣ細胞はまた他の非連結そして選択不能遺伝子を高頻度で統合することを実証する ○考　察初期のほにゆう類胎児の中に外部ＤＮＡを実験的に導入すること、そして進化の間の持続性および増殖がおよそ６年間にまず報告された。Ｊａｅｎｉｓｃｈ、　Ｒ，およびＭｉｎｔｚ。

Ｂ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　７１：１２５０〜１２５４（１９７４）。

純粋化された（非組み換え）　ＳＶ　４０ウィルスＤＮＡはマウス胚胞の中にミクロ注射された；それらは組織ＤＮＡ　７５ＥＳＶ　４０遺伝子系列を含む健康な成長マウスになっだ０例えばここに述べるような新しい技術は広い範囲の特定遺伝子が分化の間に遺伝子発現の調節の生体内分析のために胚のゲノームの中に併合されることを可能にするも０３のであろう。組み換えＤＮＡの出現によって、生来的にまたは特定的に変性された形における特殊な遺伝子の多量が得られることが出来る。生物学領域において、マウステトラトカルシノマスの悪性ステム細胞は本発明の新しい手段に寄与した。これらの細胞は培養地で成育せられ、特定の突然変異に対して選択せられ、そして胚胞中にミクロ注射され、そこでそれらのネオプラスチック性質を失わない進化にあずかる□　Ｄｅｗｅｙ、　Ｍ−等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ＋　７４：５５６４〜５５６８（１９７７）、Ｗａｔａｎａｂｅ。

Ｔ、１等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ、ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、＋　７５：５１１３−５１１７（１９７８）。培養されたＴＣＣ細胞はそれ故に予測される遺伝的変化をマウスに送るだめの乗物としてみられる０Ｍ１ｎｔｚ、　Ｂ、、　Ｂｒｏｏｋ　−ｈａｖｅｎ　Ｓｙｍｐ、＋　Ｂｉｏ・＋　２９：８２〜８５（１９７７）　；　Ｍｉｎｔｚ、　Ｂ、、　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　１３：２５〜２７（１９７９）。このような変化は明らかにＤＮＡの理解によって獲得せられた遺伝子を含む。

ＤＮＡ−仲介された遺伝子の繊維芽細胞系列の細胞への転移は培養地において達成せられた□　Ｗｉｇｌｅｒ、Ｍ、＋等。

Ｃｅ１ｌ　１１：２２３〜２３２（１９７７）；　Ｗｉｇｌｅｒ、Ｍ、＋　等、　Ｃｅ１１１４　ニア２５〜７３１　（１９７８）　；Ｗｉｌｌｅｃｋｅ、　Ｋ、、等＋　Ｍｏ１ｅｃ。

Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１７０：１７９〜１８５（１９７９）　；　Ｇｒａｆ、　Ｌ、　Ｈ，。

等、Ｓｏｍａｔ、Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、＋印刷中（１９７９）：　Ｗｉｇｌｅｚ＋１０４Ｍｌｌ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７６：１３７３〜１３７６（１９７９）；　Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｈ９，等＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃ　ｉ　、、印刷中（１９８０）　；Ｌｅｗｉｓ、　Ｗ、　Ｈ１等＋　Ｓｏｍａｔ。

Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、、印刷中（１９７９）　そしてテトラト力ルシノーマ系列によって同様な試みに対してここに基礎を提供した。胚の中へ遺伝子を転移するＴＣＣ−細胞ルートはＤＮＡの胚注射と比較して変転体、即ち特定な遺伝子が保持されている細胞クローンが識別せられそして選択または篩別によって単離されることが出来る。選択不能遺伝子の場合、選択可能なものとの共変転は比較的高頻度で起ることが見出されだｏ　Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ、、等、　Ｃｅ１ｌ　１６：７７７〜７８５（１９７９）。

現在の研究において、ｔｋ−テトラト力ルシノーマ細胞はへルベス　シンプレツクスの分枝されたチミジン　キナーゼ遺伝子によって処理され、いくつかのＨＡＴ−耐性ｔｋ＋クローンがＤＮＡの８ｇあたり約１つの変転体の頻度で得られたＯＬ−細胞変転体、　Ｗｉｇｌｅｒ＋　Ｍ、を等、’Ｃｅ１１１４ニア２５〜７３１　（１９７８）　、よりも可成シ低いＴＣＣ変転体の頻度の理由は真中核細胞中の変転体有能性に対する基礎が１だ未知のままであるから不明瞭である０ＴＣＣ変転体におけるｔｋ＋表現型の抜性原種はこれらｔｋ酵素のＨＳＶ−型電気泳動易動度によって、そしてまたＨＳＶ−１ｔｋに対して生ずる特定抗血清によるｔｋ活性の無効化によって実証せられた（第１表）。更に汚染交配試験はウィルスｔｋ遺伝子の少くとも１つの損われていないコピーが存在し、そして変転された細胞中の他のＤＮＡの中へ統合されることを示した。これらのデーターは変転されたクローンにおけるｔｋ活性が本当にウィルス遺伝子の存在と発現のせいと考えられる結論を支持する。

遺伝子の導入を含む実験に対する要求は多くの細胞世代の間選択法圧力が存在しない状態においてさえもそれらが生体内で安定に残ることにある。ｔｋ変転された表現型の安定性は培養地（第２表）のみならずマウスの中ヘステム細胞の皮下接種の後に生ずる腫瘍においても事実である。これらの腫瘍は変化しない親ＴＣＣ系列中に観察せられる範囲と同様に種々のタイプの組織分化を有する。各々の腫瘍を起源の変態せられた細胞系列と比較したハイブリッド化実験はドナーｔｋ遺伝子は試験された９個の腫瘍のうち７個において著るしい損失または再配列なくして維持されることを示す。

発展の背景における興味ある多くの遺伝子は選択可能ではない。一つの例はグロブリン遺伝子である。Ｌ−細胞による関連する実験、　Ｗｉｇｌｅｒ＋　Ｍ、等１１１　Ｃｅ１ｌ　１６：７７７〜７８５　（１９７９）におけるように完全な β−グロブリン遺伝子は結合されていないＨＳＶ　ｔｋ遺伝子と協力してＴＣＣｔｋ−細胞に対して処理された。このことはハイブリッド化の証拠から該ヒトβ −グロブリン遺伝子が存在することが分かるＴＣＣｔｋ＋クローンを得るだめの有効な方法であることを証明した。

それ故にここに記載される実験は培養されているＴＣＣステム細胞が外因性の遺伝子を受け入れることが出来ること、そしてこのような遺伝子は腫瘍において生体内の分化の間に表現されると同様に安定に保持されることが出来る。この基盤にもとづき、胚発生の間に遺伝子調節の分析のために適当な生体内マーカーを造り出す目的のために正倍数性ＴＣＣ細胞系列による実験が進められることが出来る。

実験の６つのシリーズ下記の実験がＲ４ｃｈａｒｄ　Ａｘｅｌ、　Ｄｉａｎｅ　Ｍ、Ｒｏｂｉｎｓ。

Ｉｎｂｏｋ　Ｐｅａｋ及びＰｅｔｅｒ　Ｈ，Ｓｅｅｂｕｒｇ　の共著によシ’　Ｔｈｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　ＧｒｏｗｔｈＨｏｒｍｏｒｅ　Ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｍｏｕｓｅ　Ｃｅ１ｌｓ’、なる題目で出版されている。

多くの遺伝子の転写活性化が多分調節分子と特定ＤＮＡ連鎖との相互作用を含むであろう。ステロイドホルモンは組織特定方法において遺伝子生産物の限定された組の表現を調節する□　Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ、　Ｒ，Ｄ、、　Ｃｅ１１４　：１８９−１９７（１９７５）：　Ｉｖａｒｉｅ、　Ｒ，Ｄ、及びＯ’Ｆａｒｒｅｌｌ、　Ｐ。

Ｈ８，Ｃｅ１ｌ　１３　：　４１　５５　（１９７８）ｏ　顕著な証拠がステロイドホルモンが蛋白質受容体と先ず会合しそしてその後直接に染色体上の接近し得るそして高度に特異的な位置と相互作用を行うＯＹａｍａｍｏｔｏ、　Ｋ、　Ｒ−及びＡｌｂｅｒｔｓ。

Ｂ、　Ｍ−＋　Ａｎｎｕａｌ　Ｒａｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４５　：　７２１ −７４６（１９７６）。

かくしてホルモンの結合と染色体の会合のいずれがか欠けている突然変異種グルココルチコイド受容体を有する細胞はもはやグルココルチコイドによっては調節されないＯＹａｍａｍｏｔｏ＋　Ｋ−Ｒ−Ｔ等、　ＰＮＡＳ　７１　：３９０１〜３９０５（１９７４）。

利用出来るデータと矛盾しないホルモン作用の単一モデルはステロイド受容体複合体と適当なりＮＡ連鎖との相互作用は転写を向上させることを予想させる。このモデルを支持する直接な証拠はない。この問題はそれ故に実験的に近つき易い点において詳しく調べられて来ている。

ホルモン誘導に対する敏感さをそれらに与える誘引遺伝子についての特定連鎖は存在するのが？　ホルモン受容体複合体に対する高い親和性を示す誘引遺伝子についての特定連鎖は存在するのか９　そして最後にいかに受容体とＤＮＡとの相互作用は転写活性化を導びくのが？細胞の中へホルモン的応答を示す遺伝子を導入することは誘導能力が個々のヌクレオチド連鎖に本来備わっている性質であるかどうかを測定するための実験システムを提供する。このようにして結局マウス乳腺腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ）遺伝子＋　）（３’ｎｅｓ＋　Ｎ−Ｅ、ｒ等、ＰＮＡＳ　７８　：２０３８〜２０４２（１９８１）；　Ｂｕｅｔｔｉ、　Ｅ、及びＤｉｇｇｅｌｍａｎｎ　。

Ｈ−、Ｃｅ１ｌ　２３　：　３３５〜３４５　（１９８１）　、　と同様にラットα−２μグロブリン遺伝子はグルココルチコイドに対して異種構造的受容体の中への変転を惹起す応答を示すものとなる０更に、ＭＭＴＶの促進体要素のシバイドロアオレートリダクターゼをコード化している構造遺伝子に融合することはこの遺伝子をグルココルチコイドによる誘引を可能にする。　Ｌｅｅ、　Ｆ、等、　Ｎａｔｕｒｅ　２９４　：　２２８〜２３２（１９８１）。

この研究において、ねずみ斜動物の繊維芽細胞の中へ導入されるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子の表現が研究された。を推動物においては成長ホルモン合成は脳下垂体線に限定されている。脳下垂体細胞の培養において、グルココルチコイドまたはチロイドホルモンのいずれががＧＨｍ　ＲＮＡの水準において１０倍の増加を示し、両方共添加した場合は１０倍の誘導が観察されるｒ　Ｍｑｒｔｉａｌ。

Ｊ、Ａ、、等、　ＰＮＡＳ　７４　：　１８１６〜１８２０（１９７７）；Ｔｕｓｈｊｎｓｋｉ　。

Ｒ，Ｊ、、等、、　ＰＮＡＳ　７４　：　２３５７〜２３６１　（１９７７）。

ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子の１から２０のコピーを官能性クルコ＝＋ルチコイド受容体を表現するチミジン　キナーゼが欠けだ（ｔｋ−）ねずみ斜動物繊維芽細胞の中へ導入するためには共変転が用いられて来た＋　Ｌｉｐｐｒｎａｎ＋　Ｍ、　Ｅ。

及びＴｈｏｍｐｓｏｎ、　Ｅ、　Ｂ−、Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ＋　２４９　：　２４８３〜２４８８（１９７４）ｏホルモンをこれら共変転された細胞に供与することはｈＧＨｍ　ＲＮＡの２，５から５倍の誘導及び選択された成長ホルモン蛋白質においてこれら細胞系列の半分以上の同様な誘導を結果として生ずる。

誘導に対して応答するＤＮＡ連鎖は転写を開始すると推定されている位置が側面に並んだＤＮＡの５００のヌクレオチドの中に存する。このＤＮＡのセグメントのｔｋ構造遺伝子への融合はホルモン作用に対するｔｋ遺伝子応答を与える。

結果マウス細胞中のヒト成長ホルモンの調整された表現ヒト成長ホルモン遺伝子は各々重要な連鎖相同関係を共有し、たぶん各々共通の先祖からの分岐によって生じたであろう少なくとも５つの遺伝子からなる小さい重複遺伝子のファミリーの一員である。　Ｎ１ａｌｌ、　Ｈ，Ｄｌ等。

ＰＮＡＳ　６８　：　８６６〜８７０（１９７０）、　ＤｅＮｏｔｏ、Ｆ、Ｍ、、等。

Ｎｕｃｌ−Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９：　３７１９〜３７３０（１９８１）ｏ　これらの遺伝子のうちの２つは分岐して２つの別個のホルモン、繊毛模性ソマトマモトロピンとプロラクチンを生ずることは意味あることである。ｈＧＨ連鎖を含んでいるいくらかの異なった組み換えファージはシャロンファージス４Ａ中に組み立てられるヒトＤＮＡのライブラリーから単離された。　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、等、　Ｃｅ１ｌ　１５　：　６８７〜７０１（１９７８）Ｏλ２０Ａとλ２Ｃを示す２つの異なったファージは２．６ｋｂ　Ｅｃｏ　ＲＩ断片（第３図）の中に完全な生成ホルモン遺伝子を含んでいる。λ２ＯＡから誘導されたこのＥｃｏＲＩ断片の完全なヌクレオチド連鎖はこの断片が側面に並んでいる５００５’と５２５３’に沿った完全なｈＧＨ遺伝子を含むことを示す。λ２Ｃの２．６　ｋｂ　Ｅｃｏ　ＲＩ断片の限定地図はλ２ＯＡのそれと全く同一である。

第１ブロツクに隣接する５’ＥｃｏＲＩ倍置からＢａｍ　Ｈ１位置までのλ２Ｃの部分連鎖分析（第１図）はλ２ＯＡのそれと同一である。

成長ホルモンの主要形態をおそらくコード化しているであろうλ２０Ａとλ２Ｃはこれらの研究において利用されるＯマウスＬｔｋ−細胞は官能性グルココルチコイド受容体を表現する。　Ｌｉｐｐｍａｎ、　Ｍ、　Ｅ、とＴｈｏｍｐｓｏｎ、　、　Ｅ−Ｂ−、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ　２４９　：　２４８３〜２４８８（１９７４）ｏウィルスｔｋ遺伝子は組み換えファ一ジλ２０Ａ及びλ２ＣからのＤＮＡを、ＤＮＡ− 仲介遺伝子変転によってこの細胞系列の中へ導入するだめの選択可能なマーカーとして利用されて来た。　Ｇｒａｈａｍ＋　Ｆ、　Ｌ、及びｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ＋　Ａ、　Ｊ−＋Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２　：　４５６〜４６７（１９７３）；　Ｗｉｇｌｅｒ、Ｍ、、等、　Ｃｅ１ｌ　１６：７７７〜７８５（１９７９）。

共変転はプロットハイブリッド化によって確認−され、５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、　Ｍ、　、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

９８　：　５０３〜５１７（１９７５）、そして外生的ヒト生成ホルモン連鎖の表現を調整する能力に対して試験された。ＤＮＡはＥｃｏ　ＲＩに対する酵素によって限定されるｔｋ及びｈＧＨＤＮＡへの共変転の結果得られた９個の共食転体から単離され、そして高度放射性ｈＧＨプローブを利用したプロットハイブリッド化によって分析された。該６個の共食転体のうちの３個がｈＧＨ遺伝子を含む少なくとも１つの完全なＥｃｏ断片を統合するλ２ＣＤＮＡに対して曝露された。３個の共食転体のうち共１個が完全な遺伝子を含むλ２ＯＡ　ＤＮＡに対して曝露された。これら系列におけるｈＧＨコピ一番号は一定しない。いくらかの系列は単一の統合された断片を含み、他の系列はｈＧＨＤＮＡの１０〜２０のコピーを含んでいる。

これら共食転体はそれから成長ホルモンｍＲＮＡの表現を調整するための能力に対して試験された。ポリＡ”　ＲＮＡが１０−６Ｍデキサツタシンの存在もしくは不存在下において４８〜７２時間培養された細胞から単離された。これらＲＮＡ試料のノーザーンブロノト分析は２つの細胞系列が８２５　ｂｐ　ｍＲＮＡ相同体をｈＧＨＲＮＡに統合することを示し、ｈＧＨｍ　ＲＮＡにおいて３〜４倍の増加がグルココルチコイドの添加の結果観察される。これら２つの誘引可能な細胞系列は２つの異なったクローンの各々による共変転から誘導する。他の細胞系７１Ｊは構成要素である８２５ｂｐ種と３ｋｂ種を統合し、デキサメタシンによる誘引は観察されない。より大きな転写の原因は知られておらずそして異常な開始、停止または継ぎ合わせのいずれかに反映するであろう。

成長ホルモンｍＲＮＡは第４系列においては検出出来ない。マウスとヒトの成長ホルモンの間には充分な相同性が存在し２て低下した感度にもかかわらずこれら細胞系中のねずみ科動物の表現を検出する。完全なｈＧＨ系列を含まないＴｋ＋変転体は誘引の前後のいずれかで検出可能なＧＨＲＮＡを合成しない。かくして繊維芽細胞は内因性マウスＧＨｍ　ＲＮＡの感知出来るほどの水準を合成しない。

ｈＧＨｒｒ＋ＲＮＡのより容量的測定はドツトグロノティングによるＲＮＡ混系におけるｈＧＨ連鎖の滴定友よって得られた。標進曲線はヒト脳−；垂体ＲＮＡの量の増加によ−）て最初発生する。もし放射性ドツトが計数されるならば、脳下垂体標準は少なくともｍＲＮＡ　Ｇ”）　１刀１ら５１）Ｏｐｇまでは直線を保つ。この検定は高度な再生徒を証明しそして全細胞ＲＮＡの２５ｔｔｇ中の特定化ｈＧＨｒｒ＋ＲＮＡの１ｐｇを数時間・９放射線曝露において検出することを可能ならしめる。この分析の結果はノーザーンプロンティングによって得られるより小さい量の表示を確実にする。二つのクロールはグルココルチコイドに対する応答において適当にり、ＧＨＲＮＡを調整しそして夫々完全誘引状態において細胞に対してｍＲＮＡの約１２５および２５のコピーを表現する（第３表をみよ）。

調整要素の位置決定先の実験はＤＮＡの側面に並ぶ５′および３′のいくらがのキロベースに沿っているｈＧＨを含むλクローンによって遂行される。遺伝子応答をグルココルチコイド作用に与えるために必要である最小のヌクレオチド連鎖を測定することが望ましい。最初の実験において、２．６ｋｂ　Ｅｃ。

ＲＩ断片はプラスミド、　ｐＢＲ３２５の中ヘサブクローン化され、そしてＬｔｋ−細胞の中へ導入される。】１のｔｋ＋変転体が得られた、プロットハイブリッド化によるこれら細胞系列からのＤＮＡの分析は１１のｔｋ＋コロニーのうちの９個が完全なｈＧＨＥｃｏ　ＲＩ断片の１から２０のコピーから統合された。

これらのゲルにおいて、内生的ねずみ科動物のｈＧＨ遺伝子はコントロールＬｔｋ−と変転された細胞ＤＮＡに存在するいくらかかすかな高分子量ＥｃｏＲＩ断片としてみられることが出来る。

全ＲＮＡはこれら変転体から調整せられそしてドントプロノティングによってｈＧＨＲＮＡの存在に対してスクリーンされた。９個の共食転体のうちの７個がｈＧＨＲＮＡを表現する。ポリＡ＋ＲＮＡはそれから５個のクローンから調整されそしてノーザーンブロノト分析によって試験された。

これらの系列はゲルコニｔルチコイドの付加によって誘引可能にされるヒト脳下垂体転写体と共に転移する８２５ｂｐｈＧＨｍＲＮＡを合成する。これらの系列のいくらかにおいて、誘引可能なｈＧＨｍＲＮＡは対になって現われるが、一方より大きな転写の原因は不明確であり、ＧＨ３細胞中のラットＧＨｍ　ＲＮＡ中の同じような対は異なったポリアデニル化によるものである。誘引の範囲のみならずｈＧＨｍｌＲＮＡの水準は具なった細胞系列の間で異なっている。

いくらかの系列は３倍訪引を示し、その奮；のものは誘引の中間水準を示す。大体の関係は生成されるｒｒ、ＲＮＡ０量１５と変転される細胞ＤＮＡの中へ統合されるｈＧＨコピーの数との間に存在する。

このようにして多分ｍＲＮＡの最小量を合成するであろう系列はおそらく只１個もしくは数個の遺伝子を統合したであろう。更にｈＧＨが欠けているコントロール変転体は検出可能なヒトまたはマウスＧＨｍＲＮＡを表現することが出来ない。例え只１個の単一完全ｈＧＨ遺伝子が染色体の中へ統合されているとしてもこれら共食転体はグルココルチコイドに曝露することによってＧＨｍ　ＲＮＡの向上された水準を表現するという観察は誘引のために要求される情報が２．６ｋｂ　Ｅｃｏ　ＲＩ断片の中に存在していることを強く示唆する。それ故に、ホルモン調節は受容細胞中の先住するホルモンに応答する位置の中にｈＧＨＤＮＡを統合することがら単に生ずるものではなさそうである。

ホルモン誘引は応答遺伝子についてのヌクレオチド連鎖の性質であると見られる。それ故に他の共変転されていた遺伝子の誘引はグルココルチコイドによっては正常に調整されないことが予想される。以前にｈＧＨ連鎖に対して試験されたＲＮＡがノーザーンプロノト分析を受けそしてこれら細胞系列におけるｔｌ、：遺伝子表現の誘引に対する試験のために高度な放射性ｔｋプローブに４！されるコントロール試験が行われた。より芋〈気イ１がルるように、これらの共変転ばＧＨｍ　ＲＮＡの表現に対して誘引可能であった。これに反して、これら細胞は誘引前後で水準を一定に保つ別個な１３および０．９ｋｂ　ｔｋ　ｍＲＮＡ転写を表現する（以下をみよ）。それ故にグルココルチコイド誘引能は変転された要素全部の性質ではなくてｈＧＨ遺伝子に固有なものである。

成長ホルモン蛋白質の誘引本発明の変転体の中に存在する成長ホルモンｍＲＮＡ連鎖が選択された成長ホルモンポリペプチドの合成を指揮するかどうかがその後調査された。この方法においては、ｍＲＮＡの誘導の水準が選択された蛋白質の水準における均合いのとれた誘引によって反映されるかどうかが測定出来る。細胞調節とｈＧＨ遺伝子を含む変転体がホルモンの存在下または不存在下に培地を代えることなくして５日間培養された。該培地はその後抗体被覆フィルターディスクを用いて放射性免疫検定においてｈＧＥに対する試験が行われた。第３表に示すように、ｈＧＨｍＲＮＡの重要な水準を示す細胞系列はまた組織培養培地の中へｈＧＨの顕著な量を分泌する。ｈＧＨの最大分泌はシリーズの中でｍＲＮＡの高水準も存在する細胞系列９によって観察された。この細胞系列はホルモンの不存在下において約１５μ ｑ／ｌおよび完全に誘引された状態で６０μｇ／ｌ　ｈＧＨを合成した。かくして、ｈＧＨｍＲＮＡの水準における誘導は分泌された蛋白質の水準において相伴う誘引を惹起す。

ｈＧＨ−ｔｋ融合遺伝子の調整ホルモン誘引に応答するｈＧＥ連鎖エレメントが、他の構造遺伝子と融合された時ホルモン感受性を与えることが出来るかどうかが調査された。２．６ｋｂ　Ｅｃｏ　ＲＩ断片の表現がマウス細胞においてホルモン的に調整される。これに対して共変転されたｔｋ遺伝子表現はグルココルチコイドによっては調整されない。ｈＧＨの５′側面に並ぶ連鎖とｔｋをコード化する構造連鎖からなる融合遺伝子はそれ故にこの形状においてｔｋ遺伝子がグルココルチコイド誘引に対して応答するかどうかを感知するだめに組み立てられた。ＥｃｏＲＩ位置からＢａｍＨ１位置に広がるｈＧＥ　ＤＮＡの５′側面に並ぶ領域、５′未翻訳領域の中への３つのヌクレオチドは、ｔｋＤＮＡの断片と結紮せしめられ、そしてそれは翻訳が始まる位置からさかのぼってｔｋメツセージ６０ヌクレオチドの５′未翻訳領域において始する。このｔｋ断片は完全な構造遺伝子を含んでいるが、しかしすべての本質的な促進体要素が欠けている。ＭｃＫｎｉｇｈｔ、　Ｓ、　Ｌｌ等、　Ｃｅ１ｌ　２５　：　３８５〜３９８（１９８１）。

１８かくして融合遺伝子はＬｔｋ−細胞の中へ導入せられそしてｐｏｌｙ　Ａ＋はその後得られたｔｋ＋変転体から単離される。ノーザーンプロノト分析でのｔｋ　ＲＮＡのパターンは複雑である。

野生型ｔｋ遺伝子を含む変転体は屡々１．３と０９にｋｂの２つのｔｋ　ｍ　ＲＮＡ転写を表現する。１．３　ｋｂ　ＲＮＡはいつも完全なｔｋ遺伝子を含んでいる変転体中に表現されそして野生型酵素をコード化する。０．９　ｋｂ転写はｔｋ構造遺伝子連鎖のみからなりそして少なくされた活性の切りつめられた蛋白質をコード化するｔｋ遺伝子に対して内部で開始する。ｈＧＥ　−ｔｋ融合遺伝子を含む３つのｔｋ＋変転体はｔｋ　ＲＮＡの２つの種を現わす。もしｈＧＨ促進体が開始を適当に指揮するならば、ｈＧＨ遺伝子から誘導された３つの５′ヌクレオチドと残りはウィルスｔｋ遺伝子によってコード化されたものとからなる鎖長の中に融合転写１．２５　ｋｂが存在することが予想される。これら細胞中のより大きいＲＮＡ０サイズは融合転写と一致する。

０．９　ｋｂ　ＲＮＡはたぶん異常ｔｋ転写を表わすであろう。

該融合遺伝子を含む３つの変転体の２つにおいて、より大きな転写がグリココルチコイド供与の結果誘引され得ることが観察される。内部ｔｋ促進体から生ぜしめられる０、９　ｋｂ転写は１つの偶発性の内部調節を提供する。

１９ＲＮＡ水準の誘引は融合転写に対してのみ観察され、０．９ｋｂがグルココルチコイド投与に応答せずに残る。誘引に対して応答する連鎖はｈＧＨ遺伝子の５′ 末端の側面に並んでいる５００のヌクレオチドの中に存する。この要素の他の構造遺伝子への融合はこれら連鎖のホルモン的応答を与える。

検討ヒト成長ホルモン遺伝子を含む組み換えクローンをマウス繊維芽細胞の中へ導入することは共食転体の半分以上におけるｈＧＨｍＲＮＡの調整された表現を結果として得る。これらの結果はＭＭＴＶに関する同様な研究。

Ｈ３’ｎｅｓ、　Ｎ、　Ｅ、、ｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　７８：２０３８〜２０４２（１９８１）　：　Ｂｕｅｔｔｉ、　Ｅ、及びＤｉｇｇｅｌｍａｎｎ、　Ｈ，、Ｃｅ１１２３：３３５−３４５　（１９８１）　；Ｌｅｅ、　Ｆ、、ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ２９４：２２８〜２３２　（１９８１）　；Ｈｕａｎｇ、　Ａ、　Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｅ１ｌ　２７：２４５〜２５５　（１９８１）　；Ｕｃｋｅｒ、Ｄ、　Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｅ１ｌ　２７：２５７〜２６６　（１９８１）及びｔｈｅ　ａ−２ｇグロブリン遺伝子、　Ｋｕｒｔｚ、　Ｄ、　Ｔ、　、　Ｎａｔｕｒｅ　２９１　：　６２９−６３１（１９８１）、と共に連鎖要素がホルモン的応答を与えないために充分であるこれらクローン化遺伝子の中に存することを示している。１つのこのような要素はｈＧＨの５′側面に並ぶＤＮＡの中に含まれそしてホルモン的応答を行なうようになる他の構造遺伝子に融合されることが出来る。

これらの結果は観察される誘引がＲＮＡ安定化よりもむしろ転写活性化にもとづくものであることを示唆している。第１に該ｈＧＨ−ｔｋ融合は多分非常に少ない５’　ｈＧＨヌクレオチドを有する誘引可能ｍＲＮＡ　’ｚ生じ、ＲＮＡの残シはｔｋ酵素をコード化する。調節細胞において、原生ｔｋ　ｍ　ＲＮＡはホルモンによっては誘引されない。ｈＧＩ（の短かいセグメントが連鎖またはソー７から独立したｍ　ＲＮＡの残存長さに安定性を与えることは殆んどありそうにもないと考えられる。第２に構成している成熟したｈＧＨｍ　ＲＮＡ　を合成するｈＧＨ変転体は識別されている。

もし誘引が安定化からのみの結果として生ずるならば、ｈＧＨＲＮＡ’を合成してホルモンの存在下に高められた水準を表現するすべての変転体が予想されるであろう。これらの結果はｍＲＮＡ　ｆ誘引プロセスにおける寄与因子として除外もしなければ転写水準調節が誘引の唯一の検出物であることを主張もしない。該データは５′側面に並ぶＤＮＡの５００　ｂｐ　に存在する要素が遺伝子にホルモンに対する応答性を与えるに充分であり、そしてこの要素が転写を強めるための操作を行なうことは最もありそうなことであることを示している。これはゲルココｌレチコイド誘引可能遺伝子に対〜でより直接の転写に一致しているＯ　Ｒｉｎｇｏｌｄ、　Ｇ、Ｍ−等、、ＰＮＡＳ　７４：２８７９−２８８３（１９７７）。

転写の速度を調節している調整要素が構造遺伝子に非常に接近する５’　ＤＮＡ中に存在する証拠がいく゛らかの遺伝子に対して蓄積されている。かくして、ＭＭＴＶ　（Ｌｅｅ　。

Ｆ、等、Ｎａｔｕｒｅ　２９４：２２８〜２３２　（１９８１））；α−２μクロプリン；　ｈＧＨ；　ｔｋ　（Ｍｃｋｎｉｇｈｔ、　Ｓ、　Ｌ、等Ｃｅ１ｌ　２５：３８５−３９８　（１９８１）　；マウヌグロビ：／　（Ｃｈａ□、　Ｍ、等、、原稿準備中）；メタロチオネイン（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ、　Ｒ，Ｌ、等。

Ｃｅ１ｌ　２７：２２３−２３１　（１９８１））；およびショウジヨウバエ熱衝撃（Ｃｏｒｃｅｓ　、Ｖ、等、　ＰＮＡＳ　７８ニア０３８〜７０４２（１９８１））遺伝子は１．ｋｂｔたはそれ以下の５′側面に並ぶＤＮＡを有する広く様々なる誘引試薬に対する応答性を保有する。このような要素が局部的にそれらの効力を行使することおよび長い距離にわたって情報を伝達しないことは不可能である。ｈＧＨ−ｔｋ融合遺伝子は２つのｍＲＮＡを生ずる。１つはＧＨ連鎖の中へ導入されると予想される１、２５〜１．３　ｋｂ　ＲＮＡそして２番目は約３００のヌクレオチドをさかのぼったｔｋ槽構造遺伝子中導入される０、９ｋｂ種である。しかしながらこのｍ　ＲＮＡの５′末端は詳しくは定義されていない。ただより長いＲＮＡがホルモン的に２２誘引可能であり、ｈＧＨ調整要素が転写を活性化するために局部的に作用しそして閉鎖の瀕度には僅かしかまたは全く影響しないが始期にはさかのほることを示唆している。この議論は融合遺伝子を表現する細胞系列が遺伝子の複合コピーを統合したと云う事実によって抑えられる。

それ故に、より小さい転写はホルモン作用に応答しない一！まになっている遺伝子からのみ誘導される。

１つの著しい観察は繊維芽細胞中の内生ネズミ科動物ＧＨがグルココルチコイドの存在または不存在下において不活性である間に新らしく導入されたｈＧＨ遺伝子がｍＲＮＡと蛋白質の意義のある水準を表現すると云うことである。ＧＨ合或は脳下垂体に限られており、そして繊維芽細胞によって物理的には決して表現されないので、受容細胞中で何故に新らしく導入されたＧＨ遺伝子が働らくのかを考えさせられる。コントロール繊維芽細胞は内生ＧＨｍＲＮＡの意義のある水漁を合成しないけれどもネズミ科動物遺伝子が外生ＧＨ遺伝子を表現する変転体において活性であるかどうかは知られていない。しかしながら、類似のシステムにおいて、マウス繊維芽細胞中ノ外生ラットα−２μグロブリン遺伝子のホルモン的誘引は内生マウス遺伝子の活性化と関連しない。、　Ｋｕｒｚ　Ｄ。

Ｔ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２９１：６２９−６３１　（１９８１）。

２３一つのパターンは細胞中への外生遺伝子の単なる導入はそれらの表現を保証するために充分であることを示唆している遺伝子変転実験から現われて来る。かくして細胞の中へ導入された時、クロプリンを含むいくつかの遺伝子が、Ｍａｎｔｅｉ　、　Ｎ−＋等、、　Ｎａｔｕｒｅ　２８１：４Ｏ−４４（１９７９）　；Ｃｈａｏ、　Ｍ−、等、、ＰＮＡＳ　７８：２０３８−２０４２（１９８１）、内生対遺伝子が転写的に沈黙している間にＲＮＡの意義ある量を合成する。更にもし適当な調節信号が受容細胞中に存在しているならば、新らしく導入された遺伝子の表現は適当に調整されるであろう。受容体を含むネズミ斜動物繊維芽細胞中の外生ｈＧＨ遺伝子はｍＲＮＡの誘引可能な水準を表現する。最後に、非脳下垂体組織における内生ＧＨ連鎖の表現はほとんど観察されない。

それ故に遺伝子変転の研究は正常の発育の間の遺伝子表現の研究と共に遺伝子活性の少なくとも３つの状態。

゛オフ′、゛オン′そして゛被調整′を定義する。グルココルチコイド受容被合体の単なる存在は非脳下垂体細胞中の内生ＧＨ遺伝子に対して明らかなことであるが、′″ｏｆｆ’ｏｆｆ’状態伝子を活性化するには不充分である。この状態の推持は多分内生遺伝子の染色***置を反映するかまたはその代わ）に細胞分化を介して自−永存しているこの遺伝子に関する以前の発育の過程から得られるであろう。機構が’ｏｆｆ”状態の維持に対して応答性を有しようとも、それは５７７５作用として現われ、内生遺伝子がｏｆｆ’である細胞の中へ導入される単一外生遺伝子が調整された様式で作用することが出来る。変転された遺伝子はそれ故に細胞の発育の歴史から見のがされそして直ちに’ＯＮ’状態、適当な調整体に接近し得る状態を形成する。この状態では、遺伝子はもし適当な調節要素が細胞の中に存在するならば遺伝子は調整されるであろう。調整された状態はそれ故にヌテロイドホルモンー受容体複合体のようなゞトランス′作用をする因子を含む。

第　３　表マウス細胞中のｈＧＨｍＲＮＡと蛋白質の容量分析 λＧＨ−Ｉ　−２９１２６４，８５，０＋　１４０１　１２５　１９．０ λＧＨ−Ａ　−３０３１，ＯＮ、Ｄ。

＋３８３ｗｔＧＨｌ　−５８５２，５Ｎ−Ｄ。

＋１４６　１３ｗｔＧＨ４−１１４７１０２１，７１９，０＋２０５４　１８３　６６．０ｗｔＧＨ９−４８７４３３，０１８，４＋１４５５　１２９　６６．０ｗｔＧＨ−１１−７１６２，６Ｎ、Ｄ。

＋　１８５　７第３表の説明ａ、各々の試料のｐｏｌｙ　Ａ＋ＲＮＡの３〜５の濃度を含むドノトグロノトからの測定。

ｂ、０．５　ｐｇ　ｐｏ　ｌｙＡ”　ＲＮＡ／細胞とｌｋｂの平均ｍＲＮＡサイズと仮定して２　Ｘ　１０５ｍＲＮＡ分子／Ｌ細胞が存在する０ｍＲＮＡの約２０チがｈＧＨであるヒト脳下垂体ＲＮＡのドツトプロッティングによって導ひかれる標準曲線から、４５０　ｃｐｍ　／’１１００ｎの脳下垂体ＲＮＡ　、または、２．２５　ｃ　ｐｍ／　ｐｇ　ｈＧＨｍＲＮＡが存在する。すべてのｃｐｍは同じ標準曲線に対して常態にされた。

Ｃ１不ガチブコントロールが２．５ｎｇ／ｘｌである放射線免疫検定から、Ｎ、Ｄ、−（検出されない。）材料と方法細胞培養Ｌｔｋりｏ　−７］）の誘導体、Ｌｔｋ　ａｐｒｔ、　Ｋｉｔ、Ｓ−等、。

Ｅｓｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、　３１　：　２９１−３１２（１９６３）、は１０％仔牛血清（７０−ラボラトリーズ、ロックビル、メリーランド）と５０μｇ／１ｐｔｌのジアミノプリン（ＤＡＰ）を含むズルベノコの変性イーグルの媒体（ＤＭＥ　）の中に養なわれた。

変転に先立って、細胞は洗浄され、ＤＡＰの存在しない状態で３世代にわたって成育せられた。変性されたジハイドロフォレイト　リダクターゼ（メトトレキセイトに対する耐性を与えられた）　Ａ２９　ＭｔｘＲｌＮを含むチャイニーズハムスター細胞系、　Ｆｌｉｎｔｏｆｆ、　Ｗ、Ｆ、、等、＋　ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２　：　２４５〜２６１（１９７６）、は３Ｘ−非選択性アミノ酸、　１０％仔牛血清、および１μｇ　／Ｊｌｌアメトプテリンを補充されたＤＭＥで繁殖せられた。増幅実験のために、媒体は更に２０μｇ／ｍｌのメトトレキセイトを補充された。

ねずみ類Ｌｔｋ−ａｐｒｔ−細胞はＬｔｋ−りｏ　−７］）細胞のアテニン　ホスホリボシルトランスファラーゼ−陰性誘導体である。細胞は成育媒体中で養なわれ、Ｗｉｇｌｅｒ　。

１２８Ｍ、９等、、　ＰＮＡＳ　７６：　１３７３〜１３７６（１９７９）　に記述されたように変転に対して準備された。

ＨＥｐ　−２（人間）　、　ＨｅＬａ　（人間）　、　ＣＨＯ（チャイニーズ　ハムスター卵巣）、およびＬｔｋ−細胞は成育媒体の中で成育された。ＬＨ２ｂ、ヘルペス単純ウィルスｔｋＤＮＡで変転されたＬｔｋ−の誘導体は１５μｇ／屑ｌでヒポキサンチン、０．２μ（１／ｘｌでアミノグチリン、そして５．０μ ｇ／１ｔｔｌでチミジンを含む成育媒体（ＨＡＴ　）　＋　Ｗｉｇ　ｌ　ｅ　ｒ＋　Ｍ−＋等−，Ｃｅ１ｌ　１　：　２２．３−２３２（１９７７）、中にて養なわれた。

すべての培養地器はヌンクロン（パンガード　インターナショナル、ネプチューン、Ｎ、Ｊ、）プラスチックであった０ＯＴＴ　６０５０移殖系統の腫瘍から得られた供給体独立マウス　テトラトカルシーノーマ細胞培養物系統６０５０Ｐ。

Ｗａｔａｎａｂｅ、＋　Ｔ、＋　等、、ＰＮＡＳ　７５　：５１１３〜５１１７（１９７８）。

は野生型、またはｔｋ＋親として用いられ、そしてここにＴＣＣｗｔ、と命名される。この系統はＸ１０性染色°体型の、Ｗａｔａｎａｂｅ　、　Ｔ５１等、、　（１９７８）に記述される特性を有する３９染色体の様式番号を持つ。該細胞は１０％の胎児仔牛血清の入ったズルベノコの変性イーグルの媒体中で成育せられた。３μｆｌ／１ｔｔｌの突然変異を起すＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロングアニジンに対して３時間の曝露の後、細胞は２週間回復せられそしてそれから８０μｇ／　ｚｌのＢｒｄＵｒｄの入った媒体に移された。一連の耐性クローンが単離され、本変転実験において用いられるクローン系統（ＴＣＣｔｋｌが供給された。この系統は１０−８以下の野生型への隔世遺伝頻度を有する。変転に先立って、細胞はＢｒｄＵｒｄの３０μｑ／ｍｌの入った媒体中で養われ、洗浄せられ、そして該医薬の存在しない状態において三世代にわたって成育せられた。変転効率はマウスＬ−細胞（Ｌｔｋ−）のｔｋ−欠如系統のそれ、Ｋｉｔ、Ｓｌ等。

Ｅｘｐ、　Ｃｅ１１．　Ｒｅｓ、３１：　２９７〜３１２（１９６３）、と比較された。

ゲノームＤＮＡの抽出と限定エンドヌクレアーゼ開裂高分子量のＤＮＡは培養された細胞（ＣＨＯ、ＬＨ２ｂ　、およびＨｅＬａ）から、または先に述べたように、Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ、＋等、、　Ｃｅ１ｌ　１４ニア２５〜７３０１９７８）、凍結されたラビット肝臓から得られた。高分子量鮭***ＤＮＡはウォーシントンから得られた。限定エンドヌクレアーゼ開裂（Ｂａｍｌ。

Ｈｉｎｄ　ｌ、　Ｋｐｎ　Ｉ　＋およびＸｂａｌ）は５０　ｍＭ　ＮａＣｎ　、　１０　ｍＭトリス−ＨＣＩ　、　５ｍＭ　ＭｇＣｌ１２．７ｍＭメルカプトエタノ−・ル、および牛の血清アルブミンを１００μｆ／／ｍｌ　テ含ｉｙバッファー（ｐＨ７，９）において行なわれた。酵素対ＤＮＡ比率は少なくともＤＮＡの２単位／μｇであり、反応混合物は３７℃で少なくとも２時間熟成せられた。

消化の完了をモニターするために、１１１１の遷移翻訳されたアデノウィルス− ２〔Ｐ″］ＤＮＡが反応体積の５μｌで少くとも２時間熟成され、開裂生成物は１％アガロ−ズゲル中での電気泳動によって分離され、そして消化はクロネノクス２ＤＣＸＭフィルムに乾燥ゲルを感光されることによってモニターされた。

ＣＶ−１−感染された細胞から、先に述べたように損傷１、テイナイヘルペス　ン／フレックス　ウィルス（Ｈ８ｖ）ＤＮＡが単離された、Ｐｅ１ｌｉｃｅｒ、　Ａ−＋等、、　Ｃｅ１ｌ　１４：１３３〜１４１．（１９７８）ｏ　ＤＮＡは６　ｍＭ　トリス（ｐＨ７゜９）、６ｍＭＭｇＣ１２、６ｍＭ　２−メルカプトエタノール、６　ｍＭ　ＮａＣｌおよび２００μｇ／肩ｌ牛の血清アルブミンを含むバッファーにおいてＫｐｎ　Ｉ　にューイングランド、バイオラボ）によって消化された。限定されたＤＮＡは０．５％アガロ−ズゲル（１７Ｘ　２０　Ｘ　Ｏ，５ｚ　）を介り、て２４時間、７０ＶＴ電気泳動によって分別され、そして５．１ｋｂのｔｋ−含有断片がＭａｘａｍ　＋　Ａ−Ｍ−および　Ｇ　ＩＩ　ｂｅｒｔ　、　Ｍ、　ＰＮＡＳ　７４　：５６０〜５６４（１９７７）、およびＷ＋ｇｌｅｒ＋　Ｍ、ｒ等、、　Ｃｅ１ｌ　１４ニア２５−７３１（１９７８）によって述べられているようにゲルから抽出された。

φＸ　１７４　ａｒｎ　３　ＲＦｆ　ＤＮＡはベテスダ　リサーチ　ラボラトリーズから購入された。プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡはＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１中で成育せられ、Ｃｌｅｗｅｌｌ、Ｄ。

Ｂ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１１０　：　６６７〜６７６（１９７２）の方法によって純粋化せられた。λシャロン４Ａ誘導体（ＲβＧ）中の分枝されたラビットβ巨大グロビン遺伝子は識別され、先に述べたようにして単離された。Ｍａｎｉａｔｉｓ　＋　Ｔ−。

等、、Ｃｅ１ｌ　１５：　６８７〜７０１（１９７８）。

増幅実験において、高分子量ＤＮＡの寸法はへルベスシンフーレノクス　ウィルスＤＮＡ　、！：マーカートＬ、てそのＸｂａｌ断片を用いて０．３％アガ］− スゲル中で電気泳動によって測定された。平均寸法が７５ｋｂよりも大きなりＮＡのみが増幅実験において変転能力を持っていることが見出された。この実験において、プラスミドＤＮＡは３００μｌｊ／ｍｌエチジウム　ブロマイドを含むＣｓＣｌこう配において同比重的遠心分離によってクロラムフェニコール増幅された培養物から単離された。

変転および選択変転調書はＧｒａｈａｍ＋　Ｆ−Ｌ、およびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ａ、　Ｊ、。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　５２：４５６〜４５７（１９７３）において述べられたように、以下の改変をともなう。変転の１日前に、細胞は皿あだシ０．７Ｘ１０６　細胞で植付けられた。変転の４寺−１３２間前に媒体（ｄ変更された０　１ｍＭ　トリス（ｐｎ　７．９　）１０．１　ｍＭＥＤＴＡにおいて溶解された無菌の、エタノール沈澱された高分子量捷たは限定エンドヌクレアーゼ−開裂された真中核ＤＮＡは４０　μｇ／ｄ　でＤＮＡ　％および２５０　ｍＭ　ＣａＣ＃２を含むＤＮＡ　／　ＣａＣ＃２　（マリンクロト）を調整するために用いられた。２倍に濃縮されたヘペス緩衝化された含塩物＋２ＸＨＢＳ）が調整された。それは２８０　ｍＭ　ＮａＣｌ、　５０ｍＭヘペス、および１．５ｍＭ燐酸ンーダ、を含むＩ）Ｈ７，１０±００５に調節された。ＤＮＡ／Ｃａｃ１２溶液は無菌２　Ｘ　ＨＢＳの同量に満願された。線栓のついだ１−一の無菌プラスチック　ピペットが２ＸＨＢＳを含む混合管の中へ挿入され、ＤＮＡが添加されている間吹込みによって気泡が導入された。燐酸カルシウム／ＤＮＡ沈澱物は室温で３０〜４５分で攪拌なしで形成せしめられる。沈澱物はそれからプラスチック　ピペットにそっととられることによって混合さ扛、そして皿あたり１．ｗ７の沈澱物が直接に受入細胞を覆っている成育媒体の１０１１！ｌに添加された０３７℃で４時間熟成の後、媒体は置き換えられ、そして該細胞は更に２０時間、熟成される。その時、選択性圧力が及ぼされる。ｔｋ＋選択に対しては、媒体はＨＡＴを含む成育媒体に変えられる。ａｐｒｔ＋選択に対しては、細胞はトリプシン化され、低密度で（１０−ｃｍ皿あたり約０．５〆１０　細胞）０．０５ｍＭアザセリンと０．１ｍＭ　アデニンを含む媒体中に置換せられた。ｔｋ＋およびａｐｒｔ＋選択の両方に対しては、選択性媒体はその次の日、２日後、そして次いで変転体クローンが生じている２〜３週間にわたって３日毎に変えられた。集団は分枝シリンダーを用いて摘出され、そして集団の残りはホルムアルデノ・イド固定とジエムサでの染色の後記録された。特徴づけに対しては、クローンは続いて選択性圧力下にマス培養地の中で成育させられた。記録は単離された各々のクローンに対して二倍になった細胞のみかけの数について保持された。

Ｌｔｋ−ａｐｒｔ−細胞のメトトレキセイト耐性変転体はＡ２９Ｍｔｘ”細胞からの高分子量ＤＮＡによる変転および１０％仔牛血清と０．２μｇ／ｙｔｌ　アミノプテリンを含むＤＭＥにおける選択の後に得られたＯｔｋ＋選択に対しては、細胞はメトトレキセイトに対する耐性のために、ＨＡＴ媒体中で成育せられ、細胞はメトトレキセイトの０１μｇ／肩７を補充された媒体中で選択された。集団は各々の変転体が独立の出来事から起ることを確信するため個別の皿から分枝された。Ａ２９　ＤＮＡと線状化ｐＢＲ３２２ＤＮＡとの結紮体は供給者によって推められた条件の下にＳａｌ　ｌ−開裂されたＤＮＡとＴ４リガーゼ（ベセスダ　リサーチ　ラボラトリーズ）との１＝１比（ｗ／ｗ）を熟成することによって調整された。燐酸カルシウム沈澱は２μｇの結紮体と１８μｇの担体／耐を用いて調整せられ、そして受入体細胞に添加された（結紮体の量はプラスミドが変転を阻害すると云う観察のだめに限定される）。該ＤＮＡは該細胞と４〜１２時間接続を保たれ、そして媒体はそれから吸入せられそして新らしいＤＭＥに置き換えられた。選択性圧力は２４時間及ぼされ、次いでＤＮＡに対して曝露された。２〜３週間後に、集団は分校シリンダーを用いて単離された。

マウステトラト力ルシノーマ細胞実験において、変転はＴＣＣｔｋ−細胞が変転１日前に３×１０５細胞／皿で接種されたことを除いては前に述べたと同様に変転が行われた。付着細胞の各々の皿に対して、４μｇの再結合プラスミドで調整せられた燐酸カルシウム／ＤＮＡ沈澱物、Ｌｔｋ−ａｐｒ　ｔ−細胞から得られた高分子量ＤＮＡの２０μｇの存在下Ｂａｍ　Ｈｌで消化されたＰｔｋ−１が添加された。

加うるに、いくらかの細胞はサスペンションで処理された。　Ｗｉｌｌｅｃｋｅ、　Ｋ−ｒ等、、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１７０　：１７９〜１８５（１９７９）、　７Ｘ１０６の新しくトリプシン化されたＴＣＣｔｋ− 細胞はＢａｍＨｌ−開裂されたプラスミドＰｔｋ　−１からのＤＮＡｌ０μｇおよび鮭***からの高分子量ＤＮＡの１５０μｇで調整された燐酸カルシウム／ＤＮＡ沈澱物と混合されたＯ　Ｗｉｌ　１ｅｃｋｅ　＋　Ｋ−＋等（１９７７）において述べられたように遠心分離、再懸濁、そして振盪の後に細胞は成育媒体中に再び薄く覆われた。３日後に、媒体はＨＡＴ媒体に置き換えられ、変転体の集団は２週間後に単離された。

共食転実験は染色体成人β−グロビン遺伝子を含むＨｉｎｄ　ＩＩ　−開裂されたグラスミドｐＨβ−８の４μｇと共にＢａｍ　）？１−消化されたＰｔｋ　− Ｉ　ＤＮＡの４ｔｔｆ／で行われた。

Ｌａｗｎ　、　Ｒ，Ｍ−＋等０．　Ｃｅ１ｌ　１５：１１５７〜１１７４　（１９７８）、Ｔｋ＋変転体は０．１ｍＭヒポキサンチン１０．４μＭアミノプテリン／１６μＭチミジン（Ｉ（ＡＴ　）を含む成育媒体の中で選択された。集団は分枝シリンダーで摘出され、マス培養地の中で成育された。

定義されたＤＮＡ連鎖とＨ８Ｖｔｋ遺伝子の共食転Ｌｔｋ−ａｐｒ　ｔ−マウス細胞は１〜１０μｇのφ１７４．ＩＱ　のｐＢＲ３２２または１μｇのＲβＧ− ＩＤＮＡのいずれかによって１μｇのＨ８Ｖ　−１遺伝子と１０〜２０μｇの鮭 ***担体ＤＮＡとの存在下で先に述べたように、Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ、、等、、　ＰＮＡＳ７６　：１３７３〜１３７６（１９７９）変転された。

Ｔｋ　変転体はヒボキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ）と１０％の仔牛血清を含むＤＭＥにおいて選択された。単離された集団は分枝シリンダーを用いて摘出されそしてマス培養地の中で成育された。

酵素検定抽出物は０５％トライトンＸ−１００を含む０．１ｇ？の０．０２Ｍ燐酸カリウム、ｐＨ７，の中に洗滌した細胞粒（約１０７細胞）を再懸濁することによって得られた。７００×ｇ遠心分離の２５分後に得られた上澄ｉ（チトプラズム）は酵素活性の定量と電気泳動のために用いられた。ａｐｒｔおよび蛋白質は先に述べられたように検定された。

Ｃｈａｓｉｎ　、　Ｌ、　Ａ、、　Ｃｅ１ｌ　２　：　３７〜４１（１９７４Ｌ　該反応混合物中における３ｍＭチミジン　トリホスフェイト、５′−ヌクレオチダーゼの阻害物質＋　Ｍｕｒｒａ）’＋　Ａ、　Ｗ、　オ、１：　ヒＦｒ１ｅｄｒｉｃｈｓ＋　Ｂ、＋　Ｂｉｏｃｈｅｍ＋　Ｊ、　１１１　：　８３〜８９　（１９６９）＋の含有は甚回復を増加せず、そしてそれはヌクレオチダーゼがａｐｒｔ　活性の測定を妨害していないことを示す○ａｐｒｔの導電収束は本質的にヒポキサンチン　ホスホリポシルトランスフアーゼ、に対して述べられた、Ｃｈａｓｉｎ。

Ｌ、　Ａ、およびＵｒｌａｕｂ＋　Ｇ、、Ｓｏｍａｔ−Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、　２　：　４５３〜４６７　（１９７６）、ように次の例外とともに行われたりアムホリン（ＬＫＢ　）混合液の０８％ｐＨ２，５〜４．０．８％ｐＩ（４〜６．および０．４％　ｐＨ５〜・７を含むポリアクリルアマイドゲル。酵素活性を検定するために、（２−３Ｈ）アデニン（０，０４ｍＭ　、　Ｉ　Ｃｉ／ｍｍｏ　ｌ　、　−”−ニーイングランド核（Ｉ　Ｃｉ＝０３．７Ｘ１０　ベク）／ｌ／））がヒポキサンチンに対して置換された。

チミジン　キナーゼ活性の検定特定活性測定のために、単層培養物からの細胞は燐酸バッファー血清の中へ削落され洗浄せられた。細胞粒は５容量の抽出バッフｙ　−（０，ＯＩＭ　）リスφ ＨＣｌ、　ｐＨ７，５゜０、ＯＬＭ　ＫＣｌ２．１ｍＭ　ＭｇＣ１２，１ｍＭ　２　・メルカプトエタノール、および５０ＭＭチミジン）の中へ懸濁された。該細胞サスペンションは３回凍結および溶解せられそしてＭＣＩ濃度はそれからＯ，１５Ｍに調節された。音波をかけた後、チトプラズム抽出物は３０．０００× ｇ　３０分の遠心分離によって得られ、そして上澄液はＷｉｇｌｅｒｌＭ　＋等。

Ｃｅ１ｌ　１６：７７７〜７８５　（１９７９）、において述べられたようにｔｋ検定のために用いられた。腫瘍からのチトプラズム抽出物はポッターーエルベシェーム　ホモジナイザー中で細胞の崩壊の後に得られた。それらはそれから培養された細胞に対して上に述べたように処理された。チミジン　キナーゼの一単位は分あたり１ナノモｌしのチミン３８ンをチミシンモノホヌフエイトに転換する酵素の量トシて定義される。

酵素無効化研究において、抗−Ｈ８Ｖ−１ｔｋ抗−血清または前免疫血清がチトプラズム抽出物の等量と混合され、そしてＡＴＰとマグネシウムが６．７ｍＭに添加された。

該酵素抗体混合物は室温で３０分熟成され、２０００ｘｐ。

１０分遠心分離され、その上澄液はｔｋ活性のために検定せられた。

更なる生化学的検定において、細胞培養物から、および固形腫瘍からの相同体の３０　、　ＯＯＯｘｇ上澄液が１．６πｍ薄に裁断した５チポリアクリ／レアマイト、ゲル上で電気泳動され、そしてＬｅｅ、　Ｌ、　Ｓ、およびＣｈｅｎｇ、　Ｙ、　Ｃ，、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５１：２６００−２６０４　（１９７６）に述べられたようにしてｔｋ活性に対して検定された。

ＲＮＡ単離全ＲＮＡハｐＨ５，１のフェノール、フェノール／クロロ＊、ルム／　イソｙ　ミ／ｌ／７　／Ｌ／：１−／ｌ／　（２５：２４−１．ＶＯ１／ｖｏｌ　）。

オヨヒクロロホルム／イソアミルア！レコール（２４：１゜ＶＯＩ／ＶＯＩ　）によ−コて連続的に抽出を行なうことによって変転ｌΣれ７化り細胞の対数的な相培養物から単離された。

エタノール沈澱の後、該ＲＮＡはＤＮアーゼで消化されたＯ３９Ｍａｘｗｅｌｌ＋　１．　Ｈ，、等、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、４：２４１〜２４６　（１９７７）　そしてエタノールで沈澱された。核とチトフラスムフラクションはＷｉｇｌｅｒ、　Ｍ、　、等、、ＰＮＡＳ７６：１３７３〜１３７６　（１９７９）　に述べられたと同様に単離され、そしてＲＮＡが上記のようにして抽出された。チトプラズム　ポリアデニル化ＲＮＡがオリゴ゛（ｄＴ）−ｔ！／レローズ　クロマトグラフィーによって単離された。Ａｘｅｌ。

Ｒ１１等Ｃｅ１ｌ　７：２４７−２５４　（１９７６）。

ｃＤＮＡ合成ラビットとマウスのｃＤＮＡがＭｙｅｒｓ、　Ｊ、Ｃ，およびＳｐｉｅｇｅｌｍａｎ、　Ｓ−、ＰＮＡＳ　７５：５３２９〜５３３３　（１９７８）に記載のようにしてアビアン　ミエロプラストシヌ　ウィルス　リバース　トランスプリグターセ（ＲＮＡ−依存ＤＮＡ　ポリメラーゼ）を用いて得られた。

変転細胞ＤＮＡの単離細胞はＰＢＳ中に剥脱されて収穫せられそして１０００Ｘｆ１０分間遠心分離する。粒子はＴＮＥ（１０ｍＭ）リス−Ｈ（Ｊ（ｐＨ８，０）、　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、　１０ｍＭ　ＥＣＴ罰、の４０容量に再懸濁され、そしてＳＤＳおよび −°ローテイナーゼに≠１夫々０２％および１００μｇ／／ＩＩＩ！添加された。該リセイｌは３７°Ｃ９５〜１０時間熟成され、そしてそれからバッファー飽和フェノールとＣＨＣｌ３で連続的に抽出される。高分子量ＤＮＡが該水性相と２容量の冷エタノールとを混合し、そして直ちに形成された沈澱を取出すことによって単離された。

該ＤＮＡは７０％エタノールで洗浄されそして１ｍＭ）リヌ。

０、Ｉ　ＥＤＴＡに溶解せられた。

クローンφＸ４とφＸ５からの核とチトプラズムがＲｉｎｇｏｌｄ、　Ｇ、　Ｍ、、等、Ｃｅ１ｌ　１０：１９〜２６　（１９７７）に述べられていると同様に得られた。核フラクションは、更にＨｉｒｔ、　Ｂ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　２６−３６５〜３６９　（１９６７）に述べられたと同様に高分子量と低分子量のＤＮＡに分別された。

ＤＮＡフィルター異種交配細胞ＤＮＡは限定エンドヌクレアーゼで消化せられ、アガロース　ヌラプゲルで電気泳動せられ、ニトロセルロース　フィルターシート上に移され、そしてＷｉｇｌｅｒ。

Ｍ、１等、、　ＰＮＡＳ　７６：１３７３〜１３７６に述べられたと同様に３２Ｐ−ラベ／Ｌ’　ＤＮＡ探子で異種交配せられた。

変転細胞からのＤＮＡは供給者にューイングランドバイオラボまたはベセスダ　リサーチ　ラボラトリーズ）によって特定せられた条件を用いて種々な限定エンドヌクレアーゼによって分解せられた。分解は１．５　Ｕ／μｆの酵素対ＤＮＡ比で３７°Ｃ２時間行われた。反応はＥＤＴＡの添加によって終結せられ、そして生成物は３６ｍＭ　）　’Ｊス、　３０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，７）中で水平アガローヌ　ヌラブ　ゲル上で電気泳動された。

ＤＮＡ断片はニトロセルロース　シートに移され、異種交配せられそして前に述べた方法と二つの改変された方法によって洗浄された□　Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ、　Ｒ，、等、、　ＰＮＡＳ　７５：１２９９〜１３０３　（１９７８）。二つのニトロセルロース　フィルターが転移の間用いられた。Ｊｅｆｆｒｅｙｓ、　Ａ、Ｊ、およびＦｌａｖｅｌｌ、　Ｒ，Ａ、、　Ｃｅ１ｌ　１２：１０９７〜１１０８　（１９７７）；低位フィルターは捨てられ、次いで異種交配され、該フ、（ｌレターは２　Ｘ　ＳＳＣ，２５ｍＭ燐酸ソーダ、１．５ｍＭＮａ４Ｐ２Ｏ７，０，０５％ＳＤＳにおいて４回２０分間洗浄せられ、そしてそれから１−１および１：５に希釈したこのバッフ７−において連続的に洗浄せられた。Ｊｅｆｆｒｅｙｓ、　Ａ。

Ｊ、およびＦｌａｖｅｌｌ、　Ｒ，Ａ、、Ｃｅ１ｌ　１２：４２９−４３９　（１９７７）・増幅実験において、探子は３２ｐ−遷移翻訳されたＰＢＲ３２２またはｐｄｈｆｒ−２１、マウヌｄｈｆｒ　ｍＲＮＡのｃＤＮＡ：ｌピーのいずれかであった□　Ｃｈａｎｇ　、　Ａ−Ｃ−Ｙ−ｒ等、、Ｎａｔｕｒｅ　２７５：６１７〜６２４　（１９７８）４２溶液異種交配３２ｐ−ラベルされたグロビ７　ｃＤＮＡ（２−９Ｘ１０８ＣＰｒｒＶｔｔｙの特定活性）が０．４Ｍ　ＮａＣ１／２５ｍＭ　１　、４−ピベラシンジェタンメルホニツクアシド（Ｐｉｐｅｓ　）、　ｐＨ６，５７５ｍＭＥＤＴＡ中で７５° Ｃにおいて過剰のＲＮＡと異種交配された。

熟成時間は７０時間を超えない。ＲｏｔｓがＲＮＡヌクレオチドのモ）ｖ　／　リッター／時間。時間は秒、として計算された。異種交配において単−糸状ヌクレアーゼＳ１に対する耐性が与えられたｃＤＮＡのフラクションは記載すれたと同様に測定されたｏ　Ａｘｅｌ、　Ｒ，等、、　Ｃｅ１ｌ　７：２４７〜２５４　（１９７６）。

ＲＮＡフィルター異種交配ＲＮＡはＢａ１ｌｅｙ、　Ｊ、　およびＤａｖｉｄｓｏｎ、　Ｎ、、　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ　７０ニア５〜８５　（１９７６）によって記載されたと同様に５ｍＭメチル水銀ハイドロオキサイドを含む１チアガローズ　ゲ）ｖ（１７×２０×０．４備）を通して電気泳動された。

各々の溝におけるＲＮＡの濃度は０．５μｙ／μｌであった。電気泳動は室温でｌｌ０Ｖ、１２時間であった。

Ａｌｗｉｎｅ、　Ｊ−Ｃ−等、、ＰＮＡＳ　７４：５３５０〜５３５４　（１９７９）（で述べられたと同様にしてＲＮＡはｐＨ４，０クエン酸塩転移バツフアーを用いてジアゾ化セルロース　ペーパーニ該ゲルから移された。転移の後、該ＲＮＡフィルターは担体ＲＮＡを５００μｇ／ｙｘｌ含む転移バッファーで１時間熟成された。フィルター上のＲＮＡは３２ｐ−遷移翻訳によって特定活性の２２−８Ｘ１０８Ｃｐ／μダにラベルされた分枝ＤＮＡ探子の５０　ｔｔｙ　Ａｌで異種交配され、Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ、　Ｒ，＋等、、ＰＮＡＳ７５　：１２９９〜１３０３　（１９７８）、反応容量はフィルターの２５μｌ／Ｃ１ｉであった。異種交配は４Ｘ標準血清クエン酸塩（０，１５Ｍ　ＮａＣＩＶｏ、０１５Ｍクエン酸ソーダ）１５０％ホルムアミド中で５７°Ｃ９３６〜４６時間であった。

異種交配の後、フィルターは２種類の２Ｘ標準血清ク工ン酸／２５ｍＭ燐酸ソーダ／　１．５ｍＭピロ燐酸ソーダ１０１％　ドデシルヌルホン酸ソーダ１５ｍＭＥＤＴＡ中に３７°Ｃ３０分間振盪しつつ浸漬してフォルムアミドを除去した。

連続的な洗浄はＩＸと５ｍＭＥＤＴＡと０．１％ドデシルスルホン酸ソーダを含む０．ＩＸ標準血清クエン酸塩にて６８°Ｃ９各々３０分間であった。

変転されたマウヌＬ細胞におけるラビノ）β−グロビンのパーク　シャープ分析ＪＨｌｊ［配はｓｏ％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド（イーストマン）１０．４Ｍ　Ｐｉｐｅｓ、　ｐＨ６，５１０，１ｍＭ　ＥＤＴＡｌｏ、４Ｍ　ＮａＣ１中でＣａ５ｅｙ＋　Ｊ、およびＤａｖｉｄｓｏｎ、Ｎ、、　Ｎｕｃｉｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、　４　：１５３９〜１５５２（１９７７）　；　Ｂｅｒｋ、　Ａ、　Ｊ、および５ｈａｒｐ、　Ｐ、　Ａ、、　Ｃｅ１ｌ　１２ニア２１〜７３２　（１９７７）、　１８時間、　１．８　ｋｂｐ　Ｈｈａ　Ｉ断片に対しては５１°Ｃ，Ｐｓｔ１断片に対しては４９°Ｃで行われた。該異種交配はＳ１ヌクレアーゼで処理され、そして本質的にＢｅｒｋ、　Ａ、　Ｊ、および５ｈａｐ、　Ｐ、　Ａ、　（１９７７）に述べられた方法によって分析された。

細胞培養：ホルモンの誘引ねずみ斜動物ＬｔｋＭＩ胞は１０　％コウシ血清（Ｍ、　Ａ。

Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ　）によって補われるドゥルベコの改良イーグル培地（ＤＭＥ）中に維持された。Ｔｋ＋変転体は選択され−ｔＬでＤＭＦ、１０％コウシ血清、１５μｇ／ｌｌヒポキサンチン、１　ｐｇ／ｍｌ　アミノプテリン、５１ｔｙ／ｒｌ　チミジン（ＨＡＴ）、Ｗｉｇｌｅｒ、　ＲＬ等、Ｃｅ１ｌ　１１：２２３−２３２　（１９７７）中に維持された。

ホルモンの誘引のために、１０　Ｍデキサメタシン（シグマ）が４８から７２時間副融合性細胞培地に添加された。初期の実験においては、１０−７Ｍチロイドホ）Ｖモン（トリョウドーＬ−チロシン、シグマ）が含まれた。しかしながらｈＧＨのグルココルチコイド誘引には追加の効力を持たないので（血清からのＴ３の除去の後でさえも）、後続の実験からは省かれた。コウシ血清は誘引されない細胞集団のために木炭処理によりステロイドから除去された。Ｋａｔｏ、　Ｔ、およびＨｏｒｔｏｎ、　Ｒ，Ｊ、、　Ｃｌ１ｎＥｎｄｏｃｒｊｎｏ１．　Ｍｅｔａｂ、　２８：１１６０〜１１７０　（ｉ９６８）、全血ｌ１たは除去された血清において培養された細胞のｈＧＨｍＲＮＡにおける検出可能な相違は存在しなかった（デキサメタシンの追加なしで）。

成長ホルモン遺伝子によるＬｔｋ−細胞の変転Ｌｔｋ−細胞は１　ｎｇ　ｐｔｋおよび１　ｉｔｙ　ｈｇＨλクローンＤＮＡ捷たはｈＧＨプラヌミドＤＮＡ／１０６の細胞によって前記されたと同様に変転される。ＧＨ−ｔｋ融合遺伝子による変転において、５〜１０　ｎｇのプラスミドが１０６の細胞に対して用いられた。この組み立ての変転効率はｐｔｋよりも約１０倍低いものであった。

ｈＧＨ実験のためのサザーングロットハイプリント化細胞ＤＮＡは２μヌクレア一ゼ／μｇによって２時間分解された。試料は４０ｍＭ）リス、４ｍＭ酢酸ソーダ、１ｍＭＥＤＴＡＸｐＨ７，９中ノｏ、ｓ％７　Ｈｏ−Ｘ）ｙ’　７Ｌ／　（２（Ｊｔｔｇ　ＤＮＡ／スロット）上で電気泳動された。ＤＮＡ断片はニトロセルロースに移された、５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、　Ｍ、　、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

９８：５０３〜５１３　（１９７３）、そして該フィルターはハイブリット化され、洗滌され、そして前記されたようにＸ線フィルムに拍出された、Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ、　Ｒ，等ＰＮＡＳ７５：１２９９−１３０３　（１９７８）：Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ、等Ｃｅ１ｌ　１６：７７７〜７８５　（１９７９）。ｈＧＨ遺伝子に対するＤＮＡプローブば２．６　ｋｂ　Ｅｃｏ　ＲＩ断片であり、３２Ｐデオキシヌクレオチドトリホ７フエイトによって０．５〜１．０　Ｘ　１９９ｃｐｍ／μダの固有活性に遷移翻訳された、Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ、　Ｒ１等ＰＮＡＳ７５：１２９９〜１３０３　（１９７８）。

ｈＧＨ実験のためのノーザンプロノトハイブリッド化全細胞ＲＮＡはグアニジンチオシアナートと熱フェノール抽出を用いて調整された。ｐｏｌｙ　Ａ選択ばＡｖｉｖ、　Ｈ。

およびＬｅｄｅｒ、　Ｐ、　ＰＮＡＳ　６９：１４０８−１４１２　（１９７２）によって記述されたき同様に行われた。ヒト脳下垂体ＲＮＡＩｄ−り−ｙニシンハイドロクロライド方法によって調整せられた、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、　Ｊ、　Ｍ、等Ｂｉｏｃｈｅｒｎ、　１８　：　５２９４〜５２９９（１９７９）。ＲＮＡはアガローズホルムアルデヒドゲル上に展開され、Ｌｅｈｒａｃｈ、　Ｈ，等Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６　：　４７４：３〜４７５１　（１９７７）、　（−してニトロセルロース上ニブロットされ、そしてＧｏｌｄｂｅｒｇ、　Ｄ、　ＰＮＡＳ　７７　：５７９４−５７９８（１９８０）によって記載された条件「でハイブリット化される。

ｈＧＨＲＮＡのドツトプロット定量分析Ｌ　細胞中のｈＧＨｒｎＲＮＡはミニホー／Ｌド濾過マニホールド（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよび５ｃｈｕｅｌｌ　）　ｋ用いてドツトプロットにより定量された。試料は２５μＬの全量中２　Ｘ　ＳＳＣ中２０ｇＲＮＡ（固有ＲＮＡプラヌ担体リボす−゛ムＲＮＡ　）の全量を含んでおり真空にすることなくして載置された。

ニトロセルロースに対する最適の結合のために該フィルターは少くとも５時間２ＯＸ　ＳＳＣ中に浸漬した。載置後、真空が適用され個々のウェル６　Ｘ　ＳＳＣにょ９３回ススぎ洗いされた。フィルターはその後焼かれそしてノーザンブロノトに関するかぎりでは正確にハイブリッド化された。ドツトはＸ線フィルムに対して露出させることによって視覚化されそして信号はドツトを打ち出しそして液体シンチレーション計数することによって定量分析された。

本開示は本発明に関してすべての本質的な情報を記載するものではあるけれど゛も、ここに引用される多くの刊行物は本発明および技術の様相の背景を理解することにおいて助けとなるであろう。したがって引用された刊行物のすべてはここに本開示の中（て参照として編入される。

真中該細胞の共食転所望の物質（例えば゛インターフェロン、インシュリン笥）変転マウス細胞からのｐＢＲ救出芹　の第４　図手続補正書（方式）昭和５９年６月２２日ＩＰＣＴ／ＵＳ　８３１０１２４０事件との関係　特許出願人住　所　名古屋市瑞穂区弥富町月見ケ丘３２番地６、　補正により増加する発明の数７、補正の対象国際ユ□ウ　１ｉｉｌＧ５９−５０１５３３　（４３）１ｎ＋ｐｒｉａｂａｎａｌＡｏｏｌｉｎｉｌｉｏｎＮ６．ＰＣτ／１Ｉｓｌ’ｌ’ｌ／ｎ１７４０第１頁の続き

Claims

【特許請求の範囲】１、実生核細胞を外部ＤＮＡ　Ｉと誘引可能な促進体ＤＮＡ　Ｉを含むＤＮＡ分子で共変転すること、それの代シに該実生核細胞によって表現されない選択可能な表現型に対するコードを有する結合されていない外部ＤＮＡ…で共変転することからなり、該共変転は該選択可能な表現型を獲得した実生核細胞の生存をもたらすかまたはそれを識別する適当な条件下で行なわれ、該外部ＤＮＡは該実生核細胞の染色体ＤＮＡの中へ取り入れられることを特徴とする外部ＤＮＡ　Ｉを適当な実生核細胞の中へ挿入する過程。２　［請求の範囲ｌ、１による過程において、該外部ＤＮＡＩは選択可能な表現型に関連していない蛋白質様物質に対するコードを有する。３、「請求の範囲２．」による方法において、該外部ＤＮＡ１はインターフェロンの蛋白質部分に対するコードを有する。４、「請求の範囲２」による過程において、該外部、ＤＮＡ４９１はインシュリンに対するコードを有する。５、「請求の範囲２．」による過程において、該外部ＤＮＡ１はヒト成長ホルモンに対するコードを有する。６　「請求の範囲２．」による過程において、該外部ＤＮＡ１はウシ成長ホルモンに対するコードを有する。７、「請求の範囲２」による過程において、該外部ＤＮＡ１は凝固因子に対するコードを有する。８、「請求の範囲２、」による過程において、該外部ＤＮＡ１はウィルス抗原または抗体に対するコードを有する。９　「請求の範囲２．」による過程において、該外部ＤＮＡＩは酵素に対するコードを有する。１０、「請求の範囲１．１による過程において、該外部ＤＮＡＩは実質的に純粋化されている。１１、「請求の範囲１．」による方法において、該ＤＮＡ　Ｉ　又はＤＮＡ　Ｍもしくはその両方はバクテリアプラスミドま比はファージＤＮＡに結合している。１２「請求の範囲１」による過程において、該外部ＤＮＡ１もシーりけＤＮＡ　ＩＩ又はその両方はファージパーチクル中でキャブジッド化されたファージＤＮＡに結合されている０１３「請求の範囲１」による過程において、該外部ＤＮＡ１は該ＤＮＡ分子を形成するだめに該誘引可能な促進体ＤＮＡ　Ｈに連結されている。１４　「請求の範囲１」による過程において、該ＤＮＡ分子及び該外部ＤＮＡ　ｌは真中核細胞の共変転における使用に先立って燐酸カルシウムで処理される。１５Ｆ請求の範囲１」による過程において、該真中核細胞は哺乳動物細胞である。１６「請求の範囲１４」による過程において、該哺乳動物細胞は赤芽細胞である。１７「請求の範囲１４」による過程において、該哺乳動物細胞は繊維芽細胞である。１８．１請求の範囲１」による過程において、該外部ＤＮＡ１は選択可能表現型に対するコードを有する該外部ＤＮＡ　ＩＩと関連して約１：１がら約１００，０００　：　１１７）範囲の量で存在する。１９「請求の範囲１」による過程に対する選択可能表現型に対するコードを有するＤＮＡＩはヘルペス単純ウィルスからのチミジンキナーゼに対する遺伝子であるがもしくはヘルペス単純ウィルスからのチミジンキナーゼに対する遺伝子からなる。２０「請求の範囲１」による過程において、選択可能表現型に関連した蛋白質様物質に対するコードを有するＤＮＡ　１１　ハアデニンホスホリボシルトランスファラーゼに対する遺伝子であるがもしくはアデニンホスホリボシルトランスファラーゼに対する遺伝子からなる。２１「請求の範囲１．」による過程において、選択可能表現型に対するコードを有するＤＮＡ　ｌは医薬品耐性に関連した遺伝子であるがもしくは医薬品耐性に関連した遺伝子からなる。２２、ｌ−請求の範囲２１」による過程において、該医薬品耐性に関連する遺伝子は細胞にメトトレキセートに対する耐性を与える突然変異種ジ・・イドロホレートレダクターセに対するコードを有する遺伝子である。２３「請求の範囲１」による過程において、該誘引可能な促進体ＤＮＡ　ＩＩＩ連釧はジメチルサルホキシトの存在において誘引可能なグロビン遺伝子に対する促進体連鎖であるかもしくはジメチルスルホキサイドの存在において誘引可能なグロビン遺伝子に対する促進体連鎖からなる。２４「請求の範囲１．」にＬる過程において、該誘引可能な促進体ＤＮＡＩ連鎖はチロイドホルモン又はコルチコステロイドの存在下で誘引出来るヒト成長ホルモン遺伝子に対する促進体連鎖であるかもしくはチロ１゛ドホルｅン又はコルチコステロイドの存在下で誘引出来るピ゛成長ホルモン遺伝子に対する促進体連鎖からなる。２５　蛋白質様物質を製造する過程において、［請求の範囲１」による過程を用いて適当な真中核細胞を該蛋白質様物質に対するコードを有する外部ＤＮＡ　Ｉと誘引可能な促進体ＤＮＡ　ＩＩＩとを含むＤＮＡ分子で共変転を行うこと、該共変転された真中核細胞をＤＮＡ　Ｉが繰返し転写されて補足ｍＲＮＡを形成し、そして該補足ｍ１ＲＮＡがかくして形成されて該蛋白質様物質を生成するため翻訳されるようにするために該促進体ＤＮＡＩを誘引することの出来る試薬の存在を含む適当な条件下で維持すること、かくして生成された蛋白質様物質を回収すること、からなる蛋白質様物質の製造するだめの過程。２、特許請求の範囲２５」による過程において、該蛋白質様物質はインターフェロンの蛋白質部分、インンーリン、ヒト又はウシ成長ホルモン、凝固因子、ウィルス抗原、抗体もしくは酵素からなる。２７「請求の範囲２５」による過程において、該真中核細胞は哺乳動物細胞である。２８「請求の範囲２５」による過程において、該誘引可能な促進体ＤＮＡ　ＩＩＩ連鎖はグロビン遺伝子に対する促進連鎖であるかもしくはグロビン遺伝子に対する促進連鎖からなり、そして該誘引可能な試薬はジメチルスルホキサイドである。２９「請求の範囲２５」による過程において、該誘引可能な促進体ＤＮＡ　Ｉ連鎖はヒト成長ホルモン遺伝子に対する促進体連鎖であるかもしくはヒト成長ホルモン遺伝子に対する促進体連鎖からなり、そして該誘引可能な試薬はチロイドホルモンもしくはコルチコステロイドである。３０　蛋白質様物質を製造する過程において、「請求の範囲１」による過程を用いて適当な実生核細胞を該蛋白質様物質に対するコードを有する外部ＤＮＡ　Ｉと誘引可能な促進体ＤＮＡ　Ｉとを含むＤＮＡ分子で共変転を行うこと、該共変転された実生核細胞を適当な条件のもとて培養捷だは分枝してそれから誘導された実生核細胞の複合体を生成すること、刀）＜シて生成された実生核細胞から蛋白質様物質を回収すること、からなる蛋白質様物質を製造するだめの過程。３１「請求の範囲１」により製造せられた実生核細胞。３２　蛋白質様物質に対するコードを有する遺伝子の複合コピーに相当する外部ＤＮＡ　１分子の複合体を、各々該外部ＤＮＡ　Ｉと１つの誘引可能な促進体ＤＮＡ　Ｉ連鎖を含んでいるＤＮＡ分子の複合体、および各々該真生核細胞によっては表現されない選択可能な表現型に対するコードを有する遺伝子であるかもしくはそれを含んでいる結合されていないＤＮＡ　１分子の複合体と共に適当な実生核細胞の中へ挿入する過程であシ、該共変転は該選択可能な表現型を獲得した実生核細胞の生存を可能にするかまたはそれを識別する適当な条件下でそして該促進体ＤＮＡ　Ｈに対する誘引試薬の存在下で行われることを特徴とする過程。３３「請求の範囲３２．」による過程において、該蛋白質様物質はインターフェロンの蛋白質部分、インシュリン、ヒト又は動物成長ホルモン、凝固因子、ウィルス抗原、抗体又は酵素からなる。３４、「請求の範囲３２」による過程において、該実生核細胞は哺乳動物細胞である。３５、「請求の範囲３２．」による過程において、該外部ＤＮＡ５６Ｉは選択可能な表現型に関連した蛋白質様物質に対するコードを有する該外部ＤＮＡ　Ｉｔと関連して約１：１から約１００，０００　：　１の範囲の量で存在する。３６「請求の範囲３２」による過程において、該外部ＤＮＡ■は医薬品耐性に関連した増幅遺伝子であるかもしくは医薬品耐性に関連した増幅遺伝子からなる０３７「請求の範囲３２」による過程において、該誘引可能なりＮＡ　Ｉ促進体はグロビン遺伝子に対する促進体連鎖であるかもしくはグロビン遺伝子に対する促進体連鎖からなり、そして該誘引試薬はジメチルスルホキサイドである。３８、「請求の範囲３２」による過程において、該誘引可能なりＮＡ　Ｉ促進体はヒト成長ホルモンに対する促進体連鎖であるかもしくはヒト成長ホルモンに対する促進体連鎖からなり、そして該誘引試薬はチロイドホルモンもしくはコルチコステロイドである０３９、「請求の範囲３２．」により製造せられた真生核細、胞０４０、適当な実生核細胞に「請求の範囲３２．」の過程によって該蛋白質様物質に対するコードを有する外部ＤＮＡ　１分子の複合体で共変転を行なうこと、該共変転された実生核細胞を適当な条件下で維持して該実生核細胞が該蛋白質様物質を生成出来るようにすること、そしてかくして生成された該蛋白質様物質を回収すること、からなる蛋白質様物質を製造する方法。４１、実生核細胞に「請求の範囲３２」の過程によって該蛋白質様物質に対するコードを有する外部ＤＮＡ　１分子の複合体で共変転を行なうこと、該共変転された実生核細胞を該拮抗体の存在下で培養または分枝して実生核細胞の複合体を生成するために該ＤＮＡ　ｌ促進体連鎖に対する該誘引試薬の存在下で核選Ｆ’ ｕ’Ｊ能な表＊、　Ｑ　”−３：得した実生核細胞のみの生存を容認すると、と、ノ、して該蛋白質様物質をかくして生成された冥りミ核細胞から回収すること、からなる蛋白質傑物質の製造するだめの過程。４２、適当な実生核細胞を誘引可能な促進体１）ＮＡ　ｌが結合した外部ＤＮＡ　ｌとＤＮＡ　Ｉとで共変転し、該ＤＮＡ　ｌと該ＤＮＡ　ｌは連結されておらずそして該ＤＮＡ　ｊは共変転以前では、該細胞によっては発現せられない表現型に対するコートを有することからなる実生核細胞の共変転のだめの過程。４３、「請求の範囲２５　、３０　、４０捷たは４１」の過程のいずれかによって実生核細胞の中において該蛋白質様物質を生成すること、該実生核細胞を適当な条件下に維持して該実生核細胞に該物質を形成、合成、もしくは集合せしめること、そしてかくして生成された物質を回収すること、からなる生物学的物質、その一部は蛋白質様物質である、を製造するだめの過程。４４「請求の範囲４３」に記載の過程において、該化合物はインターフェロンである。４５「請求の範囲２５　、３０　、４０または４１」のいずれかによって製造せられた蛋白質様物質。４６「請求の範囲４３．」によって製造せられた生物学的物質０４７、適当な実生核細胞を該遺伝子及び誘引可能な促進体連鎖を含むＤＮＡ分子と選択可能な表現型に対するコードを有する遺伝子を含む結合されていないＤＮＡで共変転すること、適当な条件下で該実生核細胞を維持して該実生核細胞にかくして得られた非蛋白質様生物学的物質を合成又は集合させること、からなる非蛋白質様生物学的物質を生成、調整されるかさもなければ遺伝子によって調整される合成もしくは集合を行う過程。４８「＃求の範囲４７」により製造せられた非蛋白質生物学的物質。４９、「請求の範囲４５」による蛋白質様物質の調薬上有効な量と、生理的に受入れ可能々担体とからなる医薬組成物。５０「請求の範囲４６」による生物学的物質の調薬上有効な量と、生理的に受入れ可能な担体とからなる医薬組成物。５１「請求の範囲４８」による生物学的物質の調薬上有効な量と、生理的に受入れ可能な担体とからなる医薬組成物。５２「請求の範囲４９　、５０まだは５１」のいずれかによる医薬組成物を患者に投与することからなる治療方法０５３　核真生核細胞に該遺伝的欠陥を集めることの出来る有能遺伝子と、該実生核細胞によっては発現されない選択可能な表現型に対するコードを有する連結されていないＤＮＡ　Ｉｆとで共変転を行うことからなり、該共変転は該選択可能な表現型を獲得した実生核細胞が生存もしくは識別し得る適当な条件のもとで行われることからなる遺伝的に欠陥のある実生核細胞の治療学的処理方法。５４「請求の範囲５３」による方法において、該遺伝的に欠陥のある実生核細胞はかま状細胞貧血症に関連する赤血球である。５５、「請求の範囲５４」による方法において、該外部ＤＮＡ］は正常なグロビンに対するコードを有する。５６［請求の範＋［Ｅ５３ｊによる方法において、該ＤＮＡ　ｌは医薬品に対する耐性に対するコードを有する。５７　患者の遺伝的に欠陥のある細胞を取出すこと、該細胞に有能なグロビン遺伝子および選択可能な表現型として医薬品耐性に関連する遺伝子で共変転を行なうこと、該共変転は該医薬品の存在下に行なわれる、そして該共変転せられた細胞を該患者に戻すこと、からなる人間かま状細胞貧血病の治療方法。５８　外部ＤＮＡ　Ｉを適当な実生核細胞に挿入する過程において、該実生核細胞は該実生核細胞を外部ＤＮＡ　Ｉと誘引可能な促進体ＤＮＡ　■を含むＤＮＡ分子及び該実生核細胞によっては発現されていない表現型に対するコードを有する連結されていないＤＮＡ　Ｉｔとで共変転をおこなうことからなり、該共変転は該選択可能な表現型を獲得した実生核細胞の識別及び回復が可能である適当な条件の下で行われることを特徴とする外部ＤＮＡ　ｌを適当な実生核細胞に挿入する過程。５９「請求の範囲１．」の過程を用いて適当な実生核細胞を共変転すること、適当な条件下で該共変転された実生核細胞を培養またはクローン化して該外部蛋白質様物質を生成子る実生核細胞の複合体を得ること、そして該蛋白質様物質を該実生核細胞から回収すること、１６２からなる外部蛋白質様物質を製造するだめの過程。特表昭５９−５０１５３３　（５）浄書（内、に笈更なし）