CN102844443B

CN102844443B - 用于甲状腺癌诊断和治疗的方法和组合物

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Publication number: CN102844443B
Application number: CN201080053701.1A
Authority: CN
Inventors: 保罗·沃尔菲什; 兰巨·拉尔汉
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Current assignee: Individual
Priority date: 2009-09-21
Filing date: 2010-09-21
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2030-09-21
Also published as: EP2480687B1; AU2010295172A1; CA2773907A1; CN102844443A; EP2480687A1; JP6048660B2; EP2480687A4; AU2010295172B2; JP2013505429A; WO2011032296A1; US20120252022A1

Abstract

本文描述了用于检测、诊断和监测受试者的甲状腺癌的方法，其包括测定在受试者的样品中的包括Ep-ICD和β-联蛋白在内的标志物。本发明还提供用于实施本发明方法的试剂盒和组合物。

Description

用于甲状腺癌诊断和治疗的方法和组合物

发明领域

本发明涉及与甲状腺癌、特别是侵袭性甲状腺癌有关的标志物，用于检测、诊断、预测、监测和表征甲状腺癌以及治疗甲状腺癌的组合物、试剂盒和方法。

发明背景

上皮细胞粘附分子(EpCAM)是一种40kDa跨膜糖蛋白，在几种人恶性肿瘤中频繁过表达[Spizzo等，2004；Went P等，2006；Wenqi D等，2009]。EpCAM最初被鉴定为癌症标志物，这可归于其在快速增殖性上皮肿瘤中的高表达[有关综述见Trzpis M等，2007]。正常上皮以可变但一般低于癌细胞的水平表达EpCAM。它还在正常的干细胞和祖细胞[Stingl J等，2001；Schmelzer E等，2007；Trzpis M等，2008]和在乳腺癌、结肠癌、胰腺癌和***癌的癌引发细胞[Al-Hajj M等，2003；O’Brien CA等，2007；Ricci-Vitiani L等，2007]中过表达。最近，在根治性子宫切除术后的子***患者的外周血中，在表达E6/E7-HPV癌基因的循环肿瘤细胞中检出EpCAM[Weismann P等，2009]。对于许多癌症和正常组织，有大量有关EpCAM染色的数据库。然而，所有这些研究采用针对EpCAM的胞外域的抗体，其可检测EpCAM前体或结合细胞的EpEx或两者[Wenqi D等，2009]。

EpCAM是在细胞粘附、细胞增殖、分化、迁移、细胞周期调节中起重要作用的多效分子并涉及癌症和干细胞信号转导[Munz等，2009]。并不完全了解调节EpCAM表达的分子机制。最近，研究表明调节性膜内蛋白酶解(RIP)体外和体内起其促有丝***信号转导蛋白的作用[Maetzel等，2009]。EpCAM胞外域EpEx通过蛋白酶-TACE和早老蛋白-2的切割和脱落，释放其易位至核的胞内域(Ep-ICD)。Ep-ICD与FHL2和Wnt途径组分β-联蛋白和Lef-1的缔合形成核复合体，该核复合体在Lef-1共有位点上结合DNA，并诱导基因转录，导致细胞增殖增加，而且已经表明该核复合体在免疫缺陷型小鼠中具有致癌性[Maetzel，2009]。鉴于EpCAM作为致癌信号转导蛋白、细胞粘附分子和癌症干细胞标志物的多重作用[Litvinov SV等，1997；Munz等，2009]，确立核Ep-ICD在人类癌症中的临床重要性是非常重要的。

最近报导了核Ep-ICD在人结肠癌中的初步研究，但未报导在正常结肠上皮中的情况[Maetzel，2009]。鉴于在实体瘤中的极大异质性，其它人类癌症中的核Ep-ICD的临床重要性依然有待确立。此外，已经表明EpCAM通过上调c-myc、细胞周期蛋白A和E而增加细胞增殖[Munz等，2004]。

甲状腺癌(TC)代表全部内分泌恶性肿瘤的90％，估计全球年发病率为122,800例，美国新诊断病例约为33,000例[Reis等，2005；Jemal等，2008]。退行发育性甲状腺癌(ATC)是罕见的但却是这种恶性肿瘤极具侵袭性的形式，占全部甲状腺癌的不足2％。ATC通常表现为快速增大的颈部疱块，在局部扩散，压迫邻近结构，具有扩散到局部***和远端位置的趋势[Pasieka JL等，2003；Are C和Shaha 2006]。大多数高度分化的甲状腺癌具有极好预后，5年相对存活率高于95％，尽管其具有早期转移趋势。然而，分化较低的甲状腺肿瘤-退行发育性和其它侵袭性转移性甲状腺癌可以是致命的，其生存时间中值范围为4个月到5年[Are C和Shaha，2006]。临床结局的这种变化可归因于侵袭性和非侵袭性甲状腺肿瘤在其恶性演变期间获得的遗传损伤的差异。

ATC的发病机制与BRAF、RAS、β-联蛋白、PIK3CA、TP53、AXIN1、PTEN和APC基因的突变有关[有关综述见Smallridge RC等，2009]。已经确定在ATC中的基因表达特征，其显示丝氨酸/苏氨酸激酶Polo样激酶1(PLK1)上调，并且已对其作为ATC中的治疗靶标的潜力进行了研究[Salvatore G等，2007CR；Nappi TC等，2009]。然而，没有已证实的鉴定侵袭性TC的预测性分子标志物。

发明概述

本发明涉及甲状腺癌的标志物。具体地说，EpCAM多肽及其结构域(特别是胞外域EpEx和胞内域EP-ICD)和β-联蛋白(本文统称为“多肽甲状腺癌标志物”)及编码这类多肽及其结构域的多核苷酸(本文统称为“多核苷酸甲状腺癌标志物”)构成甲状腺癌、特别是侵袭性甲状腺癌、更特别是退行发育性甲状腺癌(ATC)的生物标记。多肽甲状腺癌标志物和多核苷酸甲状腺癌标志物及其部分或片段有时在本文中统称为“甲状腺癌标志物”。

在本发明的一些方面，术语“甲状腺癌标志物”可包括Wnt蛋白和编码Wnt蛋白的多核苷酸；因此在一些方面“多肽甲状腺癌标志物”包括Wnt蛋白，在一些方面“多核苷酸甲状腺癌标志物”包括编码Wnt蛋白的多核苷酸。

因此，甲状腺癌标志物和与甲状腺癌标志物相互作用的物质，可用于检测、诊断、表征、分类和监测甲状腺癌(即监测癌症的进展或治疗性治疗的功效)，用于鉴定易患甲状腺癌的受试者，以及用于测定预后或患者生存率。在本发明的多个方面，甲状腺癌标志物，特别是Ep-ICD、β-联蛋白和EpEx，用于表征甲状腺癌的侵袭性。在本发明的一些方面，甲状腺癌标志物用于测定转移潜力或患者生存率。本发明还考虑用于评价甲状腺组织的状态的方法和甲状腺癌的诊断和治疗的方法。

与测定其它标志物的方法相比，其中测定一种或多种甲状腺癌标志物的本发明方法可具有提高的灵敏度和/或特异性。提高的临床灵敏度可以是灵敏度提高约5-10％、特别是提高6-9％、更特别是提高8％。在本发明方法的一个实施方案中，在肿瘤样品检出的一种或多种甲状腺癌标志物提供至少约80-99％甲状腺癌临床灵敏度，特别是90-95％、更特别是91％、92％、93％、94％、95％或98％甲状腺癌临床灵敏度。在其中在肿瘤样品中检出核Ep-ICD、核β-联蛋白和胞质β-联蛋白中的一种或多种的本发明的实施方案中，临床灵敏度可大于约80-90％，更特别地大于约80-85％，最特别地大于约83％、84％、85％、90％、95％或98％。临床灵敏度和特异性可采用本领域技术人员已知方法测定。

根据本发明的方法，可通过检测样品中以下物质的存在情况来评价样品中的甲状腺癌标志物：(a)对应于标志物的多肽或多肽片段；(b)具有标志物与之基本相同的至少一部分的转录的核酸或其片段；和/或(c)转录的核酸或其片段，其中所述核酸与标志物杂交。

在本发明的一个方面，提供用于检测患者中与甲状腺癌、特别是侵袭性甲状腺癌、更特别是退行发育性甲状腺癌相关的甲状腺癌标志物的方法，所述方法包括或基本由以下步骤组成：

(a)从患者中获得样品；

(b)检测或鉴定样品中的一种或多种甲状腺癌标志物，和

(c)将检测到的量与对标准物检测到的量进行比较。

根据本发明的方法，可通过例如检测样品中以下物质的存在情况，来对甲状腺组织进行评价或表征：(a)甲状腺癌标志物；(b)具有多核苷酸甲状腺癌标志物与之基本相同的至少一部分的转录的核酸或其片段；和/或(c)转录的核酸或其片段，其中所述核酸与多核苷酸甲状腺癌标志物杂交。样品中的甲状腺癌标志物可通过本文描述的和本领域普遍已知的方法测定。

一方面，本发明提供用于表征或分类甲状腺样品的方法，所述方法包括检测相对于对照的第一多个甲状腺癌标志物的表达差异，所述第一多个标志物由Ep-ICD、β-联蛋白和任选EpEx组成。

本发明的一个方面提供用于检测患者的甲状腺癌的方法，所述方法包括测定获自患者的样品中的甲状腺癌标志物的状态，其中样品状态异常表明存在甲状腺癌。甲状腺癌标志物可与特定疾病期有关。因此，本发明的另一个方面提供诊断患者的甲状腺癌的特定疾病期的方法，所述方法包括测定获自患者的样品中的甲状腺癌标志物的状态，其中标志物的异常状态表明存在特定疾病期。

本发明的另一个方面提供筛查患者的甲状腺癌的方法，所述方法包括鉴定有患甲状腺癌的风险或需要筛查和测定获自患者的样品中的甲状腺癌标志物的状态的患者，其中标志物的异常状态表明存在甲状腺癌或其特定病期。

另一方面提供诊断方法，所述方法包括鉴定作为甲状腺癌治疗的候选者的患者，并且测定获自患者的样品中的甲状腺癌标志物的状态，其中样品中甲状腺癌标志物的异常状态表明治疗是需要的或是必需的。

在本发明的多个方面，异常状态可以是高状态、低状态或负状态。在用于检测或诊断甲状腺癌的本发明的实施方案中，异常状态是高状态。

一方面，本发明提供用于诊断受试者的ATC的方法，所述方法包括：

(a)使受试者的样品与试剂接触，所述试剂能够测量目标甲状腺癌标志物、特别是选自Ep-ICD、β-联蛋白及任选EpEx和c-myc的至少一种甲状腺癌标志物的水平；和

(b)根据与获自取自未患ATC的受试者或在不同时间取自受试者的类似样品的对照水平相比，受试者的样品中Ep-ICD和β-联蛋白中的至少一种及任选c-myc的水平提高以及任选EpEx降低，提供在所述受试者中的ATC的诊断。

在本发明这个方面的实施方案中，所测定的甲状腺癌标志物是核Ep-ICD、核β-联蛋白、胞质β-联蛋白和任选EpEx。

在本发明的一个实施方案中，提供用于在患者中检测与甲状腺癌、特别是侵袭性甲状腺癌、更特别是退行发育性甲状腺癌有关的Ep-ICD、β-联蛋白、EpEx和EpCAM中的一种或多种的方法，所述方法包括或基本由以下步骤组成：

(a)从患者中获得样品；

(b)检测或鉴定样品中的Ep-ICD、β-联蛋白、EpEx和EpCAM中的一种或多种；和

(c)将检测到的量与对标准物检测到的量进行比较。

在本发明的一个具体实施方案中，提供用于诊断患者的ATC的方法，所述方法包括或基本由以下步骤组成：

(a)检测或鉴定样品中的核Ep-ICD、核β-联蛋白和胞质β-联蛋白中的一种或多种；和

(b)将检测到的量与对标准物检测到的量进行比较，其中核Ep-ICD、核β-联蛋白和胞质β-联蛋白中一种或多种增的加表明ATC。

(a)检测或鉴定样品中的核Ep-ICD、核β-联蛋白、胞质β-联蛋白和EpEx(例如膜EpEx)中的一种或多种；和

(b)将检测到的量与对标准物检测到的量进行比较，其中核Ep-ICD、核β-联蛋白和胞质β-联蛋白中一种或多种的增加和EpEx降低或缺乏表明ATC。

在本发明的一个具体方面，提供用于检测患者的与侵袭性或转移性甲状腺癌有关的甲状腺癌标志物、优选Ep-ICD和/或β-联蛋白的方法，所述方法包括或基本由以下步骤组成：

(a)从患者中获取样品(例如肿瘤样品)；

(b)检测样品中的甲状腺癌标志物、优选Ep-ICD和/或β-联蛋白；和

(c)将检测到的量与对标准物检测到的量或截断值进行比较。

术语“检测”或“检出”包括进行分析试验或以别的方式证实一种或多种目标标志物、亚单位或试剂结合的靶标的组合等的存在或缺乏，或进行分析试验以确定、证实或以别的方式测定甲状腺癌的一个或多个实际特性，例如侵袭性、转移潜力或患者生存率。标准可相当于对来自未患疾病或患早期疾病(例如低级别甲状腺癌例如甲状腺***状癌)的对照受试者的样品或来自受试者的其它样品的样品进行定量测定的水平。

本发明提供评价患者是否患有甲状腺癌、特别是侵袭性或转移性甲状腺癌、更特别是ATC或者是否易患甲状腺癌、特别是侵袭性或转移性甲状腺癌、更特别是ATC的方法，所述方法包括比较：

(a)患者的甲状腺癌标志物的水平；和

(b)获自未患有甲状腺癌或患较低级别甲状腺癌的对照患者的相同类型的样品中甲状腺癌标志物的标准水平，其中与甲状腺癌标志物的相应标准水平相比，甲状腺癌标志物水平的改变表明患者患有甲状腺癌、特别是侵袭性或转移性甲状腺癌、更特别是ATC。

在用于评价患者是否患有侵袭性或转移性甲状腺癌、特别是ATC的本发明方法的一个方面，与相应的正常水平或患较低级别甲状腺癌的患者的水平相比，样品中核Ep-ICD、核β-联蛋白或胞质β-联蛋白的较高水平，以及EpEx(例如膜EpEx)的较低水平或缺乏，表明患者患有侵袭性或转移性甲状腺癌，特别是ATC。

在用于评价患者是否患有退行发育性甲状腺癌的本发明方法的一个实施方案中，将患者样品的核Ep-ICD水平与标准进行比较，与标准相比，核Ep-ICD的较高水平表明退行发育性甲状腺癌。

在用于评价患者是否患有退行发育性甲状腺癌的本发明方法的一个实施方案中，将患者样品的核β-联蛋白水平与标准进行比较，与标准相比，核β-联蛋白的较高水平表明退行发育性甲状腺癌。

在用于评价患者是否患有退行发育性甲状腺癌的本发明方法的一个实施方案中，将患者样品的胞质β-联蛋白水平与标准进行比较，与标准相比，胞质β-联蛋白的较高水平表明退行发育性甲状腺癌。

在用于评价患者是否患有退行发育性甲状腺癌的本发明方法的一个实施方案中，将患者样品的膜EpEx水平与标准进行比较，与标准相比，膜EpEx的较低水平或缺乏表明退行发育性甲状腺癌。

在用于评价患者是否患有甲状腺滤泡癌(FTC)的本发明方法的一个实施方案中，将患者样品的膜EpEx、核Ep-ICD、胞质Ep-ICD和β-联蛋白水平与标准进行比较。

在用于评价患者是否患有甲状腺滤泡癌(FTC)的本发明方法的一个实施方案中，将患者样品的膜EpEx、核Ep-ICD和胞质Ep-ICD水平与标准进行比较。在一个实施方案中，不存在核Ep-ICD或存在低水平的核Ep-ICD和任选较高水平的胞质β-联蛋白。

在用于评价患者是否患有甲状腺***状癌(PTC)的本发明方法的一个实施方案中，将患者样品的膜EpEx、核Ep-ICD、胞质Ep-ICD和β-联蛋白水平与标准进行比较。在一个实施方案中，不存在核Ep-ICD和β-联蛋白或存在低水平的核Ep-ICD和β-联蛋白。

在用于评价患者是否患有甲状腺鳞状细胞癌的本发明方法的一个实施方案中，将患者样品的膜EpEx、核Ep-ICD、胞质Ep-ICD和β-联蛋白水平与标准进行比较。

在具体方面，本发明的方法用于诊断受试者的甲状腺癌病期或表征受试者的甲状腺癌。在一个实施方案中，所述方法包括比较：

(a)患者样品的甲状腺癌标志物(例如活组织检查样品)的水平；和

(b)获自无甲状腺癌的患者或患不同期的甲状腺癌(例如低级别甲状腺癌)的对照患者的相同类型的对照样品或在不同时间取自患者的样品的甲状腺癌标志物水平，其中相对于对照样品的相应水平，甲状腺癌标志物水平的改变表明患者患有更大侵袭性或转移性的甲状腺癌。

在实施方案中，侵袭性甲状腺癌是ATC，甲状腺癌标志物是核Ep-ICD、核β-联蛋白和胞质β-联蛋白中的一种或多种。在具体实施方案中，甲状腺癌标志物是核Ep-ICD。

本发明还提供用于检测或诊断受试者的甲状腺癌、特别是侵袭性或转移性甲状腺癌、更特别是ATC的非侵入性非手术方法，所述方法包括：从受试者中获取样品(例如活组织检查样品)；对样品进行检测一种或多种甲状腺癌标志物的步骤；通过将一种或多种甲状腺癌标志物的水平与获自无甲状腺癌或较低级别甲状腺癌的对照受试者或在不同时间取自患者的样品的一种或多种甲状腺癌标志物的水平进行比较，来检测或诊断甲状腺癌。在本发明该方法的实施方案中，一种或多种甲状腺癌标志物是核Ep-ICD、核β-联蛋白、胞质β-联蛋白中的一种或多种。在具体实施方案中，甲状腺癌标志物是核Ep-ICD。

在本发明的多个方面，通过确定在与获自对照或在不同时间取自患者的样品的这类水平进行比较时核Ep-ICD、核β-联蛋白、胞质β-联蛋白中的一种或多种水平升高，来检测、诊断或表征侵袭性甲状腺癌、特别是ATC。

在一个具体实施方案中，本发明提供用于诊断受试者的甲状腺癌的侵袭性的方法，所述方法包括：

(a)测定受试者样品(例如肿瘤样品)中核Ep-ICD的量；

(b)测定样品中核β-联蛋白和β-联蛋白中的一种或两种的量；

(c)测定样品中EpEx的量；

(d)以数学方法组合步骤(a)和步骤(b)及任选步骤(c)的结果，得到数学组合；和

(e)将数学组合与甲状腺癌的侵袭性相比较或者使数学组合与甲状腺癌的侵袭性相关联。

优选将组合与预先确定的标准的数学组合进行比较。

一方面，本发明提供用于监测患者的甲状腺癌进展的方法，所述方法包括：

(a)在第一时间点检测患者样品(例如活组织检查样品)中的一种或多种甲状腺癌标志物；

(b)在随后的时间点上重复步骤(a)；和

(c)比较在(a)和(b)中检出的水平，从而监测患者的甲状腺癌的进展。

本发明提供将患有甲状腺癌的患者分类的方法，所述方法包括测定患者样品(例如肿瘤样品)的一种或多种甲状腺癌标志物，使所测定的值与对分类组别中已分级的甲状腺癌患者的甲状腺癌标志物测定的值相关联。该方法可用于预测患者生存率，其中一种或多种甲状腺癌标志物预测生存率，且其中分类组别包括已知总体生存率的组别。在本发明该方法的方面，一种或多种甲状腺癌标志物选自Ep-ICD和β-联蛋白，特别是核Ep-ICD、核β-联蛋白和胞质β-联蛋白。在各个实施方案中，可使所测定的值归一化，以得到更准确的量化，并纠正实验偏差。

在本发明特别有用的方面，检测多核苷酸甲状腺癌标志物，优选编码Ep-ICD和/或β-联蛋白的多核苷酸，将患者样品(例如活组织检查样品)的多核苷酸甲状腺癌标志物的水平与得自无甲状腺癌、患较低级别甲状腺癌患者的样品的多核苷酸甲状腺癌标志物水平或者得自相同患者的样品的水平进行比较。本发明的方法可使用能够与多核苷酸甲状腺癌标志物和优选编码Ep-ICD的多核苷酸杂交的一种或多种多核苷酸、寡核苷酸或核酸。在本发明的一个方面，检测Ep-ICD mRNA。

本发明涉及用于诊断和表征受试者样品的甲状腺癌、更特别是甲状腺癌的病期的方法，所述方法包括从样品分离核酸、优选mRNA，并检测样品中的多核苷酸甲状腺癌标志物。在一个实施方案中，与标准或对照相比，样品中编码Ep-ICD和/或β-联蛋白的多核苷酸水平升高的存在表明甲状腺癌的侵袭性或转移潜力，特别表明ATC。

本发明还提供用于测定受试者的甲状腺癌存在与否或甲状腺癌的侵袭性或转移潜力、特别是测定受试者的ATC的方法，所述方法包括测定样品中与一种或多种多核苷酸甲状腺癌标志物杂交的核酸的水平，将该水平与预先确定的标准或截断值进行比较，由此测定受试者的甲状腺癌存在与否或者甲状腺癌的侵袭性或转移潜力，特别是测定受试者的ATC。在一个实施方案中，提供用于测定受试者的甲状腺癌的侵袭性或转移潜力的方法，所述方法包括：(a)使取自受试者的样品与同编码Ep-ICD和/或β-联蛋白的多核苷酸杂交的寡核苷酸接触；和(b)检测样品中相对于预先确定的标准或截断值的与寡核苷酸杂交的核酸的水平，由此测定受试者的癌症的侵袭性或转移潜力。

一方面，本发明提供评价患者的甲状腺癌的侵袭性或转移潜力的方法，所述方法包括比较：

(a)患者样品中一种或多种多核苷酸甲状腺癌标志物的水平；和

(b)获自未患甲状腺癌或患较低级别甲状腺癌的对照患者的相同类型的样品或者在不同时间取自患者的样品中的一种或多种多核苷酸甲状腺癌标志物的对照水平，其中与相应的一种或多种多核苷酸甲状腺癌标志物的对照水平相比，一种或多种多核苷酸甲状腺癌标志物水平的改变表明甲状腺癌的侵袭性或转移潜力。

在用于评价患者是否患有侵袭性或转移性甲状腺癌、特别是ATC的本发明的一个具体方法中，与相应的对照水平相比，样品中Ep-ICD和/或β-联蛋白的较高水平表明患者患有侵袭性或转移性甲状腺癌。

在某些实施方案中，使用例如与一种或多种多核苷酸甲状腺癌标志物或这类多核苷酸的互补序列杂交的至少一种寡核苷酸引物，通过扩增反应例如聚合酶链式反应(PCR)，检测是mRNA的核酸的量。在其它实施方案中，使用与一种或多种多核苷酸甲状腺癌标志物或其互补序列杂交的寡核苷酸探针，应用杂交技术检测mRNA的量。

当采用mRNA检测时，可如下进行该方法：通过按照标准方法将分离的mRNA与试剂混合以转化成cDNA；所转化的cDNA用扩增反应试剂连同引物的合适混合物处理以产生扩增产物；和分析扩增产物以检测样品中一种或多种多核苷酸甲状腺癌标志物的存在情况。对于mRNA，可采用RT-PCR分析以检测一种或多种多核苷酸甲状腺癌标志物的存在情况，来完成分析步骤。可如下来完成分析步骤：通过定量检测扩增产物中一种或多种多核苷酸甲状腺癌标志物的存在情况，和对针对使用类似引物得到的已知在正常和恶性肿瘤样品(例如组织样品，特别是患有不同期甲状腺癌的患者的组织样品)存在或缺乏的一组预期值检测的一种或多种多核苷酸甲状腺癌标志物的量进行比较。

因此，本发明提供其中通过以下步骤检测mRNA的方法：(a)从样品中分离mRNA，使mRNA与试剂混合以将其转化成cDNA；(b)转化的cDNA用扩增反应试剂和与一种或多种多核苷酸甲状腺癌标志物杂交的核酸引物处理以产生扩增产物；(d)分析扩增产物以检测一种或多种mRNA多核苷酸甲状腺癌标志物的量；和(e)将mRNA的量与针对用类似核酸引物得到的正常组织和恶性肿瘤组织(例如患有不同病期的甲状腺癌的患者的组织)的一组预期值检测的量进行比较。

基于蛋白质的方法也可用于诊断和监测受试者的甲状腺癌、特别是甲状腺癌的侵袭性或转移潜力、更特别是ATC，所述方法包括检测受试者样品中的甲状腺癌标志物。可使用甲状腺癌标志物的结合剂，优选与甲状腺癌标志物或其组成部分有特异性反应的抗体，来检测甲状腺癌标志物。

本发明提供评价患者是否患有甲状腺癌、特别是侵袭性或转移性甲状腺癌、更特别是ATC的方法，所述方法包括比较：

(a)患者样品中多肽甲状腺癌标志物的水平；和

(b)非癌样品或患较低级别甲状腺癌的患者的样品或在不同时间取自患者的样品中的多肽甲状腺癌标志物的对照水平，其中与对照水平相比，患者样品中多肽甲状腺癌标志物显著不同的水平(例如患者样品中的较高水平)表明患者患有甲状腺癌或侵袭性或转移性甲状腺癌，特别是ATC。

在另一方面，本发明提供用于测定患者中甲状腺癌存在与否或者甲状腺癌的侵袭性或转移潜力、特别是ATC的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使获自患者的生物样品与特异性结合一种或多种多肽甲状腺癌标志物的结合剂接触；和(b)检测样品中相对于预先确定的标准或截断值的结合一种或多种结合剂的一种或多种多肽甲状腺癌标志物的量，由此确定患者的甲状腺癌的侵袭性或转移潜力存在与否。

在一个实施方案中，本发明涉及通过定量测定受试者的生物样品中一种或多种多肽甲状腺癌标志物，对受试者的甲状腺癌进行检测、诊断、分期和监测的方法，所述方法包括：(a)使生物样品与对一种或多种多肽甲状腺癌标志物有特异性的抗体反应，所述抗体用可检测物质直接或间接标记；和(b)检测所述可检测物质。

在另一个实施方案中，本发明提供使用抗体检测样品中一种或多种多肽甲状腺癌标志物的表达的方法，所述方法包括：(a)在允许抗体：蛋白质复合物形成的条件下，将对一种或多种多肽甲状腺癌标志物有特异性的抗体与样品混合；和(b)检测复合物形成，其中复合物形成表明样品中一种或多种多肽甲状腺癌标志物的表达。可将表达与标准进行比较，并对甲状腺癌或甲状腺癌的侵袭性或转移潜力、特别是ATC作出诊断。

一方面，本发明提供用于监测患者中甲状腺癌的进展的方法，所述方法包括：

(a)在第一时间点检测患者样品中的一种或多种多肽甲状腺癌标志物；和

(b)在随后的时间点上重复步骤(a)；和

本发明还涉及评价治疗患者的甲状腺癌、更特别是侵袭性或转移性甲状腺癌的功效的方法。该方法包括比较：

(a)在向患者提供至少一部分治疗前获自患者的第一样品中的甲状腺癌标志物的水平；和

(b)在治疗后获自患者的第二样品中的甲状腺癌标志物的水平。

与第一样品相比，第二样品中显著不同的甲状腺癌标志物水平表明治疗对抑制甲状腺癌、更特别是退行发育性甲状腺癌有效。在一个实施方案中，方法用来评价治疗抑制甲状腺癌、更特别是侵袭性或转移性甲状腺癌的功效，与第一样品相比，第二样品中核Ep-ICD、核β-联蛋白或胞质β-联蛋白的较低水平，表明治疗对抑制癌症或转移有效。治疗可以是用于治疗甲状腺癌的任何疗法，包括但不限于化学疗法、免疫疗法、基因疗法、放射疗法和组织的手术切除。因此，在治疗之前、期间和之后，该方法可用于评价患者，例如用于评价肿瘤负荷、肿瘤的侵袭性或转移潜力的降低。

本发明考虑用于测定环境因素对甲状腺组织或甲状腺癌的作用的方法，所述方法包括比较在环境因素存在和不存在的情况下的甲状腺癌标志物。

本发明还提供用于评价试验物质治疗甲状腺癌的潜在功效的方法和选择治疗甲状腺癌的物质的方法。

本发明考虑评价试验化合物有助于甲状腺癌的潜力的方法，所述方法包括：

(a)在试验化合物存在和不存在的情况下，维持单独的患病细胞的等分部分；和

(b)将各个等分部分中的甲状腺癌标志物水平进行比较。

在存在试验化合物的情况下维持(或暴露于试验化合物)的等分部分相对于在不存在试验化合物的情况下维持的等分部分在标志物水平之间的显著差异，表明试验化合物可能有助于甲状腺癌。

本发明还提供包含甲状腺癌标志物或与甲状腺癌标志物相互作用的物质的药物组合物或诊断组合物。具体地讲，本发明提供包含多肽甲状腺癌标志物或与这类标志物结合或与多核苷酸甲状腺癌标志物杂交或扩增多核苷酸甲状腺癌标志物的物质的药物组合物或诊断组合物。

在一个实施方案中，组合物包含与多核苷酸甲状腺癌标志物或其片段特异性杂交的探针。在另一个实施方案中，提供包含能够应用聚合酶链式反应方法扩增多核苷酸甲状腺癌标志物的特异性引物对的组合物。在又一个实施方案中，组合物包含与多肽甲状腺癌标志物或其片段结合的一种或多种结合剂(例如抗体)。探针、引物和结合剂可用可检测物质标记。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物或诊断组合物包含对Ep-ICD、β-联蛋白和/或EpEx有特异性的抗体。在一个实施方案中，本发明的药物组合物或诊断组合物包含与编码Ep-ICD、β-联蛋白和/或EpEx的多核苷酸杂交的核苷酸(例如探针)。在一个实施方案中，本发明的诊断组合物包含扩增编码Ep-ICD、β-联蛋白和/或EpEx的多核苷酸的引物。

另一方面，本发明涉及与甲状腺癌标志物相互作用的物质在制备用于诊断甲状腺癌、特别是甲状腺癌的侵袭性或转移潜力、更特别是ATC的组合物中的用途。

本发明的方法可包括检测Wnt蛋白和编码Wnt蛋白的多核苷酸。本发明的方法还可包括检测与甲状腺癌有关的其它标志物，例如半乳凝素-3、甲状腺球蛋白、E-钙黏着蛋白、β-肌动蛋白、FHL2和Lef-1。此外，甲状腺癌标志物的量可与其它甲状腺癌的标志物在数学上组合。在一个实施方案中，本发明提供用于检测或诊断受试者的甲状腺癌的方法，所述方法包括：

(a)测定受试者样品中的甲状腺癌标志物的量；

(b)测定样品中与甲状腺癌有关的其它标志物的量，特别是选自半乳凝素-3、甲状腺球蛋白、E-钙黏着蛋白、c-Myc、β-肌动蛋白、FHL2和Lef-1的标志物的量；

(c)以数学方法组合步骤(a)和步骤(b)的结果，得到数学组合；和

(d)将数学组合与甲状腺癌的存在情况或甲状腺癌的侵袭性或转移潜力相比较或者使数学组合与甲状腺癌的存在情况或甲状腺癌的侵袭性或转移潜力相关联。

优选将组合与预先确定的标准的数学组合进行比较。在具体方面，本发明提供用于通过测定受试者样品中甲状腺癌标志物及半乳凝素-3和甲状腺球蛋白中的一种或两种的组合，来检测、表征或诊断甲状腺癌的方法。

本发明还包括用于实施本发明方法的试剂盒。一方面，本发明提供包括甲状腺癌标志物的用于检测、诊断或表征甲状腺癌的试剂盒。在一个具体方面，本发明提供用于诊断或表征受试者的甲状腺癌的试验试剂盒，其包括与一种或多种甲状腺癌标志物相互作用的物质。在一个实施方案中，试剂盒用于评价患者是否患有侵袭性或转移性甲状腺癌、特别是ATC，且包括用于鉴定和/或评价Ep-ICD、β-联蛋白和任选EpEx的水平的试剂。

本发明因此考虑包括将携带用于成像的标记且与一种或多种甲状腺癌标志物结合的一种或多种物质给予哺乳动物，然后对哺乳动物进行成像的体内方法。按照本发明的一个优选方面，提供用于使甲状腺癌成像的体内方法，所述方法包括：

(a)用与一种或多种甲状腺癌标志物结合的物质给患者注射，该物质携带使甲状腺癌成像的标记；

(b)使该物质在体内温育并与一种或多种甲状腺癌标志物结合；和

(c)检测定位于甲状腺癌的标记的存在情况。

在本发明的一个实施方案中，该物质是识别一种或多种甲状腺癌标志物的抗体。在本发明的另一个实施方案中，该物质是识别一种或多种甲状腺癌标志物的化学实体。

该物质携带使一种或多种甲状腺癌标志物成像的标记。用于成像的标记的实例是放射性标记、荧光标记(例如荧光素和罗丹明)、核磁共振活性标记、通过正电子成像术(“PET”)扫描器可检测的正电子发射同位素、化学发光物(chemiluminescer)(例如萤光素)和酶标志物(例如过氧化物酶或磷酸酶)。还可采用通过短程检测器探针可检测的短程辐射发射体(radiationemitter)，例如同位素。

本发明还考虑使用甲状腺癌的多种标志物的本文所述的定位或成像方法。

本发明提供治疗甲状腺癌、特别是ATC的方法，所述方法包括给予受试者本发明的药物组合物或使用本发明的药物组合物。一方面，本发明提供可在治疗上用于破坏或抑制甲状腺癌细胞(例如ATC细胞)的生长或者阻断Ep-ICD或β-联蛋白活性的对Ep-ICD或β-联蛋白有特异性的拮抗剂(例如抗体)。另外，Ep-ICD或β-联蛋白可用于各种免疫治疗方法以促进免疫介导的对表达Ep-ICD或β-联蛋白的肿瘤的破坏或生长抑制。

本发明的其它目的、特征和优势从下面的发明详述来看将是显而易见的。然而，应当理解的是，在指明本发明的优选实施方案的同时，仅通过阐述给出发明详述和具体实例，因为从本发明详述来看，在本发明的精神和范围内的各种改动和修改对本领域技术人员而言将变得显而易见。

附图描述

下面将参照附图对本发明进行描述，其中：

图1.甲状腺癌中EpEx、Ep-ICD和β-联蛋白的免疫组织化学分析。退行发育性甲状腺癌不显示可检测的膜EpEx染色(IA)；所分析的甲状腺癌的所有其它亚型和正常甲状腺组织显示质膜EpEX染色(IB-IF)。仅在未分化和分化差的甲状腺癌中观察到核Ep-ICD染色(IIA-IIC和IIF)，但在高度分化的甲状腺癌和正常甲状腺组织中未观察到(IID、IIE)。与核Ep-ICD染色相关，在侵袭性甲状腺癌中观察到核或胞质β-联蛋白染色(IIIA-IIIC和IIIF)，而在较低侵袭性甲状腺癌和正常甲状腺组织中观察到膜染色(IIID、IIIE)。

图2.相同甲状腺癌患者中EpEx、Ep-ICD和β-联蛋白的免疫组织化学分析。在退行发育性甲状腺癌切片中未观察到膜EpEx染色(IA)，在鳞状细胞切片中观察到微弱的膜EpEx染色(IB)，在分化差的切片和正常切片两者中观察到强的膜EpEx染色(IC、ID)。未分化和分化差的切片中的核和胞质Ep-ICD染色(IIA-IIC)，在正常组织中的膜和胞质染色(IID)。退行发育性甲状腺癌切片中的核和胞质β联蛋白染色(IIIA)，该样品中其它亚类的膜β-联蛋白染色(IIIB-IIID)。

图3.在甲状腺癌中EpEx、Ep-ICD和β-联蛋白表达的箱形图分析。箱形图显示在正常甲状腺组织和甲状腺癌的不同类型的石蜡包埋切片中通过免疫组织化学测定的免疫染色总评分的分布。垂直轴给出如实施例1中所述得到的免疫染色总评分。组图A表示EpEx染色的箱形图-I描绘在正常组织和PTC中的膜定位、在ATC中无可检测的表达、在FTC和SCC中表达的不同降低(其评分中值为3，黑体水平线)。组图AII描绘EpEx在正常组织、PTC、PDPTC、PDFTC和FTC中的胞质定位、在ATC中无可检测的表达和在SCC中表达的不同降低。组图AIII描绘在正常组织和甲状腺癌的所有亚型中无可检测的EpEx核定位。组图B表示Ep-ICD染色的箱形图。组图BI表示在正常组织、PTC、ATC、FTC和SCC、PDPTC和PDFTC中可变的Ep-ICD膜定位。组图BII描绘在正常组织、PTC、ATC、FTC和SCC、PDPTC和PDFTC中的胞质Ep-ICD定位。组图BIII描绘与评分中值为0的PTC、FTC、PDPTC、PDFTC和正常甲状腺组织相比，在ATC中的核定位和在SCC中的不同表达(评分中值为3，黑体水平线，范围0-4，用垂直条形柱表示)。组图C表示β-联蛋白染色的箱形图-CI描绘仅ATC中有核染色。组图CII表示所分析的所有甲状腺癌亚型的胞质β-联蛋白。组图CIII表示正常组织和除大多数ATC以外的所分析的所有甲状腺癌亚型中的膜β-联蛋白。组图D表示采用Visiopharm Integrator System的甲状腺癌不同亚型中的Ep-ICD核染色。所分析的所有ATC和1个PDPTC和1个PDFTC显示核Ep-ICD表达。

图4.人甲状腺原发性肿瘤中EpCAM的定量实时PCR分析。直方图表示在甲状腺癌的不同亚类中EpCAM转录物的水平。

图5.总体生存率的累积比例的Kaplan-Meier估计：(A)膜EpEx表达的丧失。(B)核Ep-ICD蓄积。(C)核β-联蛋白蓄积。(D)甲状腺癌中核Ep-ICD和β-联蛋白伴随表达。

图6.人甲状腺癌衍生细胞系中的EpCAM表达。(A)组图I-免疫细胞化学-EpEx染色在ARO(结肠癌细胞，之前认为是ATC细胞)、WRO(结肠癌细胞，之前认为是侵袭性甲状腺滤泡癌细胞)和TT(甲状腺髓样癌细胞)中定位于质膜；在CAL-62中检出胞质Ep-Ex，而在TPC-1(低级别甲状腺***状癌细胞)中未观察到EpEx染色(原始放大倍数x 200)。组图II-用Ep-ICD(1144)的免疫细胞化学法。Ep-ICD染色在ARO(结肠癌细胞，之前认为是ATC细胞)、WRO(结肠癌细胞，之前认为是侵袭性甲状腺滤泡癌细胞)和TT(甲状腺髓样癌细胞)中定位于质膜和胞质；在CAL-62中检出胞质Ep-ICD，而TPC-1(低级别甲状腺***状癌细胞)中未观察到Ep-ICD染色(原始放大倍数x 200)。组图III.免疫荧光-EpEx染色定位于ARO、WRO和TT的质膜(中间组图)和CAL-62的胞质(原始放大倍数x 400)。组图IV-为了界定核定位，显示了4′-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核酸染色(原始放大倍数x 400)。(B)免疫荧光分析。用MOC-31的强EpEx染色在ARO和WRO细胞中定位于质膜，而Ep-ICD染色在CAL 62细胞中定准于胞质和核(原始放大倍数x 400)。(C)同一组的甲状腺癌细胞系中EpCAM表达的蛋白质印迹分析。细胞裂解物用SDS-PAGE分离，并使用抗EpCAM抗体(B302)探测EpCAM(上组图)。为了确保等量加样，探测相同裂解物的β-肌动蛋白(下组图)。在ARO、WRO和TT细胞中观察到一个40kDa条带，但在TPC-1细胞中未检出条带。(D)同一组甲状腺癌细胞系中EpCAM的定量实时PCR分析。显示了在ARO、WRO、TT细胞中EpCAM与GAPDH的比率，而在TPC-1细胞中无法定量检出转录物。(E)同一组甲状腺癌细胞系中用MOC-31的免疫荧光EpEx染色和β-联蛋白。(F)同一组甲状腺癌细胞系中用MOC-31的免疫荧光EpEx染色和c-myc。

图7表示用免疫毒素VB4-845/VB6-845治疗癌细胞系和阳性对照结肠癌细胞系后EpCAM阳性甲状腺癌细胞增殖的抑制。

图8表示在用不同浓度的VB4-845治疗之前和之后，通过蛋白质印迹法测定的VB4-845对EpCAM在细胞系中表达的作用。

图9表示用甲状腺***状癌-1(TPC-1)细胞和VB4(A)和PBS(B)治疗的SCID小鼠中肿瘤大小的变化。

图10是显示甲状腺癌中EpEx膜染色的散点图。

图11是显示甲状腺癌中EpEx胞质染色的散点图。

图12是显示甲状腺癌中Ep-ICD膜染色的散点图。

图13是显示甲状腺癌中Ep-ICD胞质染色的散点图。

图14是显示甲状腺癌中Ep-ICD核染色的散点图。

图15是将ATC与PTC区别开的EpICD核染色的ROC曲线分析。

图16是将ATC与PTC区别开的EpEx膜染色的ROC分析。

图17表示甲状腺肿瘤中EpEx和Ep-ICD表达的免疫组织化学分析。显微照片表示甲状腺良性肿瘤(A)、甲状腺非侵袭性恶性肿瘤(C)、甲状腺侵袭性恶性肿瘤(E)和(G)中膜表达的EpEx染色；在甲状腺良性肿瘤(B)、甲状腺非侵袭性恶性肿瘤(D)、甲状腺侵袭性恶性肿瘤(F)和(H)中观察到Ep-ICD核表达。M，膜染色；N，核染色。所有显微照片使用原始放大倍数x 400。

图18是菲律宾患者中膜EpEx表达的散点图分析。散点图显示在甲状腺良性肿瘤、临床非侵袭性和侵袭性甲状腺恶性肿瘤中免疫染色总评分的分布。垂直轴给出如实施例中所述的免疫组织化学染色总评分。≥4的截断值用来确定阳性。在所分析的大多数侵袭性菲律宾人恶性肿瘤病例中观察到EpEx的膜表达减少；在所有良性肿瘤病例和非侵袭性恶性肿瘤病例中观察到高的膜EpEx表达。≤4的截断值评分用来确定阳性(膜表达丧失)。

图19是菲律宾患者中核Ep-ICD表达的散点图分析。散点图显示在甲状腺良性肿瘤、临床非侵袭性和侵袭性甲状腺恶性肿瘤中测定的免疫染色总评分的分布。垂直轴给出如实施例中所述的免疫组织化学染色总评分。≥4的截断值用来确定阳性。在所分析的几乎所有侵袭性菲律宾人甲状腺恶性肿瘤中观察到Ep-ICD的核表达升高，但在良性肿瘤和非侵袭性恶性肿瘤病例中未观察到。

图20表示菲律宾人甲状腺良性肿瘤、非侵袭性和侵袭性癌症中膜EpEX(A、C)和核Ep-ICD(B、D)的接受者操作特征(ROC)曲线。根据膜EpEx和核Ep-ICD表达的灵敏度和1-特异性绘制ROC曲线。垂直轴表明灵敏度，水平轴表明1-特异性。对于癌症的灵敏度、特异性和曲线下面积(AUC)值概括于表8。

图21表示核Ep-ICD(B)的和膜EpEx表达丧失(A)的箱形图分析。

图22表示膜EpEx表达和核Ep-ICD表达的箱形图分析。箱形图显示通过对甲状腺良性肿瘤、临床非侵袭性和侵袭性甲状腺恶性肿瘤的组织切片的免疫组织化学测定的免疫染色总评分的分布。垂直轴给出如实施例中所述的免疫组织化学染色总评分。A.在所分析的大多数侵袭性菲律宾人恶性肿瘤病例中观察到EpEx的膜表达减少；在所有良性肿瘤病例和非侵袭性恶性肿瘤病例中观察到高的膜EpEx表达。≤4的截断值用来确定阳性(膜表达丧失)。B.在所分析的几乎所有侵袭性菲律宾人甲状腺恶性肿瘤中观察到Ep-ICD的核表达增加，但在良性肿瘤和非侵袭性恶性肿瘤病例中未观察到。≥4的截断值用来确定阳性。

发明详述

本发明涉及新发现的甲状腺癌标志物的表达与甲状腺癌、特别是甲状腺癌的侵袭性或转移潜力、更特别是ATC之间的关系。本文所述甲状腺癌标志物提供用于诊断、检测或表征甲状腺癌、特别是甲状腺癌的侵袭性或转移潜力、更特别是ATC的方法。提供用于诊断或检测样品中侵袭性或转移性甲状腺癌是否存在、用于监测甲状腺癌的进展以及提供有关与患者的甲状腺癌的诊断和表征有关的甲状腺癌的特征的信息的方法。

除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。下面的定义补充本领域的定义，针对本申请，而不归因于任何相关或不相关的情况。虽然在实施本发明时可采用类似或等同于本文所述方法和材料的任何方法和材料，但是本文描述了具体的材料和方法。

本文通过端点列举的数值范围包括归入该范围内的所有数值和分数(例如1-5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。还要理解的是，假定所有数值及其分数被术语“约”修饰。术语“约”意指所提及的数值正负0.1-50％、5-50％或10-40％、优选10-20％、更优选10％或15％。本文和随附权利要求书中使用的单数形式包括复数形式，除非文中另有明确说明。

术语“甲状腺癌”是指甲状腺的任何恶性进程。甲状腺癌的实例包括但不限于甲状腺***状癌、甲状腺***状癌的滤泡变体、滤泡癌、Hurthle细胞肿瘤、退行发育性甲状腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺淋巴瘤、分化差的甲状腺癌和甲状腺血管肉瘤。在本发明的多方面，甲状腺癌是甲状腺髓样癌。在本发明的多方面，甲状腺癌是侵袭性癌或具有转移潜力、特别是侵袭性甲状腺髓样癌或甲状腺滤泡癌或具有转移潜力的甲状腺髓样癌或甲状腺滤泡癌。在本发明的多方面，甲状腺癌是退行发育性甲状腺癌(ATC)。

“转移潜力”是指癌细胞从最初部位(即甲状腺)移动至机体的其它部位的能力或可能性。

术语“样品”等意指已知或疑似表达或含有甲状腺癌标志物或结合剂的材料，结合剂为例如对多肽甲状腺癌标志物有特异性的抗体。样品可来源于生物来源(“生物样品”)，例如组织(例如活组织检查样品)、提取物或包括细胞(例如肿瘤细胞)、细胞裂解物在内的细胞培养物和生物或生理流体，例如全血、血浆、血清、唾液、脑髓液、汗、尿液、乳汁、腹膜液等。获自来源的样品或在预处理以改进样品特征(例如从血液制备血浆、稀释黏液等)后的样品可直接使用。在本发明的某些方面，样品是人生理流体，例如人血清。在本发明的某些方面，样品是活组织检查样品。在本发明的某些方面，样品是良性、恶性或正常组织样品。

可按照本发明进行分析的样品包括临床相关来源的多核苷酸，优选表达的RNA或由此得到的核酸(cDNA或来源于掺入RNA聚合酶启动子的cDNA的扩增RNA)。正如本领域技术人员应理解的是，靶多核苷酸可包括RNA，包括而不限于细胞总RNA、聚(A)⁺信使RNA(mRNA)或其部分、胞质mRNA或由cDNA转录的RNA(即cRNA)。

可采用本领域已知方法，在一个或多个核苷酸上对靶多核苷酸进行可检测标记。标记优选沿RNA长度均匀掺入，更优选以高度效率进行。可检测标记可以是而不限于发光标记、荧光标记、生物发光标记、化学发光标记、放射性标记和比色标记。

可对患者样品的靶多核苷酸进行区别于标准物的多核苷酸地标记。标准物可包含正常个体(例如未患或易患甲状腺癌的个体)的靶多核苷酸(特别是由正常个体或患不同病期的患者的样品合并的)。靶多核苷酸可来源于同一个体，但在不同的时间点取得，因此在疗程期间和之后通过标志物表达的改变或其缺乏来表明治疗的功效。

术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文可互换使用，是指温血动物，例如患有或疑似患有、易患或对其筛查甲状腺癌、特别是实际的或疑似的侵袭性甲状腺癌或转移潜力、更特别是ATC的哺乳动物。该术语包括但不限于家畜、运动动物、灵长类动物和人。优选该术语是指人。

本文所用术语“疑似患有甲状腺癌的受试者”是指呈现表明甲状腺癌的一种或多种症状(例如明显的肿块或疱块)或对其筛查癌症(例如例行体检期间)的受试者。疑似患有甲状腺癌的受试者还可能有一种或多种风险因素。疑似患有甲状腺癌的受试者一般未针对癌症进行检测。然而，“疑似患有甲状腺癌的受试者”包括已接受初步诊断但癌症病期未知的个体。该术语还包括曾患癌症的人(例如消退情况下的个体)。

本文所用术语“有甲状腺癌风险的受试者”是指具有发生甲状腺癌、特别是侵袭性或转移性甲状腺癌、更特别是ATC的一种或多种风险因素的受试者。风险因素包括但不限于性别、年龄、遗传倾向性、环境暴露、之前的癌症事件、先前存在的非癌症疾病和生活方式。

本文所用术语在受试者中“表征甲状腺癌”是指鉴定受试者癌症样品的一种或多种性质，包括但不限于受试者的预后或生存率。癌症可通过鉴定一种或多种标志物的表达来表征，所述标志物包括但不限于本文公开的甲状腺癌标志物。

本文所用术语“治疗”是指用于部分或完全减轻、改善、缓解特定病况的一种或多种症状或特征、抑制、预防、延缓特定病况的一种或多种症状或特征的发生、降低特定病况的一种或多种症状或特征的严重程度和/或降低特定病况的一种或多种症状或特征的发病率的任何方法。可将治疗给予不显示病况体征和/或只显示早期病况体征的受试者，目的在于降低发生与病况有关的病理的风险。因此，根据受试者的状态，在本发明的一些方面，该术语可指预防病况，并包括预防发病或预防与病况有关的症状。该术语还包括维持病况和/或症状，使得病况和/或症状的严重程度不发展。治疗可以急性或慢性方式进行。该术语还指减轻病况或与在患有病况之前与该病况有关的症状的严重程度。这种患病之前病况的预防或病况严重程度的减轻是指给予在给药时未患病的受试者治疗。预防还包括预防病况或与这类病况有关的一种或多种症状的复发。术语“治疗”和“治疗上的”是指治疗的行动，如上述“治疗”的定义。介入的目的是与病况抗争，包括给予治疗以预防或延缓症状或并发症的发生，或者减轻症状或并发症，或者消除病况。

“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，表示通过共价和/或非共价键连接的氨基酸的至少一个分子链。该术语包括肽、寡肽和蛋白质及多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。蛋白质片段、类似物、突变蛋白质或变体蛋白质、融合蛋白等也包括在该术语的含义中。

术语“EpCAM”是指包含表皮生长因子(EGF)样结构域和甲状腺球蛋白重复序列结构域的I型膜蛋白。具体地讲，它由大的胞外域(265个氨基酸)(EpEx)、23个氨基酸的单一跨膜组成部分(SEQ ID NO.1的氨基酸266-288)和26个氨基酸的短的胞质结构域(Ep-ICD-SEQ ID NO.1的氨基酸289-413)组成。两个EGF样重复序列位于胞外域内(Balzar等，2001)。成熟酶由314个氨基酸组成。[有关EpCAM(CD326)的综述参见Baeuerie PA和O Gires，British Journal of Cancer(2007)96，第417-423页]。该术语包括EpCAM、特别是人EpCAM的天然序列多肽、同种型、前体和嵌合蛋白或融合蛋白。可用于本发明的EpCAM多肽包括而不限于包含存在于检索号NP_002345和SEQ ID NO.1中的序列的多肽。在本发明的具体方面，EpCAM的结构域被用于本发明的方法，特别是Ep-ICD和EpEx。

术语“β-联蛋白”是指粘附连接蛋白，其含有几个犰狳重复序列，即参与蛋白质-蛋白质相互作用的约50个氨基酸的序列。每个重复序列由3个螺旋组成，具有彼此反向平行并垂直于螺旋2的螺旋1和3及允许螺旋1和2急剧转向的保守氨酸残基(参见Aberle H等，J Cell Sci.1994 Dec；107(Pt12)：3655-63；van Hengel，J.等，Cytogenet.Cell Genet.70(1-2)，68-70(1995))。该术语包括β-联蛋白、特别是人β-联蛋白的天然序列多肽、同种型、前体和嵌合蛋白或融合蛋白。可应用于本发明的β-联蛋白多肽包括而不限于包含存在于Swiss-Prot检索号：P35222.1、Genbank NP_001091679和SEQ IDNO.7的序列的多肽。

“Wnt蛋白”是指在胚胎发生期间调节细胞-细胞间相互作用的高度保守的分泌信号分子家族。Wnt蛋白包括调节Wnt信号分子的产生、其与靶细胞上的受体的相互作用和导致细胞与Wnt配体(包括靶蛋白)接触的靶细胞生理反应的蛋白质。Wnt蛋白包括而不限于Wnt蛋白(例如Wnt1、Wnt3、Wnt4、Wnt5B、Wnt7A、Wnt10A、Wnt10B)、Frizzled(FRZ)家族的细胞表面受体、Dishevelled家族蛋白质、轴蛋白(例如Axin1、Axin2)、WTX、PORC1、RSPO4、VANGL1、GSK-3、APC、TCF/LEF家族转录因子(例如TCF4)、跨膜蛋白LRP、硬化蛋白(sclerostin)、三聚体G蛋白、CK1、GSK3、Norrin、WTX、PORC1、RSPO4、VANGL1和靶蛋白例如C-myc。(参见MacDonald BT等，Dev Cell.2009 Jul；17(1)：9-26；Cadigan KM Curr Biol.2008 Oct28；18(20)：R943-7)。

“天然序列多肽”包括具有与天然来源多肽相同的氨基酸序列的多肽。这类天然序列多肽可从自然界分离出来或可通过重组或合成方法产生。该术语特别包括多肽的天然存在的截短或分泌形式、多肽变体包括天然存在的变体形式(例如可变剪接形式或剪接变体)和天然存在的等位基因变体。

术语“多肽变体”意指与天然序列多肽具有以下氨基酸序列同一性的多肽：至少约10％、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％、特别是至少约70-80％、更特别是至少约85％、还更特别是至少约90％、最特别至少约95％、97％或99％氨基酸序列同一性。特定的多肽变体与检索号NP_002345和SEQ IDNO：1或Swiss-Prot检索号：P35222.1、Genbank NP_001091679和SEQ IDNO.7确定的序列具有以下氨基酸序列同一性：至少70-80％、85％、90％、95％、97％或99％。这类变体包括例如其中将一个或多个氨基酸残基加入多肽全长或成熟序列的N端或C端或者从多肽全长或成熟序列的N端或C端缺失一个或多个氨基酸残基的多肽，包括来自其它物种的变体，但不包括天然序列多肽。在本发明的多方面，变体保持相应的天然序列多肽的免疫原性活性。

2个氨基酸序列或2个核酸序列的序列同一性定义为在比对序列和必要时引入空位以达到最大百分比序列同一性后，且不考虑任何保守取代作为序列同一性的组成部分，与多肽的氨基酸残基或核酸序列相同的候选序列的氨基酸残基或核苷酸的百分比。可以各种常规方式实现目的是测定百分比氨基酸或核酸序列同一性的比对，例如应用可公开获取的计算机软件，包括GCG程序包(Devereux J.等，Nucleic Acids Research 12(1)：387，1984)；BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul，S.F.等，J.Molec.Biol.215：403-410，1990)。BLAST X程序可公开获自NCBI和其它来源(BLAST Manual，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)。技术人员可确定用于测定比对的合适参数，包括在待比较序列全长内达到最大比对所需要的任何算法。可公开获取的计算机程序对测定同一性和相似性的方法进行了编程。

多肽变体包括包含这样的氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与包含比全长多肽少的氨基酸的天然多肽的氨基酸序列充分相同或来源于包含比全长多肽少的氨基酸的天然多肽的氨基酸序列。多肽的部分或片段可以是长为例如3-5、8-10、10、15、15-20、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸的多肽。其中缺失多肽的区域的部分或片段可通过重组技术制备，并可针对一种或多种功能活性进行评价，例如形成对多肽有特异性的抗体的能力。多肽的部分或片段可包含多肽的结构域，特别是胞外域或胞内域。

还可通过将取代、添加或缺失引入编码天然多肽序列的核酸，使得将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入编码的蛋白质中，来产生等位基因变体。突变可通过标准方法引入，例如位点定向诱变和PCR介导的诱变。在一个实施方案中，保守取代在一个或多个预测的非必需氨基酸残基上进行。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代，若干种具有类似侧链的氨基酸残基是本领域已知的。

天然存在的等位基因变体可含有来自天然多肽序列的保守氨基酸取代，或者可含有来自多肽类似物(例如鼠多肽)相应位置上的氨基酸的取代。

本文公开的多肽包括嵌合蛋白或融合蛋白。“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含与异源多肽(即不同的多肽)有效连接的多肽的全部或部分(优选有生物活性的部分)。在融合蛋白内，术语“有效连接”欲指多肽和异源多肽彼此符合读框地融合。异源多肽可与多肽的N端或C端融合。一种有用的融合蛋白是GST融合蛋白，其中多肽与GST序列的C端融合。融合蛋白的另一个实例是免疫球蛋白融合蛋白，其中多肽的全部或部分与来源于免疫球蛋白蛋白质家族成员的序列融合。嵌合蛋白和融合蛋白可通过标准重组DNA技术产生。

用于本文公开的方法的多肽可分离自多种来源，例如来自人组织类型或来自其它来源，或通过重组或合成方法或者通过这些技术和类似技术的任何组合制备。

“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的多聚体形式，为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。该术语包括双链和单链DNA和RNA，例如多核苷酸的甲基化或帽化等修饰形式和未修饰形式。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文可互换使用。多核苷酸可但非必需包括其它编码或非编码序列，或者它可以(但不一定)与其它分子和/或载体或支持材料连接。用于本发明方法的多核苷酸可具有适于具体方法的任何长度。在某些应用中，术语是指反义核酸分子(例如处于有义多核苷酸甲状腺癌标志物的相反方向的mRNA或DNA链)。

多核苷酸甲状腺癌标志物包括编码多肽甲状腺癌标志物的多核苷酸，多肽甲状腺癌标志物包括天然序列多肽、包括多肽甲状腺癌标志物一部分的多肽变体、同种型、前体和嵌合多肽。编码可用于本发明的EpCAM多肽的多核苷酸包括而不限于包含检索号UniProtKB/TrEMBL Q6FG26、UniProtKB/Swiss-Prot 16422、Genbank NM_002354和BC014785或SEQ IDNO.2的序列或其片段的核酸。编码可应用于本发明的β-联蛋白多肽的多核苷酸包括而不限于包含GenBank检索号NM_001904.3、NM_001098209、或NM_001098210、或SEQ ID NO.8、9或10的序列的核酸。

用于本发明方法的多核苷酸包括互补核酸序列和与这些序列基本相同的核酸(例如至少约10％、20％、30％、40％或45％、优选50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性)。

多核苷酸还包括因遗传密码简并而不同于核酸序列的序列。举例来说，本文公开的甲状腺癌标志物的核苷酸序列内的DNA序列多态性可导致不影响氨基酸序列的沉默突变。一个或多个核苷酸的变异可由于天然等位基因变异而存在于群体内的个体中。还可存在导致多肽的氨基酸序列改变的DNA序列多态性。

可用于本文公开的方法的多核苷酸还包括在严格条件下、优选高严格性条件下与多核苷酸甲状腺癌标志物核酸序列杂交的核酸。促进DNA杂交的适当严格性条件为本领域技术人员所知，或可参见Ausubel等(主编)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。总的来讲，可选择比在规定离子强度和pH下特定序列的热解链温度(Tm)低约5℃的严格条件。Tm是在其下平衡时50％与靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度(在规定的离子强度、pH和核酸浓度下)。总的来讲，严格条件可为这样的条件，其中盐浓度小于约1.0M钠离子或其它盐(例如约0.01-1.0M钠离子)，对于短的探针、引物或寡核苷酸(例如10-50个核苷酸)温度至少约为30℃，而对于较长的探针、引物和寡核苷酸温度至少为60℃。例如，杂交可在6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)下于约45℃进行，接着2.0x SSC于50℃洗涤，或在含有6xSCC、0.5％SDS和50％甲酰胺的溶液中于42℃洗涤，接着在0.1x SCC和0.5％SDS的溶液中于68℃洗涤。

多核苷酸甲状腺癌标志物还包括截短核酸或核酸片段和通过可变剪接对应于DNA的mRNA而产生的本文公开或引用的核酸的变体形式。多核苷酸片段包括包含对应于(即等同于或互补于)规定核苷酸序列区的连续序列的多核苷酸序列，所述连续序列具有大约至少约6个核苷酸、特别是至少约8个核苷酸、更特别是至少约10-12个核苷酸、甚至更特别是15-20核苷酸。

与对照或标准(例如正常水平、不同病期的水平或患者其它样品的水平)相比，患者样品中标志物“显著不同的”水平或标志物水平的“显著差异”可表示高于或低于检测试验的标准误差的水平，优选水平分别为对照或标准的至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍或者为对照或标准的至多约1/1.5、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9或1/10。

“微阵列”和“阵列”是指可用来检测与甲状腺癌有关的生物分子(例如测定基因表达)的核酸或核苷酸阵列或蛋白质或肽阵列。多种阵列是市售可获得的，例如由Affymetrix，Inc.制造的原位合成的寡核苷酸阵列GeneChip^TM或由Incyte Genomics Inc.制造的有斑点的cDNA阵列LifeArray^TM。微阵列的制造、使用和分析为本领域技术人员所熟知。(参见例如Brennan，T.M.等(1995)，美国专利号5,474,796；Schena等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93：10614-10619；Baldeschweiler等(1995)，PCT申请WO95/251116；Shalon，D.等(1995)PCT申请WO95/35505；Heller，R.A.等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：2150-2155；以及Heller，M.J.等(1997)，美国专利号5,605,662)。

“结合剂”是指例如与多肽甲状腺癌标志物特异性结合的多肽、抗体、核糖体或适体等物质。如果物质以可检测的水平与多肽甲状腺癌标志物起反应，而不与含有无关序列或不同多肽的序列的肽可检测地起反应，则它与多肽甲状腺癌标志物“特异性结合”。可采用本领域技术人员可容易进行的ELISA来评价结合性质。

结合剂可以是含或不含肽组分的核糖体、RNA或DNA分子或多肽。结合剂可以是包含多肽甲状腺癌标志物序列、其肽变体或这类序列的非肽模拟物的多肽。举例来说，多肽甲状腺癌标志物序列可以是能够调节由多肽介导的功能的多肽的肽部分。

适体包括与核酸和蛋白质结合的DNA或RNA分子。与甲状腺癌标志物结合的适体可在无需过多实验的情况下利用常规技术产生。[例如参见下列描述适体体外选择的出版物：Klug等，Mol.Biol.Reports 20：97-107(1994)；Wallis等，Chem.Biol.2：543-552(1995)；Ellington，Curr.Biol.4：427-429(1994)；Lato等，Chem.Biol.2：291-303(1995)；Conrad等，Mol.Div.1：69-78(1995)；以及Uphoff等，Curr.Opin.Struct.Biol.6：281-287(1996)]。

用于本发明的抗体包括但不限于合成抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗体片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)₂)、dAb(结构域抗体；参见Ward等，1989，Nature，341：544-546)、抗体重链、胞内抗体、人源化抗体、人抗体、抗体轻链、单链F_vs(scFv)(例如包括单特异性、双特异性等)、抗独特型(ant-Id)抗体、包含抗体部分的蛋白质、嵌合抗体(例如含有鼠抗体的结合特异性但其中其余部分是人来源的抗体)、衍生物例如酶缀合物或标记的衍生物、双链抗体、线性抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、上述任一种的表位结合片段和包含所需特异性的抗原识别部位的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。抗体包括任何类型(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如IgG2a和IgG2b)的抗体，抗体不必是任何特定的类型、类别或亚类。在本发明的某些实施方案中，抗体是IgG抗体或其类别或亚类。抗体可来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物(例如人、鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡)。

“重组抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的抗体，例如使用转染至宿主细胞的重组表达载体表达的抗体、自重组的组合抗体文库分离的抗体、自人免疫球蛋白基因转基因和/或转染色体的动物(例如小鼠或牛)分离的抗体；或者通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪切为其它DNA序列的任何其它方法制备、表达、产生或分离的抗体。

“单克隆抗体”是指自一群同源或大致同源的抗体中得到的抗体。各个单克隆抗体一般识别抗原的单一表位。在本发明多方面，单克隆抗体是由单一杂交瘤或其它细胞产生的抗体，只与甲状腺癌标志物特异性结合，正如例如通过ELISA或本领域已知的其它抗原结合测定法或竞争结合测定法所测定的一样。该术语不限于用于制备抗体的具体方法，例如它们可通过杂交瘤方法产生，或可采用本领域已知方法自噬菌体文库分离。

包括单克隆和多克隆抗体、片段和嵌合体的抗体可采用本领域技术人员众所周知的方法制备。可利用分离的天然多肽甲状腺癌标志物或重组多肽甲状腺癌标志物制备抗体。对于单克隆抗体的制备参见例如Kohler等(1975)Nature 256：495-497；Kozbor等(1985)J.Immunol Methods 81：31-42；Cote等(1983)Proc Natl Acad Sci 80：2026-2030和Cole等(1984)Mol Cell Biol62：109-120；对于单克隆Fab片段的制备参见Huse等(1989)Science246：1275-1281；而对于鉴定抗体的噬菌粒或B淋巴细胞免疫球蛋白文库的制备参见Pound(1998)Immunochemical Protocols，Humana Press，Totowa，N.J。对多肽甲状腺癌标志物有特异性的抗体还可获自学术或商业来源。在本发明的一个实施方案中，如果它们结合的K_a大于或等于10^-7M，则抗体具有针对多肽甲状腺癌标志物的反应性。

对EpCAM多肽有特异性的抗体的实例见表1。

标志物的“状态”是指标志物的存在、缺乏或程度/水平或标志物的一些物理、化学或遗传特征。这类特征包括而不限于表达水平、活性水平、结构(序列信息)、拷贝数、翻译后修饰等。可直接或间接测定标志物的状态。在一些实施方案中，通过测定样品中标志物的水平来确定状态。样品中组分的“水平”具有其在本领域的常规含义，包括定量测定(例如mg/mL、倍数变化等)和定性测定(例如测定标志物是否存在或确定标志物的水平相对于标准是高、是低还是相等)。

术语“异常状态”意指样品中标志物的状态不同于标志物的参比状态。参比状态可以是来自正常受试者的样品、患病受试者的平均样品或来自相同受试者的在不同时间取得的一种或多种样品中的标志物状态。异常状态包括一种或多种标志物增加、降低、存在或缺乏。测定样品中标志物的水平可包括测定样品中标志物的水平，异常状态可以是与标准相比的较低水平(包括未检出水平)或较高水平(包括超过零的任何量)。如果受试者样品中标志物的状态与病况有关(例如标志物的水平接近标准或参比或者以超过某种阈值的水平存在，其中超过该值与病况有关)，则受试者可患本文所公开的病况的可能性加大。患本文所公开的病况的可能性加大的受试者包括具有标志物异常状态的受试者，因此比起受试者不具有该状态的情形，受试者具有该病况的可能性较高。

“高状态”意指标志物的一个或多个特征高于标准。在本发明的多方面，该术语是指与标准相比某特征增加。“低状态”意指标志物的一个或多个特征低于标准。在本发明的多方面，该术语是指与标准相比某特征降低。“负状态”意指标志物的一个或多个特征不存在或未检出。

通用方法

多种方法可应用于包括甲状腺癌标志物的甲状腺癌的诊断和预后评价和易患这类病症的受试者的鉴定。这类方法可利用例如多核苷酸甲状腺癌标志物和其片段以及针对包括肽片段在内的多肽甲状腺癌标志物的结合剂(例如抗体)。具体地讲，多核苷酸和抗体可用于例如(1)检测多核苷酸突变的存在情况，或检测相对于非病症状态mRNA的过表达或表达不足，或者定性或定量检测与某些病况或这类病况的易感性有关的多核苷酸转录物的可变剪接形式；和(2)检测相对于非病症状态多肽的过量丰度或丰度不足或者与病症状态或病症状态的进展有关的修饰(例如小于全长)多肽的存在情况。

本文所述方法可用于评价例如从宿主新鲜取出的细胞群中存在恶性细胞的概率。这类方法可用来检测肿瘤、量化和监测其生长，并有助于疾病的诊断和预后。例如，核Ep-ICD、核β-联蛋白或胞质β-联蛋白的较高水平表明侵袭性甲状腺癌或转移性甲状腺癌，特别是ATC。

一方面，本发明考虑用于测定甲状腺癌、更特别是ATC的侵袭性或病期的方法，所述方法包括得到患者细胞中的多肽甲状腺癌标志物和与甲状腺癌有关的其它标志物的水平概况，并将该概况与参比进行比较以鉴定表明疾病的侵袭性或病期的试验细胞的概况。

本发明的方法需要将在待测受试者样品中定量测定的甲状腺癌标志物的量与预先确定的标准或截断值进行比较。标准可相当于对受试者的另一个样品或较早期的样品进行定量测定的水平，或对对照样品、特别是患较低级别癌症的受试者的样品进行定量测定的水平。可通过前瞻性和/或追溯性统计研究确立健康受试者或癌症受试者的对照样品的水平。可选择没有临床明显疾病或异常情况的健康受试者用于统计研究。可根据与对照样品或对相同受试者定量测定的过往水平相比，甲状腺癌标志物统计学上不同水平的研究结果作出诊断。

本发明还考虑使用甲状腺癌的多种标志物的本文所述方法。因此，本发明考虑用于分析生物样品的甲状腺癌标志物和作为甲状腺癌的特异性指示物的其它标志物的存在情况的方法。可通过包括检测其它标志物或编码该标志物的多核苷酸的试剂而对本文所述方法作修改。其它标志物的实例包括而不限于半乳凝素-3、甲状腺球蛋白、E-钙黏着蛋白、β-联蛋白、FHL2和Lef-1、c-Myc和β-肌动蛋白，特别是半乳凝素-3。

核酸方法

正如本文所注意到的，可根据样品中多核苷酸甲状腺癌标志物的水平检测甲状腺癌、特别是侵袭性甲状腺癌或具有转移潜力的甲状腺癌、更特别是ATC。检测核酸分子的技术例如聚合酶链式反应(PCR)和杂交试验是本领域众所周知的。

探针可用于检测多核苷酸的杂交技术。该技术一般包括将自患者样品或其它细胞来源获得的核酸与探针在有利于探针与核酸中的互补序列特异性退火的条件下(例如在本文论述的严格条件下)接触和温育。温育后，除去未退火的核酸，检测已与探针杂交的核酸(如有的话)的存在情况。

用于检测样品的多核苷酸序列的核苷酸探针可用本领域已知的常规方法构建。探针可包含相当于生物基因组一部分的DNA或DNA模拟物或者互补RNA或RNA模拟物。可在碱基部分、在糖部分或在磷酸骨架上对核酸进行修饰。DNA可采用标准方法获得，例如基因组DNA或克隆序列的聚合酶链式反应(PCR)扩增。本领域已知的计算机程序可用来设计具有所需特异性和最适扩增性质的引物。

核苷酸探针可用可检测物质例如提供适当信号并具有足够半寿期的放射性标记(例如³²P、³H、¹⁴C等)标记。可使用的其它可检测物质包括被特异性标记的抗体识别的抗原、荧光化合物、酶、对标记抗原有特异性的抗体和发光化合物。可考虑探针与待检测核酸的杂交率和结合率以及可用于杂交的核酸的量，选择合适标记。标记的探针可在固相支持体与核酸杂交，固相支持体为例如一般描述于以下文献的硝化纤维素滤器或尼龙膜：Sambrook等，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第2版)。可使用核酸探针优选在人细胞中检测多核苷酸甲状腺癌标志物。核苷酸探针还可用于诊断涉及多核苷酸甲状腺癌标志物的甲状腺癌，监测甲状腺癌进展或监测治疗性治疗。

样品中多核苷酸的检测可包括采用扩增方法(例如PCR)扩增特定基因序列，接着采用本领域技术人员已知的技术对扩增分子进行分析。举例来说，寡核苷酸引物可用于基于PCR的试验以扩增多核苷酸的一部分和扩增来源于样品的多核苷酸的一部分，其中寡核苷酸引物对多核苷酸有特异性(即与之杂交)。然后采用本领域众所周知的技术(例如凝胶电泳)分离并检测扩增的cDNA。

为了使杂交在试验条件下最大化，用于本发明方法的引物和探针一般与多核苷酸甲状腺癌标志物的一部分有至少约60％、优选至少约75％和更优选至少约90％同一性；也就是说，它们长为至少10个核苷酸、优选至少20个核苷酸。在一个实施方案中，引物和探针的长度为至少约10-40个核苷酸。引物的实例为SEQ ID NO.3-6。

杂交和扩增反应也可在本文论述的严格条件下进行。

本文所述杂交和扩增技术可用于定性和定量测定多核苷酸表达的方面。例如，RNA可从已知表达多核苷酸甲状腺癌标志物的细胞类型或组织中分离，并利用杂交(例如标准RNA印迹分析)或PCR技术测定。

引物和探针可原位使用，即直接在获自活组织检查或切除术的患者组织的组织切片(固定和/或冷冻的)上使用。

在本发明的一个方面，提供利用反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法，其中PCR与反转录组合应用。总的来讲，RNA采用标准技术从样品组织中提取，并反转录以产生cDNA。将cDNA用作聚合酶链式反应的模板。使cDNA与特异性针对多核苷酸甲状腺癌标志物设计的引物组杂交。一旦引物和模板退火，则使用DNA聚合酶从引物延伸，以合成模板的拷贝。使DNA链变性，重复该过程多次直到形成足够的DNA以供通过溴化乙锭染色和琼脂糖凝胶电泳显现。

可对获自疑似患甲状腺癌的受试者、未患甲状腺癌或患早期疾病或患有侵袭性或转移性疾病、特别是ATC的个体的样品进行扩增。可在若干跨越至少2个数量级的cDNA稀释液中进行反应。与非癌样品或早期癌症样品的相同稀释液相比，受试者样品若干稀释液在表达方面的统计显著性差异可视为癌症存在情况的阳性。

来源于多核苷酸甲状腺癌标志物的寡核苷酸或较长片段可在微阵列中用作靶标。微阵列可用来监测多核苷酸的表达水平并鉴定遗传变体、突变和多态性。来自微阵列的信息可用来确定基因功能，理解病症的遗传基础，诊断病症，并开发和监测治疗药物的活性。因此，本发明还包括包含多核苷酸甲状腺癌标志物和任选其它甲状腺癌标志物的阵列。阵列可用来测定阵列中多核苷酸甲状腺癌标志物的表达。本发明可供定量测定多核苷酸的表达。

本发明提供包含多核苷酸甲状腺癌标志物的微阵列。在一个实施方案中，本发明提供用于区分与甲状腺癌、特别是侵袭性甲状腺癌或具有转移潜力的甲状腺癌、特别是ATC有关的样品的微阵列，所述微阵列包含与支持体结合的多核苷酸探针的位置上可寻址的阵列，所述多核苷酸探针包含与多核苷酸甲状腺癌标志物互补和杂交的序列。

在一个实施方案中，阵列可用来监测阵列中多核苷酸甲状腺癌标志物表达的时程。这可发生在各种生物环境(例如肿瘤进展)中。

阵列还可用于确定正常和异常细胞中多核苷酸甲状腺癌标志物和任选其它甲状腺癌标志物的差异表达模式。这可提供可用作诊断或治疗介入的分子靶标的一系列核酸。

蛋白质方法

结合剂可用于多种诊断和试验应用。有许多技术人员已知的使用结合剂检测样品中的靶分子的测定方式。(例如参见Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1988)。一般而言，可通过以下步骤测定受试者中侵袭性甲状腺癌或具有转移潜力的甲状腺癌、特别是ATC存在与否：(a)使受试者的样品与结合剂接触；(b)检测样品中与结合剂结合的多肽的水平；和(c)将多肽的水平与预先确定的标准或截断值进行比较。在本发明的具体方面，结合剂是抗体。

一方面，本发明提供通过定量测定受试者生物样品中的多肽甲状腺癌标志物来监测或诊断受试者的甲状腺癌的诊断方法，所述方法包括使样品与用可检测物质直接或间接标记的对多肽甲状腺癌标志物有特异性的抗体反应，并检测所述可检测物质。

在本发明的一个方面，提供用于检测或诊断甲状腺癌的侵袭性或转移潜力、特别是ATC的方法，所述方法包括或基本由以下步骤组成：

(a)获取疑似含有多肽甲状腺癌标志物的样品；

(b)使所述样品在有效结合抗体并形成复合物的条件下与特异性结合多肽甲状腺癌标志物的抗体接触；

(c)通过定量测定复合物的量来测量样品中存在的多肽甲状腺癌标志物的量；和

(d)将样品中存在的多肽甲状腺癌标志物的量与对照中的多肽甲状腺癌标志物的量进行比较，其中与对照的量相比，样品中多肽甲状腺癌标志物的量的变化或显著差异表明侵袭性甲状腺癌或具有转移潜力的甲状腺癌、特别是ATC。

在一个实施方案中，本发明考虑用于监测个体的甲状腺癌进展的方法，所述方法包括：

(a)使与多肽甲状腺癌标志物结合的抗体与个体的样品接触，使得在样品中形成包含抗体和多肽甲状腺癌标志物的复合物；

(b)测定或检测样品中复合物形成的存在情况或量；

(c)在稍后的时间点上重复步骤(a)和(b)；和

(d)将步骤(b)的结果与步骤(c)的结果进行比较，其中复合物形成的量的差异表明所述个体中癌症的疾病、病期、进展、侵袭性和/或转移潜力。

还可将复合物的量与得自未处于甲状腺癌风险中或患有不同期甲状腺癌的个体或得自相同个体不同时间点的复合物的量的代表值进行比较。

与多肽甲状腺癌标志物特异性反应的抗体或衍生物(例如酶缀合物或标记的衍生物)可用来检测不同样品(例如生物材料、特别是组织样品)中的多肽甲状腺癌标志物。它们可用作诊断或预后试剂，而且它们可用来检测多肽甲状腺癌标志物水平的异常情况或多肽甲状腺癌标志物的结构和/或时间、组织、细胞或亚细胞位置的异常情况。抗体还可用来体外筛选潜在的治疗化合物，以测定其对涉及多肽甲状腺癌标志物的甲状腺癌的作用。体外免疫测定法还可用来评价或监测具体疗法的功效。

抗体可用于依赖于多肽甲状腺癌标志物的抗原决定簇与抗体之间的结合相互作用的任何免疫测定法。用于体外检测样品中的抗原的免疫测定法也是本领域众所周知的。[对于免疫测定法的一般描述参见例如Paterson等，Int.J.Can.37：659(1986)和Burchell等，Int.J.Can.34：763(1984)]。可以直接或间接的方式，通过竞争或非竞争免疫测定法实现样品中的多肽甲状腺癌标志物的定性和/或定量测定。使用抗体检测多肽甲状腺癌标志物可包括例如以正向、逆向或同时方式运行的免疫测定。免疫测定法的实例为放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(例如ELISA)、免疫荧光法、免疫沉淀、胶乳凝集、血细胞凝集、组织化学试验和夹心(免疫)测定法。或者，可直接使用例如表面等离振子共振(SPR)方法例如Biacore、微量热法或纳米悬臂(nano-cantilivers)，来检测抗体与多肽甲状腺癌标志物的结合。本领域技术人员十分了解这些术语，他们将清楚或可容易地认出其它免疫测定方式而无需过多实验。

对多肽甲状腺癌标志物有特异性的抗体可用可检测物质标记，并可根据可检测物质的存在情况定位于生物样品。可检测物质的实例包括但不限于以下物质：放射性同位素(例如³H、¹⁴C、³⁵S、¹²⁵I、¹³¹I)、荧光标记(例如FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、发光标记例如鲁米诺；以及酶标记(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶)、生物素基团(其可通过标记的抗生物素蛋白例如含有荧光标记的链霉抗生物素或者可通过光学或量热方法检测的酶活性检测)以及预先确定的被第二报道分子识别的多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合部位、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记通过不同长度的间隔臂连接以减小可能的位阻。抗体还可与容易通过电子显微镜术观察到电子致密物质例如铁蛋白或胶态金偶联。

抗体可被可检测标记的一种方式是将其与酶直接连接。当酶稍后暴露于其底物时，可产生可被检出的产物。作为酶的可检测物质的实例为辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、苹果酸脱氢酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶(steriod isomerase)、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸、丙糖磷酸异构酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶和乙酰胆碱酯酶。

为了在免疫测定***中提高灵敏度，可使用荧光发射金属原子例如Eu(铕)和其它镧系元素。可通过金属螯合基团(例如DTPA或EDTA)使这些与所需分子连接。

生物发光化合物还可用作可检测物质。生物发光可检测物质的实例为萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。

还可采用间接方法，其中最初的抗原-抗体反应因引入第二抗体而放大，所述第二抗体对针对多肽甲状腺癌标志物有反应性的抗体具有特异性。举例来说，如果对多肽甲状腺癌标志物具有特异性的抗体是兔IgG抗体，则第二抗体可以是用本文所述可检测物质标记的山羊抗兔IgG Fc片段特异性抗体。

本领域的普通技术人员可容易地实现上述缀合或标记抗体的方法。

本领域已知的使用光学和电子显微镜术对抗原进行定位的细胞化学技术可用来检测多肽甲状腺癌标志物。抗体一般可用可检测物质标记，可根据可检测物质的存在情况，在组织和细胞中对多肽甲状腺癌标志物进行定位。

在本发明方法的情况下，可将样品、结合剂(例如抗体)或多肽甲状腺癌标志物固定在载体或支持体例如琼脂糖、纤维素、硝酸纤维、葡聚糖、交联葡聚糖、琼脂糖凝胶、脂质体、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、滤纸、离子交换树脂、塑料膜、尼龙或丝织物上。支持体材料可具有任何可能的形状，包括球状、圆柱或扁平形状。因此，载体可呈例如管、试验板、孔、珠粒、圆盘、球体等形状。可通过采用已知的化学或物理方法(例如溴化氰偶联)，使材料与合适的不溶性载体反应，来制备固定化材料。可采用对第一结合剂有特异性的第二结合剂，使结合剂(例如抗体)间接固定化。例如，可使用包被在载体或支持体上的绵羊抗小鼠IgG Fc片段特异性抗体，将对多肽甲状腺癌标志物有特异性的小鼠抗体固定化。

如果放射性标记用作可检测物质，则可通过放射自显影照相术对多肽甲状腺癌标志物进行定位。可用各种光学方法通过测定放射自显影照片中粒子的密度，或通过统计晶粒，对放射自显影照相术的结果进行量化。

时间分辨荧光测定法可用来检测荧光信号、标记或可检测物质。例如，Christopoulos TK和Diamandis EP Anal.Chem.，1992：64：342-346中描述的方法可与常用的时间分辨荧光计一起使用。

按照本发明的一个实施方案，用于检测生物样品中多肽甲状腺癌标志物的免疫测定法包括在允许形成包含结合剂和多肽甲状腺癌标志物的一种或多种复合物的条件下，使一定量的与多肽甲状腺癌标志物特异性结合的结合剂与样品接触，并测定一种或多种复合物的存在情况或量作为样品中所包含的多肽甲状腺癌标志物的量的衡量。

按照本发明的一个实施方案，提供一种方法，其中多肽甲状腺癌标志物抗体用酶直接或间接标记，加入酶底物，其中选择底物使得底物或酶与底物的反应产物与镧系元素金属(优选铕和铽)形成荧光复合物。加入一种或多种镧系元素金属，通过测量荧光复合物的荧光，定量测定样品的多肽甲状腺癌标志物。根据酶底物或酶与底物的反应产物与镧系元素金属复合的能力来选择酶。

提供这类荧光复合物的酶和酶底物的实例描述于Diamandis的美国专利号5,312,922。举例来说，当抗体用碱性磷酸酶直接或间接标记时，用于本方法的底物可以是4-甲基伞形酮磷酸酯、5-氟水杨酸磷酸酯或二氟尼柳磷酸酯。通常使用时间分辨荧光计测量复合物的荧光强度。

对多肽甲状腺癌标志物有特异性的抗体也可用酶间接标记。例如，抗体可与配体结合对的一个配偶体缀合，而酶可与配体结合对的另一个配偶体偶联。代表性实例包括抗生物素蛋白-生物素和核黄素-核黄素结合蛋白。在实施方案中，对多肽甲状腺癌标志物有特异性的抗体用酶标记。

本发明方法的多方面包括：(a)使受试者的生物样品与对多肽甲状腺癌标志物有特异性的抗体反应，其中抗体用酶直接或间接标记；(b)加入酶底物，其中选择底物使得底物或酶与底物的反应产物形成荧光复合物；(c)通过测定荧光复合物的荧光，来定量测定样品中的多肽甲状腺癌标志物；和(d)将定量测定的水平与从受试患者或对照受试者的其它样品得到的水平进行比较。在一个实施方案中，多肽甲状腺癌标志物是Ep-ICD和β-联蛋白，将定量测定的水平与对正常受试者、患早期疾病的受试者或同一受试者不同时间点的定量测定水平进行比较，其中与对照受试者相比，标志物水平的提高表明ATC和/或预后或生存率不佳。

本发明的一个具体实施方案包括下列步骤：

(a)使生物样品与用可检测物质直接或间接标记的对多肽甲状腺癌标志物有特异性的第一抗体和被固定的对多肽甲状腺癌标志物有特异性的第二抗体一起温育；

(b)将第一抗体与第二抗体相分离，得到第一抗体相和第二抗体相；

(c)检测第一或第二抗体相中的可检测物质，从而定量测定生物样品中的多肽甲状腺癌标志物；和

(d)将定量测定的多肽甲状腺癌标志物与预先确定的标准的水平进行比较。

标准可相当于对未患疾病或患早期疾病的对照受试者的样品或得自受试者的其它样品的样品定量测定的水平。与标准相比，Ep-ICD和/或β-联蛋白的水平升高可表明退行发育性甲状腺癌。

按照一个实施方案，本发明提供通过用免疫测定法测定多肽甲状腺癌标志物而用于测定样品中的多肽甲状腺癌标志物的方法。对技术人员而言显而易见的是，多种竞争或非竞争免疫测定方法可用来测定血清中的多肽甲状腺癌标志物。竞争方法通常采用固定化或可固定的抗多肽甲状腺癌标志物的抗体和多肽甲状腺癌标志物的标记形式。样品多肽甲状腺癌标志物和标记的多肽甲状腺癌标志物竞争结合对多肽甲状腺癌标志物有特异性的抗体。在将所得的已与抗体结合的标记多肽甲状腺癌标志物(结合的部分)与其余的未结合的标记多肽甲状腺癌标志物(未结合的部分)分离后，测定结合或未结合的部分中的标记的量，并可按任何常规方式例如通过与标准曲线作比较将其与试验样品中多肽甲状腺癌标志物的量相关联。

另一方面，非竞争方法被用于测定多肽甲状腺癌标志物，其最常见的方法为“夹心”方法。在该测定中，采用对多肽甲状腺癌标志物有特异性的两种抗体。一种抗体被直接或间接标记(“检测抗体”)，另一个是固定化或可固定的(“俘获抗体”)。可将俘获抗体和检测抗体与试验样品同时或序贯接触。可通过将俘获抗体与样品一起温育，之后在预先确定的时间加入检测抗体来完成序贯方法，或者可将检测抗体先与样品一起温育，然后加入俘获抗体。在进行完成测定所必须的温育后，可将俘获抗体与液体试验混合物相分离，并且可在分离的俘获抗体相的至少一部分中或液体试验混合物的其余部分中测定标记。一般在俘获抗体相中测定标记，因为俘获抗体相包含在俘获抗体和检测抗体之间“夹心的”多肽甲状腺癌标志物。在另一个实施方案中，可在不分离俘获抗体和液体试验混合物的情况下测定标记。

在本发明的具体夹心免疫测定法中，使用对多肽甲状腺癌标志物有特异性的小鼠多克隆/单克隆抗体和对多肽甲状腺癌标志物有特异性的兔多克隆/单克隆抗体。

在一个典型的多肽甲状腺癌标志物的双位点免疫测定法(two-siteimmunometric assay)中，俘获抗体和检测抗体之一或两者是多克隆抗体，或者俘获抗体和检测抗体的之一或两者是单克隆抗体(即多克隆/多克隆、单克隆/单克隆或单克隆/多克隆)。用于检测抗体的标记可选自本领域常规已知的任何标记。标记可以是酶或化学发光部分，但它也可以是放射性同位素、荧光团、可检测的配体(例如可通过经由配体的标记结合配偶体的二次结合而检测)等。一方面，抗体用酶标记，酶通过加入经选择使得酶与底物的反应产物形成荧光复合物的底物而检出。可选择俘获抗体，使得它提供将其从试验混合物的其余部分中分离出来的方法。因此，俘获抗体可以已固定化形式或不溶形式引入测定，或者可呈可固定形式，即能够继将俘获抗体引入测定之后实现固定。固定化俘获抗体可包含与固相共价或非共价连接的抗体，所述固定相为例如磁性粒子、乳胶粒子、微量滴定板孔、珠粒、比色皿或其它反应容器。可固定化俘获抗体的实例是这样的抗体，其已用配体部分(例如半抗原、生物素等)化学修饰，并且随后可通过与配体的结合配偶体(例如抗体、抗生物素蛋白等)的固定化形式接触而固定化。在一个实施方案中，俘获抗体可使用对与固相结合的俘获抗体有物种特异性的抗体固定化。

筛选方法

本发明还考虑用于针对其在治疗甲状腺癌、特别是侵袭性甲状腺癌、更特别是ATC中的潜在功效评价试验物质或化合物的方法。试验物质和化合物包括但不限于肽，例如可溶性肽包括具Ig尾的融合肽、随机肽文库和由D-和/或L-构型氨基酸构成的组合化学法衍生的分子文库的成员、磷酸肽(包括随机或部分简并、定向磷酸肽文库的成员)、抗体[例如多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、抗独特型抗体、嵌合抗体、单链抗体、片段(例如Fab、F(ab)₂和Fab表达文库片段和其表位结合片段)]、多核苷酸(例如反义物、siRNA)及有机或无机小分子。所述物质或化合物可以是内源性生理化合物或者天然或合成化合物。

本发明提供用于评价试验物质在治疗甲状腺癌、特别是侵袭性甲状腺癌、更特别是ATC中的潜在功效的方法，所述方法包括比较：

(a)获自患者并暴露于试验物质的第一样品中的一种或多种甲状腺癌标志物和任选其它标志物的水平；和

(b)获自患者的第二样品中的一种或多种甲状腺癌标志物和任选其它标志物的水平，其中所述样品未暴露于试验物质，其中第一样品相对于第二样品在一种或多种甲状腺癌标志物和任选其它标志物的表达水平方面的显著差异，表明试验物质潜在对治疗患者的甲状腺癌有效。

第一样品和第二样品可以是获自患者的单一样品的部分或获自患者的合并样品的部分。

一方面，本发明提供选择用于治疗患者的甲状腺癌、特别是侵袭性甲状腺癌、更特别是ATC的物质的方法，所述方法包括：

(a)从患者中获得样品；

(b)分别在多种试验物质存在下维持样品的等分部分；

(c)对各等分部分中的一种或多种甲状腺癌标志物和任选其它标志物进行比较；和

(d)选出一种试验物质，其相对于其它试验物质在含有该试验物质的等分部分中改变一种或多种甲状腺癌标志物和任选其它标志物的水平。

一方面，本发明提供选择用于抑制受试者的甲状腺癌的物质的方法，所述方法包括(a)从受试者中获得包含癌细胞的样品；(b)分别在多种试验物质存在下暴露样品的等分部分；(c)将各等分部分中的一种或多种甲状腺癌标志物的水平进行比较；和(d)选出一种试验物质，其相对于其它试验物质改变含有该试验物质的等分部分中的甲状腺癌标志物水平，其中甲状腺癌标志物是Ep-ICD和/或β-联蛋白。该方法还可包括给予受试者至少一种试验物质，其相对于其它试验物质改变含有该试验物质的等分部分中的甲状腺癌标志物水平。

一方面，本发明提供评价试验化合物的甲状腺癌细胞致癌潜力的方法，所述方法包括：(a)在试验化合物存在和不存在的情况下维持单独的甲状腺癌细胞等分部分；和(b)将各等分部分中的一种或多种甲状腺癌标志物的表达进行比较，其中在试验化合物存在下维持的等分部分相对于在不存在试验化合物的情况下维持的等分部分在甲状腺癌标志物水平方面的显著差异，表明试验化合物具有甲状腺癌细胞致癌潜力，其中甲状腺癌标志物是Ep-ICD和/或β-联蛋白。

试剂盒

本发明考虑用于实施本发明的方法以诊断甲状腺癌、特别是检测甲状腺癌的侵袭性或转移潜力、更特别是ATC的试剂盒。这类试剂盒通常包括对进行诊断测定所必需的两种或更多种组分。组分包括但不限于化合物、试剂、容器和/或装置。因此，本文所述方法可通过利用预先包装的诊断试剂盒进行，所述试剂盒至少包括本文所述的物质(例如抗体、探针、引物等)，其可适宜例如在临床背景下用于诊断患有甲状腺癌或具有形成甲状腺癌的诱因的患者、特别是用于测定甲状腺癌的侵袭性或转移潜力更特别是ATC。

本发明考虑装试剂盒的容器，所述试剂盒包括本文所述用于诊断甲状腺癌、特别是测定甲状腺癌的侵袭性或转移潜力、更特别是ATC的一种或多种结合剂。举例来说，试剂盒可包括对多肽甲状腺癌标志物有特异性的抗体、针对用一种或多种酶标记的抗体的抗体和一种或多种酶的底物。试剂盒还可包括微量滴定板孔、标准品、测定稀释剂、洗涤缓冲液、粘性板盖和/或使用试剂盒实施本发明方法的说明书。

一方面，本发明提供用于诊断受试者的甲状腺癌、特别是甲状腺癌的侵袭性或转移潜力、更特别是ATC的试验试剂盒，其包括与多肽甲状腺癌标志物结合的抗体和/或与多核苷酸甲状腺癌标志物杂交或扩增多核苷酸甲状腺癌标志物的多核苷酸。在另一方面，本发明涉及与多肽甲状腺癌标志物结合的抗体和/或与多核苷酸甲状腺癌标志物杂交或扩增多核苷酸甲状腺癌标志物的多核苷酸在制备用于诊断或检测甲状腺癌、特别是诊断或检测甲状腺癌的侵袭性或转移潜力的组合物中的用途。

在本发明的又一个方面，试剂盒包括与多肽甲状腺癌标志物的表位特异性结合的抗体或抗体片段，以及用于检测抗体与其甲状腺癌细胞相关表位结合的工具，作为可在测试前进一步稀释的浓缩物(包括冻干组合物)。具体地讲，本发明提供用于诊断甲状腺癌的侵袭性或转移潜力、特别是ATC的试剂盒，其包括已知量的与多肽甲状腺癌标志物特异性结合的第一结合剂，其中第一结合剂包含可检测物质，或者它与可检测物质直接或间接结合。

可设计试剂盒以检测样品中多核苷酸甲状腺癌标志物的水平。这类试剂盒一般包括本文所述的与多核苷酸甲状腺癌标志物杂交或扩增多核苷酸甲状腺癌标志物的寡核苷酸探针或引物。寡核苷酸可用于例如PCR或杂交步骤中。还提供可用于检测靶多核苷酸甲状腺癌标志物的试验试剂盒，其包括包含多核苷酸甲状腺癌标志物及其片段或互补序列的容器。试剂盒可包括引物SEQ ID NO.3-6中的一种或多种。

本发明的试剂盒还可包括内有可用于收集试验样品(例如血清)的工具(包括用于收集和稳定血液的柳叶刀和吸水纸或吸水布)的容器。

计算机***

本文考虑的分析方法可通过应用下面描述的和本领域已知的计算机***和方法执行。因此，本发明提供包含一种或多种甲状腺癌标志物的计算机可读介质。“计算机可读介质”是指可直接通过计算机读取和访问的任何介质，包括但不限于磁性存储介质，例如软盘、硬盘存储介质和磁带；光学存储介质，例如CD-ROM；电存储介质，例如RAM和ROM；及这些类别的混合，例如磁/光学存储介质。因此，本发明考虑在其上记录了针对患者和对照鉴定的标志物的计算机可读介质。

“记录”是指在计算机可读介质上存储信息的过程。技术人员可容易地采取目前已知的在计算机可读介质上记录信息的任何方法，以产生包含有关本文公开的一种或多种标志物的信息的制品。

多个数据处理机程序和格式可用来存储有关一种或多种甲状腺癌标志物的信息。例如，信息可在市售软件(例如WordPerfect和MicroSoft Word)中经格式化的字处理文本文件中再提出，或者以ASCII文件形式再提出，ASCII文件存储在数据库应用中，例如DB2、Sybase、Oracle等中。可对许多数字处理机结构化格式(例如文本文件或数据库)作改动以获得已将标志物信息记录在其上的计算机可读介质。

通过提供计算机可读形式的标志物信息，可按常规访问信息用于多种目的。例如，本领域技术人员可利用呈计算机可读形式的信息，将在治疗期间或之后获得的标志物信息与数据存储手段内存储的信息进行比较。

本发明提供用于保持关于进行确定患者是否患有甲状腺癌、特别是侵袭性甲状腺癌、更特别是ATC或者是否易患有这类病况的方法的指令的介质，所述方法包括测定一种或多种甲状腺癌标志物存在与否，并根据标志物的存在与否，确定病况或该病况的倾向，任选推荐措施或治疗。

本发明还提供在电子***中和/或在网络中的用于确定受试者是否患有本文公开的病况或是否易患本文公开的病况的方法，所述方法包括测定一种或多种标志物存在与否，并根据标志物的存在与否，确定受试者是否患有该病况或是否易患该病况，并任选推荐措施或治疗。

本发明还提供在网络中的用于确定受试者是否患有本文公开的病况或是否易患本文公开的病况的方法，所述方法包括：(a)接收有关受试者的表型信息和有关与受试者样品有关的本文公开的一种或多种标志物的信息；(b)从网络获取与标志物相应的信息；和(c)根据表型信息和有关标志物的信息，确定受试者是否患有该病况或是否易患该病况，和(d)任选推荐措施或治疗。

本发明另还提供用于鉴定所选记录的***，所述所选记录鉴定患病细胞或组织。本发明的***一般包括数字计算机；与计算机连接的数据库服务器；与有数据存储在其中的数据库服务器连接的数据库，包括数据记录(其包括本文公开的一种或多种标志物)的数据，以及根据所需选择标准向数据库的数据文件执行查询，以提供与所需选择标准匹配的记录报告的编码机制。

本发明考虑用于确定受试者是否患有本文公开的病况或是否易患本文公开的病况、特别是ATC的商业方法，所述方法包括：(a)接受有关受试者的表型信息和关于与受试者样品有关的本文公开的一种或多种标志物的信息；(b)从网络获取与标志物相应的信息；和(c)根据表型信息、有关标志物的信息和获取的信息，确定受试者是否患有该病况或是否易患该病况，并任选推荐措施或治疗。

在本发明的一个方面，本文所述计算机***、组分和方法用来监测病况或确定病况的病期。

治疗应用

本发明考虑与本文公开的甲状腺癌标志物包括甲状腺癌、特别是侵袭性甲状腺癌、更特别是ATC有关的治疗应用。甲状腺癌标志物可以是治疗的靶标。例如，核Ep-ICD可以是治疗侵袭性甲状腺癌和ATC的靶标。治疗方法包括免疫治疗方法，其包括抗体疗法的应用。一方面，本发明提供可用来预防甲状腺癌、特别是侵袭性甲状腺癌、更特别是ATC的一种或多种抗体。另一方面，本发明提供预防、抑制或减轻甲状腺癌、特别是侵袭性甲状腺癌、更特别是ATC的方法，所述方法包括以有效预防、抑制或减轻病况或减少病况发生的量将与甲状腺癌标志物(例如Ep-ICD)结合的抗体给予患者。

与甲状腺癌标志物、特别是Ep-ICD结合的抗体可与标记、药物或细胞毒性剂、受体的靶标结合区、黏着分子、配体、酶、细胞因子或趋化因子组合。在本发明的多方面，甲状腺癌标志物，特别是Ep-ICD，可与细胞毒性剂(例如化疗剂)或毒素或其活性片段缀合。毒素和其相应片段的实例包括白喉A链、外毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、酚霉素、伊诺霉素等。细胞毒性剂可以是通过将放射性同位素与抗体缀合，或将放射性核素与已与抗体共价连接的螯合剂结合而制备的放射化学物质。抗体还可与一种或多种小分子毒素缀合，例如加卡奇霉素、美登素、单端孢霉烯(trichothene)和CC1065(参见美国专利号5,208,020)。

本发明的方法考虑给予单一抗体以及不同的各种抗体(例如识别其它标志物的不同表位的抗体)的组合或“混合物”。这类混合物可具有某些优势，因为它们含有与甲状腺癌标志物的不同表位结合和/或利用不同的效应子机制的抗体。这类组合的抗体可具有协同治疗作用。另外，给予一种或多种标志物特异性抗体可与其它治疗剂组合。特异性抗体可以其“裸露的”或未缀合形式给予，或者可具有与其缀合的治疗剂。

本发明还考虑治疗受试者的甲状腺癌的方法，所述方法包括将对Ep-CAM、特别是对EpEx或Ep-ICD有特异性的抗体递送给有需要的受试者。在本发明的一个方面，抗体与细胞毒性剂或毒素缀合(见上文)。抗体可以是例如公开于美国专利号7557190和US7459538、美国公布申请号20050163785、20070122406和20070196366及McDonald等(Drug Design，Development and Therapy 2008；2：105-114)的治疗性抗体。在一个具体的实施方案中，抗体是与毒素、更特别是与VB4-845免疫毒素缀合的抗体(Viventia Biotechnologies Inc.，Ontario，Canada)。

更具体地讲，按照本发明的一个方面，提供治疗患有甲状腺癌的受试者的方法，其中以治疗有效量给予对Ep-CAM、特别是对EpEx或Ep-ICD有特异性的抗体。在又一个方面，以药学上可接受的形式提供抗体。

一方面，本发明提供用于治疗甲状腺癌的药物组合物，其特征在于所述组合物包含对Ep-CAM、特别是对EpEx或Ep-ICD有特异性的抗体以及药学上可接受的载体、赋形剂或溶媒。

用于本发明方法的抗体可配制成包含适于所需递送方法的载体的药物组合物。合适的载体包括当与抗体混合时保持抗体的功能并且与受试者的免疫***无反应性的任何材料。实例包括许多标准药用载体的任一种，例如无菌磷酸缓冲盐溶液、抑菌水等(一般参见Remington′s PharmaceuticalSciences第16版，A.Osal.，主编，1980)。

可通过能够将抗体递送到损伤部位的任何途径，给予一种或多种标志物特异性抗体制剂。给药途径包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、真皮内等。抗体制剂可被冻干，并作为无菌粉剂优选在真空下保存，然后在注射前在含有例如苯甲醇防腐剂的抑菌水中或在无菌水中复溶。

治疗一般可包括以有效剂量经可接受的给药途径重复给予抗体制剂。剂量将取决于本领域技术人员普遍了解的各种因素，包括病况的病因学、病况的病期、所用抗体的结合亲和力和半寿期、患者中标志物表达的程度、所需要的稳态抗体浓度水平、治疗频率和与本发明的治疗方法联用的任何治疗剂的影响。限定适当剂量的决定因素是在具体情况下治疗有效所必须的具体抗体的量。可能需要重复给予以达到所需效果。直接给予一种或多种标志物抗体也是可行的，并且在某些情况下可具有优势。

可针对甲状腺癌标志物对患者进行评价，以便辅助确定最有效的给药方案和相关因素。本文所述测定方法或类似测定法，可用于在治疗前定量测定患者中的标志物水平。这类测定法还可用于整个治疗的监测，并且可用于结合评价其它参数(例如标志物水平)来衡量治疗的成功。

可通过用表达高水平多核苷酸的载体转染细胞或组织，来关闭本文公开的多核苷酸甲状腺癌标志物。这类构建体可使细胞充满不可翻译的有义或反义序列。甚至在缺乏整合到DNA时，这类载体可继续转录RNA分子直到所有拷贝被内源核酸酶破坏。来源于反转录病毒、腺病毒、疱疹病毒或痘苗病毒或者来源于各种细菌质粒的载体可用来将多核苷酸递送至靶定器官、组织或细胞群。本领域技术人员熟知的方法可用来构建表达多核苷酸(例如反义物)的重组载体。(参见例如Sambrook等人(同上)和Ausubel等人(同上)描述的技术)。

用于将载体导入适于体内、体外和离体治疗的细胞或组织的方法是本领域众所周知的。例如通过转染或通过脂质体的递送是本领域众所周知的。

可通过针对多核苷酸甲状腺癌标志物的调节区(即启动子、增强子和内含子)设计反义分子、DNA、RNA或PNA，来获得基因表达的修饰。优选寡核苷酸来源于转录起始位点，例如介于前导序列-10和+10区域。还可设计反义分子，使得通过防止转录物与核糖体结合而阻断mRNA的翻译。还可采用“三股螺旋”碱基配对方法实现抑制。三股螺旋配对损害双螺旋充分打开以结合聚合酶、转录因子或调节分子的能力。有关使用三链体DNA的治疗进展的综述参见Gee J E等(载于：Huber B E and B I Carr(1994)Molecular and Immunologic Approaches，Futura Publishing Co，Mt KiscoN.Y.)。

核酶是催化RNA的特异性切割的酶RNA分子。核酶通过核酶分子与互补靶RNA的序列特异性杂交，接着内核分离而起作用。因此，本发明考虑可特异性和有效催化多核苷酸标志物的内核分离的工程改造的锤头基序核酶分子。

任何可能的RNA靶标内的特异性核酶切割位点最初可通过扫描包括下列序列的核酶切割位点的靶分子来鉴定：GUA、GUU和GUC。一旦鉴定出位点，便可针对可使寡核苷酸无法操作的二级结构特征，对相当于含有切割位点的靶基因区域的15-20个核糖核苷酸的短RNA序列进行评价。还可采用核糖核酸酶保护测定，通过测试与互补寡核苷酸杂交的可及性，来确定候选靶标的适宜性。

本发明提供预防、抑制或减轻患者的甲状腺癌、特别是侵袭性甲状腺癌、更特别是ATC的方法，所述方法包括：

(a)从患者中获取肿瘤样品；

(b)分别在多种试验物质存在下维持样品的等分部分；

(c)对各等分部分中的本文公开的甲状腺癌标志物和任选一种或多种其它标志物的水平进行比较；

(d)将至少一种试验物质给予患者，该试验物质相对于其它试验物质改变含有该试验物质的等分部分中的甲状腺癌标志物和任选其它标志物的水平。

本文所述活性治疗物质可以合适的方式给予，例如通过注射(皮下、静脉内等)、口服给予、吸入、经皮施用或直肠给予。根据给药途径，活性物质可用保护物质不受酶、酸和可钝化物质的其它自然条件的作用的材料包衣。可在合适的溶剂中用合适的表面活性剂制备活性化合物作为游离碱或药学上可接受的盐的溶液剂。可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中，或者在油中制备分散体。

可通过本身已知的用于制备可给予受试者的药学上可接受的组合物的方法来制备本文所述组合物，使得将有效量的活性物质在具有药学上可接受的溶媒的混合物中混合。合适的溶媒描述于例如Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy(第21版.2005，University of the Sciences inPhiladelphia(编辑)，Mack Publishing Company)和1999年出版的The UnitedStates Pharmacopeia：The National Formulary(USP 24NF 19)。在此基础上，组合物包含(虽然并非唯一)活性物质的溶液，所述活性物质与一种或多种药学上可接受的溶媒或稀释剂联合，并包含在具有合适pH并与生理流体等渗的缓冲溶液中。

组合物被标示为单独或与其它治疗剂或其它治疗形成联合的治疗剂。本发明的组合物可与其它治疗剂或疗法同时、分别或序贯给予。

可使用合适的动物模型体内评价采用本发明方法鉴定的组合物和物质/化合物的治疗活性。

下面的非限制性实施例对本发明进行了说明：

实施例1

使用针对EpCAM的Ep-Ex和Ep-ICD结构域的抗体，通过免疫组织化学(IHC)对在原发性人甲状腺癌以及在一组侵袭性和非侵袭性甲状腺癌细胞系中的EpEx和Ep-ICD蛋白表达进行了研究，研究结果得到蛋白质印迹法的证实。为了确定EpCAM过表达是否归因于转录增加，采用定量实时PCR(Q-PCR)对这些肿瘤中的EpCAM转录物进行分析。此外，进行了核Ep-ICD和β-联蛋白的同时染色以确立甲状腺癌中致癌Ep-ICD信号转导的预后值。

在该实施例中描述的研究中采用下列材料与方法。

材料与方法

患者和组织样品：

研究获安大略伦理委员会和加拿大多伦多辛乃山医院(Ontario EthicsCommittee and Mount Sinai Hospital，Toronto，Canada)批准。告知所有患者实情，并取得签名同意书。从加拿大多伦多辛乃山医院病理学部门档案馆取出30个甲状腺癌石蜡块。由15个甲状腺肿瘤和15个邻近正常组织组成的30个新鲜冷冻样品也包括在研究中，用于定量实时PCR分析。将组织在RNAlater TissueProtect溶液(Qiagen，Mississauga，ON)中速冻，并保存在-80℃下备用。在进一步实验前由病理学家检查每个病例。

从数据库调取患者随访数据，以将肿瘤中的蛋白质表达与临床结局相关联，从而评价这些蛋白质的预后关联性。患者随访最短15个月的时间，最长199个月的时间。

抗体

抗EpCAM单克隆抗体MOC-31(AbD Serotec，Oxford，UK)识别EpCAM氨基端区的胞外组分(EGF1结构域-aa 27-59)[Chaudry Ma等，2007]。EpCAM的胞内域，α-EpICD抗体1144(Epitomics)识别EpCAM的胞质结构域。针对β-联蛋白的aa 571-781产生的β-联蛋白抗体(目录号610154，B D Sciences，San Jose，CA)和c-myc抗体(C19，sc-788，亲和纯化的兔多克隆抗体，Santa Cruz Biotechnology Inc.)。

细胞系

使得自M.Ringel，The Ohio State University，OH的结肠癌细胞系WRO(之前认为是甲状腺癌细胞系)和ARO-结肠癌细胞系(之前认为是ATC细胞系)生长在补充了10％胎牛血清(FBS)、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠和1x非必需氨基酸的RPMI 1640中。将高度分化的甲状腺***状癌细胞系TPC-1维持在补充了5％FBS和2mmol/L L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。使甲状腺髓样癌细胞系TT(得自J.Fagin，University of Cincinnati，Cincinnati，OH)生长在补充了10％FBS的F-12K培养基(Invitrogen Life Technologies，Grand Island，NY)。使退行发育性甲状腺癌细胞系CAL62(来自J.Fagin)生长在补充了10％FBS的DMEM中。将所有细胞系培养在潮湿、5％CO₂、37℃培养箱中；70-80％汇合细胞用于下述实验。

甲状腺癌中EpEx和Ep-ICD表达的免疫组织化学

从石蜡块上切取4μm厚的连续切片，固定在载玻片上。切片用二甲苯和逐级酒精系列脱蜡并水化。载玻片在室温下用0.3％H₂O₂处理30分钟以阻断内源过氧化物酶活性。在阻断与正常马或山羊血清的非特异性结合后，将切片与抗EpEx小鼠单克隆抗体MOC-31(稀释度1∶200)、或α-EpICD抗体1144(稀释度1∶200)、或小鼠单克隆β-联蛋白抗体(稀释度1∶200)一起温育30分钟后，与生物素化第二抗体(马抗小鼠或山羊抗兔)一起温育30分钟。切片最后与VECTASTAIN Elite ABC试剂(Vector labs，Burlingame，CA)一起温育，二氨基联苯胺(diaminobenzedine)用作色原。

免疫组织化学染色的评价

按照文献所述，在组织切片的5个区域对免疫阳性染色进行了评价[Ralhan等，2008]。在由2名不知临床结局的评估人员观察时，如果上皮细胞在胞质、质膜和/或核中显示免疫阳性，则切片记为阳性。对这些切片如下进行评分：0，＜10％细胞；1，10-30％细胞；2，30-50％细胞；3，50-70％细胞；4，＞70％细胞显示免疫反应性。还根据强度如下对切片进行半定量评分：0，无；1，轻微；2，中等；3，强。最后，对各个甲状腺癌和正常甲状腺组织切片，通过将百分比阳性的和强度的分值相加，得到总分(范围为0-7)。如前所述对免疫组织化学数据进行统计分析[Ralhan等，2008]。

采用Visiopharm Integrator System(Visiopharm，Horsholm，Denmark)，验证了免疫组织化学得分数据。仅定量测定核染色，因为软件不允许根据阳性褐色染色强度的差异同时定量测定膜、胞质和核染色。

统计分析

应用SPSS 10.0软件(Chicago)，对免疫组织化学数据进行统计分析。箱形图用来确定正常甲状腺组织和甲状腺癌中膜EpEx、核Ep-ICD和核或胞质β-联蛋白表达的总分的分布。截断值≥2定义为统计检查的核β-联蛋白免疫阳性的阳性标准。对于膜β-联蛋白，6的分值定义为表达丧失。

利用由生存数据用Kaplan-Meier曲线建立的生命表，对表达的EpEx、Ep-ICD和/或β-联蛋白染色与患者总体生存率之间的相关性进行了评价。自细胞系、冷冻样品、石蜡切片进行的RNA分离和第一链cDNA合成

所有RNA分离均按照生产商的说明书进行。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen，Maryland，MA)，从细胞系中提取总RNA。使用High Pure RNATissue Kit和High Pure RNA Paraffin Kit(Roche，Mannheim，Germany)分别从新鲜冷冻甲状腺组织样品和FFPE样品分离RNA。采用ND-1000分光光度计(Nanodrop Technologies，Wilmington，DE)测定RNA的量。使用Transciptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche，Mannheim，Germany)进行第一链cDNA合成。5μl的反应产物用作实时PCR的模板。

定量实时RT-PCR

按照生产商的说明书，利用LightCycler480(Roche，Mannheim，Germany)与SYBR Green I Master试剂盒(Roche，Mannheim，Germany)，进行定量实时RT-PCR(Q-PCR)分析。实时PCR反应始于在95℃下温育5分钟，接着在95℃下变性10秒钟、在65℃下退火15秒钟，并在72℃下延伸15秒钟的45个循环。完成PCR后立即进行解链曲线分析。所有反应以一式三份进行，并重复实验至少两次。应用LightCycler480软件1.5分析数据。

EpCAM和GAPDH的引物应用ProbeFinder测定设计软件(Roche，Mannheim，Germany)设计，由Sigma合成并进行HPLC纯化。引物序列如下：EpCAM，5’-CCATGTGCTGGTGTGTGAA-3’[SEQ ID NO.3](正向)和5’-TGTGTTTTAGTTCAATGGATGATCCA-3’[SEQ ID NO.4](反向)；GAPDH，5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’[SEQ ID NO.5](正向)和5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’[SEQ ID NO.6](反向)。

免疫细胞化学

将侵袭性和非侵袭性甲状腺癌细胞(WRO、CAL-62、TT和TPC-1)和对照细胞(ARO)(1x103)铺在盖玻片上，生长过夜。之后，细胞用PBS洗涤三次，使用4％低聚甲醛固定。对于通过免疫细胞化学检测Ep-Ex、Ep-ICD和β-联蛋白，固定细胞分别用MOC-31、1144(稀释度1∶200)或小鼠单克隆β-联蛋白抗体染色30分钟，用生物素化第二抗体染色30分钟。切片最后与VECTASTAIN Elite ABC试剂(Vector labs，Burlingame，CA)一起温育，二氨基联苯胺用作色原。

对于免疫荧光检测，山羊抗小鼠IgG-FITC(Sigma，St Louis，MO)或IgG-Alexa用作第二抗体。核用DAPI染色。免疫荧光使用荧光显微镜(LeicaDM IRBE，Houston，TX)检测。

蛋白质印迹法

在裂解缓冲液(0.15mM NaCl、5mM EDTA(pH 8.0)、1％Triton、10mMTris-Cl(pH 7.4))和蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)中制备细胞裂解物。细胞裂解物(30微克蛋白质)通过SDS-PAGE分离，并转移到PVDF膜(Millipore，Billerica，MA)。膜用抗EpCAM小鼠单克隆抗体B302(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)(稀释度1∶500)探测，接着按照生产商的说明书通过辣根过氧化物酶缀合的第二山羊抗小鼠抗体和化学发光检测***(PerkinElmer Life Sciences，Boston，MA)探测。作为蛋白质加样的对照，使用小鼠单克隆抗体C-4(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)(稀释度1∶1000)，针对β-肌动蛋白探测印迹。应用ImageGauge软件(Altura Software Inc.)，通过光密度测定分析进行定量。

结果

甲状腺癌中EpEx和Ep-ICD表达的免疫组织化学分析

为了确定甲状腺癌中Ep-Ex和Ep-ICD的临床重要性，分别使用结构域特异性抗体MOC-31和1144，在存档组织中通过免疫组织化学法对其表达进行分析。在ATC中未观察到质膜EpEx免疫反应性(图1，组图IA)。为了确定膜EpEx的丧失是否导致其胞质/核蓄积，使用1144抗体进行Ep-ICD免疫染色-在ATC中观察到强的核和胞质Ep-ICD免疫染色(图1，组图IIA)。已经表明活化Ep-ICD与β-联蛋白结合，并体外激活癌细胞的细胞增殖[Maetzel等，2009]。在连续切片中进行β-联蛋白免疫染色以确定在胞质/核Ep-ICD和核/胞质β-联蛋白之间是否有任何相关性。研究表明ATC中同时存在胞质和核β-联蛋白免疫染色(图1，组图IIIA)。

相比之下，分化差的甲状腺滤泡癌(PDFTC)亚类显示，定位于细胞-细胞接触的区域有强的局灶性EpEx膜染色(图1，组图IB)；在这些肿瘤中观察到中等核染色和胞质Ep-ICD免疫染色(图1，组图IIB)；对于β-联蛋白，观察到轻微的胞质染色和显著的膜染色(图1，组图IIIB)。分化差的甲状腺***状癌(PDPTC)显示EpEx膜染色(图1，组图IC)；在这些肿瘤中未观察到核染色和观察到微弱的胞质Ep-ICD免疫染色(图1，组图IIC)；对β-联蛋白观察到膜染色和轻微胞质染色(图1，组图IIIC)。高度分化的甲状腺***状癌(WDPTC)显示强的EpEx膜染色(图1，组图ID)；在这些肿瘤中未观察到核染色，但有轻微胞质Ep-ICD免疫染色(图1，组图IID)；并对β-联蛋白观察到强膜染色(图1，组图IIID)。相比之下，正常(非恶性)甲状腺组织显示基础EpEx膜免疫反应性(图1，组图IE)和微弱或无胞质或核Ep-ICD染色(图1，组图IIE)及针对β-联蛋白的基础膜免疫反应性(图1，组图IIIE)。鳞状细胞癌变体显示微弱的EpEx膜免疫反应性(图1，组图IF)；强的胞质和核Ep-ICD染色(图1，组图IIF)；及针对β-联蛋白的膜和胞质免疫反应性(图1，组图IIIF)。

利用visioform定量测定核Ep-ICD染色；图1G中给出显示不同的甲状腺癌亚型中百分比核Ep-ICD阳性的直方图。所有的5个ATC均显示核阳性；核Ep-ICD总阳性面积范围为12-40％。值得注意的是，1个PDPTC和1个PDFTC也显示核Ep-ICD阳性。总的来说，甲状腺肿瘤不同亚型中β-联蛋白表达分析表明ATC中的胞质和核表达，而在PDFTC和PDPTC及在WDPTC以及在非恶性甲状腺组织中观察到膜定位。

具有不同病理的同一患者的不同组织块的组织切片分析表明这些蛋白质表达模式中的差异，正如在各个甲状腺肿瘤中观察到的一样。图2组图AI描绘没有EpEx膜染色的ATC切片，而组图AII表示在连续ATC切片中强的Ep-ICD核和胞质定位，组图AIII显示核和胞质β-联蛋白表达。得自同一患者的另一个组织块表明SCC，组图BI表示局灶性微弱的膜EpCAM表达，而组图BII表示强的核和胞质Ep-ICD表达，组图BIII表示核和膜β-联蛋白表达。相比之下，显示PDFTC的来自同一患者的另一个组织块仅显示膜EpEx(组图CI)，同时只观察到胞质Ep-ICD(组图CII)，并观察到无核免疫染色的膜β-联蛋白(组图CIII)。得自同一患者的正常甲状腺组织显示强的EpCAM膜染色(组图DI)，无Ep-ICD的核染色和强染色(组图DII)及β-联蛋白的膜染色(组图DIII)。在同一患者中观察到的这些不同的染色模式支持甲状腺癌的不同亚类中这些蛋白质差异表达的观察结果。

箱形图分析

在正常甲状腺组织和不同甲状腺癌亚型的石蜡包埋切片中测定的EpEx、Ep-ICD和β-联蛋白的免疫染色总评分的分布见图3。组图A表示EpEx染色的箱形图-AI描绘在正常组织和PTC中的膜EpEx定位、在ATC中无可检测的表达、在FTC和SCC中表达的不同降低(评分中值为3，黑体水平线)。组图AII描绘在正常组织、PTC、PDPTC、PDFTC和FTC中的胞质EpEx定位、在ATC中无可检测的表达和在SCC中表达的不同降低。组图AIII描绘在正常组织或任一种甲状腺癌中无可检测的核EpEx染色。

组图B表示Ep-ICD染色的箱形图-I描绘在一些PTC、PDFTC和PDPTC中的膜Ep-ICD定位，但在ATC、FTC和SCC中无膜染色。组图BII描绘在正常组织、PTC、ATC、FTC和SCC、PDPTC和PDFTC中的胞质Ep-ICD定位。组图BIII描绘与评分中值为0的PTC、FTC、PDPTC、PDFTC和正常甲状腺组织相比，在ATC中的核Ep-ICD定位和在SCC中的不同表达(评分中值为3，黑体水平线，范围0-4，用垂直条形柱表示)。

组图C表示β-联蛋白染色的箱形图-I描绘仅ATC中的核染色。组图CII表示在所分析的所有甲状腺癌亚型中的胞质β-联蛋白。组图CIII表示在正常组织和除大多数的ATC以外的所分析的所有甲状腺癌亚型中的膜β-联蛋白。

利用Visiopharm Integrator System进一步验证了免疫组织化学得分数据。图3D表示甲状腺癌不同亚型中的Ep-ICD核染色。所分析的所有ATC及1个PDPTC和1个PDFTC显示核Ep-ICD表达。

甲状腺癌中EpCAM表达的定量实时RT-PCR分析

在转录物水平上通过Q-PCR测定了侵袭性和非侵袭性甲状腺癌中EpCAM的差异表达。图4表示甲状腺肿瘤和非恶性(组织学上正常的)甲状腺组织中EpCAM转录物的水平。与FTC和PTC相比，ATC显示非常低的EpCAM转录物水平。在EpCAM转录物和甲状腺癌侵袭性之间未观察到相关性。

EpEx、Ep-ICD和β-联蛋白表达与疾病结局的关联

Kaplan-Meier生存分析揭示具有核Ep-ICD表达的甲状腺癌患者的总体生存期缩短(p＜0.0001，图5A)。与不显示核Ep-ICD的患者的185个月总体生存期中值相比，显示核Ep-ICD的患者的总体生存期中值为5个月。显示丧失膜EpEx的患者的总体生存期(中位值＝5个月)比具有膜表达的患者(中位值＝185个月，p＜0.0001，图5B)短。显示核β-联蛋白的患者的总体生存期(中位值＝5个月)比不显示核β-联蛋白的患者(中位值＝185个月，p＝0.0014，图5C)短。具有Ep-ICD和β-联蛋白两者核表达的甲状腺癌患者的总体生存期(中位值＝5个月)比不具有Ep-ICD和β-联蛋白两者核表达的患者(中位值＝185个月，p＝0.0014，图5D)短。

EpEx在侵袭性人甲状腺癌细胞系中的亚细胞定位

在侵袭性和非侵袭性人甲状腺癌中观察到的Ep-Ex和Ep-ICD的差异亚细胞定位在体外繁殖的甲状腺癌细胞系中模拟，并通过免疫细胞化学进行测定。通过免疫细胞化学法在WRO细胞、甲状腺髓样癌细胞-TT和阳性对照结肠癌细胞-ARO(之前认为是ATC细胞)中观察到定位于质膜的强的EpEx免疫染色，而在退行发育性甲状腺癌细胞(CAL-62)和低级别甲状腺***状癌细胞(TPC-1)中未检测到膜EpCAM染色(图6A组图I)。这些研究结果得到免疫荧光的证实(图6A组图III)。

在CAL-62细胞中观察到胞质和核Ep-ICD染色，相比之下，WRO细胞显示胞质Ep-ICD和微弱的核染色(图6B组图II和IV)。图6B中给出EpEx和Ep-ICD染色的合并图像，组图IV描绘WRO细胞中强的膜染色和微弱的胞质染色。在TT细胞中，EpEx在膜中细胞-细胞接触处显示强的局灶性染色和微弱的胞质Ep-ICD染色。相比之下，退行发育性CAL-62细胞显示核和胞质Ep-ICD染色和无或微弱的EpEx染色。相比之下，非侵袭性甲状腺***状癌细胞系TPC-1不具有可检测的EpEx或Ep-ICD染色。

蛋白质印迹分析证实了EpEx在ARO、WRO和TT细胞中显著过表达；相比之下，在CAL-62细胞中观察到EpEx水平降低，而在TPC-1细胞中未检出EpEx(图6C)。

Q-PCR分析显示同组癌细胞系中EpCAM转录物的水平无显著差异。图6D表示在ARO、WRO、TT和CAL-62细胞中的EpCAM/GAPDH比率；在TPC-1细胞中无法定量测定转录物。

作为致癌信号转导蛋白的EpCAM

研究提出EpCAM的致癌潜力因其胞内域的释放而被激活，这可通过激活Wnt途径组分向细胞核发出信号。为了确定在EpEx自质膜的表达丧失、胞质蓄积和易位至核与Wnt途径组分β-联蛋白的亚细胞定位和靶基因例如c-myc的表达之间是否有任何相关性，在上述甲状腺癌细胞系组中对这些蛋白质的表达进行了分析。图6E和6F显示在WRO和ARO细胞中在细胞-细胞间接触处有强的EpEx表达以及β联蛋白和c-myc的胞质和核定位，但在CAL-62、TT和TPC-1细胞中却无。

讨论

关键的研究结果是：(i)退行发育性甲状腺肿瘤显示膜EpEx丧失，但在肿瘤细胞的胞质和核中Ep-ICD蓄积增加，这与并发的β-联蛋白表达并行，表明了Ep-ICD可在这些肿瘤中起致癌信号转导蛋白的作用，Wnt途径组分(包括β-联蛋白)的随之激活可能是这些肿瘤快速生长及其预后差的原因；(ii)在高度分化的甲状腺滤泡癌和甲状腺***状癌中观察到EpEx膜过表达，而在分化差的甲状腺滤泡癌和甲状腺***状癌的亚类中显示核Ep-ICD；(iii)EpEx在培养中的癌细胞WRO和TT的表面中过表达，但在退行发育性甲状腺癌细胞(CAL62)和较少侵袭性细胞TPC-1中的膜上未检测出，而在CAL62细胞中检出核Ep-ICD，这就支持临床研究结果。

本项研究是使用对Ep-ICD的胞质结构域有特异性的抗体的首次报道，证实了在ATC中Ep-ICD的胞质结构域的胞质和核蓄积。最近有研究提出，EpCAM的调节性膜内蛋白酶解(RIP)产生Ep-ICD，已经表明Ep-ICD在癌细胞中转导EpCAM信号并激活Wnt蛋白——导致β-联蛋白及靶基因c-myc和细胞周期蛋白D1的核蓄积增加(Munz等，2009)。证实了在ATC中胞质和核Ep-ICD与β-联蛋白伴随表达，这就表明Ep-ICD信号转导的活化和随之Wnt途径组分的活化可能是ATC快速生长的原因。

β-联蛋白作为参与典型Wnt途径的信号转导因子起重要作用[Li H等，2002]。β-联蛋白的核定位参与口腔白斑的癌前期变化[Ishida K等，2007]，并且已知与包括结肠直肠肿瘤、胃肿瘤和食管肿瘤等人类癌症的恶性转化有关[Morin PJ 1997，Ogasawara N 2006，Takayama T，1996，Zhou XB 2002]。典型Wnt信号转导途径的活化导致β-联蛋白的核易位[Lustig B 2003]，因此，核β-联蛋白是活性细胞增殖的标志物。与膜和胞质表达不同，β-联蛋白的核定位影响肿瘤进展。核β-联蛋白在ATC中的表达反应了这些肿瘤的侵袭性质。

此外，在侵袭性甲状腺癌细胞系CAL62中的体外研究结果表明，Ep-ICD、β-联蛋白和c-myc共定位支持可能造成ATC及SCC、PDPTC和PDFTC亚类侵袭行为的致癌Ep-ICD信号转导活化、Wnt途径组分活化和其靶蛋白cmyc的过表达。生存分析数据还表明膜EpEx丧失与甲状腺癌患者总体生存期缩短关联(p＜0.0001)。此外，还发现与不显示这些蛋白质核蓄积的甲状腺癌患者(中位值＝185个月)相比，核Ep-ICD蓄积(p＜0.0001)和核β-联蛋白表达(p＝0.0014)单独或伴以Ep-ICD(p＝0.0014)与总体生存期缩短相关(中位值＝5个月)。这是强调单独或与核β-联蛋白相关联的核Ep-ICD作为侵袭性甲状腺癌不良预测物的临床重要性的首次报告。

甲状腺癌细胞系和原发性甲状腺肿瘤的体外研究结果表明EpEx在高度分化和分化差的甲状腺癌的质膜中过表达，并强调其作为免疫治疗靶标的潜力。值得注意的是，在早期免疫组织化学研究中，Ensinger等(2006)报道了EpEx在高度分化和分化差的甲状腺癌中过表达，但在所分析的22个ATC中未观察到表达。结果还证实在ATC中使用识别Ep-CAM胞外域的抗体MOC-31，细胞表面的EpEx表达丧失。极高度分化和分化差的甲状腺滤泡性肿瘤细胞和甲状腺***状肿瘤细胞的质膜上的EpEx过表达，使之成为癌症标志物以及免疫治疗靶标的理想候选物。在ATC中膜EpEx的丧失及其核定位表明，在这些肿瘤中需要靶向Ep-ICD的新的治疗方法。

结论

综上所述，证实了侵袭性甲状腺癌(退行发育性甲状腺癌和一些分化差的甲状腺***状癌)中膜EpEx的丧失和Ep-ICD的核蓄积。在这些肿瘤中核β-联蛋白的同时增加表明这些肿瘤中Wnt途径信号转导的活化。此外，膜EpEx的丧失，或者单独或连同β-联蛋白的Ep-ICD的核蓄积，与甲状腺癌患者总体生存率差相关。Ep-ICD可用作侵袭性甲状腺癌的标志物，并且是新疗法的潜在靶标。

实施例2 EpCAM-潜在治疗靶标

用VB4-845/VB6-845治疗后EpCAM阳性甲状腺癌细胞增殖的抑制

在甲状腺癌细胞系组以及在具有不同EpCAM表达水平的阳性对照结肠癌细胞系中，检查了EpCAM特异性免疫毒素VB4-845/VB6-845对细胞增殖的作用。如图7所示，基于MTT的细胞存活率测定表明，VB4-845抑制WRO和ARO细胞的增殖，其IC₅₀分别为1pM和0.7pM。相比之下，甲状腺髓样癌细胞系TT边缘地对免疫毒素治疗起反应，而无可检测的膜EpCAM表达的***状细胞系TPC-1和退行发育性细胞系CAL-62对VB4-845无反应。用VB6-845治疗的相同细胞系中观察到类似结果(数据未显示)。

甲状腺癌细胞系中VB4-845对细胞凋亡的诱导

VB4-845治疗的甲状腺癌细胞通过FACS进行的细胞周期分析显示时间依赖性地诱导细胞凋亡，反映在与TT和TPC-1细胞相比，WRO和阳性对照ARO细胞中的subG0部分显著增加。还在用不同浓度的VB4-845治疗前后，通过蛋白质印迹法测定了细胞系中VB4-845对EpCAM表达的作用。图8表示用免疫毒素治疗的WRO细胞中EpCAM表达的剂量依赖性降低；未治疗或VB4-845治疗的TPC-1细胞中未检测到EpCAM表达。

由免疫毒素和EpCAM结合引起的VB4-845细胞毒性

免疫毒素VB4-845是将抗EpCAM单链可变片段与假单胞菌属(Pseuodomonas)外毒素A的毒性结合的重组融合蛋白。蛋白质的侧翼是2个六聚组氨酸(hexahistinide)标签。正如在流式细胞术测定中测定的一样，在与VB4-845温育2小时后，在具有EpCAM表达的细胞中检出抗His抗体。

将TPC-1细胞(10⁶)注射给6周龄SCID小鼠。4周后，每2天给每个肿瘤的肿瘤周注射含7.5ug VB4的100ul PBS。约2周后，小鼠主要因肿瘤过大而处死。测量肿瘤的大小，并在VB4治疗和PBS治疗之间进行比较。还在体内和体外两种情况下筛选TPC-1的EpCAM表达。因肿大小各异，因此将肿瘤体积转化成百分比。至于VB4治疗，10个之中有4个肿瘤缩小(图9(A))，而在PBS组中8个之中仅1个肿瘤缩小(图9(B))。

实施例3

在本实施例描述的研究中采用下列材料与方法。

患者和组织样品：

研究获加拿大多伦多辛乃山医院研究伦理理事会批准。对于IHC分析，从肿瘤库提取正常甲状腺组织(N＝9)、非肿瘤性-增生性/胶质结节(N＝1)、甲状腺***状癌(PTC，N＝86)、甲状腺滤泡癌(FTC，N＝2)、分化差的PTC(N＝1)、分化差的FTC(N＝1)、甲状腺髓样癌(N＝3)、岛状癌(N＝6)、SCC(N＝4)、退行发育性甲状腺癌(N＝11)的存档组织块，由病理学家检查，并用于切取组织切片，用下文所述Ep-ICD和EpEx(Moc31)抗体进行免疫染色。

以下是对研究结果的论述。

散点图分析

图10-14中的散点图表示在正常甲状腺组织和所分析的9个甲状腺肿瘤组织亚型中Ep-ICD和EpEx膜/胞质/核免疫组织化学染色评分的分布。ATC和SCC组显示膜EpEx染色显著减少，平均评分小于4，岛状癌显示膜EpEx中等减少。值得注意的是，ATC显示EpEx丧失，膜IHC评分小于1(图10)。与正常甲状腺组织组类似，其它较少侵袭性甲状腺肿瘤亚型显示强的EpEx膜染色，平均IHC评分大于6(图10)。在对EpEx胞质染色的观察中(图11)，与正常甲状腺组类似，比起较大侵袭性甲状腺癌亚型(包括ATC、SCC和岛状癌亚型)，一些较少侵袭性甲状腺癌亚型(例如PTC、FTC)显示较强的EpEx染色。ATC组显示无可检测的低EpEx染色或微弱的免疫反应性。

重要的是，使用对EpCAM的胞内胞质结构域(Ep-ICD)有特异性的抗体，图12和图13所示的膜染色，表示在所有甲状腺肿瘤亚型和另在正常甲状腺组中观察到的IHC评分为4-5的平均表达水平。所检查的11个ATC组织块中有10个观察到核Ep-ICD染色增加(大于截断值≥4)(图14)，平均染色评分为4.7。在较少侵袭性亚型SCC组中，4例中有2例显示达到截断值4的核Ep-ICD染色。在所有86个PTC组织块中，大部分肿瘤显示非常低的EpICD核染色，平均评分为0.6(表2)，与正常组相似。其它亚型例如HP、FTC、PDPTC、PDFTC、MTC、岛状癌，全都显示低水平的EpICD核染色，Ep-ICD核表达评分介于0-2之间(图14)。

甲状腺肿瘤中Ep-ICD和EpEx表达的免疫组织化学分析

在所比较的2个肿瘤甲状腺癌亚型(甲状腺***状癌和退行发育性甲状腺癌)中(表2)，ATC组表明当选择截断值≥4以确定阳性时，11个组织块中10个(90.9％)为核Ep-ICD阳性，而所有11个组织在截断值≤4时显示EpEx膜表达丧失。86个PTC组织中仅1个(1.2％)显示核Ep-ICD阳性。在PTC中4.5的核EpICD高评分与临床史的相关性显示患者为35岁男性，并具有***转移的证据。核Ep-ICD评分为3的另一名PTC患者患有转移性胰腺癌伴发脓毒症。Ep-ICD和EpEx IHC染色评分在PTC和ATC组间显著不同，将侵袭性与非侵袭性甲状腺癌(TC)相区别。

ROC曲线分析

绘制膜EpEx和核Ep-ICD的ROC曲线以将最大侵袭性甲状腺癌亚型ATC与最常观察到的但非侵袭性甲状腺癌亚型PTC区别开来(图15和16)。ROC分析的结果概括于表4。在≥4的截断值下，核Ep-ICD蓄积将ATC与PTC相区别，灵敏度为90.9％，特异性为98.8％，AUC为0.9931(图15和表4)。这就表明高水平的核EpICD蓄积具有用作区分侵袭性与其它非侵袭性甲状腺癌亚型的良好生物标记的潜力。如图15和表5中所示，当选择核EpICD IHC染色评分的截断值介于2.5-4之间时，该生物标记(核EpICD)可以90-100％的高灵敏度和95-98％的高特异性将ATC与PTC区别开来。在≤4的截断值下，膜EpEx表达丧失还可以100％的高灵敏度、98.8％的高特异性和0.914的AUC值将所有ATC病例与PTC区别开来(图16和表6)。阳性预测值为91.67％，阴性预测值为100％(图16和表6)。如图16和表7所示，选择EpEx膜IHC染色评分的截断值介于3.5-5之间，该生物标记(膜EpEx)可以90-100％的高灵敏度和95-100％的高特异性将ATC与PTC区别开来。

实施例4 菲律宾人甲状腺癌研究

观察到菲律宾人群具有较高的甲状腺癌发病率，并且肿瘤比非菲律宾患者的肿瘤更具侵袭性。在菲律宾患者的侵袭性和非侵袭性甲状腺癌中对EpEx和Ep-ICD的表达进行了分析。给出结果如下。

菲律宾人甲状腺肿瘤中Ep-ICD表达的免疫组织化学分析

在IHC评分截断值为4时，在所比较的3个肿瘤组中(表3)，侵袭性恶性肿瘤组在10个组织中有7个显示核Ep-ICD阳性，10个组织中有6个显示EpEx膜表达丧失。在所分析的9个良性肿瘤病例和11个非侵袭性恶性病例的任一个中未观察到EpEx膜表达丧失。非侵袭性甲状腺癌不显示核Ep-ICD阳性，且所分析的9个良性肿瘤中仅1个显示核Ep-ICD阳性。图17所示显微照片表示良性甲状腺肿瘤(A)和非侵袭性恶性肿瘤(C)中的膜EpEx表达，在所有10个甲状腺侵袭性恶性肿瘤病例的某些区域(E、G)中观察到EpEx膜表达丧失。在甲状腺侵袭性恶性肿瘤(F、H)中观察到Ep-ICD核表达，但在良性肿瘤组和非侵袭性恶性肿瘤组(B、D)中未观察到。

箱形图分析

图18和19的散点图以及图21A和21B及图22A和22B的箱形图显示所分析的3组(共30病例)菲律宾人甲状腺肿瘤病例中膜EpEx和核Ep-ICD染色评分的分布。在所检查的10例侵袭性恶性肿瘤中有7例发现核Ep-ICD染色增加(超过截断值≥4)(图22B)，平均染色评分为4.3。在9例良性肿瘤中仅观察到1例达到截断值≥4的核Ep-ICD染色，11个非侵袭性恶性肿瘤组织中无一观察到达到截断值≥4的核Ep-ICD染色。所检查的全部9个良性甲状腺肿瘤组织和全部11例非侵袭性恶性肿瘤显示高水平膜EpEx染色，平均分值约为7分(图21(A))。在2/3侵袭性恶性病例中观察到膜EpEx表达丧失(图22A.)。

ROC曲线分析

绘制膜EpEx和核Ep-ICD的ROC曲线以将恶性甲状腺肿瘤与良性肿瘤区别开来(图20A、B)，并且还将侵袭性恶性肿瘤与非侵袭性肿瘤区别开来(图20C，D)。包括相关ROC分析的结果概括于表8。

核Ep-ICD蓄积以33.33％灵敏度、88.89％的特异性和0.703的AUC值将甲状腺恶性肿瘤与良性肿瘤区别开来。核Ep-ICD蓄积以80％灵敏度、100％的特异性和1.0的AUC将侵袭性甲状腺恶性肿瘤与非侵袭性癌区别开来(表8)。膜EpEx表达丧失以28.57％灵敏度、100％的特异性和0.857的AUC值将甲状腺恶性肿瘤与良性肿瘤区别开来。核Ep-ICD蓄积以60％灵敏度、100％的特异性和0.914的AUC将侵袭性甲状腺恶性肿瘤与非侵袭性癌区别开来(表8)。

表1

已知的针对EpCAM的抗体

表2

良性和恶性甲状腺肿瘤中EpEx和Ep-ICD的免疫组织化学分析

注释：≥4的截断值用来确定核Ep-ICD阳性；≤4评分的截断值用来确定膜EpEx表达丧失。

表3

菲律宾人甲状腺肿瘤癌症中核Ep-ICD表达和膜EpEx表达的生物标记分析

表4

核EpICD的ROC曲线

ROC曲线下面积
		面积	0.9931
标准误差	0.006375
		95％置信区间	0.9806-1.006
P值	＜0.0001
		数据
对照(PTC)	86
		患者(ATC)	11
遗漏(missing)对照	0
		遗漏患者	0

表5

区分ATC与PTC的EpICD核染色

截断值	灵敏度％	特异性％
			＞2.300	100	95.35
＞2.850	100	96.51
			＞3.150	90.91	97.67
＞3.650	90.91	98.84
			＞4.250	54.55	98.84
＞4.750	54.55	100
			＞5.500	27.27	100

表6

EpEX-膜的ROC曲线

ROC曲线下面积
		面积	0.9989
标准误差	0.001768
		95％置信区间	0.9955-1.002
P值	＜0.0001
		数据
对照(PTC)	86
		患者(ATC)	11
遗漏对照	0
		遗漏患者	0

表7

区分ATC与PTC的EpEx膜染色

截断值	灵敏度％	特异性％
			＜3.300	90.91	100
＜3.550	90.91	98.84
			＜4.000	100	98.84
＜4.550	100	97.67
			＜4.750	100	96.51
＜5.050	100	95.35

表8

注释：4的截断值用来确定阳性。

出版物的完整引用

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本发明在范围上不受限于本文所述具体实施方案，因为这类实施方案旨在且仅说明本发明的一个方面，任何功能上等同的实施方案都属于本发明的范围。实际上，除本文所示和所描述的修改以外，根据前述说明和附图，本发明的各种修改对于本领域技术而言将是显而易见的。这类修改旨在落入随附权利要求书的范围内。

本文引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其整体结合，其程度就像每个单独的出版物、专利或专利申请具体和单独指明通过引用以其整体结合一样。本文提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用结合到本文中用于描述和公开其中报道的可与本发明联用的抗体、方法等的目的。本文绝不得解释为承认本发明无资格根据先前发明先于这类公开内容。

序列表

SEQ ID NO.1

NP_002345

SEQ ID NO.2

人(Homo sapiens)上皮细胞粘附分子(EPCAM)，mRNA

检索号NM_002354

SEQ ID NO.3

5’-CCATGTGCTGGTGTGTGAA-3’

SEQ ID NO.4

5’-TGTGTTTTAGTTCAATGGATGATCCA-3’

SEQ ID NO.5

5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’

SEQ ID NO.6

5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’

SEQ ID NO.7

β-联蛋白Swiss-Prot：P35222.1和Genbank NP_001091679

SEQ ID NO.8

β-联蛋白mRNA NM_001904.3(人)

SEQ ID NO.9

NM_001098209mRNA线性人联蛋白(钙黏着蛋白相关蛋白)，β1，

88kDa

SEQ ID NO.10

NM_001098210mRNA线性人联蛋白(钙黏着蛋白相关蛋白)，β1，

Claims

1.一种用于检测和/或诊断侵袭性甲状腺癌或具有转移潜力的甲状腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括与甲状腺癌标志物特异性结合的至少一种结合剂或与编码甲状腺癌标志物的多核苷酸的一部分杂交或扩增所述部分的至少一种物质，其中所述甲状腺癌标志物是Ep-ICD。

2.权利要求1的试剂盒，其还包括与EpEx特异性结合的至少一种结合剂或与EpEx的一部分杂交或扩增所述部分的至少一种物质。

3.权利要求1或2的试剂盒，其中所述与Ep-ICD特异性结合的至少一种结合剂为抗体或抗体片段。

4.权利要求2的试剂盒，其中所述与EpEx特异性结合的至少一种结合剂为抗体或抗体片段。

5.权利要求4的试剂盒，其中所述与EpEx结合的结合剂结合EpEx的EGF1结构域中的氨基酸。

6.权利要求1-2和4-5中任一项的试剂盒，其中与编码Ep-ICD的多核苷酸的一部分杂交或扩增所述部分的至少一种物质为SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4。

7.权利要求1-2和4-5中任一项的试剂盒，其还包括用于检测和/或诊断侵袭性甲状腺癌或具有转移潜力的甲状腺癌的一种或多种化合物、试剂、容器、装置部件或说明书。