KR101440102B1

KR101440102B1 - 하이드로젤 코팅과 전기천공법을 이용한 강력한 항원제시세포의 제조방법

Info

Publication number: KR101440102B1
Application number: KR1020120120226A
Authority: KR
Inventors: 박유수; 손철훈; 양광모; 조월순; 신동역; 이홍래
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2012-10-29
Filing date: 2012-10-29
Publication date: 2014-09-18
Also published as: KR20140056525A

Abstract

본 발명은 하이드로젤 코팅과 전기천공법을 이용한 강력한 항원제시세포의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 혈액의 백혈구로 부터 말초혈액단핵세포(PBMC)를 분리한 후 단세포(monocyte)를 분리하여 미성숙 수지상세포로 분화킨다. 후에 전기천공법(electroporation)으로 이용하여 항원이 탑재된 미성숙 수지상세포를 하이드로젤(Hydrogel)이 코팅된 배양용기에 넣고 배양하여 성숙 수지상세포로 분화시키는 단계들을 포함하는 항원제시세포인 성숙 수지상 세포 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 종래의 수지상세포배양법 문제점인 부착 및 스프레딩 (spreading) 현상을 방지함으로써 수지상세포의 형태변화를 막아 강력한 항원제시세포로서의 기능을 갖는 수지상세포의 수율을 향상 시킬 수 있다.

Description

하이드로젤 코팅과 전기천공법을 이용한 강력한 항원제시세포의 제조방법 {Manufacturing method of strong antigen-presenting cells using hydrogel coating and electroporation}

본 발명은 하이드로젤 코팅과 전기천공법을 이용한 강력한 항원제시세포의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 혈액의 백혈구로부터 말초혈액단핵세포(PBMC)를 분리한 후 단세포(monocyte)를 분리하여 배양 후 미성숙 수지상세포로 분화킨다. 후에 전기천공법(electroporation)으로 이용하여 항원이 탑재된 미성숙 수지상세포를 하이드로젤(Hydrogel)이 코팅된 배양용기에 넣고 배양하여 성숙 수지상세포로 분화시키는 단계들을 포함하는 항원제시세포인 성숙 수지상 세포 제조방법에 관한 것이다.

수지상세포 (Dendritic cells; DCs)는 선천성(innate) 및 적응(adaptive) 면역시스템의 교량 역할을 하는 가장 강력한 항원제시세포 (Antigen-presenting cells; APC)이다. 수지상세포는 1868년 랑겔한스(Langerhans)에 의해 피부에서 처음 발견되었으며 1973년 칸(Cohn)과 스테인만(Steinmann)에 의해 면역보조 세포로 기능이 알려지게 되었다. 그리고 1990년대에는 강력한 항원제시세포(professional antigen presenting cells; APC)로 기능이 밝혀지면서 적응면역반응을 개시하고 유도하는 중요한 역할을 함을 알게 되었다. 인체 내의 수지상세포는 전체 순환 백혈구의 단지 약 0.3%를 차지할 뿐이지만 대식세포와는 구별되는 표현형을 지닌 이질적인 집단으로 구성되어 있다. 수지상 세포는 비교적 약한 항원제시능력을 지닌 B 세포나 대식세포와는 달리 강력한 항원제시세포라는 점에서 차별화된다. 수지상 세포는 다양한 lineages에서 유래됨이 알려져 있으나, 보통 수지상 세포는 IL-4와 GM-CSF로 자극된 단세포나 또는 단핵구 전구체(CD34+ cell)에서 유래되어 vaccine protocol에 사용되고 있다. 수지상세포가 항원을 탐식하면 MHC 분자 발현이 증가하고 CD80/CD86과 같은 공동작극분자(co-stimulating molecules)의 발현이 증가하면서 빠르게 성숙(mature)된다. 성숙된 수지상세포는 secondary lymphoid organs으로 이동하여 항원 특이적 면역반응을 유도할 수 있는 CD4+와 CD8+ naive T lymphocytes에게 항원정보를 전달한다(Banchereau et al.,1982; Banchereau et al., 2005; Fong et al., 2000). 수지상세포는 IFN-γ 및 IL-12와 같은 사이토카인 (cytokine)을 분비하여 다양한 면역세포를 활성화 시키는 것으로 알려져 있다. 특히, 성숙수지상세포(mature dendritic cells)에 의해 생성된 pro-inflammatory cytokine IL-12는 CD8+ T 세포를 자극하여 Th1 면역반응을 유도하는 중추적인 역할을 한다(Trinchieri et al., 2003). 그러나 수지상세포는 면역반응을 유도하는 T 세포를 자극하는 중요한 역할 (Kapsenberg et al., 2003;Kalinski et al., 1999;Langenkamp et al., 2000)을 할 뿐만 아니라 면역관용(immunological tolerance)을 유도하는 면역억제 T 세포(regulatory T cell; Treg)의 증식에도 영향을 미친다(Steinman et al., 2003;Zou et al., 2006).

Pathogen associated molecular patterns (PAMPSs)으로부터 유래하는 danger signals이나 inflammatory stimuli와 같은 자극인자의 존재하에서 미성숙수지상세포(immature dendritic cells)가 항원을 탐식하게 되면 항원 특이적 면역반응을 유도하는 성숙수지상세포로 분화되게 된다 (Gilboa et al., 2007;Matzinger et al., 2002). 반대로, 미성숙수지상세포가 성숙과정을 억제하는 조건하에서 항원을 탐식하게 되면 적응면역반응을 방해하는 세포표면분자를 발현하게 된다(Morelli et al., 2007;van Kooten et al., 2011).

수지상세포의 성숙은 CD40, CD58, CD80, CD86, CD83 및 LAMP3 (lysosomal-associated membrane protein 3)발현의 증가와 밀접한 관련이 있다. CD80 및 CD86과 같은 공통자극분자는 T 세포의 활성화에 중요한 역할을 한다 (Banchereau et al., 1998;Gilboa et al., 2007;Lanzavecchia et al., 2001;O'Neill et al., 2004). 특히, CD83은 성숙수지상세포의 분화마커로 성숙자극 (maturation stimuli)에 의해 증가 되어지고 T 세포를 자극하는 역할을 한다 (Lechmann et al., 2002). 성숙수지상세포로 분화시키기 위해 cytokine cocktail (TNF, IL-6, IL-1β, and PGE2), CD40L, TNF-a, IFN-a, IFN-γ 및 PolyI:C 등과 같은 여러 가지 생물학적제제(biological agents)등이 사용되고 있다 (Gilboa et al., 2007;Jonuleit et al., 1997).

수지상세포는 혈액 내에 소량 존재하고 분리하기가 어려워 임상에 적용하기에는 큰 장애요인이 되어왔으나 최근 체외(in vitro)에서 혈액 세포나 줄기세포를 이용하여 수지상세포로 분화하는 방법이 개발되면서 암 면역세포치료 임상연구가 활발히 이루어지고 있다. 최근에는 강력한 항원제시세포인 수지상세포의 기능과 수율 (yield)을 높이기 위해 여러 연구들이 진행되고 있다. 선행 연구에서는, 기능적으로 우수한 수지상세포를 유도하기 위해 lipofection, passive pulse, 또는 전기천공 (electroporation) 등과 같은 다양한 종양항원 탑재 (pulsing) 프로토콜들을 개발하여 사용하고 있다 (O'Neill et al., 2004;van Tendeloo et al., 2001;Brossart et al., 2001;Kim et al., 2004). 특히, 전기천공법은 다른 종양항원 탑재 방법들보다 매우 효율적으로 항원을 수지상세포에 탑재할 수 있다는 것을 증명하였다 (Van Tendeloo et al., 2001;Kim et al., 2004). 그러나 이 방법은 기능적으로 우수한 수지상세포를 얻었을 수는 있었지만 다른 방법과 마찬가지로 배양기간 동안 세포의 부착 (attachment) 및 스프레딩 (spreading) 때문에 얻고자 하는 수지상세포의 수율이 높지 않다는 문제점이 있었다. 배양 과정 중에 세포가 배양용기에 부착 (attachment) 되어 형태가 변화거나(spreading) 분화가 제대로 이루어지지 않을 경우 강력한 항원제시세포로서 그 기능을 갖는 수지상세포를 얻기에는 큰 어려움이 따른다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 하이드로젤 (hydrogel) 코팅 배양법과 전기천공법을 접목시켜 수지상세포를 배양하는 경우, 부착 및 스프레딩 (spreading) 현상을 방지함으로써 수지상세포의 형태변화를 막아 수지상세포의 기능 및 수율 향상을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 하이드로젤 (hydrogel) 코팅 배양법과 전기천공법과 접목시켜 수지상세포를 배양하여 수지상세포의 기능 및 수율 향상효과를 갖는 하이드로젤 코팅과 전기천공법을 이용한 강력한 항원제시세포의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포(Dendritic cells)를 제조하는 방법:

a) 혈액의 백혈구로부터 말초혈액단핵세포(PBMC)를 분리하는 단계;

b) 상기 말초혈액단핵세포로부터 단세포(monocyte)를 분리하는 단계;

c) 상기 단세포를 배양하여 미성숙 수지상세포로 분화시키는 단계;

d) 상기 미성숙 수지상세포에 전기천공법(electroporation)으로 종양항원(단백질)을 탑재시키는 단계; 및

e) 상기 항원이 탑재된 미성숙 수지상세포를 하이드로젤(Hydrogel)이 코팅된 배양용기에 넣고 배양하여 성숙 수지상세포로 분화시키는 단계인 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 a)단계의 백혈구는 트리플백(triple bag)이나 백혈구 채집술(apheresis)을 통해 얻어진 백혈구 농축액을 PBS(또는 생리식염수)로 희석한다.

본 발명에 있어서, 상기 a) 단계의 말초혈액단핵세포의 분리는 원심분리를 이용하는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 b) 단계의 단세포의 분리는 배양용기 부착법(plastic-adherent), 맥스 마이크로비드법(MACS MicroBeads), 또는 밀도구배법(Density Gradient)을 이용하는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 c) 단계의 배양은 rhIL-4 및 rhGM-CSF가 첨가된 무동물혈청 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 d) 단계의 전기천공법은 미성숙수지상세포와 종양항원(단백질)을 혼합한 후 스퀘어웨이브 펄스(square wave pulse)을 이용하는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법을 제공한다.

스퀘어웨이브 펄스(square wave pulse) 이외에 Exponential pulse법이 있다. square wave pulse는 일정한 시간 동안 동일한 voltage를 유지시킬 수 있는 방법이고, Exponential pulse는 정해진 voltage만으로 충격을 가하는 방법이다.

전기천공법이란, 세포를 DNA용액에 현탁하여 직류고전압의 펄스를 통과시키면 세포 내에 DNA가 도입되는 것을 이용한 유전자 도입법의 하나로 전기에 의해 세포막에 구멍이 뚫리고 동시에 DNA분자가 전기영동의 작용으로 세포 내로 도입된다. 동물, 식물, 미생물을 막론하고 여러 가지 세포종(種)에 적용이 가능하며 또한, 적당한 조건을 선택하면 상당히 높은 효율로 유전자도입이 가능하므로 널리 사용되고 있다. 또한, 단백질 도입에도 응용되어 사용되고 있다.

본 발명에서 상기 전기천공법을 이용하여 미성숙수지상세포에 항원을 탑재하기 위해 미성숙수지상세포와 항원을 혼합한 후 스퀘어웨이브 펄스 파형을 이용하여 전기천공 한다.

본 발명에 있어서, 상기 e) 단계의 하이드로젤 코팅은 PolyHEMA (poly(2-hydroxyethyl metacrylate)) 하이드로젤 코팅 물질을 이용하는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 하이드로젤 성분인 polyHEMA는 poly(2-hydroxyethyl metacrylate)으로 명명되어 지는 폴리머 (polymer)로 1960년대에 Wichterle에 의해 개발되었다. PolyHEMA는 물을 흡수하여 팽창하고, 부드럽고 탈력성이 있으며, 투수성 (water permeability)과 낮은 표면장력을 가지는 안정한 3차원적인 구조를 가진 물질이다. PolyHEMA는 상대적으로 생산하기 저렴하고, 다른 monomer와 결합이 용이하고, 매우 유연하며, pH와 온도 변화에 안정하기 때문에 세포배양용 코팅 물질로서 적절하다. 또한, 다공성 물질 (porous material)로 알려진 polyHEMA 하이드로젤은 세포의 증식을 자극하고 세포 외 기질 성분 (extracellular matrix components)을 합성할 수 있다. PolyHEMA 하이드로젤은 콘택트 렌즈 (contact lenses), 약물전달 (drug delivery), 치과 (dental) 및 정형외과 이식 (orthopedic implants) 등에서 임상적으로 사용되고 있는 안전한 생체적응재료 (biomaterial) 이다.

본 발명에 있어서, 제 1항에 있어서, 상기 e) 단계의 배양은 성숙유도인자를 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 성숙유도인자로는 미수지상세포를 성숙수지상세포로 성숙시킬 수 있는 어떤 유도 인자도 사용될 수 있으며, 예컨대 CD40L, TNF-a, IFN-a, IFN-γ 및 PolyI:C 이 있으며 바람직하게는, TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE2인 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤 코팅은 하이드로젤 코팅을 하지 않은 것에 비해 성숙 수지상세포의 제조 수율(yield)를 향상시키는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법을 제공한다.

PolyHEMA 하이드로젤 코팅의 유무에 따른 성숙수지상세포 제조 수율 향상에 대한 결과(Fig.1)에서 나타나는 것과 같이 하이드로젤이 코팅 된 배양용기에 배양하여 성숙수지상세포분화를 유도한 것이 하이드로젤이 코팅되지 않은 배양용기에 배양하여 성숙수지상세포분화를 유도한것 보다 성숙수지상세포의 생성이 현저하게 향상됨을 나타내고 있다. 이러한 결과는 수지상세포배양 중 나타나는 부착(attachment) 및 스프레딩(spreading) 문제점을 polyHEMA 하이드로젤 코팅된 배양용기에서 배양함으로써 성숙수지상세포를 높은 수율로 얻을 수 있다는 것과 polyHEMA가 세포배양용 코팅 물질로서 적절하다는 것을 의미한다.

또한, 하이드로젤이 코팅된 배양용기에서 전기천공법을 사용하지 않고 배양한 성숙수지상세포분화가 전기천공법을 사용하여 배양한 성숙수지상세포분화보다 약간 더 높은 수율보다 조금 낮게 나타나는데, 이는 전기천공이 세포에 약간의 손상을 주소 세포수가 약간 감소하는 경향이 있기 때문이다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤 코팅은 하이드로젤 코팅을 하지 않은 것에 비해 수지상세포의 성숙 마커인 CD83 표면항원의 발현을 향상시키는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법을 제공한다.

PolyHEMA 하이드로젤 코팅의 유무에 따라 유도된 성숙수지상세포의 표면항원(phenotype)에 대한 결과(Fig.2)에서 나타나는 것과 같이 공동자극분자인 CD80과 CD86은 모든 배양조건에서 차이가 없었다. 하지만 수지상세포의 성숙 마커인 CD83은 ployHEMA 하이드로젤이 코팅된 조건이 ployHEMA 하이드로젤이 코팅되지 않은 조건보다 현저하게 증가 된 것을 볼 수 있다. 이러한 결과는 T 세포를 자극하는 기능이 증가된 성숙수지상세포를 얻을 수 있음을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤 코팅은 하이드로젤 코팅을 하지 않은 것에 비해 성숙 수지상세포가 더 길고 강한 수상돌기를 가진 둥근 형태의 세포모양을 나타내는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법을 제공한다.

PolyHEMA 하이드로젤 코팅의 유무에 따라 유도된 성숙수지상세포의 표면항원 성상(morphology)에 대한 결과(Fig.3)에서 나타나는 것과 같이 PolyHEMA 하이드로젤로 코팅된 조건에서 분화 유도된 성숙수지상세포는 코팅되지 않은 배양조건에서 분화 유도된 성숙수지상세포보다 더욱 길고 강한 수상 돌기를 가진 둥근 형태의 세포모양을 나타냄을 볼 수 있다. 이는 배양 과정 중에 세포가 배양용기에 부착되어 형태의 변화가 적고 분화가 제대로 이루어질 수 있게 되어 강력한 항원제시세포로서 그 기능을 갖는 수지상세포를 얻을 수 있음을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤 코팅은 하이드로젤 코팅을 하지 않은 것에 비해 수지상세포의 기능을 나타내는 사이토카인(IL-12 및 IFN-r)의 생성을 향상시키는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙수지상세포를 제조하는 방법을 제공한다.

PolyHEMA 하이드로젤 코팅의 유무에 따라 유도된 성숙수지상세포의 사이토카인 생성에 대한 결과(Fig.4)에서 나타나는 것과 같이 PolyHEMA 하이드로젤 코팅된 배양조건에서 유도된 성숙수지상세포의 IL-12 와 IFN-r의 생성량은 PolyHEMA 하이드로젤 코팅되지 않은 배양조건에서 유도된 성숙수지상세포의 IL-12 와 IFN-r의 생성량보다 현저히 증가하는 것을 나타낸다. 이는 기능적으로 우수한 성숙수지상세포를 얻게 되어 IL-12 와 IFN-r와 같은 면역유도 사이토카인을 증가시킬 수 있음을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 전기천공법은 전기천공법을 하지 않은 것에 비해 수지상세포의 성숙 마커인 CD83 표면항원의 발현을 향상시키고, 수지상세포의 기능을 나타내는 사이토카인(IL-12 및 IFN-r)의 생성을 향상시키는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법을 제공한다.

PolyHEMA 하이드로젤 코팅과 전기천공법을 함께 이용하였을 때 유도된 성숙수지상세포의 표면항원(phenotype)에 대한 결과(Fig.2)에서 나타나는 것과 같이 전기천공법을 함께 사용한 배양조건이 사용하지 않은 배양조건보다 현저히 증가 된 것 볼 수 있다. 또한 PolyHEMA 하이드로젤 코팅과 전기천공법을 함께 이용하였을 때 유도된 성숙수지상세포의 사이토카인 생성에 대한 결과(Fig.4)에서 나타나는 것과 같이 전기천공법을 이용하여 항원을 탑재시킨 수지상세포의 IL-12 와 IFN-r 생성량을 더욱 증가 시켰음을 볼 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단계에 따른 성숙수지상세포 제조방법으로 분화시킨 성숙수지상세포를 유효성분으로 함유하는 암 면역세포치료제 조성물을 제공한다.

면역체계가 종양을 인지하고 공격하는 능력이 있음은 잘 알려져 있다. 체액성 및 세포성 면역 모두 종양의 용해에 관여하지만 대부분의 경우에 종양 항원의 특이적 인지를 통한 종양의 퇴축(regression)은 세포면역이 관여한다. 특히 CD8+ cytotoxic T lymphocyte (CTL)가 종양세포를 인지하고 사멸시킬 수 있다는 것이 여러 모델에서 증명되었다 (1. Boon, T., J.C. Cerottini, B. Van den Eynde, P. van derBruggen, and A. Van Pel. 1994. Tumor antigens recognized by T lymphocytes. Annu Rev Immunol 12:337. 2. Celluzzi, C.M., J.I. Mayordomo, W.J. Storkus, M.T. Lotze, and L.D. Falo, Jr. 1996. Peptide-pulsed dendritic cells induce antigen-specific CTL-mediated protective tumor immunity. J Exp Med 183, 1:283. 3. Feltkamp, M.C., H.L.Smits, M.P. Vierboom, R.P. Minnaar, B.M. de Jongh, J.W. Drijfhout, J. ter Schegget, C.J. Melief, and W.M. Kast.1993. Vaccination with cytotoxic T lymphocyte epitope-containing peptide protects against a tumor induced by human papillomavirus type 16- transformed cells. Eur J Immunol 23, 9:2242.3).

수지상 세포(dendritic cell)는 면역반응을 유발시킬 수 있는 유일한 항원제시 세포(antigen-presenting cell)로서 암과 감염 질환의 항원 특이 면역치료에 광범위하게 사용되어 왔다(Banchereau, J., F. Briere, C. Caux, J. Davoust, S. Lebecque, Y.J. Liu, B. Pulendran, and K.Palucka. 2000. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol 18:767.). T 세포가 종양 특이적인 방식으로 종양세포를 인지하고 사멸시킬 수 있도록 수지상 세포가 초기화할 수 있는 능력은 여러 동물 모델에서 보고된 바 있다. 또한 수지상 세포를 기반으로 한 면역(immunization)은 면역학적인 memory를 유발하여 추후의 종양 발생도 막을 수 있게 한다. 수지상 세포는 비교적 약한 항원제시능력을 지닌 B 세포나 대식세포와는 달리 강력한 항원제시세포라는 점에서 차별화된다.

최근에 수지상 세포가 외부에서 유입된 항원에 대하여 proteasome 및 TAP 의존성 기전에 의해 MHC I 분자를 통하여 제시할 능력이 있음이 증명되었다. 따라서 수지상 세포는 외부 항원에 대해서 특별한 처리과정을 통해 T 세포 및 B 세포 모두를 자극할 수 있다. 수지상세포의 이러한 특성 때문에 현재 암 면역치료에 많이 활용하고 있다.

이는 상기 제조방법으로 제조된 성숙수지상세포를 유효성분으로 함유하는 암 면역세포치료제는 암 면역세포치료에서 효과를 나타낼 수 있음을 의미한다.

본 발명의 암 면역세포치료제는 당업계에 일반적인 제형, 예컨대 주사제의 형태로 제조될 수 있으며, 외과 수술적으로 종양부위에 직접 이식하거나, 정맥에 투여된 후 종양부위로 이동할 수 있다. 본 발명의 세포면역치료제는 질병의 유형, 투여경로, 환자의 나이 및 성, 및 질병의 정도에 따라 변할 수 있으나, 바람직하게는 평균 성인의 경우, 1 × 10⁶ ~ 10¹¹ 세포를 투여한다.

이와 같은 결과는 기능적으로 우수한 수지상세포를 유도하기 위해 사용된 전기천공법과 하이드로젤 코팅 배양법을 접목시켜 기능적으로 우수한 수지상세포를 높은 수율로 얻을 수 있다는 것을 의미한다.

세포의 배양용기 부착 및 스프레딩을 방지하는 하이드로젤 코팅 배양법과 기존에 수지상세포에 항원을 효율적으로 탑재시키는 전기천공법을 접목시킴으로써 강력한 항원제시세포로서의 기능을 갖는 성숙수지상세포의 높을 수율 및 기능을 향상시킬 수 있다.

도 1은 PolyHEMA 하이드로젤 코팅 배양조건과 코팅되지 않은 배양조건과 전기천공법을 함께 사용한 배양조건으로부터 유도된 성숙수지상세포의 세포수의 비교값을 나타낸다.
도 2는 PolyHEMA 하이드로젤 코팅 배양조건과 코팅되지 않은 배양조건과 전기천공법을 함께 사용한 배양조건으로부터 유도된 성숙수지상세포의 표면항원 발현 비교값을 나타낸다.
도 4는 PolyHEMA 하이드로젤 코팅 배양조건과 코팅되지 않은 배양조건과 전기천공법을 함께 사용한 배양조건으로부터 유도된 성숙수지상세포에 의한 IL-12 (상기도면) 및 IFN-r(하기도면) 생성량 측정값을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실험예 1: 말초혈액단핵구 ( PBMC , peripheral blood mononuclear cell ) 분리

트리플백 (triple bag)이나 백혈구 채집술 (apheresis)을 통해 얻어진 백혈구 농축액(buffy coat)을 PBS(또는 생리식염수)로 희석하여 밀도구배 용액인 Histopaque-1077 위에 올린 후, 400 × g에서 30분간 실온에서 원심분리 하여 말초혈액단핵세포(PBMC, peripheral blood mononuclear cell)를 얻었다.

실험예 2: 말초혈액단핵세포 ( PBMC )로부터 단세포 ( monocyte ) 분리

1) 배양용기 부착법 (plastic-adherent)

분리된 말초혈액단핵세포를 PBS로 2~3회 세척 후, 무동물혈청 배지에 현탁하여 배양용기에 옮겨, 60~90분 동안 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하였다. 부착되지 않은 세포는 PBS로 조심스럽게 피펫팅 하여 제거하고 배양용기에 부착된 단세포를 얻었다.

2)MACS MicroBeads 법

말초혈액단핵세포에 CD14, CD3, CD19 등과 같은 magnetic microbeads가 부착된 안티바디(antibody)와 반응시켜 칼럼을 통해 고순도의 단세포를 얻었다.

3) 밀도구배법 (Density Gradient)

단세포 분리 용액을 제조하기 위해 밀도구배 용액인 Histopaque-1077의 삼투압과 밀도를 335mOsm 및 1.072g/ml로 조절하였다. (Histopaque-1077 9.35ml + PBS 0.65ml + 5M NaCl 50ul). 말초혈액단핵세포에 이 용액 5ml을 첨가여 잘 혼합시키고 600 Xg에서 20분간 실온에서 원심분리하였다. 분리된 단세포층을 수거하여 고순도의 단세포를 얻었다.

실험예 3: 하이드로젤 코팅 ( Hydrogel coating )

하이드로젤 코팅 전에 배양용기를 에탄올을 이용하여 1~3회 세척한다. PolyHEMA (poly(2-hydroxyethyl metacrylate)) 하이드로젤(hydrogel) 코팅 물질을 최종농도 0.5%가 되게 만들어 에탄올로 세척된 배양용기에 표면이 덥 힐 정도로 첨가하여 무균상태로 건조한다. 건조된 코팅 배양용기는 PBS (또는 생리식염수)로 2~3회 세척하여 사용한다.

실험예 4: 수지상세포 ( Dendritic cells ) 배양

펄싱법(electroporation(-))을 이용하여 미성숙수지상세포에 항원을 탑재하기 위해 실험예 2의 1),2),3)의 방법 (배양용기 부착법, MACS법, 밀도구배법)에 의해 얻어진 단세포는 rhIL-4(1000U/㎖) 및 rhGM-CSF(1000U/㎖)(R&D System)가 첨가된 무동물혈청 배지에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하였다. 배양 3일째, 동량의 rhIL-4(1000U/㎖) 및 rhGM-CSF(1000U/㎖)가 들어있는 신선한 배지를 첨가하였다. 배양 6일째, 분화된 미성숙수지상세포를 조심스럽게 피펫팅하여 배양용기로부터 수거하였다. 항원 탑재(pulsing)를 위해 미성숙수지상세포 (1×10⁶cells/ml)는 polyHEMA 하이드로젤(hydrogel)이 코팅된 배양용기와 코팅되지 않은 배양용기로 옮기고 K562 세포로부터 항원을 추출한 항원 (100ug/1×10⁶cells)을 첨가하였다. 그 후, 성숙유도인자(TNF-α 10ng/㎖ , IL-1β 10ng/㎖ , IL-6 1000U/㎖ and PGE2 1㎍/㎖)를 첨가하여 24시간 동안 추가 배양하여 성숙수지상세포로 분화시켰다.

전기천공법(electroporation(+))을 이용하여 미성숙수지상세포에 항원을 탑재하기 위해 우선 큐벳 (cuvette)에 미성숙수지상세포 (5×10⁶cells/cuvette)와 K562 세포로부터 항원을 추출한 항원 (100ug/1×10⁶cells)을 혼합하여 10분 동안 아이스에서 저온 배양한다. 전기천공은 스퀘어웨이브 펄스 (square wave pulse) 방법을 이용한다. 전기천공 후 즉시 큐벳을 아이스에 넣어 10분 동안 저온 배양한다. 전기천공을 수행한 미성숙수지상세포는 polyHEMA하이드로젤 (hydrogel)이 코팅된 배양용기와 코팅되지 않은 배양용기로 옮긴 후, 성숙유도인자(TNF-α 10ng/㎖ , IL-1β 10ng/㎖ , IL-6 1000U/㎖ and PGE2 1㎍/㎖)를 첨가하여 24시간 동안 추가 배양하여 성숙수지상세포로 분화시켰다.

실험예 5: 성숙수지상세포 제조 수율 측정

PolyHEMA 하이드로젤 코팅이 성숙수지상세포의 생성에 영향을 미치는지 확인하기 위해, 미성숙수지상세포를 polyHEMA 하이드로젤이 코팅된 배양용기와 코팅되지 않은 배양용기에서 24시간 동안 성숙수지상세포로 분화 유도하였다. PolyHEMA 하이드로젤 코팅 배양조건 [Electroporation (-); (A) 3.64 ± 0.38 x 10⁶cells, (B) 3.80 ± 0.39 x 10⁶cells, (C) 3.98 ± 0.36 x 10⁶ cells, Electroporation (+); (A) 3.46 ± 0.39 x 10⁶cells, (B) 3.54 ± 0.34 x 10⁶ cells, (C) 3.56 ± 0.37 x 10⁶ cells]과 코팅되지 않은 배양조건 [(A) 2.62 ± 0.46 x 10⁶cells, (B) 2.74 ± 0.45 x 10⁶ cells, (C) 2.98 ± 0.54 x 10⁶ cells]에서 생성된 성숙수지상세포의 세포수를 비교하였다.

단세포는 말초혈액단핵세포 (PBMC)로부터 배양용기 부착법, MACS법 및 밀도구배법을 통해 각각 분리하였다. 미성숙수지상세포에 항원 탑재를 위해 펄싱 (pulsing) 또는 전기천공방법 (electroporation)을 이용하였다.

그 결과 도 1에서 알 수 있는 바와 같이 polyHEMA 하이드로젤이 코팅된 배양조건에서 성숙수지상세포의 생성이 현저하게 향상 [(A) hydrogel-coated vs. non-coated, P < 0.05; (B) hydrogel-coated vs. non-coated, P < 0.05; (C) hydrogel-coated vs. non-coated, P < 0.05]된 것을 확인하였다.

실험예 6: 수지상세포 성상 및 표면항원 분석

수지상세포의 성상을 확인하기 위해서 수지상세포의 형태를 도립현미경으로 400배 비율로 관찰하였다.

수지상세포 성상 분석 결과 도 3에서 알 수 있는 바와 같이 코팅되지 않은 배양조건 (A) 에서 유도된 성숙수지상세포는 배양용기 표면에 부착된 세포가 많고 수상돌기가 적은 타원형 형태를 나타낸다. 그리고 다양한 형태의 세포가 존재한다. 그러나 polyHEMA 하이드로젤 코팅 배양조건 (B) 에서 유도된 성숙수지상세포는 특징적으로 크고 수상돌기가 많은 둥근 형태를 나타낸다. 또한 polyHEMA 하이드로젤 코팅 하에 electroporation(-)와 electroporation(+) 조건에서 수지상세포 성상에서는 큰 차이를 나타내지 않았다.

표면항원 분석을 위해 FITC-, PE- or PC5-가 접합된 isotype control, anti-CD80, anti-CD83 및 anti-CD86(Beckman Coulter)등의 단일클론항체를 넣어 4℃에서 20분간 반응시킨 후 유세포 분석기로 측정하였다.

표면항원 분석은 수지상세포의 성숙 마커인 CD83은 polyHEMA 코팅 배양조건 [Electroporation (-); (A) 55.08 ± 7.48%, (B) 63.78 ± 6.82%, (C) 60.58 ± 4.66%, Electroporation (+); (A) 72.14 ± 5.53%, (B) 74.02 ± 3.71%, (C) 69.44 ± 6.90%)과 코팅되지 않은 배양조건 [(A) 40.14 ± 3.91%, (B) 43.30 ± 5.34%, (C) 42.22 ± 4.28%)을 비교하였다.

표면항원 분석 결과 도 2에서 알 수 있는 바와 같이 공동자극 분자인 CD80과 CD86 발현의 정도는 polyHEMA 하이드로젤 코팅 배양조건 (electroporation; -/+)과 코팅되지 않은 배양조건에서 통계적인 유의한 차이는 없었다(P > 0.05). 그러나 수지상세포의 성숙 마커인 CD83의 발현은 polyHEMA 하이드로젤 코팅 배양조건 (electroporation; -/+)에서 통계적으로 유의하게 증가하였다. (A) hydrogel-coated vs. non-coated, P < 0.05; (B) hydrogel-coated vs. non-coated, P < 0.05; (C) hydrogel-coated vs. non-coated, P < 0.05.

실험예 7: 수지상세포의 사이토카인 분비능

성숙수지상세포의 IL-12의 분비능을 확인하기 위해서 polyHEMA 하이드로젤(hydrogel)로 코팅된 배양용기와 코팅되지 않은 배양용기에서 배양된 성숙수지상세포의 배양액을 채취하여 ELISA법으로 정량분석 하였다. 또한, 수지상세포에 의해 활성화되는 T 림프구의 IFN-r 분비능을 확인하기 위해 polyHEMA 하이드로젤(hydrogel)로 코팅된 배양용기와 코팅되지 않은 배양용기에서 배양된 각각의 성숙수지상세포 (5 × 10⁵ cells)와 allogeneic 림프구 (1×10⁶cells)를 3일 동안 혼합 배양한 후 배양액을 채취하여 ELISA법으로 정량분석 하였다.

그 결과 도 4에서 알 수 있는 바와 같이 PolyHEMA 하이드로젤 코팅 배양조건 (electroporation; -/+)에서 분화 유도된 성숙수지상세포의 IL-12 생성[Electroporation (-); (a) 824.6 ± 76.7 pg/ml, (b) 894.4 ± 91.3 pg/ml, (c) 869.6 ± 71.3 pg/ml, Electroporation (+); (a) 959.0 ± 65.8 pg/ml, (b) 1016.2 ± 72.0 pg/ml, (c) 972.4 ± 102.9 pg/ml]은 코팅되지 않은 배양조건에서 유도된 성숙수지상세포의 IL-12 생성량 [(a) 585.8 ± 49.9 pg/ml, (b) 647.8 ± 70.1 pg/ml, (c) 630.8 ± 67 pg/ml] 보다 현저하게 증가하였다 (P < 0.05, fig. 4A). 또한, PolyHEMA 하이드로젤 코팅 배양조건에서 유도된 성숙수지상세포 [Electroporation (-); (a) 1001.6 ± 163.5 pg/ml, (b) 1316.4 ± 159.9 pg/ml, (c) 1179.8 ± 107.9 pg/ml, Electroporation (+); (a) 1282.2 ± 49.5 pg/ml, (b) 1480.4 ± 59.7 pg/ml, (c) 1270.8 ± 106.1 pg/ml]가 코팅 되지 않은 배양조건에서 유도된 성숙수지상세포 [(a) 728 ± 130.7 pg/ml, (b) 864.6 ± 66.6 pg/ml, (c) 912.8 ± 56.7 pg/ml] 보다 IFN-r 생성량이 현저히 증가하였다 (P < 0.05, fig. 4B). 특히, polyHEMA 코팅 배양조건은 전기천공법을 이용하여 항원을 탑재시킨 수지상세포의 IL-12 및 IFN-r 생성량을 더욱 증가 시켰다 [(a) electroporation (-) vs. electroporation (+), P < 0.05; (b) electroporation (-) vs. electroporation (+), P < 0.05; (c) electroporation (-) vs. electroporation (+), P < 0.05]. 따라서 이 결과는 polyHEMA 하이드로젤 코팅 배양조건이 성숙수지상세포의 기능을 향상시킨다는 것을 알 수 있다.

Claims

다음 단계들을 포함하는 항원제시세포인 성숙수지상세포(Dendritic cells)를 제조하는 방법:
a) 혈액의 백혈구로 부터 말초혈액단핵세포(PBMC)를 분리하는 단계;
b) 상기 말초혈액단핵세포로부터 단세포(monocyte)를 분리하는 단계;
c) 상기 단세포를 배양하여 미성숙 수지상세포로 분화시키는 단계;
d) 상기 미성숙 수지상세포에 전기천공법(electroporation)으로 종양항원(단백질)을 탑재시키는 단계; 및
e) 상기 항원이 탑재된 미성숙 수지상세포를 하이드로젤(Hydrogel)이 코팅된 배양용기에 넣고 배양하여 성숙 수지상세포로 분화시키는 단계.
제 1항에 있어서, 상기 a) 단계의 말초혈액단핵세포의 분리는 원심분리를 이용하는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 b) 단계의 단세포의 분리는 배양용기 부착법(plastic-adherent), 맥스 마이크로비드법(MACS MicroBeads), 또는 밀도구배법(Density Gradient)을 이용하는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 c) 단계의 배양은 rhIL-4 및 rhGM-CSF가 첨가된 무동물혈청 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 d) 단계의 전기천공법은 미성숙 수지상세포와 종양항원(단백질)을 혼합한 후 스퀘어웨이브 펄스(square wave pulse)을 이용하는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 e) 단계의 하이드로젤 코팅은 PolyHEMA (poly(2-hydroxyethyl metacrylate)) 하이드로젤 코팅 물질을 이용하는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 e) 단계의 배양은 성숙유도인자를 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 성숙유도인자는 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE2인 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하이드로젤 코팅은 하이드로젤 코팅을 하지 않은 것에 비해 성숙 수지상세포의 제조 수율(yield)를 향상시키는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하이드로젤 코팅은 하이드로젤 코팅을 하지 않은 것에 비해 수지상세포의 성숙 마커인 CD83 표면항원의 발현을 향상시키는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법.
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제 1항에 있어서, 상기 하이드로젤 코팅은 하이드로젤 코팅을 하지 않은 것에 비해 수지상세포의 기능을 나타내는 사이토카인(IL-12 및 IFN-r)의 생성을 향상시키는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 전기천공법은 전기천공법은 하지 않은 것에 비해 수지상세포의 성숙 마커인 CD83 표면항원의 발현을 향상시키고, 수지상세포의 기능을 나타내는 사이토카인(IL-12 및 IFN-r)의 생성을 향상시키는 것을 특징으로 하는 항원제시세포인 성숙 수지상세포를 제조하는 방법.
제 1항에 따른 제조방법으로 분화시킨 성숙수지상세포를 유효성분으로 함유하는 암 면역세포치료제 조성물.