CN105670981B - 一种粘质沙雷氏菌spg-1及其产壳聚糖酶的方法 - Google Patents

一种粘质沙雷氏菌spg-1及其产壳聚糖酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种粘质沙雷氏菌SPG‑1(Serratia marcescens)CCTCC NO：M 2015784，粘质沙雷氏菌SPG‑1为革兰氏阴性菌，短杆状，成单个排列，无芽孢，大小为0.5～1.0×1.2～2.0μm。本发明还公开了采用沙雷氏菌SPG‑1制备壳聚糖酶的方法。本发明菌株的壳聚糖酶产量较高，培养基成本低，培养条件易于控制，提取过程简单并节能环保。产壳聚糖酶的方法具有简单实用、成本低廉的优点，容易在工业生产上推广应用。

Description

一种粘质沙雷氏菌SPG-1及其产壳聚糖酶的方法
技术领域
本发明涉及一种微生物，特别是一种粘质沙雷氏菌SPG-1，本发明还涉及该菌株产壳聚糖酶的方法。
背景技术
壳聚糖酶能水解脱乙酰化的壳聚糖，因此被认为是对线性壳聚糖具有专一水解性的酶。壳聚糖酶主要存在于放线菌、真菌、细菌和动植物等生物群体中，其主要作用于β-1.4-氨基葡萄糖苷键，以内切方式降解壳聚糖得到其低聚物。壳聚糖酶最初被分为2类，但Fukamizo等提议将其分为3类，即壳聚糖酶I、壳聚糖酶Ⅱ、壳聚糖酶Ⅲ。第一类能水解Gen—Gen键和Glucina—Gen键；第二类只能水解Gen—Gen键；第三类既能水解Gen—Glen键，又能水解Gen—Cenacle键。
研究发现不同来源的壳聚糖酶的相对分子质量由于其结构和组成的不同而存在差异。植物中分离得到的壳聚糖酶分子质量为10 000~23 000 u，而从微生物中分离得到的壳聚糖酶分子质量大约为20 000~40 000 u。壳聚糖酶大部分为碱性蛋白，来源于各类微生物的壳聚糖酶，其最适pH值范围一般在4.0~8.0。酶的等电点(pI)变化范围也比较大，大多集中在4.0~10.1。
利用壳聚糖酶水解壳聚糖得到由2~10个氨基葡萄糖通过β-1, 4-糖苷键连接而成的低聚糖，尤其以壳寡糖为典型代表。壳寡糖的主要应用领域有：
(1) 医药
壳寡糖在医药方面存在相当大的潜力，可使伤口免受细菌感染，同时还有很好的透气效果，对伤口的愈合很有帮助。可被溶菌酶降解生成天然的代谢物，具有无毒、易吸收等特点，用它作为药物缓释剂有很大的优越性。1997年，有学者以低分子壳聚糖进行辅助治疗，发现淋巴细胞和白细胞总数维持稳定，T细胞数量明显增加，这种低分子壳聚糖为抗肿瘤的研究提供了依据。目前，细胞水平的实验证明壳寡糖对多种肿瘤细胞有杀伤效果。
(2) 食品
壳寡糖在食品领域的应用更是备受关注，它具有多项生理调节功能，作为肠道益生菌的活化因子，促进钙和矿物质的吸收，吸附体内重金属等。可替代调味品中苯甲酸钠等化学防腐剂，成为天然绿色防腐产品。它还可降低对胆固醇和脂肪的吸收，降低高血压，被广泛应用于减肥瘦身、排毒养颜、免疫调节等功能性饮料中。可用它对水果蔬菜进行涂膜保鲜，其膜层有良好的通透性、阻水性，同时还有防腐抗菌之功效。
(3) 农业
壳寡糖作为一种新型农药，兼有肥效和药效双重功能的特点，而且无毒无害、不污染环境等优点，它可改变土壤中的菌群, 促进有益微生物的生长，壳寡糖还可诱导激活植物的免疫***，提高植物对病毒的抵抗能力，对小麦花叶病、水稻稻瘟病、棉花黄萎病、番茄晚疫病等病害具有良好的防预和治疗作用，可以开发为生长调节剂、生物农药和肥料等。
(4) 日用化工
壳寡糖具有良好的保湿效果，活化机体细胞，抑制皮肤表面有害菌滋生、抗皮肤病和吸收紫外线等功效，重要的是其来源于生物提取物，可很好的避免普通化妆品带来的副作用，从而可以应用在保湿、抗皱、防晒等类型的护肤品中；壳寡糖还具有保持头发表面成膜的通透性，湿润易梳理，并有去屑止痒、防尘、抗静电的功效。
(5) 生物兽药
利用其抗菌作用，预防和治疗由金黄色葡萄球菌等细菌引起的动物疾病；还可利用壳寡糖促进伤口的愈合，被用于外伤或骨折的辅助治疗；羧甲基壳寡糖对锌离子、铁离子和钙离子等均有良好的络合作用，有望制成新的天然补锌剂、补铁剂和补钙剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的可以产壳聚糖酶的粘质沙雷氏菌SPG-1菌株。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供了上述粘质沙雷氏菌SPG-1菌株产壳聚糖酶的方法，以克服现有技术存在的酶生产成本高的问题。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明的特征包括粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SPG-1菌株本身，以及利用该菌株产壳聚糖酶的方法。
本发明所涉及的菌株是粘质沙雷氏菌SPG-1(Serratia marcescens)，以下简称粘质沙雷氏菌SPG-1或者菌株SPG-1。该菌株已于2015年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号为CCTCC NO:M2015784。保藏地址：中国武汉武汉大学，邮编430072，电话027－68754052。
本发明还涉及上述粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens) SPG-1产壳聚糖酶的方法，其特点是，其步骤如下：
(1) 菌种的准备：将粘质沙雷氏菌SPG-1菌株在灭过菌的丰富培养基平板上划线，于28℃静置培养1~2天后，挑取单菌落进行丰富培养基斜面培养1天后保存于4 ℃冰箱中备用；所述的丰富培养基为：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，琼脂 15～20g，水 1000mL，pH7.0～7.2；
(2) 细胞的培养及粗酶液的收集：挑取斜面培养的菌种，接种到装有50mL液体培养基的250mL三角瓶中，在25~30℃，150~250 r/min，的摇床上培养18~30h后得种子液，将种子液按5%的接种量接种于含有30~50mL液体培养基的250mL三角瓶中，26~30℃，150~200 r/min摇床培养60~75h后取出，在8000 r/min离心去除菌体沉淀，收集上清液即为粗酶液，置于4 ℃冰箱中贮存备用；所述的液体培养基为：豆粕粉25 g，蔗糖 20 g，K2HPO4 2 g，KH2PO42 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，水1000mL，pH 6.0；
(3) 壳聚糖酶的提取及纯化：步骤（2）中粗酶液，采用1倍体积的乙醇提取时，得比酶活为24 U/mg protein的粗酶沉淀；用Sephadex G75分离纯化所得酶的比酶活为30 U/mgprotein，SDS-PAGE法测得分离纯化得到的壳聚糖酶相对分子质量为30000，用等电点聚沉法初步测得壳聚糖酶的等电点为5.98。
以上所述的产壳聚糖酶的方法技术方案中，进一步优选的技术特征是：步骤（2）中：挑取斜面培养的菌种，接种到装有50mL液体培养基的250mL三角瓶中， 25℃，200 r/min，摇床上培养24h后得种子液。
以上所述的产壳聚糖酶的方法技术方案中，进一步优选的技术特征是：步骤（2）中：将种子液按5%的接种量接种于含有40mL液体培养基的250mL三角瓶中，28℃，180 r/min摇床培养72h后取出。
以下对本发明进行进一步的阐述。
一、本发明菌株粘质沙雷氏菌SPG-1的筛选方法。
该菌株粘质沙雷氏菌SPG-1是通过如下的方法筛选获得的：
除去土样里的杂物，取土样少许加入装有5mL富集培养基(胶体壳聚糖 5，小分子壳聚糖 3，牛肉膏 2，(NH4)2SO4 10，K2HPO4 2，KH2PO4 2，NaCl 5，MgSO4·7H2O 0.25，水1000mL，pH 6. 5)的试管中，在摇床中于30 ℃，摇床转速160 r/min培养2 d；富集后取少许培养液，稀释涂初筛培养基 (酵母膏 1，胶体壳聚糖 10，粉末壳聚糖（分子量5万） 5，(NH4)2SO4 5，K2HPO4 2，NaCl 5，MgSO4·7H2O 0.5，琼脂15～20，水 1000mL，pH 6.5～7.5) 平板，30 ℃倒置培养3 d。再挑取单菌落接种于液体种子培养基(蛋白胨 5，酵母提取物 5，葡萄糖 5，K2HPO4 2，KH2PO4 2，NaCl 5，MgSO4·7H2O 0.5，水 1000mL，pH 6.5～7.5) ，在28℃，180 r/min的摇床上培养24h后得种子液，将种子液按5%的接种量接种于发酵培养基(粉末壳聚糖 10，葡萄糖 1.0，酵母提取物 3，(NH4)2SO4 5， K2HPO4 2，NaCl 5，MgSO4·7H2O 0.5，水 1000mL，pH 6)， 于28℃，180r/min摇床培养60h后取出，在8000 r/min离心去除菌体沉淀，收集上清液即为粗酶液，用DNS法测定壳聚糖酶活力，最后从50株侯选菌株中选出一株产壳聚糖酶的微生物：粘质沙雷氏菌SPG-1。
二、粘质沙雷氏菌SPG-1菌株的性质。
具有如下的性质：
(1) 形态特征：革兰氏阴性菌，短杆状，成单个排列，无芽孢。大小为0.5～1.0×1.2～2.0 μm，不运动或者运动性不强。
(2) 培养特征：菌落为圆形，不透明，菌落凸起，粘稠易挑取，颜色为红色，边缘整齐，无褶皱，好氧，液体培养均匀浑浊，无沉淀，无气泡产生，培养基从澄清的黄色变为红色再变为浑浊的黄色。
(3) 生理生化实验结果：
① 糖发酵试验结果：菌株SPG-1发酵蔗糖、山梨糖、核糖、果糖、山梨醇、甘露醇、海藻糖、鼠李糖、葡萄糖，但不产气，不发酵木糖、***糖、乳糖、半乳糖。
② 碳源同化试验结果：见表1。
表1 菌株SPG-1碳源同化试验结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
③ 氮源同化试验结果：见表2。
表2 菌株SPG-1氮源同化试验结果
Figure 406292DEST_PATH_IMAGE002
④ 其他生理生化试验结果：菌株SPG-1液化明胶，脲酶阴性，接触酶阳性，甲基红实验阴性，V-P实验结果阳性，吲哚实验结果呈阳性，产H2S实验结果显示强阳性，牛奶实验产生酸凝现象，还原硝酸盐，不还原亚硝酸盐，对青霉素钠不敏感，产红色物质对枯草芽孢杆菌有微弱抑制作用，七叶灵水解实验为阳性。
(4) 生态特性
① 不同温度生长结果：温度生长范围在10～40℃之间，在15~30℃时都能正常产生红色素，在37℃以上不产生红色素。
② 不同pH生长结果：生长pH范围为4~10，最适生长pH为7~7.5。
③ 耐盐性实验：NaCl浓度为2%～8%时生长，随着盐浓度的增加，产色素减少，NaCl浓度为2%时颜色最红。
(5) 16S rDNA测序结果：见表3。
表3 16SrDNA测序结果
Figure DEST_PATH_IMAGE003
(6) 进化树
根据菌株SPG-1的形态特征、培养特征、生理生化特征及生态特性，该菌株与《伯杰氏鉴定细菌学手册》中粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens)的分类特征最相符， 结合16S rDNA测序结果，所以鉴定菌株SPG-1为粘质沙雷氏菌，定名为：粘质沙雷氏菌SPG-1(Serratia marcescens SPG-1)。已有北京三博志远生物技术有限公司在2013年6月测序，测序引物为：27F，测序编号为：06050080，测序结果为菌株SPG-1和粘质沙雷氏菌同源度高达99%。进化树参见图1。
三、产酶方法。
1、粘质沙雷氏菌SPG-1(Serratia marcescens SPG-1)产壳聚糖酶的方法步骤如下：
(1) 菌种的准备：将粘质沙雷氏菌SPG-1菌株在灭过菌的丰富培养基平板上划线，于28℃静置培养1~2天后，挑取单菌落进行丰富培养基斜面培养1天后保存于4 ℃冰箱中备用；所述的丰富培养基为：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，琼脂 15～20g，蒸馏水 100mL，pH 7.0～7.2；
(2) 细胞的培养及粗酶液的收集：挑取斜面培养的菌种，接种到装有50mL液体培养基的250mL三角瓶中，在25~30℃，150~250 r/min的摇床上培养18~30h后得种子液，将种子液按5%的接种量接种于含有30~50mL液体培养基的250mL三角瓶中，26~30℃，150~200 r/min摇床培养60~75h后取出，在8000 r/min离心去除菌体沉淀，收集上清液即为粗酶液，置于4 ℃冰箱中贮存备用；所述的液体培养基为：豆粕粉25 g，蔗糖 20 g，K2HPO4 2 g，KH2PO42 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，水1000mL，pH 6.0。
(3) 壳聚糖酶的提取及纯化：步骤（2）中粗酶液，采用1倍体积的乙醇提取时，得比酶活为24 U/mg protein的粗酶沉淀。用Sephadex G75分离纯化所得酶的比酶活为30 U/mgprotein，SDS-PAGE法测得分离纯化得到的壳聚糖酶相对分子质量为30000，用等电点聚沉法初步测得壳聚糖酶的等电点为5.98。
与现有技术相比，本发明提供了一种新的可以产壳聚糖酶的粘质沙雷氏菌SPG-1菌株。本发明菌株的壳聚糖酶产量较高，培养基成本低，培养条件易于控制，提取过程简单并节能环保。产壳聚糖酶的方法具有简单实用、成本低廉的优点，容易在工业生产上推广应用。
附图说明
图1为本发明粘质沙雷氏菌SPG-1的菌株进化树。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，一种粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens) SPG-1，该菌株的保藏号为CCTCC NO：M 2015784。该菌株具有以下特征：
(1) 形态特征：革兰氏阴性菌，短杆状，成单个排列，无芽孢。大小为0.5～1.0×1.2～2.0 μm，不运动或者运动性不强。
(2) 培养特征：菌落为圆形，不透明，菌落凸起，粘稠易挑取，颜色为红色，边缘整齐，无褶皱，好氧，液体培养均匀浑浊，无沉淀，无气泡产生，培养基从澄清的黄色变为红色再变为浑浊的黄色。
(3) 生理生化特征：能够利用柠檬酸钠、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、海藻糖、核糖、D-果糖、山梨醇、甘露醇作为唯一碳源，不利用可溶性淀粉、纤维素、***糖、L-山梨糖、乳糖、D-木糖作为唯一碳源；可利用脲素、干酪素、硝酸钾、氯化铵、硫酸铵、甘氨酸、天冬氨酸作为唯一氮源，不利用L-缬氨酸作为唯一氮源。菌株SPG-1发酵蔗糖、山梨糖、核糖、果糖、山梨醇、甘露醇、海藻糖、鼠李糖、葡萄糖，但不产气，不发酵木糖、***糖、乳糖、半乳糖。
菌株SPG-1液化明胶，脲酶阴性，接触酶为阳性，甲基红实验阴性，V-P实验结果呈阳性，吲哚实验结果呈阳性，产H2S实验结果阳性，牛奶实验产生酸凝现象，还原硝酸盐，不还原亚硝酸盐，七叶灵水解实验为阳性，对青霉素钠不敏感，该菌生成一种红红色物质，该物质几乎不溶于水，但溶于乙醇，该红色物质对枯草芽孢杆菌有微弱抑制作用。
实施例2，一种如实施例1所述的粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens) SPG-1产壳聚糖酶的方法，其步骤如下：
(1) 菌种的准备：将粘质沙雷氏菌SPG-1菌株在灭过菌的丰富培养基平板上划线，于28℃静置培养1天后，挑取单菌落进行丰富培养基斜面培养1天后保存于4 ℃冰箱中备用；所述的丰富培养基为：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，琼脂 15g，蒸馏水 100mL，pH7.0；
(2) 细胞的培养及粗酶液的收集：挑取斜面培养的菌种，接种到装有50mL液体培养基的250mL三角瓶中，在25℃，150 r/min，的摇床上培养18~30h后得种子液，将种子液按5%的接种量接种于含有30mL液体培养基的250mL三角瓶中，26℃，150r/min摇床培养60h后取出，在8000 r/min离心去除菌体沉淀，收集上清液即为粗酶液，置于4 ℃冰箱中贮存备用；所述的液体培养基为：豆粕粉25 g，蔗糖 20 g，K2HPO4 2 g，KH2PO4 2 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，自来水1000mL，pH 6.0。
(3) 壳聚糖酶的提取及纯化：步骤（2）中粗酶液，采用1倍体积的乙醇提取时，得比酶活为24 U/mg protein的粗酶沉淀。用Sephadex G75分离纯化所得酶的比酶活为30 U/mgprotein，SDS-PAGE法测得分离纯化得到的壳聚糖酶相对分子质量为30000，用等电点聚沉法初步测得壳聚糖酶的等电点为5.98。
实施例3，一种如实施例1所述的粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens) SPG-1产壳聚糖酶的方法，其步骤如下：
(1) 菌种的准备：将粘质沙雷氏菌SPG-1菌株在灭过菌的丰富培养基平板上划线，于28℃静置培养2天后，挑取单菌落进行丰富培养基斜面培养1天后保存于4 ℃冰箱中备用；所述的丰富培养基为：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水 100mL，pH7.2；
(2) 细胞的培养及粗酶液的收集：挑取斜面培养的菌种，接种到装有50mL液体培养基的250mL三角瓶中，在30℃，250 r/min，的摇床上培养30h后得种子液，将种子液按5%的接种量接种于含有50mL液体培养基的250mL三角瓶中， 30℃，200 r/min摇床培养75h后取出，在8000 r/min离心去除菌体沉淀，收集上清液即为粗酶液，置于4 ℃冰箱中贮存备用；所述的液体培养基为：豆粕粉25 g，蔗糖 20 g，K2HPO4 2 g，KH2PO4 2 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，自来水1000mL，pH 6.0。
(3) 壳聚糖酶的提取及纯化：步骤（2）中粗酶液，采用1倍体积的乙醇提取时，得比酶活为24 U/mg protein的粗酶沉淀。用Sephadex G75分离纯化所得酶的比酶活为30 U/mgprotein，SDS-PAGE法测得分离纯化得到的壳聚糖酶相对分子质量为30000，用等电点聚沉法初步测得壳聚糖酶的等电点为5.98。
实施例4，一种如实施例1所述的粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens) SPG-1产壳聚糖酶的方法的步骤（2）中：挑取斜面培养的菌种，接种到装有50mL液体培养基的250mL三角瓶中， 25℃，200 r/min，摇床上培养24h后得种子液；将种子液按5%的接种量接种于含有40mL液体培养基的250mL三角瓶中，28℃，180 r/min摇床培养72h后取出。其余与实施例1相同。
实施例5，一种如实施例1所述的粘质沙雷氏菌SPG-1(Serratia marcescens SPG-1)产壳聚糖酶的方法，其步骤如下：
(1) 在容积1L的大三角瓶中装入150 mL发酵培养基 (豆粕粉25 g，蔗糖 20 g，K2HPO4 2 g，KH2PO4 2 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，自来水1000mL，pH 6.0)，灭菌后按5%的接种量接入SPG-1种子培养液，在28℃，165 r/min摇床培养69h后取出，在8000 r/min离心去除菌体沉淀，收集上清液即为粗酶液，置于4 ℃冰箱中贮存备用；
(2) 取上清液100mL加入100mL的冰乙醇，混匀后于4℃静置5-10 min，在12000 r/min冷冻离心得粗酶沉淀，粗酶沉淀得比酶活为24 U/mg protein；粗酶沉淀溶于5 mL的pH4.4的乙酸缓冲液中过Sephadex G75凝胶柱，用pH 4.4乙酸缓冲液洗脱并收集流分，将酶活高的流分合并，用冰乙醇沉淀后所得酶的比酶活为69 U/mg protein。
实施例6，一种如实施例1所述的粘质沙雷氏菌SPG-1(Serratia marcescens SPG-1)产壳聚糖酶的方法，其步骤如下：
(1) 在5L发酵罐中装入3.5 L发酵培养基(豆粕粉25 g，蔗糖 20 g，K2HPO4 2 g，KH2PO4 2 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，自来水1000mL，pH 6.0)，灭菌后按5%的接种量接入SPG-1种子培养液，在温度为28℃，搅拌转速为350r/min和通气速率为0.9 vvm的条件下发酵，发酵过程中控制pH为6.0，至 69h放罐时发酵上清液中壳聚糖酶含量为3500U/L。
(2) 取上清液300mL加入300mL的冰乙醇，混匀后于4℃静置5~10 min，在12000 r/min冷冻离心得粗酶沉淀，粗酶沉淀的比酶活为35U/mg protein；粗酶沉淀溶于5 mL的pH4.4的乙酸缓冲液中过Sephadex G75凝胶柱，用pH4.4乙酸缓冲液洗脱并收集流分，将酶活高的流分合并，用冰乙醇沉淀后所得酶的比酶活为76 U/mg protein。
实施例7。一种如实施例1所述的粘质沙雷氏菌SPG-1(Serratia marcescens SPG-1)产壳聚糖酶水解壳聚糖的方法，其步骤如下：
(1) 在5L发酵罐中装入3.5 L发酵培养基(豆粕粉25 g，蔗糖 20 g，K2HPO4 2 g，KH2PO4 2 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，自来水1000mL，pH 6.0)，灭菌后按5%的接种量接入SPG-1种子培养液，在温度为28℃，搅拌转速为350r/min和通气速率为0.9 vvm的条件下发酵，发酵过程中控制pH为6.0，至 69h放罐时发酵上清液中壳聚糖酶含量为3500U/L。
(2) 取上清液300mL加入300mL的冰乙醇，混匀后于4℃静置5~10 min，在12000 r/min冷冻离心得粗酶沉淀，粗酶沉淀的比酶活为35U/mg protein；粗酶沉淀溶于5 mL的pH4.4的乙酸缓冲液中过Sephadex G75凝胶柱，用pH4.4乙酸缓冲液洗脱并收集流分，将酶活高的流分合并，用冰乙醇沉淀后所得酶的比酶活为76 U/mg protein。
(3) 在100mL浓度为20g/L ，pH 6的胶体壳聚糖溶液中，加入50mg步骤(2)中的壳聚糖酶，在45℃反应5小时结束，经硅胶板层析其酶反应产物主要为壳寡糖，少量氨基葡萄糖，其余为不同分子量的低聚糖。

Claims (1)

1.一种粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens) SPG-1产壳聚糖酶的方法，其特征在于，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens) SPG-1的保藏号为CCTCC NO：M 2015784；SPG-1产壳聚糖酶的方法步骤如下：
(1) 菌种的准备：将粘质沙雷氏菌SPG-1菌株在灭过菌的丰富培养基平板上划线，于28℃静置培养1~2天后，挑取单菌落进行丰富培养基斜面培养1天后保存于4 ℃冰箱中备用；所述的丰富培养基为：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，琼脂 15～20g，水 1000mL，pH 7.0～7.2；
(2) 细胞的培养及粗酶液的收集：挑取斜面培养的菌种，接种到装有50mL液体培养基的250mL三角瓶中， 25℃，200 r/min，摇床上培养24h后得种子液，将种子液按5%的接种量接种于含有40mL液体培养基的250mL三角瓶中，28℃，180 r/min摇床培养72h后取出，在8000 r/min离心去除菌体沉淀，收集上清液即为粗酶液，置于4 ℃冰箱中贮存备用；所述的液体培养基为：豆粕粉25 g，蔗糖 20 g，K2HPO4 2 g，KH2PO4 2 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H2O0.5 g，水1000mL，pH 6.0；
(3) 壳聚糖酶的提取及纯化：步骤（2）中粗酶液，采用1倍体积的乙醇提取时，得比酶活为24 U/mg protein的粗酶沉淀；用Sephadex G75分离纯化所得酶的比酶活为30 U/mgprotein，SDS-PAGE法测得分离纯化得到的壳聚糖酶相对分子质量为30000，用等电点聚沉法初步测得壳聚糖酶的等电点为5.98。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102071181A (zh) * 2010-05-14 2011-05-25 昆明理工大学 沙雷氏菌产碱性蛋白酶的方法及其专用培养基
CN105483036A (zh) * 2015-10-30 2016-04-13 西安交通大学第一附属医院 一种粘质沙雷氏菌及其制备方法和应用
CN105441367A (zh) * 2016-01-07 2016-03-30 福建省农业科学院土壤肥料研究所 一株粘质沙雷氏菌及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chitinases A,B and C1 of Serratia marcescens 2170 Produced by Recombinant Escherichia coli:Enzymatic Properties and Synergism on Chitin Degradation;Kazushi Suzuki等;《Biosci. Biotechnol. Biochem.》;20021231;第66卷(第5期);1075-1083 *
Comparative studies of chitinases A and B from Serratia marcescens;May B. Brurberg等;《Microbiolog》;19961231;第142卷;摘要、"Materials and methods"部分 *
N.N. Nawani等.One-step puri®cation of chitinase from Serratia marcescens NK1, a soil isolate.《Journal of Applied Microbiology》.2001,第90卷 *
Production of chitinolytic enzymes by Serratia marcescens QMB1466 using various chitinous substrates;Andrew T Green等;《Journal of Chemical Technology and Biotechnology》;20041012;第80卷;摘要、"Materials and methods"部分 *
Purification and characterization of a chitosanase from Serratia marcescens TKU011;San-Lang Wang等;《Carbohydrate Research》;20080330;第343卷;摘要、"Materials and methods"部分 *

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