CN105664155A - 基于dc的乳腺癌治疗性疫苗及其制备方法 - Google Patents

基于dc的乳腺癌治疗性疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于DC的乳腺癌治疗性疫苗及其制备方法，其制备方法包括以下步骤：获取未成熟DC；将乳腺癌抗原复合物与未成熟DC于DC培养基中进行共培养5～9天；再加入肿瘤坏死因子-α继续培养，至DC成熟且负载有乳腺癌抗原复合物；其中，所述乳腺癌抗原复合物是由灭活后的乳腺癌细胞和MUC1单抗复合物共培养获得的。本发明提供的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗免疫原性较强，能够很好的调节乳腺癌的机体免疫机制。

Description

基于DC的乳腺癌治疗性疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程和生物医药领域，特别涉及一种基于DC的乳腺癌治疗性疫苗及其制备方法。
背景技术
乳腺癌是女性排名第一的常见恶性肿瘤，且发病率呈逐年上升趋势。现有的乳腺癌治疗过程中对患者免疫***的损害极大，导致肿瘤治疗过程遇到无法突破的瓶颈，杀瘤能力差，肿瘤无法完全治愈。现阶段细胞因子诱导的杀伤细胞是具有细胞毒作用的免疫活性细胞；树突状细胞是最具潜力的抗原提呈细胞，在初始性免疫和获得性免疫中具有重要作用；树突状细胞是已知机体内抗原提呈递能力最强的细胞，它能捕获抗原，并将信息传递给T、B淋巴细胞，从而引发一系列的特异性免疫应答反应。因此，如果将肿瘤抗原注入树突状细胞，将可引起机体特异性的抗肿瘤免疫反应。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中乳腺癌治疗性疫苗存在免疫反应弱、杀瘤能力差等缺陷，提供一种免疫原性及特异性强的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗及其制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种基于DC的乳腺癌治疗性疫苗的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
获取未成熟DC；
将乳腺癌抗原复合物与未成熟DC于DC培养基中进行共培养5～9天；
再加入肿瘤坏死因子-α继续培养，至DC成熟且负载有乳腺癌抗原复合物；
其中，所述乳腺癌抗原复合物是由灭活后的乳腺癌细胞和MUC1单抗复合物共培养获得的。
在本发明提供的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗的制备方法中，所述未成熟DC与所述乳腺癌抗原复合物的体积比为(3～7)：1。
在本发明提供的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗的制备方法中，所述MUC1单抗复合物的浓度为(0.5～1.5)μg/(1×105)个乳腺癌细胞。
在本发明提供的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗的制备方法中，
所述灭活后的乳腺癌细胞与MUC1单抗复合物共培养的过程，包括以下步骤：
取灭活后的乳腺癌细胞，加入0.5～2％牛血清白蛋白，再加入MUC1单抗复合物共培养0.5～1.5小时。
在本发明提供的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗的制备方法中，
所述灭活后的乳腺癌细胞获取过程，包括以下步骤：
取对数生长期的乳腺癌细胞，洗涤并离心后，制成(0.5～2)×107个/ml的乳腺癌细胞悬液，放入液氮中，并于水浴中完全融化，再次放入液氮中，反复多次置于液氮和水浴中，然后过滤，收集滤液，即灭活后的乳腺癌细胞。
在本发明提供的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗的制备方法中，所述未成熟DC的浓度为(2～5)×105个/ml。
在本发明提供的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗的制备方法中，
所述未成熟DC的获取过程包括以下步骤：
取外周血，通过磁珠筛选出CD14+单核细胞，加入体外诱导培养基进行诱导培养2～6天，至CD14+单核细胞诱导分化成未成熟DC。
在本发明提供的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗的制备方法中，所述DC培养基中添加有750～850U/mL粒-巨噬细胞和900～1100U/mL白介素-4的基础培养基。
在本发明提供的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗的制备方法中，所述肿瘤坏死因子-α在培养基中的终浓度为800～1200U/ml。
本发明还提供一种基于DC的乳腺癌治疗性疫苗，由上述基于DC的乳腺癌治疗性疫苗制备方法所获得的。
实施本发明提供的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗及其制备方法，可以达到以下有益效果：采用由灭活的乳腺癌细胞和MUC1单抗复合物共同作为肿瘤抗原信息的提供者共刺激DC，促进DC的抗原提呈，提高机体的免疫反应，通过本发明获得的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗不仅性状较稳定，而且免疫原性及特异性较强，杀瘤能力较强，能够很好的调节乳腺癌的机体免疫机制。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的一种基于DC的乳腺癌治疗性疫苗，其制备方法包括以下步骤：
S1、获取未成熟DC；
S2、将乳腺癌抗原复合物与未成熟DC于DC培养基中共培养5～9天；其中，乳腺癌抗原复合物是由灭火后的乳腺癌细胞和MUC1单抗复合物共培养所获得的；
S3、然后再加入肿瘤坏死因子-α继续培养，至DC成熟且负载有乳腺癌抗原复合物。
步骤S1中，未成熟DC可来源于人体血液，但由于未成熟DC在血液中仅占单核细胞总数的0.5-1.0％，数量很少；因此，本发明优选实施例中，采取诱导单核细胞的方式获取未成熟DC，具体步骤为：
S11、从外周血中分离出单核细胞；
S12、再加入体外诱导培养基培养2～6天，对步骤S11中获得的单核细胞进行诱导培养至单核细胞转化成未成熟DC。
在步骤S11中，单核细胞可以为CD34+和/或CD14+单核细胞，其中，CD34+单核细胞可以从骨髓、脐带血或脾脏等分离得到；CD14+单核细胞从人外周血分离得到的。由于从脐带血中纯化出CD34+单核细胞费用昂贵；骨髓采集不易，而且容易污染，患者比较痛苦，扩增费用昂贵；而脾脏来源受限等使得CD34+单核细胞获取较困难；因此，在本发明中，优选采用从人外周新鲜血液中分离筛选出CD14+单核细胞，从新鲜血液中获取，相比经过冷库储存或者培养传代之后的CD14+单核细胞，从新鲜血液中提取的CD14+单核细胞离体时间不长，其细胞活性和状态的减弱或者形态改变程度都较少，更加利于获取DC。优选地，本发明中，采用免疫磁珠法从外周血中分离出CD14+单核细胞。
步骤S12中的体外诱导培养基优选为适宜于DC生长的含5％～15％胎牛血清、750～850U/mL粒-巨噬细胞和900～1100U/mL白介素-4的基础培养基。需要特别注意的是，由于DC相比非贴壁细胞其能具有贴壁性，但是其贴壁性能并不强，而是偏向于半贴壁的类型，因此在步骤S13中单个核细胞的培养过程中需采用半量换液，以避免将目的DC吹成悬浮而流失。
当然可以理解的是，本发明获得未成熟DC的途径也并不局限于此，通过其他诱导方法诱导单核细胞获得的未成熟DC同样适用于本发明。
在步骤S2中，优选地，采用含有750～850U/mL粒-巨噬细胞因子和900～1100U/mL白介素-4的DC培养基上将未成熟DC与乳腺癌抗原复合物共培养5～9天；其中，未成熟DC与乳腺癌抗原复合物的体积比为(4～6)：1。
粒-巨噬细胞因子和白介素-4不仅有利于DC的生长增殖，而且有利于DC摄取抗原信息。由于DC有簇状生长的习惯，浓度太高，集结成团，位于中心的DC不易成熟，影响乳腺癌抗原的负载，从而影响疫苗的免疫效果，因此，DC浓度不易过高，在该步骤中，待未成熟DC在DC培养基中的浓度为(2～5)×105个/ml或将步骤S1获得未成熟DC的浓度调整为(2～5)×105个/ml时，加入乳腺癌抗原复合物进行预负载。
由于未成熟DC具有极强的抗原吞噬能力，在摄取抗原(包括体外加工进行内吞，在内体中加工抗原)，并提呈抗原给MHCⅠ和MHCⅡ，从而启动抗原特异性CTL反应；并且未成熟DC表达能介导DC摄取抗原的一些膜受体如Fc受体，因而相比成熟DC拥有更强的抗原摄取、加工和处理能力，因此，步骤S2中利用未成熟DC与乳腺癌抗原复合物共培养能够实现乳腺癌抗原的预负载，促进并提高乳腺癌抗原的负载量，同时，未成熟DC经抗原致敏可至成熟。
进一步地，乳腺癌抗原复合物的获取过程，包括以下步骤：
S21、获取对数生长期的乳腺癌细胞；
S22、对步骤S21中获得的对数生长期的乳腺癌细胞进行灭活处理；
S23、将步骤S22中获得的灭活后的乳腺癌细胞与MUC1单抗复合物共培养0.5～2小时。
其中，在步骤21中，乳腺癌细胞可来源于自体，也可来源于异体；本发明中所采用的乳腺癌细胞来自于中国医学科学院血液病医院提供的MCF-7乳腺癌细胞株。
步骤S22中，乳腺癌细胞灭活的过程，包括以下步骤：
取步骤S21中获取的对数生长期乳腺癌细胞，洗涤后离心，制成浓度为(0.5～2)×107个/ml的乳腺癌细胞悬液，加入生理盐水中，放入液氮，2～8分钟迅速放入30～45℃水浴中，待乳腺癌细胞完全融化后，再次放入液氮中，反复多次置于液氮和水浴中，微孔滤膜过滤，收集滤液，即收获灭活后的乳腺癌细胞，于4℃保存备用。
可以理解的是，以上仅为本发明提供的乳腺癌细胞灭活的一种方法，采用其他方法获得的灭活后的乳腺癌细胞同样适用于本发明。
步骤S23中，灭活后的乳腺癌细胞与MUC1单抗复合物共培养的过程为：在灭活后的乳腺癌细胞中，加入0.5～2％牛血清白蛋白，再加入MUC1单抗复合物共培养0.5～1.5小时，即获得乳腺癌抗原复合物；其中，MUC1单抗复合物的浓度为(0.5～1.5)μg/(1×105)个细胞。
其中，MUC1(人粘蛋白核心肽)基因几乎在所有的上皮细胞腺癌中有所表达，而且其通过MHC限制和非MHC限制两种方式诱导活化CTL，对表达MUC1阳性的肿瘤细胞具有杀伤作用，因而MUC1成为主动特异性免疫治疗癌症的理想靶抗原。本发明中将乳腺癌细胞与MUC1单抗复合物共刺激DC细胞，能够诱导产生特异性的MUC1免疫应答，能够阻断或延迟自发性乳腺癌的发展，并且除了活化CD8+T细胞，还可以活化CD4+T细胞；且融合的DC可以迁移到局部引流***并与T细胞相互作用，促使T细胞发生增殖，产生MUC1特异性CD8+CTL和分泌IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-4、CD4+T细胞，从而产生多种抗肿瘤效应基质，实现全面杀瘤，提高杀瘤率的目的。
在步骤S3中，肿瘤坏死因子-α由体内免疫细胞(如T淋巴细胞、T细胞杂交瘤、T淋巴样细胞系以NK细胞等)分泌的一种单核因子，肿瘤坏死因子-α对未成熟DC的刺激影响作用较强，能够提高肿瘤抗原的负载率，并且能够稳定DC的抗原提呈性的同时促进DC成熟，成熟DC表达的MHC-II类分子、共刺激分子、黏附分子的水平较非成熟DC高，故其抗原提呈能力相对非成熟DC较强，可提高机体免疫反应；优选地，肿瘤坏死因子-α在培养基中的终浓度为800～1200U/ml。
具体实施方式为：
实施例1
基于DC的乳腺癌治疗性疫苗，其制备方法包括以下步骤：
S1、乳腺癌抗原复合物的获取：
S11、取对数生长期的MCF-7乳腺癌细胞，购自于中国医学科学院血液病医院；
S12、采用冻融法对步骤S11中的乳腺癌细胞进行灭活处理；
取对数生长期的乳腺癌细胞，生理盐水洗涤两遍，1800转/分离心后，PBS溶液重悬细胞液，获得1×107个/ml的乳腺癌细胞悬液，取20μL细胞悬液加入100μL生理盐水中，然后放入液氮中，5分钟后迅速放入37℃水浴中，待乳腺癌细胞完全融化后，再次放入液氮中，反复3次，然后微孔滤膜过滤，收集滤液，4℃保存备用。
S13、将灭活后的乳腺癌细胞与MUC1单抗复合物共培养；
取20μL灭活后的乳腺癌细胞加入1％的牛血清白蛋白封闭细胞表面非特异性抗原表位，于4℃下静置30分钟，然后加入2μL的1μg/(1×105)个细胞的MUC1单抗复合物(购自于艾博抗(上海)贸易有限公司)于37℃共培养1小时后，PBS洗涤2次，收集灭活乳腺癌细胞-MUC1单抗复合物并采用细胞免疫荧光间接法鉴定，即收获乳腺癌抗原复合物。
S2、获取未成熟DC；
S21、分离获取CD14+单核细胞；
取20ml人外周血，使用德国美天旎公司MonocyteIsolationKitIIOrderno.130-091-153，按说明书分离出CD14+单核细胞。
S22、将步骤S21获得的CD14+单核细胞诱导分化成未成熟DC；
将CD14+单核细胞接种到含有10％胎牛血清、800U/mL粒-巨噬细胞因子和1000U/mL白介素-4的RPMI-l640培养基中并在37℃，CO2浓度为5％的培养箱中诱导培养4天，隔天半量换液，补充粒-巨噬细胞因子和白介素-4，维持粒-巨噬细胞因子和白介素-4浓度不变，获得未成熟DC。
S3、将未成熟DC与乳腺癌抗原复合物共培养
将未成熟DC与乳腺癌抗原复合物按5:1的体积比混合，其中，未成熟DC浓度为3×105个/ml；然后，加入含有800U/mL粒细胞巨噬细胞因子和1000U/mL的白介素4的DC培养基中共培养7天；
然后，加入1000U/ml的肿瘤坏死因子-α诱导培养两天至DC成熟且已负载上乳腺癌抗原复合物。
实施例2
与本发明提供的实施例1的不同之处在于，在本实施例中，
未成熟DC的浓度为2×105个/ml；
乳腺癌细胞悬液的浓度为0.5×107个/ml；
MUC1单抗复合物的浓度为0.5μg/(1×105)个细胞；
肿瘤坏死因子-α的浓度为800U/ml；
未成熟DC与乳腺癌抗原复合物的体积比为4：1。
实施例3
与本发明提供的实施例1的不同之处在于，在本实施例中，
未成熟DC的浓度为5×105个/ml；
乳腺癌细胞悬液的浓度为2×107个/ml；
MUC1单抗复合物的浓度为1.5μg/(1×105)个细胞；
肿瘤坏死因子-α的浓度为1200U/ml；
未成熟DC与乳腺癌抗原复合物的体积比为6：1。
为进一步验证本发明提供的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗(下简称“DC疫苗”)的显著效果，设置以下实验进行检测验证。
检测实验一、流式细胞仪检测细胞表面分子表达率
检测对象
检测组：本发明实施例1提供的DC疫苗；
对照组：现有技术中DC-肿瘤细胞融合疫苗；
针对实施例1中获得的负载有肿瘤抗原信息的DC培养一周后，经流式细胞术检测DC表面分子CD80表达率为50.06±1.92％，表面分子CD83表达率60.07±2.09％，表面分子CD86表达率52.43±1.67％，表面分子HLA-DR表达率58.80±3.37％，而DC-肿瘤细胞融合疫苗经流式细胞术检测DC表面分子CD80表达率为38.06±2.02％，表面分子CD83表达率40.07±1.06％，表面分子CD86表达率30.03±1.04％，表面分子HLA-DR表达率35.190±2.29％，由此可见，本发明提供的DC疫苗相对于DC-肿瘤细胞融合疫苗所引起的免疫反应较强。
检测实验二、
检测对象：
检测组1～3—分别对应本发明实施例1～3获得的DC疫苗；
对照组—现有技术中由DC和肿瘤细胞共同制成的疫苗；
检测过程：
将靶细胞(乳腺癌细胞)接种于96孔板中(三复孔)，分别对实验组1～3和对照组执行以下操作：
每孔分别按效靶比为5：1、25：1、50：1和100：1加入疫苗，每种效靶比设三个复孔，同时设最大释放组(用浓度为2mol/L的盐酸替代效应细胞)和最小释放组(用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI1640培养基替代效应细胞)；将96孔板500r/min离心30秒后，温度37℃孵育4小时，1000r/min离心10分钟，各孔取上清100μL，用γ计数器测定每分钟放射活性(cpm值)，按下述公式计算杀伤率：杀伤率(％)＝[(实验组cpm均值-最小释放组cpm均值)/(最大释放组cpm均值-最小释放组cpm均值)]×100％，计算杀伤率，计算结果见下表。
表1
效靶比E/T 5:1 25:1 50:1 100:1
检测组1 19.80±2.11 41.29±2.58 59.37±1.50 48.20±2.17
检测组2 17.42±1.64 39.85±2.65 54.42±2.85 47.63±2.41
检测组3 25.22±1.52 47.49±2.57 64.83±1.61 52.73±1.82
对照组 9.37±1.21 16.67±2.31 21.59±140 17.39±1.71
实验结果：如下表1所示，检测组1～3在各效靶比对乳腺癌细胞均有特异性杀伤作用，且随着效靶比增大，特异性杀伤作用逐渐增强，当E/T为50∶1时，杀伤率达到最大值，最高杀伤率为64.83％，而对照组对乳腺癌细胞杀伤率为21.59％；由此表明，本发明提供的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗能够有效激发T细胞产生对乳腺癌细胞的特异性杀伤效应。
以上对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种基于DC的乳腺癌治疗性疫苗的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
获取未成熟DC；
将乳腺癌抗原复合物与未成熟DC于DC培养基中共培养5～9天；
再加入肿瘤坏死因子-α继续培养，至DC成熟且负载有所述乳腺癌抗原复合物；
其中，所述乳腺癌抗原复合物是由灭活后的乳腺癌细胞和MUC1单抗复合物共培养获得的。
2.根据权利要求1所述的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，所述未成熟DC与所述乳腺癌抗原复合物的体积比为(3～7)：1。
3.根据权利要求1所述的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，所述MUC1单抗复合物的浓度为(0.5～1.5)μg/(1×105)个乳腺癌细胞。
4.根据权利要求1或3所述的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，所述灭活后的乳腺癌细胞与MUC1单抗复合物共培养的过程，包括以下步骤：
取灭活后的乳腺癌细胞，加入0.5～2％牛血清白蛋白，再加入MUC1单抗复合物共培养0.5～1.5小时。
5.根据权利要求4所述的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，所述灭活后的乳腺癌细胞获取过程，包括以下步骤：
取对数生长期的乳腺癌细胞，洗涤并离心后，制成(0.5～2)×107个/ml的乳腺癌细胞悬液，放入液氮中，并于水浴中完全融化，再次放入液氮中，反复多次置于液氮和水浴中，然后过滤，收集滤液，即灭活后的乳腺癌细胞。
6.根据权利要求1所述的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，所述未成熟DC的浓度为(2～5)×105个/ml。
7.根据权利要求6所述的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，所述未成熟DC的获取过程包括以下步骤：
取外周血，通过磁珠筛选出CD14+单核细胞，加入体外诱导培养基进行诱导培养2～6天，至CD14+单核细胞诱导分化成未成熟DC。
8.根据权利要求1所述的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，所述DC培养基中添加有750～850U/mL粒-巨噬细胞和900～1100U/mL白介素-4的基础培养基。
9.根据权利要求1所述的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，所述肿瘤坏死因子-α在培养基中的终浓度为800～1200U/ml。
10.一种基于DC的乳腺癌治疗性疫苗，其特征在于，由权利要求1-9任一项所述的基于DC的乳腺癌治疗性疫苗制备方法所获得的。
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