CN105483036A - 一种粘质沙雷氏菌及其制备方法和应用 - Google Patents
一种粘质沙雷氏菌及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种粘质沙雷氏菌及其制备方法和应用,属于微生物领域。该粘质沙雷氏菌的序列如序列表中SEQ?IN?NO:1所示。该制备方法包括:在固废垃圾处理厂的废电池与重金属填埋地周边提取土壤样品,加入无菌水中并充分振荡,静置后得到上清液,将上清液稀释至不同倍数后分别涂布到培养基上,在培养基上加入重金属离子培养,从培养基上挑取单菌落接种到斜面培养基上,得到原始菌株;在液体培养基上接种原始菌株,恒温振荡培养过夜,得到菌液,取菌液稀释后分别放置于灭菌平皿中,进行紫外线照射后涂布于固体培养基上,恒温静置培养后进行富集重金属分析并得到所述粘质沙雷氏菌。所述粘质沙雷氏菌对Cr2+、Cd2+、Pb2+具有良好的吸附性能,是良好的生物吸附材料。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域,特别涉及一种粘质沙雷氏菌及其制备方法和应用。
背景技术
随着我国工业的快速发展,重金属污染也越来越严重,重金属污染会导致土壤微生物活性降低,使土壤肥力和质量严重下降,重金属还会通过食物链在人体内富集,危害人体健康。因此,重金属污染的治理迫在眉睫。
重金属污染的传统处理方法包括:化学沉淀法、离子交换法、活性炭及硅胶吸附法、电化学法及膜分离法等,但是采用传统方法处理重金属离子的成本较高。近年来,生物修复技术因成本低廉而得到了广泛的应用,取得了较理想的结果。然而,国内外关于生物修复重金属污染的研究较少,使得现有已开发的微生物吸附材料的种类少,而且现有的微生物吸附材料的吸附能力差。
发明内容
为了解决现有技术中微生物吸附材料吸附能力差的问题,本发明实施例提供了一种粘质沙雷氏菌及其制备方法和应用。所述技术方案如下:
一方面,本发明实施例提供了一种粘质沙雷氏菌,所述粘质沙雷氏菌的序列如序列表中SEQINNO:1所示。
另一方面,本发明实施例提供了一种制备上述的粘质沙雷氏菌的方法,所述方法包括:
在固废垃圾处理厂的废电池与重金属填埋地周边提取土壤样品,将所述土壤样品加入无菌水中并充分振荡,静置后得到上清液,将所述上清液稀释至不同倍数后分别涂布到培养基上,在所述培养基上加入重金属离子,将所述培养基倒置并于28℃培养7d,从所述培养基上挑取表面光滑的圆形单菌落接种到斜面培养基上,在所述斜面培养基上得到粘质沙雷氏菌的原始菌株;
在液体培养基上接种所述原始菌株,于37℃恒温振荡培养过夜,得到菌液,取1mL所述菌液稀释至10-5倍,分别在6个灭菌平皿上铺上10mL稀释菌液,进行紫外线照射后分别吸取200μL所述稀释菌液涂布于含有6.0mg/L3-氨基-9-乙基咔唑的基本固体培养基上,于37℃恒温静置培养10h后进行富集重金属分析得到所述粘质沙雷氏菌。
具体地,采用紫外线灯进行所述紫外线照射,所述紫外线灯的参数为:功率25W,紫外线波长253nm。
具体地,在进行紫外线照射时,6个铺有10mL稀释菌液的所述灭菌平皿的照射时间分别为0min、2min、4min、6min、8min和10min。
具体地,将所述上清液采用10倍梯度稀释法进行稀释,得到浓度为10-2、10-3、10-4和10-5的菌液分别涂布到所述培养基上。
具体地,所述培养基为含有Cr2+的肉汤培养基。
具体地,所述方法还包括:将所述粘质沙雷氏菌进行摇瓶发酵培养,所述摇瓶发酵培养的条件为:发酵温度35-37℃,发酵时间30-36h,转速200-225r/min。
具体地,所述方法还包括:将所述粘质沙雷氏菌在10L发酵罐中进行试发酵,所述试发酵的条件为:装入4-7L发酵培养基,接种量3-5%,接种菌液浓度为2×108CFU/mL,发酵温度35-37℃,pH6.5-7.5,发酵时间30-36h,转速300-400r/min,通气量1:1。
具体地,在进行富集重金属分析时所采用的重金属离子包括:Cd2+、Pb2+和Cr2+。
又一方面,本发明实施例提供了一种粘质沙雷氏菌的应用,所述粘质沙雷氏菌用于修复重金属污染。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是:本发明实施例提供的粘质沙雷氏菌对Cr2+、Cd2+、Pb2+具有良好的吸附性能,是良好的生物吸附材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将结合附图对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的***发育树图。
该细菌已于2015年7月29日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏,分类命名:沙雷氏菌属粘质沙雷氏菌XA07,拉丁文学名SerratiamarcescensXA07;保藏编号:CCTCCM2015476;保藏单位:中国典型培养物保藏中心;保藏地址:中国湖北省武汉市珞珈山武汉大学。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例
本发明实施例提供一种制备上述粘质沙雷氏菌的方法,该方法包括:
筛选:在固废垃圾处理厂的废电池与重金属填埋地周边提取深度为15-20cm的土壤样品,将1g土壤样品加入9ml无菌水中并充分振荡,静置5min后得到上清液,将上清液稀释后分别涂布到培养基上,在培养基上加入重金属离子,将培养基倒置并于28℃培养箱中培养7d,从培养基上挑取表面光滑圆形单菌落接种到斜面培养基上,在斜面培养基上得到粘质沙雷氏菌的原始菌株。如果发现有非纯培养的菌株,再用接种环挑取少许菌苔在平板上划线分离,直至分离得到纯培养的原始菌株。
诱变和富集驯化:在液体培养基上接种原始菌株,于37℃恒温振荡培养过夜,得到菌液,取1mL菌液稀释10-5倍,分别在6个灭菌平皿上铺上10mL稀释菌液,进行紫外线照射后分别吸取200μL稀释菌液涂布于含有6.0mg/L3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)的基本固体培养基上,于37℃恒温静置培养10h后进行富集重金属分析并得到粘质沙雷氏菌,该粘质沙雷氏菌的分类命名:沙雷氏菌属粘质沙雷氏菌XA07,拉丁文学名SerratiamarcescensXA07;保藏日期:2015年7月29日;保藏编号:CCTCCM2015476;保藏单位:中国典型培养物保藏中心;保藏地址:中国湖北省武汉市珞珈山武汉大学。
具体地,采用紫外线灯进行紫外线照射,紫外线灯的参数为:功率25W,紫外线波长253nm,阴极离光源距离40cm。
具体地,在进行紫外线照射时,6个铺有10mL稀释菌液的灭菌平皿的照射时间可以分别为0min、2min、4min、6min、8min和10min。
具体地,当土壤样品加入无菌水振荡时,可以采用涡旋器振荡10min使土壤样品和无菌水振荡充分。
具体地,将上清液采用10倍梯度稀释法进行稀释,分别得到浓度为10-2、10-3、10-4和10-5的菌液分别涂布到培养基上。
具体地,培养基为含有Cr2+的肉汤培养基(LB平板培养基)。LB(Luria-Bertani)平板培养基的成分为:胰蛋白胨10g、酵母浸出物5g、氯化钠10g、琼脂粉15g和去离子水1000mL,pH6.8-7.2。
具体地,液体培养基为LB液体培养基,LB液体培养基的成分为:胰蛋白胨10g、酵母浸出物5g、氯化钠10g和去离子水1000mL,pH6.8-7.2。
具体地,在进行富集重金属分析时所采用的重金属离子包括:Cd2+、Pb2+和Cr2+。
具体地,将所获得的粘质沙雷氏菌的摇瓶发酵培养条件为:发酵温度35-37℃,发酵时间30-36h,转速200-225r/min。
具体地,所获得的粘质沙雷氏菌在10L发酵罐中试发酵条件为:装入4-7L发酵培养基,接种量3-5%,接种菌液浓度为2×108CFU/mL,发酵温度35-37℃,pH6.5-7.5,发酵时间30-36h,转速300-400r/min,通气量1:1。
进一步地,摇瓶发酵培养基和发酵培养基均为LB(Luria-Bertani)培养基。LB培养基成分为:胰蛋白胨10g、酵母浸出物5g、氯化钠10g、去离子水1000mL,pH6.8-7.2。
其中,所获得的粘质沙雷氏菌可以在pH4-10、以及盐浓度10%以下环境中生长;在18℃-36℃条件下,粘质沙雷氏菌能够在平板培养基中生长良好,而在4℃和42℃的极端环境下,粘质沙雷氏菌也能够在平板培养基中生长。
将粘质沙雷氏菌XA07进行Biolog(GN2/GP2)自动鉴定分析(GP板透光率:28%±3%,GN板透光率:52%±3%),具体步骤包括:
挑取待测的粘质沙雷氏菌XA07的菌苔接种于Biolog平板上,在28℃下培养至对数生长期。用灭菌棉签蘸取BiologIF液体后将平板上的菌苔刮下,再溶入BiologIF液体中,振荡混匀得到菌悬液;使用Biolog浊度仪调浊度至指定范围(GP板透光率:28%±3%,GN板透光率:52%±3%);再用移液枪将菌悬液加入Biolog鉴定板中,每孔150μL;然后在28℃培养16-24h取出Biolog鉴定板,用BiologMicroStation分析仪对Biolog鉴定板进行数据读取和分析,具体结果见表1。
表1:自动鉴定结果
将得到的粘质沙雷氏菌XA07进行16SrRNA基因序列分析,并得出其16SrRNA的基因核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:1所示,通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/网页中的比对程序进行同源性分析,得出该菌种属于沙雷氏菌属,发明人将其命名为XA07。
具体地,将粘质沙雷氏菌XA07的16SrRNA基因序列分析,具体方法包括:
(1)染色体DNA(小量)的提取
1.取1.5mL粘质沙雷氏菌XA07菌液加入1.5mLEppendorf(EP)管(微量离心管)中,12000r/min离心5min。
2.静置弃上清,得到沉淀,向该沉淀中加入900μL磷酸缓冲液(PBS)重悬沉淀,于4℃12000r/min离心5min。
3.再静置弃上清,得到沉淀,向该沉淀中加入300TE(Tris-EDTA缓冲液)和200μL10mg/mL溶菌酶,通过吹吸混匀,于37℃温育1h,在温育期间每隔15min颠倒混匀一次。
4.向EP管中加入600TENS裂解液(200mmol/LNaCl,100mmol/LTril-HClpH8.0,2.0%SDS,50mmol/LEDTA,0.5%TritonX-100)和20mg/mL蛋白酶K10μL,颠倒混匀,于55℃温育1h,在温育期间每隔15min颠倒混匀一次。
5.将EP管于4℃12000r/min离心5min,取上清液。
6.向上清液中加入体积比为25︰24︰1的苯酚︰氯仿︰异丙醇并充分混匀,于4℃12000r/min离心10min。
7.重复步骤6。
8.将上清液转入新的EP管中,向新的EP管中加入1/10上清液体积的3mol/L醋酸钠,2倍上清液体积的无水乙醇,混匀,于-20℃下放置60min后,于4℃12000r/min离心10min。
9.弃上清,得到沉淀,将装有沉淀的EP管倒扣在吸水纸上,吸水纸吸干液体后将EP管中的沉淀风干,风干后得到粘质沙雷氏菌XA07的染色体DNA,向染色体DNA中加入30μL无菌水和10mg/mLRNaseA0.5μL,于-20℃保存。
(2)PCR扩增
以刚提取的染色体DNA为模板,利用由上海英骏生物技术有限公司合成的引物(上游引物27F,5’-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3’,下游引物1527R,5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)进行16SrRNA基因序列的PCR扩增,具体PCR扩增体系见表2。
表2:PCR扩增体系
PCR扩增条件:
Step1,预变性94℃10min;
Step2,变性95℃30s,
复性60℃1min,
延伸72℃1min;共30个循环。
Step3延伸72℃10min。得到粘质沙雷氏菌XA07的16SrRNA基因的PCR产物。
(3)16SrRNA基因PCR产物的纯化
(参照OmegaBio-tek公司PCR产物纯化试剂盒说明书)
1.将上述PCR产物从琼脂糖胶上相应的位置切下回收至EP管中,向EP管中加人Bindingbuffer(1g/mL),在65℃水浴7min直到琼脂糖胶完全溶解。
2.将溶液转移至吸附柱中,10000r/min离心1min,弃收集管中废液。
3.向吸附柱中加入300μL的Bindingbuffer,10000r/min离心1min,弃收集管中废液。
4.向吸附柱中加入700μL的SPWbuffer,室温下放置2-3min,10000r/min离心1min,弃收集管中废液。重复一次。
5.于10000r/min空柱离心2min,弃收集管中废液。
6.将吸附柱放入一个干净的EP管中,加入30-50μL的Elutionbuffer,12000r/min离心2min收集产物,该产物用于基因序列。
(4)16SrRNA基因的测序
16SrRNA基因序列测定由上海英骏公司完成,测序结果见序列表中的序列1。
(5)16SrRNA基因序列相似度分析
将测序后的16SrRNA基因序列通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/和http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/网页中的比对程序进行同源性分析。
(6)基于16SrRNA基因序列的***发育分析
利用Clustalx1.8,MEGA5.0软件,根据16SrRNA基因序列相似度分析的结果,选取相关模式菌株的16SrRNA基因序列,分别采用neigbor-joining(NJ,邻位相接法)算法得到相应的***发育树,见图1。
通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/网页中的比对程序进行同源性分析,得出同源性排名前十的菌种如下表3。
表3同源性比对分析
由表3可知,本发明实施例提供的粘质沙雷氏菌属于沙雷氏菌属粘质沙雷菌,将其命名为XA07。
将粘质沙雷氏菌XA07进行脂肪酸自动鉴定分析,具体方法包括:
1.获取菌体
采用4区划线将粘质沙雷氏菌XA07的菌株接种在TSB(胰酪胨大豆肉汤培养基)平板上。刮取第3区约40mg的菌量,涂抹在带有特氟龙螺旋盖的试管底部,同时做好标记。
2.皂化
(1)吸取1.0(±0.1)mL的皂化试剂,注入试管内,将含内垫的螺旋盖旋紧,Vortex振荡5~10s;
(2)将试管浸入95~100℃的水浴锅中5min;
(3)取出试管,不要拧开螺旋盖,用Vortex振荡5~10s;
(4)放回95~100℃的水浴锅中反应25min,注意螺旋盖是否旋紧;
(5)取出试管,放入冷水中冷却。
3.甲基化
(1)拧开螺旋盖,加入2.0(±0.1)mL的甲基化试剂;
(2)拧紧螺旋盖,用Vortex振荡5~10s;
(3)放入80±1℃的水浴锅中反应10(±1)min;
(4)取出试管,放入冷水中冷却。
4.萃取
(1)拧开螺旋盖,加入1.25(±0.1)mL的萃取试剂;
(2)拧紧螺旋盖,将试管轻柔颠倒混合10min;
(3)拧开螺旋盖,用玻璃吸管取出下层液体,弃去,保留上层液体。
5.洗涤
(1)加入3.0(±0.1)mL的洗涤试剂;
(2)拧紧螺旋盖,将试管轻柔颠倒混合5min;
(3)静置等待分层,若分层不够清晰,加入4~5滴的饱和NaCl溶液;
(4)用干净玻璃吸管取出约200μL的上层液体,即提取的样品,移到GC(GasChromatography)小管中,准备气相色谱分析。
6.脂肪酸气相分析
利用Agilent气相色谱仪和MIDISherlock程序对提取的样品进行脂肪酸组分和***分析。色谱条件:氢离子火焰检测器(FID),检测器温度为300℃;色谱柱为HP-ULTRA2型毛细柱;汽化室温度为250℃;载气为H2,30mL/min;进样量为0.2μL;炉温由170℃保持5℃/min上升到260℃。脂肪酸气相分析结果见表4。
表4:脂肪酸组分百分比含量
脂肪酸组分 | 百分含量% |
C12:00 | 2.40 |
C12:02OH | 0.35 |
C14:00 | 6.33 |
C16:1w5c | 0.18 |
C16:00 | 31.76 |
C17:0 cyclo | 8.82 |
C17:00 | 0.78 |
C18:1w9c | 0.49 |
C18:00 | 1.60 |
C19:0cyclo w8c | 0.20 |
Summed Feature 2 | 7.17 |
Summed Feature 3 | 24.60 |
Summed Feature 8 | 10.33 |
其中,SummedFeature为此脂肪酸组分中难区分的脂肪酸成分。SummedFeature2为C12:0(aldehyde)、C16:1isoI或C14:03OH;SummedFeature3为C16:1w7c或C16:1 w6c;SummedFeature8为C18:1w7c或C18:1w6c。
对粘质沙雷氏菌XA07的耐盐、耐pH及温度实验
1)用LB培养基活化粘质沙雷氏菌XA07菌株;
2)将LB固体培养基800mL,分装于16个三角瓶中,将其中9瓶三角瓶的pH值分别调为3、4、5、6、7、8、9、10、11,再将剩余的7瓶三角瓶中的NaCl含量调为2%、4%、6%、8%、10%、11%、12%并用高温蒸汽灭菌锅在121℃下灭菌15min,将上述16个三角瓶内的部分液体倒入平板内;
3)向上述16个三角瓶内各接种总体积的1%的活化的粘质沙雷氏菌XA07菌株,同时,在平板上用推棒涂布粘质沙雷氏菌XA07菌株。
4)将接种好的三角瓶放入30℃的恒温摇床内,180r培养24h。将平板分别放入4℃、15℃、28℃、36℃、42℃下静置培养;
5)培养24h后,用分光光度计测量液体培养基的OD600数值,并检查平板中涂布的菌是否生长。
实验结果表明,在pH4-10之间粘质沙雷氏菌XA07均能生长;盐浓度10%以下粘质沙雷氏菌XA07均能生长;在15℃-36℃下粘质沙雷氏菌XA07能够在平板中生长良好,而在4℃和42℃的环境下,粘质沙雷氏菌XA07也能够在平板中生长。
对粘质沙雷氏菌XA07进行耐受重金属实验
1)用LB培养基活化粘质沙雷氏菌XA07菌株,并分别配制好100mL100mmol/LCr2+;100mL100mmol/LPb2+;100mL100mmol/LCd2+的重金属离子溶液;
2)配制LB培养基500mL,分装于48支试管中,并用高温蒸汽灭菌锅在121℃下灭菌15min;
3)将先配好并灭菌的Cr2+、Cd2+、Pb2+重金属离子溶液分别加入到LB培养
基中,使各试管中的金属离子终浓度按表5所示分别加入两支试管中;
表5:粘质沙雷氏菌XA07耐受重金属试验结果
处理组 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
Cr2+mmol/L | 2.0 | 4.0 | 6.0 | 8.0 | 10.0 | 12.0 | 14.0 | 16.0 |
Cd2+mmol/L | 2.0 | 4.0 | 6.0 | 8.0 | 10.0 | 12.0 | 14.0 | 16.0 |
Pb2+mmol/L | 2.0 | 4.0 | 6.0 | 8.0 | 10.0 | 12.0 | 14.0 | 16.0 |
4)向每支试管内接种1%的活化的粘质沙雷氏菌XA07菌株,同一浓度的金属离子的试管只接种一支,另外一支作为空白对照;
5)将接种好的试管放入30℃的恒温摇床内,于200r/min下培养24h;
6)将培养好的菌液用分光光度计在OD600下测其吸光值,每一支都用其空白对照进行调零。
试验结果表明,粘质沙雷氏菌XA07对Cr2+的最大耐受能力为14mmol/L,对Cd2+的最大耐受能力为10mmol/L,对Pb2+的最大耐受能力为6mmol/L。
具体地,本发明实施例提供的粘质沙雷氏菌XA07可用于修复重金属污染。
对粘质沙雷氏菌XA07进行吸附重金属实验
1)在分别为4mmol/L的Cr2+、Cd2+、Pb2+重金属离子浓度下培养几批菌体,培养时间分别为12h、24h、36h;
2)将培养好的菌体离心、清洗、烘干后准确称取干菌体的重量;
3)用原子吸收光谱仪检测样干菌体,粘质沙雷氏菌XA07的干菌体所能吸附Cr2+金属离子的量可达14.5μg/g,Cd2+金属离子的量可达10.8μg/g,Pb2+金属离子的量可达5.5μg/g。
由此可见,本发明实施例提供的粘质沙雷氏菌对Cr2+、Cd2+、Pb2+具有良好的吸附性能,是良好的生物吸附材料。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种粘质沙雷氏菌,其特征在于,所述粘质沙雷氏菌的序列如序列表中SEQINNO:1所示。
2.一种制备如权利要求1所述的粘质沙雷氏菌的方法,其特征在于,所述方法包括:
在固废垃圾处理厂的废电池与重金属填埋地周边提取土壤样品,将所述土壤样品加入无菌水中并充分振荡,静置后得到上清液,将所述上清液稀释至不同倍数后分别涂布到培养基上,在所述培养基上加入重金属离子,将所述培养基倒置并于28℃培养7d,从所述培养基上挑取表面光滑的圆形单菌落接种到斜面培养基上,在所述斜面培养基上得到粘质沙雷氏菌的原始菌株;
在液体培养基上接种所述原始菌株,于37℃恒温振荡培养过夜,得到菌液,取1mL所述菌液稀释至10-5倍,分别在6个灭菌平皿上铺上10mL稀释菌液,进行紫外线照射后分别吸取200μL所述稀释菌液涂布于含有6.0mg/L3-氨基-9-乙基咔唑的基本固体培养基上,于37℃恒温静置培养10h后进行富集重金属分析得到所述粘质沙雷氏菌。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,采用紫外线灯进行所述紫外线照射,所述紫外线灯的参数为:功率25W,紫外线波长253nm。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在进行紫外线照射时,6个铺有10mL稀释菌液的所述灭菌平皿的照射时间分别为0min、2min、4min、6min、8min和10min。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,将所述上清液采用10倍梯度稀释法进行稀释,得到浓度为10-2、10-3、10-4和10-5的菌液分别涂布到所述培养基上。
6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述培养基为含有Cr2+的肉汤培养基。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:将所述粘质沙雷氏菌进行摇瓶发酵培养,所述摇瓶发酵培养的条件为:发酵温度35-37℃,发酵时间30-36h,转速200-225r/min。
8.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:将所述粘质沙雷氏菌在10L发酵罐中进行试发酵,所述试发酵的条件为:装入4-7L发酵培养基,接种量3-5%,接种菌液浓度为2×108CFU/mL,发酵温度35-37℃,pH6.5-7.5,发酵时间30-36h,转速300-400r/min,通气量1:1。
9.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在进行富集重金属分析时所采用的重金属离子包括:Cd2+、Pb2+和Cr2+。
10.一种如权利要求1所述的粘质沙雷氏菌的应用,其特征在于,所述粘质沙雷氏菌用于修复重金属污染。
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