CN105658237A - 抗Ly6E抗体及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供抗Ly6E抗体，免疫缀合物及使用它们的方法。

Description

抗Ly6E抗体及使用方法
发明领域
本发明涉及抗Ly6E抗体和免疫缀合物及使用它们的方法。
发明背景
淋巴细胞抗原6复合物，基因座E(Ly6E)，也称作视黄酸诱导的基因E(RIG-E)和干细胞抗原2(SCA-2)。它是一种GPI连接的，长131个氨基酸，约8.4kDa的蛋白质，功能未知，无已知的结合配偶物。它最初鉴定为在小鼠中的未成熟胸腺细胞，胸腺髓质上皮细胞中表达的转录物。RIG-E,ahumanhomologofthemurineLy-6family,isinducedbyretinoicacidduringthedifferentiationofacutepromyelocyticleukemiacell.MaoM.,YuM.,TongJ.-H.,YeJ.,ZhuJ.,HuangQ.-H.,FuG.,YuL.,ZhaoS.-Y.,WaxmanS.,LanotteM.,WangZ.-Y.,TanJ.-Z.,ChanS.-J.,ChenZ.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:5910-5914(1996)。
本领域需要靶向Ly6E的药剂来诊断和治疗Ly6E相关疾患，诸如癌症。本发明实现该需要且提供其它好处。
发明概述
本发明提供抗Ly6E抗体，免疫缀合物及使用它们的方法。
在一些实施方案中，提供一种结合Ly6E的分离的抗体，其中该抗体包含(a)包含SEQIDNO：34的氨基酸序列的HVR-H3，(b)包含SEQIDNO：31的氨基酸序列的HVR-L3，和(c)包含SEQIDNO：33的氨基酸序列的HVR-H2。在一些实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQIDNO:32的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQIDNO:29的氨基酸序列的HVR-L1，(b)包含SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，该抗体包含(a)与SEQIDNO：28的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与SEQIDNO：27的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。在一些实施方案中，该抗体包含SEQIDNO：28的VH序列。在一些实施方案中，该抗体包含SEQIDNO：27的VL序列。
在一些实施方案中，提供一种结合Ly6E的分离的抗体，其中该抗体包含SEQIDNO：28的VH序列和SEQIDNO：27的VL序列。
在一些实施方案中，该结合Ly6E的抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗体为小鼠抗体，家兔抗体，人抗体，人源化抗体，或嵌合抗体。在一些实施方案中，该抗体为IgG。在其它实施方案中，该IgG为IgG1，IgG2a或IgG2b，或IgG3，或IgG4。
在一些实施方案中，提供编码本文所述任何抗体的分离的核酸。在一些实施方案中，提供包含该分离的核酸的宿主细胞。在一些实施方案中，提供生成本文所述抗体的方法，其包括培养该宿主细胞。
在一些实施方案中，提供包含本文所述抗体和细胞毒剂的免疫缀合物。在一些实施方案中，提供包含该免疫缀合物和药学可接受载剂的药物组合物。
在一些实施方案中，本文所述抗体是与标记物缀合的。在一些实施方案中，该标记物为正电子发射体。在一些此类实施方案中，该正电子发射体为89Zr。
在一些实施方案中，提供检测生物学样品中的人Ly6E的方法。在一些实施方案中，该方法包括在允许本文所述抗Ly6E抗体结合天然存在人Ly6E的条件下将该生物学样品与该抗Ly6E抗体接触。在一些实施方案中，该方法包括检测该抗Ly6E抗体和该生物学样品中的天然存在人Ly6E之间是否形成复合物。在一些实施方案中，该生物学样品为乳腺癌样品，胰腺癌样品，结肠癌样品，结直肠癌样品，黑素瘤癌样品，卵巢癌样品，非小细胞肺癌样品，食道癌样品，头和颈癌样品，肾癌样品，软组织癌样品，子宫内膜癌样品，或胃癌样品。
在一些实施方案中，提供检测Ly6E阳性癌症的方法。在一些实施方案中，该方法包括(i)将经标记的抗Ly6E抗体施用于具有或怀疑具有Ly6E阳性癌症的受试者，其中该经标记的抗Ly6E抗体包含本文所述抗Ly6E抗体，并(ii)检测该受试者中的该经标记的抗Ly6E抗体。在一些实施方案中，检测到该经标记的抗Ly6E抗体指示该受试者中的Ly6E阳性癌症。在一些实施方案中，该经标记的抗Ly6E抗体包含与正电子发射体缀合的本文所述抗Ly6E抗体。在一些此类实施方案中，该正电子发射体为89Zr。
在一些实施方案中，提供将癌症患者鉴定为具有Ly6E阳性癌症的方法。在一些实施方案中，该方法包括在允许本文所述抗Ly6E抗体结合天然存在人Ly6E的条件下将来自该患者的癌样品与该抗Ly6E抗体接触。在一些实施方案中，该方法包括检测该抗Ly6E抗体和该癌样品中的天然存在人Ly6E之间是否形成复合物。在一些实施方案中，如果检测到该本文所述抗Ly6E抗体和癌症活检样品中的天然存在人Ly6E之间的复合物的话，将该癌症患者鉴定为具有Ly6E阳性癌症。
在一些实施方案中，提供选择癌症患者用包含抗Ly6E抗体的免疫缀合物治疗的方法。在一些实施方案中，该方法包括在允许本文所述抗Ly6E抗体结合天然存在人Ly6E的条件下将来自该患者的癌样品与该抗Ly6E抗体接触。在一些实施方案中，该方法包括检测该抗Ly6E抗体和该癌样品中的天然存在人Ly6E之间是否形成复合物。在一些实施方案中，如果检测到该抗Ly6E抗体和癌症活检样品中的天然存在人Ly6E之间的复合物的话，选择该癌症患者。在一些此类实施方案中，选择该癌症患者用包含如下抗Ly6E抗体的免疫缀合物治疗，该抗Ly6E抗体包含(a)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的HVR-H2，(c)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的HVR-L1，(e)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的HVR-L2，和(f)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，选择该癌症患者用包含如下抗Ly6E抗体的免疫缀合物治疗，该抗Ly6E抗体包含SEQIDNO：5的VH序列和SEQIDNO：3的VL序列。在一些实施方案中，该免疫缀合物包含与细胞毒剂缀合的抗Ly6E抗体。在一些实施方案中，该癌样品为乳腺癌样品，胰腺癌样品，结肠癌样品，结直肠癌样品，黑素瘤癌样品，卵巢癌样品，非小细胞肺癌样品，食道癌样品，头和颈癌样品，肾癌样品，软组织癌样品，子宫内膜癌样品，或胃癌样品。在一些实施方案中，该乳腺癌样品来自Her2阳性乳腺癌，Her2阴性乳腺癌，Her2阴性/激素受体阳性(Her2-/ER+/PR+)乳腺癌，或三重阴性(Her2-/ER-/PR-)乳腺癌。在一些实施方案中，该胃癌样品来自Her2阳性胃癌或Her2阴性胃癌。
附图简述
图1显示序列比对，比较来自人(SEQIDNO：1)，食蟹猴(cynomolgusmonkey)(SEQIDNO：2)，恒河猴(rhesusmonkey)(SEQIDNO：35)，小鼠(SEQIDNO：36)，和大鼠(SEQIDNO：37)物种的Ly6E直向同系物的序列。在胞外域(ECD)中，这些序列之间在氨基酸水平的百分比同一性显示为人与食蟹猴Ly6E之间的约96％及人与大鼠Ly6E之间的约52％。
图2显示Ly6EmRNA表达的Genelogic概况，如实施例1中进一步描述的。测量是在AffymetrixU133P芯片上进行的，而且表述为人组织中Ly6E表达的定标平均差异。每个点代表一份正常(绿色)，肿瘤(红色)，或患病非肿瘤(蓝色)人组织标本。矩形涵盖每种分布的25至75百分位范围。WBC＝白细胞。格外地，在乳腺，胰腺，结直肠，肺，黑素瘤和卵巢癌中看到Ly6E的过表达。
图3描绘一组正常人组织和选定癌细胞系和组织中针对RPL19对照基因表达标准化的Ly6E转录物表达的QRT-PCR相对倍数变化，如实施例2中描述的。结果指示正常组织中的Ly6E转录物表达与乳腺和胰腺癌中的Ly6E表达相比较低。
图4显示家兔抗Ly6E抗体克隆GEN-93-8-1的轻链可变域序列和重链可变域序列。高变区(HVR)标有下划线。位置依照Kabat编号。
图5显示抗Ly6EADC在表皮生长因子受体Her2扩增的乳腺癌异种移植物小鼠模型中的体内功效，如实施例7中描述的。小图A显示接种HCC1569X2乳腺癌细胞的免疫缺陷小鼠中建立的皮下肿瘤。当肿瘤体积达到大约100-250mm3时(第0天)，以所示剂量给予动物单次IV注射对照ADC(对照-vc-MMAE)或人源化抗Ly6E(hu9B12v12)ADC(MC-vc-PAB-MMAE)。自每组9只动物测定平均肿瘤体积及标准偏差(在图上标示)。小图B显示活的HCC1569X2细胞中的表面Ly6E蛋白质表达，如通过流式细胞术看到的，其中灰色峰指示仅用第二检测试剂处理的细胞，而黑色峰指示用3μg/mLLy6E抗体(hu9B12v12)ADC处理，接着用作为第二检测试剂的缀合至人IgG的Alexafluor488处理的细胞。作为几何均值，Ly6E表达显示在柱形图的右边。小图C显示hu9B12v12ADC滴定对乳腺癌细胞系HCC1569X2的细胞杀伤。将所示浓度的hu9B12v12ADC，对照IgG-vc-MMAE，或等同量的PBS媒介对照与细胞一起温育5天，并使用CellTiter-Glo评估相对细胞存活力(y轴)。小图D显示HCC1569X2肿瘤上的1+/2+Ly6E染色，使用小鼠抗Ly6E克隆10G7.7.8通过免疫组织化学进行。指出了使用小鼠抗Ly6E克隆10G7.7.8时Ly6E染色处于1+水平的肿瘤细胞的百分比。小图E显示HCC1569X2细胞团粒上的3+Ly6E染色，使用家兔抗Ly6E抗体克隆GEN-93-8-1通过免疫组织化学进行。
图6显示抗Ly6EADC在胰腺癌异种移植物小鼠模型中的体内功效。小图A显示接种SU.86.86胰腺癌细胞的免疫缺陷小鼠中建立的皮下肿瘤。如实施例5所述，当肿瘤体积达到大约100-250mm3时(第0天)，以所示剂量给予动物单次IV注射对照ADC(对照-vc-MMAE)或抗Ly6EADC。自每组9只动物测定平均肿瘤体积及标准偏差(在图上标示)。小图B比较HCC1569X2和SU.86.86细胞裂解物中的总Ly6E蛋白质表达，使用家兔抗Ly6E抗体克隆GEN-93-8-1通过免疫印迹进行。平行测量总β-微管蛋白蛋白质水平以充当加载对照。小图C显示SU.86.86肿瘤上的1+Ly6E染色，使用小鼠抗Ly6E克隆10G7.7.8通过免疫组织化学进行。小图D显示抗Ly6EADC滴定对胰腺癌细胞系SU.86.86的细胞杀伤。将所示浓度的抗Ly6EADC，对照IgG-vc-MMAE，或等同量的PBS媒介对照与细胞一起温育5天，并使用CellTiter-Glo评估以相对发光单位(RLU)计的相对细胞存活力(y轴)。小图E显示SU.86.86肿瘤上的2+Ly6E染色，使用家兔抗Ly6E抗体克隆GEN-93-8-1通过免疫组织化学进行。
图7显示如图5中所述抗Ly6EADC在于XenTech(Evry，France)建立的原代三重阴性(Her2-/ER-/PR-)乳腺癌肿瘤异种移植物模型HBCx-9中的体内功效。小图A显示植入有患者衍生乳腺癌肿瘤材料的免疫缺陷小鼠中建立的皮下肿瘤。当肿瘤体积达到大约100-250mm3时(第0天)，以所示剂量给予动物单次IV注射对照ADC(对照-vc-MMAE)或抗Ly6EADC。自每组9只动物测定平均肿瘤体积及标准偏差(在图上标示)。小图B比较多种XenTech原代肿瘤模型中及HCC1569X1和SU.86.86细胞裂解物中的总Ly6E蛋白质表达，使用小鼠抗Ly6E抗体4D8通过免疫印迹进行。平行测量总β-肌动蛋白蛋白质水平以充当加载对照。小图C显示HBCx-9肿瘤上的Ly6E染色，通过免疫组织化学进行。多份肿瘤样品的独立染色显示异质染色样式。指出了使用小鼠抗Ly6E克隆10G7.7.8时Ly6E染色处于1+水平的肿瘤细胞的百分比。小图D显示HBCx-9肿瘤上的2+Ly6E染色，使用家兔抗Ly6E抗体克隆GEN-93-8-1通过免疫组织化学进行。小图E显示HBCx-9细胞裂解物中的总Ly6E蛋白质表达，使用抗体GEN-93-8-1通过免疫印迹进行。平行测量GAPDH蛋白质水平以充当加载对照。
图8显示如图5中所述抗Ly6EADC在于XenTech(Evry，France)建立的原代三重阴性(Her2-/ER-/PR-)乳腺癌肿瘤异种移植物模型HBCx-8中的体内功效。小图A显示植入有患者衍生乳腺癌肿瘤材料的免疫缺陷小鼠中建立的皮下肿瘤。当肿瘤体积达到大约100-250mm3时(第0天)，以所示剂量给予动物单次IV注射对照ADC(对照-vc-MMAE)或抗Ly6EADC。自每组10只动物测定平均肿瘤体积及标准偏差(在图上标示)。小图B比较多种XenTech原代肿瘤模型中及HCC1569X1和SU.86.86细胞裂解物中的总Ly6E蛋白质表达，使用小鼠抗Ly6E抗体4D8通过免疫印迹进行。平行测量总β-肌动蛋白蛋白质水平以充当加载对照。小图C显示HBCx-8肿瘤上的Ly6E染色，使用小鼠抗Ly6E克隆10G7.7.8通过免疫组织化学进行。小图D显示HBCx-8肿瘤上的1+/2+Ly6E染色，使用家兔抗Ly6E抗体克隆GEN-93-8-1通过免疫组织化学进行。多份肿瘤样品使用10G7.7.8或GEN-93-8-1的独立染色显示处于1+或2+水平的染色样式，然而使用GEN-93-8-1的染色与10G7.7.8染色相比更加强健和同质。小图E显示HBCx-8细胞裂解物中的总Ly6E蛋白质表达，使用抗体GEN-93-8-1通过免疫印迹进行。平行测量GAPDH蛋白质水平以充当加载对照。
图9显示如图5中所述抗Ly6EADC在于OncotestGmbH(Freiburg，Germany)建立的原代表皮生长因子受体Her2扩增的乳腺癌肿瘤异种移植物模型MAXF-1162中的体内功效。小图A显示植入有患者衍生乳腺癌肿瘤材料的免疫缺陷小鼠中建立的皮下肿瘤。当肿瘤体积达到大约100-250mm3时(第0天)，以所示剂量给予动物单次IV注射对照ADC(对照-vc-MMAE)或抗Ly6EADC。自每组10只动物测定平均肿瘤体积及标准偏差(在图上标示)。小图B比较多种Oncotest原代肿瘤模型及细胞裂解物中的总Ly6E蛋白质表达，通过免疫印迹进行。平行测量总GAPDH蛋白质水平以充当加载对照。小图C显示MAXF-1162肿瘤上的Ly6E染色，使用小鼠抗Ly6E克隆10G7.7.8通过免疫组织化学进行。多份肿瘤样品的独立染色显示异质染色样式。指出了Ly6E染色处于1+或2+水平的肿瘤细胞的百分比。小图D显示MAXF-1162肿瘤上的强健2+Ly6E染色(及潜在缺氧中心区中的一些1+染色)，使用家兔抗Ly6E抗体克隆GEN-93-8-1通过免疫组织化学进行。
图10显示如图5中所述抗Ly6EADC在于OncotestGmbH(Freiburg，Germany)建立的原代胰腺癌肿瘤异种移植物模型PAXF-1657中的体内功效。小图A显示植入有患者衍生胰腺癌肿瘤外植体的免疫缺陷小鼠中建立的皮下肿瘤。当肿瘤体积达到大约100-250mm3时(第0天)，以所示剂量给予动物单次IV注射对照ADC(对照-vc-MMAE)或抗Ly6EADC。自每组10只动物测定平均肿瘤体积及标准偏差(在图上标示)。小图B比较多种原代肿瘤模型及细胞裂解物中的总Ly6E蛋白质表达，通过免疫印迹进行。平行测量总GAPDH或β-肌动蛋白蛋白质水平以充当加载对照。小图C显示PAXF-1657肿瘤上的Ly6E染色，使用小鼠抗Ly6E克隆10G7.7.8通过免疫组织化学进行。多份肿瘤样品的独立染色显示异质染色样式。指出了Ly6E染色处于很弱(+/-)水平的肿瘤细胞的百分比。小图D显示PAXF-1657肿瘤上的2+Ly6E染色，使用家兔抗Ly6E抗体克隆GEN-93-8-1通过免疫组织化学进行。
本发明实施方案的详述
I.定义
出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指与不拥有此类改变的亲本抗体相比，在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
术语“抗Ly6E抗体”和“结合Ly6E的抗体”指能够以足够的亲和力结合Ly6E，使得抗体可用作靶向Ly6E中的诊断和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中，抗Ly6E抗体对无关的，非Ly6E蛋白的结合程度小于抗体对Ly6E的结合的约10％，如例如通过放射性免疫测定法(RIA)或Scatchard分析或表面等离振子共振(诸如例如Biacore)测量的。在某些实施方案中，结合Ly6E的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗Ly6E抗体结合来自不同物种的Ly6E间保守的Ly6E表位。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
如本文中使用的，术语“抗体药物缀合物”(ADC)等同于术语“免疫缀合物”。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中与完整抗体结合的抗原结合的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和自抗体片段形成的多特异性抗体。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了一种例示性竞争测定法。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖不受调节的生理状况。癌症的例子包括但不限于癌瘤，淋巴瘤(例如何杰金(Hodgkin)氏和非何杰金氏淋巴瘤)，母细胞瘤，肉瘤，和白血病。此类癌症的更具体的例子包括过表达Ly6E的癌症，其可以包括例如乳腺癌和/或转移性乳腺癌，包括Her2阳性乳腺癌，Her2阴性乳腺癌，Her2阴性/激素受体阳性(Her2-/ER+/PR+)，和三重阴性乳腺癌，胰腺癌和/或转移性胰腺癌，结肠癌，结直肠癌，皮肤癌，黑素瘤和/或转移性黑素瘤，卵巢癌，非小细胞肺癌(鳞状和/或非鳞状，诸如腺癌)，胃癌(包括Her2阳性胃癌和/或Her2阴性胃癌)，鳞状细胞癌，小细胞肺癌，肺的腺癌，肺的鳞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃肠癌，胶质瘤，***，肝癌，膀胱癌，肝瘤，软组织癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，食道癌，肾癌，肝癌，***癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌瘤，白血病和其它淋巴增殖性病症，和各种类型的头和颈癌。
术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。
如本文中使用的，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或化疗药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱类(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)C，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌，真菌，植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。
术语“表位”指抗原分子上，抗体结合的特定位点。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号***，又称作EU索引，如记载于Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1，FR2，FR3，和FR4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”，“完整抗体”，和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有本文中定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”，和“宿主细胞培养物”可互换使用，指已经导入有外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变体后代。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“家兔抗体”指拥有与由家兔或家兔细胞生成的或利用家兔抗体全集或其它家兔抗体编码序列自非家兔来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,NIHPublication91-3242,BethesdaMD(1991),vols.1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组卡帕I。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
如本文中使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的每一个区域。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR；三个在VH中(H1，H2，H3)，且三个在VL中(L1，L2，L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。例示性高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)(ChothiaandLesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。例示性CDR(CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2，和CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34，L2的50-56，L3的89-97，H1的31-35B，H2的50-65，和H3的95-102(Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991))。除了VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的CDR，或a-CDR的CDR区域内。例示性a-CDR(a-CDR-L1，a-CDR-L2，a-CDR-L3，a-CDR-H1，a-CDR-H2，和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34，L2的50-55，L3的89-96，H1的31-35B，H2的50-58，和H3的95-102(参见AlmagroandFransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号。
“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒剂)缀合的抗体。免疫缀合物等同于术语“抗体药物缀合物”(ADC)。
“个体”或“患者”或“受试者”指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛，绵羊，猫，犬，和马)，灵长类(例如人和非人灵长类，诸如猴)，家兔，和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者指人。
“分离的”抗体指已经与其天然环境的成分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述参见例如Flatmanetal.,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分离的”核酸指已经与其天然环境的成分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色***置不同的染色***置处存在。
“编码抗Ly6E抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或分开的载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。
如本文中使用的，术语“Ly6E”指任何天然，成熟Ly6E，其源自细胞中对Ly6E前体蛋白的加工。该术语包括来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物，诸如灵长类(例如人和食蟹猴或恒河猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的Ly6E，除非另有说明。该术语还包括天然存在的Ly6E变体，例如剪接变体或等位变体。一种带信号序列(氨基酸1-20＝信号序列)的例示性人Ly6E前体蛋白的氨基酸序列显示于SEQIDNO：1。一种例示性成熟人Ly6E的氨基酸序列显示于SEQIDNO：38。一种例示性食蟹猴Ly6E的氨基酸1-131的序列显示于SEQIDNO：2。一种例示性成熟食蟹猴Ly6E的氨基酸序列显示于SEQIDNO：39。一种例示性大鼠Ly6E前体(带信号序列，氨基酸1-26)的氨基酸序列和成熟序列分别显示于SEQIDNO：37和42。例示性小鼠Ly6E前体(带信号序列，氨基酸1-26)的氨基酸序列和成熟序列分别显示于SEQIDNO：36和41。例示性恒河猴Ly6E前体(带信号序列，氨基酸1-20)的氨基酸序列和成熟序列分别显示于SEQIDNO：35和40。
术语“Ly6E阳性癌症”指包含在其表面上表达Ly6E的细胞的癌症。为了确定细胞是否在表面上表达Ly6E的目的，认为Ly6EmRNA表达与细胞表面上的Ly6E表达有关联。在一些实施方案中，通过选自原位杂交和RT-PCR(包括定量RT-PCR)的方法测定Ly6EmRNA表达。或者，可以在例如诸如免疫组织化学，FACS，等方法中使用针对Ly6E的抗体测定细胞表面上的Ly6E表达。在一些实施方案中，Ly6E阳性癌症包括乳腺癌和转移性乳腺癌，包括Her2阳性乳腺癌，Her2阴性乳腺癌，Her2阴性/激素受体阳性(Her2-/ER+/PR+)，和三重阴性乳腺癌，胰腺癌，结肠癌，结直肠癌，黑素瘤，卵巢癌，肺癌，非小细胞肺癌(鳞状和/或非鳞状，诸如腺癌)，软组织癌，子宫内膜癌，食道癌，头和颈癌，肾癌，或胃癌(包括Her2阳性胃癌和Her2阴性胃癌)，在每一种情况中展现可检测水平的Ly6E表达。
术语“Ly6E阳性细胞”指在其表面上表达Ly6E的癌细胞。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体展示方法，和利用含有整个或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1，CH2，和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症，用法，剂量，施用，联合疗法，禁忌症和/或警告的信息。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长实现最大对比需要的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(WashingtonD.C.，20559)，在那里其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech公司(SouthSanFrancisco，California)可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作***(包括数码UNIXV4.0D)上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)，与(with)，或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于，与，或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当领会，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“药物配制剂”指所处形式使得允许其中含有的活性组分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
“药学可接受载剂”指药物配制剂中除活性组分以外，且对受试者无毒的组分。药学可接受载剂包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂，或防腐剂。
如本文中使用的，“铂复合物”指抗癌化疗药物，诸如例如但不限于顺铂(cisplatin)，奥沙利铂(oxaliplatin)，卡铂(carboplatin)，异丙铂(iproplatin)，沙铂(satraplatin)，CI-973，AZ0473，DWA2114R，奈达铂(nedaplatin)，和螺铂(sprioplatin)，它们基于它们共价结合DNA的能力发挥针对肿瘤的功效。
如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。期望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或再发生，减轻症状，减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，其中每一个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)(参见例如Kindtetal.,KubyImmunology,6thed.,W.H.FreemanandCo.,page91(2007))。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合特定抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合该抗原的抗体。参见例如Portolanoetal.,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarksonetal.,Nature352:624-628(1991)。
如本文中使用的，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体以及并入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
II.组合物和方法
一方面，本发明部分基于结合Ly6E的抗体和包含此类抗体的免疫缀合物。本发明的抗体和免疫缀合物对于例如Ly6E阳性癌症的诊断或治疗是有用的。
A.例示性抗Ly6E抗体
在一些实施方案中，本发明提供结合Ly6E的分离的抗体。在某些实施方案中，抗Ly6E抗体具有至少一项或多项下述特征(任意组合)：
(a)结合SEQIDNO：1氨基酸21-131内的表位；和
(b)以≤7nM，或≤6nM，或≤5nM，或≤4nM，或≤3nM，或≤2nM，或≤1nM，且任选≥0.0001nM，或≥0.001nM，或≥0.01nM的亲和力结合Ly6E，如通过SPR或Scatchard分析测量的。
抗体9B12
一种非限制性例示性抗Ly6E抗体是鼠9B12及其人源化变体，诸如例如hu9B12.v12(见例如SEQIDNO：4和6；及SEQIDNO：3和5所示可变区序列)。在一些实施方案中，Ly6E为人Ly6E。在一些实施方案中，Ly6E选自人，食蟹猴，恒河猴，小鼠或大鼠Ly6E。
在一些实施方案中，抗Ly6E抗体结合SEQIDNO：1氨基酸21-131内的表位。在一些此类实施方案中，该抗Ly6E抗体以≤7nM，或≤6nM，或≤5nM，或≤4nM，或≤3nM，或≤2nM，或≤1nM，且任选≥0.0001nM，或≥0.001nM，或≥0.01nM的亲和力结合Ly6E，如通过SPR或Scatchard分析测量的。本发明的一种非限制性例示性抗体是鼠9B12及其人源化变体，诸如例如hu9B12.v12。在一些实施方案中，Ly6E为人Ly6E。在一些实施方案中，Ly6E为人Ly6E或食蟹猴Ly6E。
一方面，本发明提供一种抗Ly6E抗体，其包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的HVR：(a)包含氨基酸序列SEQIDNO：10的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQIDNO：11的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列SEQIDNO：12的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列SEQIDNO：7的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列SEQIDNO：8的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列SEQIDNO：9的HVR-L3。
一方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VHHVR序列：(a)包含氨基酸序列SEQIDNO：10的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQIDNO：11的HVR-H2；和(c)包含氨基酸序列SEQIDNO：12的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQIDNO：12。在另一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQIDNO：12，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQIDNO：9。在又一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQIDNO：12，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQIDNO：9，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQIDNO：11。在又一个实施方案中，该抗体包含：(a)包含氨基酸序列SEQIDNO：10的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQIDNO：11的HVR-H2；和(c)包含氨基酸序列SEQIDNO：12的HVR-H3。
另一方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VLHVR序列：(a)包含氨基酸序列SEQIDNO：7的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQIDNO：8的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQIDNO：9的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含：(a)包含氨基酸序列SEQIDNO：7的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQIDNO：8的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQIDNO：9的HVR-L3。
另一方面，本发明的抗体包含：(a)VH结构域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VHHVR序列：(i)包含氨基酸序列SEQIDNO：10的HVR-H1，(ii)包含氨基酸序列SEQIDNO：11的HVR-H2，和(iii)包含氨基酸序列SEQIDNO：12的HVR-H3；和(b)VL结构域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VLHVR序列：(i)包含氨基酸序列SEQIDNO：7的HVR-L1，(ii)包含氨基酸序列SEQIDNO：8的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQIDNO：9的HVR-L3。
另一方面，本发明提供一种抗体，其包含：(a)包含氨基酸序列SEQIDNO：10的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQIDNO：11的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列SEQIDNO：12的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列SEQIDNO：7的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列SEQIDNO：8的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列SEQIDNO：9的HVR-L3。
在任何上述实施方案中，抗Ly6E抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗Ly6E抗体包含任何上述实施方案中的HVR，而且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在另一个实施方案中，抗Ly6E抗体包含任何上述实施方案中的HVR，而且它进一步包含轻链可变域框架FR2序列SEQIDNO：20或轻链可变域框架FR3序列SEQIDNO：21或重链可变域框架FR1序列SEQIDNO：23或重链可变域框架FR2序列SEQIDNO：24。
另一方面，抗Ly6E抗体包含与氨基酸序列SEQIDNO：5具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参照序列包含替代(例如保守替代)，***，或删除，但是包含该序列的抗Ly6E抗体保留结合Ly6E的能力。在某些实施方案中，在SEQIDNO：5中替代，***和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，***，或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，抗Ly6E抗体包含SEQIDNO：5中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定的实施方案中，该VH包含一种，两种或三种选自下述的HVR：(a)包含氨基酸序列SEQIDNO：10的HVR-H1，(b)包含氨基酸序列SEQIDNO：11的HVR-H2，和(c)包含氨基酸序列SEQIDNO：12的HVR-H3。
另一方面，提供一种抗Ly6E抗体，其中该抗体包含与氨基酸序列SEQIDNO：3具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参照序列包含替代(例如保守替代)，***，或删除，但是包含该序列的抗Ly6E抗体保留结合Ly6E的能力。在某些实施方案中，在SEQIDNO：3中替代，***和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，***，或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，抗Ly6E抗体包含SEQIDNO：3中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定的实施方案中，该VL包含一种，两种或三种选自下述的HVR：(a)包含氨基酸序列SEQIDNO：7的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQIDNO：8的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQIDNO：9的HVR-L3。
另一方面，提供一种抗Ly6E抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQIDNO：5和SEQIDNO：3中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
又一方面，本发明提供与本文中提供的抗Ly6E抗体结合相同表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供与包含VH序列SEQIDNO：5和VL序列SEQIDNO：3的抗Ly6E抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供了一种抗体，其结合由SEQIDNO：1氨基酸21-131组成的Ly6E片段内的表位。
在本发明的又一方面，依照任何上述实施方案的抗Ly6E抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体，人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗Ly6E抗体是抗体片段，例如Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体，或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgG1抗体或其它抗体类或同种型，如本文中定义的。
又一方面，依照任何上述实施方案的抗Ly6E抗体可单一地或组合地并入下文1-7节中描述的任何特征。
抗体GEN-93-8-1
一种非限制性例示性抗Ly6E抗体是图4所示家兔GEN-93-8-1及包含GEN-93-8-1的一种或多种HVR的抗体。在一些实施方案中，Ly6E为人Ly6E。在一些实施方案中，Ly6E选自人，非人灵长类动物，小鼠或大鼠Ly6E。在一些实施方案中，非人灵长类动物Ly6E为食蟹猴或恒河猴Ly6E。
一方面，本发明提供一种抗Ly6E抗体，其包含至少一种，两种，三种，四种，五种，或六种选自下述的HVR：(a)包含氨基酸序列SEQIDNO：32的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQIDNO：33的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列SEQIDNO：34的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列SEQIDNO：29的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列SEQIDNO：30的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列SEQIDNO：31的HVR-L3。
一方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VHHVR序列：(a)包含氨基酸序列SEQIDNO：32的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQIDNO：33的HVR-H2；和(c)包含氨基酸序列SEQIDNO：34的HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQIDNO：34。在另一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3和HVR-L3，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQIDNO：34，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQIDNO：31。在又一个实施方案中，该抗体包含HVR-H3，HVR-L3和HVR-H2，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQIDNO：34，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQIDNO：31，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQIDNO：33。在又一个实施方案中，该抗体包含：(a)包含氨基酸序列SEQIDNO：32的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQIDNO：33的HVR-H2；和(c)包含氨基酸序列SEQIDNO：34的HVR-H3。
另一方面，本发明提供一种抗体，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VLHVR序列：(a)包含氨基酸序列SEQIDNO：29的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQIDNO：30的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQIDNO：31的HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含：(a)包含氨基酸序列SEQIDNO：29的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQIDNO：30的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQIDNO：31的HVR-L3。
另一方面，本发明的抗体包含：(a)VH结构域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VHHVR序列：(i)包含氨基酸序列SEQIDNO：32的HVR-H1，(ii)包含氨基酸序列SEQIDNO：33的HVR-H2，和(iii)包含氨基酸序列SEQIDNO：34的HVR-H3；和(b)VL结构域，其包含至少一种，至少两种，或所有三种选自下述的VLHVR序列：(i)包含氨基酸序列SEQIDNO：29的HVR-L1，(ii)包含氨基酸序列SEQIDNO：30的HVR-L2，和(c)包含氨基酸序列SEQIDNO：31的HVR-L3。
另一方面，本发明提供一种抗体，其包含：(a)包含氨基酸序列SEQIDNO：32的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQIDNO：33的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列SEQIDNO：34的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列SEQIDNO：29的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列SEQIDNO：30的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列SEQIDNO：31的HVR-L3。
在任何上述实施方案中，抗Ly6E抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗Ly6E抗体包含任何上述实施方案中的HVR，而且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
另一方面，抗Ly6E抗体包含与氨基酸序列SEQIDNO：28具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参照序列包含替代(例如保守替代)，***，或删除，但是包含该序列的抗Ly6E抗体保留结合Ly6E的能力。在某些实施方案中，在SEQIDNO：28中替代，***和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，***，或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，抗Ly6E抗体包含SEQIDNO：28中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定的实施方案中，该VH包含一种，两种或三种选自下述的HVR：(a)包含氨基酸序列SEQIDNO：32的HVR-H1，(b)包含氨基酸序列SEQIDNO：33的HVR-H2，和(c)包含氨基酸序列SEQIDNO：34的HVR-H3。
另一方面，提供一种抗Ly6E抗体，其中该抗体包含与氨基酸序列SEQIDNO：27具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参照序列包含替代(例如保守替代)，***，或删除，但是包含该序列的抗Ly6E抗体保留结合Ly6E的能力。在某些实施方案中，在SEQIDNO：27中替代，***和/或删除了总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，***，或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，抗Ly6E抗体包含SEQIDNO：27中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定的实施方案中，该VL包含一种，两种或三种选自下述的HVR：(a)包含氨基酸序列SEQIDNO：29的HVR-L1；(b)包含氨基酸序列SEQIDNO：30的HVR-L2；和(c)包含氨基酸序列SEQIDNO：31的HVR-L3。
另一方面，提供一种抗Ly6E抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQIDNO：28和SEQIDNO：27中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
又一方面，本发明提供与本文中提供的抗Ly6E抗体结合相同表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供与包含VH序列SEQIDNO：28和VL序列SEQIDNO：27的抗Ly6E抗体结合相同表位的抗体。
在本发明的又一方面，依照任何上述实施方案的抗Ly6E抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体，人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗Ly6E抗体是抗体片段，例如Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体，或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgG1抗体或其它抗体类或同种型，如本文中定义的。
又一方面，依照任何上述实施方案的抗Ly6E抗体可单一地或组合地并入下文1-7节中描述的任何特征。
测定法
为了确定抗Ly6E抗体是否“结合SEQIDNO：1氨基酸21-131内的表位”，在293细胞中表达具有N和C端删除的Ly6E多肽，并通过FACS测试抗体对截短型多肽的结合，其中抗体对截短型多肽的结合相对于对在293细胞中表达的全长Ly6E的结合的实质性降低(≥70％降低)或消除指示该抗体不结合该截短型多肽。
依照如本文中实施例4所述的Scatchard分析来确定抗Ly6E抗体是否“以≤6nM，或≤5nM，或≤4nM，或≤3nM，或≤2nM，或≤1nM的亲和力结合”。或者，可以依照例如BIAcore测定法来测定抗Ly6E抗体亲和力。具体而言，Kd是使用表面等离振子共振测定法使用(BIAcore,Inc.，Piscataway，NJ)测量的。依照供应商的用法说明书用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)试剂活化BIAcoreTM研究级CM5芯片。将山羊抗人FcIgG偶联至芯片以实现每个流动室中大约10,000个响应单位(RU)。用1M乙醇胺封闭未反应的偶联基团。为了进行动力学测量，捕捉抗Ly6E抗体以实现大约300RU。于25℃以30μl/min的流速注射人Ly6E(例如杆状病毒***中表达的与His-Fc融合的氨基酸21-131或自CHO细胞表达的与Fc融合的氨基酸21-131)在HBS-P缓冲液(0.01MHEPESpH7.4，0.15MNaCl，0.005％表面活性剂P20)中的两倍连续稀释液(125nM至0.49nM)。使用1:1朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcoreTMEvaluationSoftwareversion3.2)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1s-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计，诸如配备了断流装置的分光光度计(AvivInstruments)或8000系列分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅动比色杯进行的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBSpH7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
在任何上述实施方案中，抗Ly6E抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗Ly6E抗体包含任何上述实施方案中的HVR，而且进一步包含人受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些实施方案中，人受体框架为人VL卡帕IV共有(VLKIV)框架和/或VH框架VH1。
在本发明的又一方面，依照任何上述实施方案的抗Ly6E抗体为单克隆抗体，包括嵌合抗体，人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗Ly6E抗体为抗体片段，例如Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体，或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，该抗体为基本上全长抗体，例如IgG1抗体或其它抗体类或同种型，如本文中定义的。
又一方面，依照任何上述实施方案的抗Ly6E抗体可单一地或组合地并入下文1-7节中描述的任何特征。
在本发明的又一方面，依照任何上述实施方案的抗Ly6E抗体为单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，抗Ly6E抗体为抗体片段，例如Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体，或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，该抗体为基本上全长抗体，例如IgG2a抗体或其它抗体类或同种型，如本文中定义的。
又一方面，依照任何上述实施方案的抗Ly6E抗体可单一地或组合地并入下文1-7节中描述的任何特征。
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM，且任选≥10-13M(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，Kd是通过如下述测定法所述用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施的放射性标记抗原结合测定法(RIA)测量的。通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如Chenetal.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立测定法的条件，将多孔板(ThermoScientific)用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(CappelLabs)包被过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白于室温(大约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的感兴趣Fab混合(例如与Prestaetal.,CancerRes.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将感兴趣Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时段(例如约65个小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板，于室温温育(例如1小时)。然后除去溶液，并用PBS中的0.1％聚山梨酯20洗板8次。板干燥后，添加150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20TM；Packard)，然后在TOPCOUNTTM伽马计数仪(Packard)上对板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一个实施方案，Kd是使用Scatchard分析测量的，如实施例4中所述。依照另一个实施方案，Kd是使用表面等离振子共振测定法使用或(BIAcore,Inc.，Piscataway，NJ)于25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射以获得大约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了动力学测量，于25℃以大约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(Evaluation软件版本3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chenetal.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1s-1，那么可使用荧光淬灭技术来测定结合速率，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(AvivInstruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯进行的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBSpH7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2，Fv，和scFv片段，及下文描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudsonetal.,Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün,inThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,RosenburgandMooreeds.,(Springer-Verlag,NewYork),pp.269-315(1994)；还可参见WO93/16185；及美国专利No.5,571,894和No.5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，参见美国专利No.5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。参见例如EP404,097；WO1993/01161；Hudsonetal.,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollingeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudsonetal.,Nat.Med.9:129-134(2003)。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。
可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。
3.嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567；及Morrisonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984)。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如自小鼠，大鼠，仓鼠，家兔，或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如为了恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如AlmagroandFransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmannetal.,Nature332:323-329(1988)；Queenetal.,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337，No.7,527,791，No.6,982,321，和No.7,087,409；Kashmirietal.,Methods36:25-34(2005)(记载SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(记载“重修表面”)；Dall’Acquaetal.,Methods36:43-60(2005)(记载“FR改组”)；及Osbournetal.,Methods36:61-68(2005)及Klimkaetal.,Br.J.Cancer83:252-260(2000)(记载FR改组的“引导选择”办法)。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(参见例如Simsetal.,J.Immunol.151:2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(参见例如Carteretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285(1992)；及Prestaetal.,J.Immunol.151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见例如AlmagroandFransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(参见例如Bacaetal.,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosoketal.,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于vanDijkandvandeWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有整个或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可参见例如美国专利No.6,075,181和No.6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M技术，和美国专利申请公开文本No.US2007/0061900，其描述了技术。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见例如Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984)；Brodeuretal.,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)；及Boerneretal.,J.Immunol.147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Liietal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些记载于例如美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)及Ni,XiandaiMianyixue26(4):265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于VollmersandBrandlein,HistologyandHistopathology20(3):927-937(2005)及VollmersandBrandlein,MethodsandFindingsinExperimentalandClinicalPharmacology27(3):185-91(2005)。
也可以如下生成人抗体，即分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库及对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboometal.,inMethodsinMolecularBiology178:1-37(O’Brienetal.,ed.,HumanPress,Totowa,NJ,2001)，并且进一步记载于例如McCaffertyetal.,Nature348:552-554；Clacksonetal.,Nature352:624-628(1991)；Marksetal.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；MarksandBradbury,inMethodsinMolecularBiology248:161-175(Lo,ed.,HumanPress,Totowa,NJ,2003)；Sidhuetal.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Leeetal.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；及Leeetal.,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winteretal.,Ann.Rev.Immunol.12:433-455(1994)。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆未免疫全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffithsetal.,EMBOJ,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol.227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373及美国专利公开文本No.2005/0079574，2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598，2007/0237764，2007/0292936和2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对Ly6E，而另一针对任何其它抗原。在某些实施方案中，结合特异性之一针对Ly6E，而另一针对CD3。参见例如美国专利No.5,821,337。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合Ly6E的两种不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达Ly6E的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链的重组共表达(参见MilsteinandCuello,Nature305:537(1983)；WO93/08829；及Trauneckeretal.,EMBOJ.10:3655(1991))，和“节-入-穴”工程化(参见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见例如美国专利No.4,676,980及Brennanetal.,Science229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(参见例如Kostelnyetal.,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见例如Hollingeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruberetal.,J.Immunol.152:5368(1994))；及制备三特异性抗体(如例如Tuttetal.,J.Immunol.147:60(1991)中所描述的)来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US2006/0025576A1)。
本文中的抗体或片段还包括包含结合Ly6E及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(参见例如US2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将适宜的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除，和/或***和/或替代。可以进行删除，***，和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如抗原结合。
a)替代，***，和删除变体
在某些实施方案中，提供具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表1中在“优选的替代”的标题下显示。更实质的变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
表1
初始残基 例示性替代 优选的替代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp19 -->
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性，亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)碱性的：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力，降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。一种例示性替代变体是亲和力成熟抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可以在HVR中做出变化(例如替代)，例如为了改善抗体亲和力。可以在HVR“热点”即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury,MethodsMol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中做出此类变化，对所得变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboometal.,inMethodsinMolecularBiology178:1-37(O’Brienetal.,ed.,HumanPress,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR，链改组，或寡核苷酸指导的诱变)任一将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的办法，其中将数个HVR残基(例如一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代，***，或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中做出保守变化(例如保守替代，如本文中提供的)，其没有实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR以外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或是未改变的，或是含有不多于1，2或3处氨基酸替代。
一种可用于鉴定抗体中可作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如记载于CunninghamandWells,Science,244:1081-1085(1989)。在这种方法中，鉴定一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如arg，asp，his，lys，和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原之间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望特性。
氨基酸序列***包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它***变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体添加或删除糖基化位点。
在抗体包含Fc区的情况中，可以改变附着于Fc区的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的，双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。参见例如Wrightetal.,TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖，和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改良特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供抗体变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖的量可以是1％至80％，1％至65％，5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如复合的，杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开文本No.US2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(KyowaHakkoKogyoCo.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazakietal.,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnukietal.,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripkaetal.,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请NoUS2003/0157108A1,Presta,L；及WO2004/056312A1,Adams等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnukietal.,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.etal.,Biotechnol.Bioeng.94(4):680-688(2006)；及WO2003/085107)。
进一步提供具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(Umana等)；及US2005/0123546(Umana等)。还提供在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO1997/30087(Patel等)；WO1998/58964(Raju,S.)；及WO1999/22764(Raju,S.)。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。在RavetchandKinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362(参见例如Hellstrom,I.etal.,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA83:7059-7063(1986))及Hellstrom,I.etal.,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.etal.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.，MountainView，CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynesetal.,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA95:652-656(1998)的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoroetal.,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.etal.,Blood101:1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.andM.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.etal.,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238，265，269，270，297，327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265，269，270，297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(参见例如美国专利No.6,737,056；WO2004/056312；及Shieldsetal.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代(例如Fc区位置298，333，和/或334(EU残基编号方式)的替代)的Fc区。
在一些实施方案中，在Fc区中做出改变，其导致改变的(即改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551；WO99/51642；及Idusogieetal.,J.Immunol.164:4178-4184(2000)的。
具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyeretal.,J.Immunol.117:587(1976)及Kimetal.,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含具有改善Fc区对FcRn的结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434中的一处或多处具有替代(例如Fc区残基434的替代)的(美国专利No.7,371,826)。
还可参见DuncanandWinter,Nature322:738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。
d)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中，可能期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在特定实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体缀合至其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下述残基之任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的另外的非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，右旋糖苷，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧戊环，聚-1,3,6-三口恶烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)，和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇，及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着至抗体的聚合物的数目可以变化，而且如果附着了多于一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下述考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能，抗体衍生物是否会用于指定条件下的治疗，等。
在另一个实施方案中，提供抗体和可以通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kametal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，而且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
B.重组方法和组合物
可使用重组方法和组合物来生成抗体，例如如记载于美国专利No.4,816,567的。在一个实施方案中，提供编码本文所述抗Ly6E抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中，提供包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如已经用下述各项转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供生成抗Ly6E抗体的方法，其中该方法包括在适合于抗体表达的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，如上文提供的，并任选自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体。
对于抗Ly6E抗体的重组生成，分离编码抗体的核酸(例如如上文所描述的)，并***一种或多种载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可使用常规规程将此类核酸容易地分离并测序(例如通过使用寡核苷酸探针来进行，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体重和轻链的基因)。
适合于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利No.5,648,237；No.5,789,199；及No.5,840,523。还可参见Charlton,MethodsinMolecularBiology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,HumanaPress,Totowa,NJ,2003),pp.245-254，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。表达后，可以在可溶性级分中自细菌细胞浆分离抗体，并可以进一步纯化。
在原核生物之外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是适合于编码抗体的载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)；及Lietal.,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也是自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生的。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。
也可利用植物细胞培养物作为宿主。参见例如美国专利No.5,959,177；No.6,040,498；No.6,420,548；No.7,125,978；及No.6,417,429(其描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用哺乳动物宿主细胞系的其它例子有经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如记载于例如Grahametal.,J.GenVirol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如记载于例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠***肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，如记载于例如Matheretal.,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)；MRC5细胞；和FS4细胞。其它有用哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaubetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0，NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如YazakiandWu,MethodsinMolecularBiology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,HumanaPress,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。
C.测定法
可通过本领域已知的多种测定法对本文中提供的抗Ly6E抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知方法诸如ELISA，FACS，或Western印迹。
另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与本文所述任何抗体竞争对Ly6E的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与本文所述抗体所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法参见Morris(1996)“EpitopeMappingProtocols,”inMethodsinMolecularBiology,vol.66(HumanaPress,Totowa,NJ)。
在一种例示性竞争测定法中，在包含第一经标记抗体(其结合Ly6E，例如本文所述任何抗体)和第二未标记抗体(其要测试与第一抗体竞争对Ly6E的结合的能力)的溶液中温育固定化Ly6E。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化Ly6E。在允许第一抗体结合Ly6E的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定化Ly6E联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化Ly6E联合的标记物的量相对于对照样品实质性减少，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对Ly6E的结合。参见HarlowandLane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual,ch.14(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY)。
D.免疫缀合物
本发明还提供包含缀合有一种或多种细胞毒剂(诸如化疗剂或化疗药物，生长抑制剂，毒素(例如蛋白质毒素，细菌，真菌，植物，或动物起源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素(即放射缀合物))的本文中抗Ly6E抗体的免疫缀合物。
免疫缀合物容许将药物模块靶向投递至肿瘤，而且在一些实施方案中，在其中胞内积累，在那里***施用未缀合的药物可对正常细胞导致不可接受水平的毒性(Polakis,P.(2005)CurrentOpinioninPharmacology5:382-387)。
抗体-药物缀合物(ADC)是靶向化疗分子，其通过将有力的细胞毒性药物靶向表达抗原的肿瘤细胞而组合抗体和细胞毒性药物二者的特性(Teicher,B.A.(2009)CurrentCancerDrugTargets9:982-1004)，由此通过最大化功效及最小化脱靶毒性而增强治疗指数(Carter,P.J.andSenterP.D.(2008)TheCancerJour.14(3):154-169；Chari,R.V.(2008)Acc.Chem.Res.41:98-107)。
本发明的ADC化合物包括那些具有抗癌活性的。在一些实施方案中，该ADC化合物包括缀合(即共价附着)至药物模块的抗体。在一些实施方案中，经由接头将抗体共价附着至药物模块。本发明的抗体-药物缀合物(ADC)将有效剂量的药物选择性投递至肿瘤组织，由此在提高治疗指数(“治疗窗”)的同时可实现更大的选择性(即更低的有效剂量)。
抗体-药物缀合物(ADC)的药物模块(D)可包括任何具有细胞毒性或细胞抑制性效果的化合物，模块或基团。药物模块可通过包括但不限于微管蛋白结合，DNA结合或插层，和抑制RNA聚合酶，蛋白质合成，和/或拓扑异构酶的机制来发挥它们的细胞毒性和细胞抑制性效果。例示性药物模块包括但不限于美登木素生物碱(maytansinoid)，多拉司他汀(dolastatin)，奥瑞司他汀(auristatin)，加利车霉素(calicheamicin)，吡咯并苯并二氮卓(pyrrolobenzodiazepine，PBD)，奈莫柔比星(nemorubicin)及其衍生物，PNU-159682，蒽环类抗生素(anthracycline)，度卡霉素(duocarmycin)，长春花生物碱(vincaalkaloid)，紫杉烷(taxane)，单端孢菌素(trichothecene)，CC1065，喜树碱(camptothecin)，依利奈法德(elinafide)，及其具有细胞毒性活性的立体异构体，电子等排体，类似物，和衍生物。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文中提供的任何抗Ly6E抗体对于检测生物学样品中Ly6E的存在是有用的。如本文中使用的，术语“检测”涵盖定量或定性检测。“生物学样品”包括例如细胞或组织(例如活检材料，包括癌性或潜在癌性的结肠，结直肠，子宫内膜，胰腺，或卵巢组织)。
在一个实施方案中，提供在诊断或检测方法中使用的抗Ly6E抗体。又一方面，提供检测生物学样品中Ly6E的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在允许抗Ly6E抗体结合Ly6E的条件下使生物学样品与本文所述抗Ly6E抗体接触，并检测是否在抗Ly6E抗体和生物学样品中的Ly6E之间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗Ly6E抗体来选择适合用抗Ly6E抗体治疗的受试者，例如其中Ly6E是一种用于选择患者的生物标志物。在又一个实施方案中，生物学样品为细胞或组织(例如活检材料，包括癌性或潜在癌性的结肠，结直肠，子宫内膜，胰腺，或卵巢组织)。
在又一个实施方案中，体内使用抗Ly6E抗体来检测(例如通过体内成像)受试者中的Ly6E阳性癌症，例如为了癌症诊断，预后，或分期，确定适宜的治疗过程，或监测癌症对治疗的响应的目的。本领域已知用于体内检测的一种方法是免疫-正电子发射体层摄影术(immuno-PET)，如记载于例如vanDongenetal.,TheOncologist12:1379-1389(2007)及Vereletal.,J.Nucl.Med.44:1271-1281(2003)。在此类实施方案中，提供一种用于检测受试者中的Ly6E阳性癌症的方法，该方法包括将经标记的抗Ly6E抗体施用于具有或怀疑具有Ly6E阳性癌症的受试者，并检测受试者中经标记的抗Ly6E抗体，其中检测到经标记的抗Ly6E抗体指示受试者中的Ly6E阳性癌症。在某些此类实施方案中，经标记的抗Ly6E抗体包含缀合至正电子发射体(诸如68Ga，18F，64Cu，86Y，76Br，89Zr，和124I)的抗Ly6E抗体。在一个特定实施方案中，正电子发射体为89Zr。生成和使用89Zr标记的抗体的非限制性例示性方法记载于例如PCT公开文本No.WO2011/056983。在一些实施方案中，经标记的抗Ly6E抗体为与一种或多种锆复合物缀合的半胱氨酸改造抗体。参见例如WO2011/056983。
在又一些实施方案中，诊断或检测方法包括使固定化至基片的第一抗Ly6E抗体与要测试Ly6E存在情况的生物学样品接触，使基片暴露于第二抗Ly6E抗体，并检测第二抗Ly6E抗体是否结合至第一抗Ly6E抗体和生物学样品中的Ly6E之间的复合物。基片可以是任何支持性介质，例如玻璃，金属，陶瓷，聚合物珠，载片，芯片，和其它基片。在某些实施方案中，生物学样品包括细胞或组织(例如活检材料，包括癌性或潜在癌性的结直肠，子宫内膜，胰腺或卵巢组织。在某些实施方案中，第一或第二抗Ly6E抗体是本文所述任何抗体。在此类实施方案中，第二抗Ly6E抗体可以是6D3或7C9；或者自6D3或7C9衍生的抗体，如本文中描述的。
可依照任何上述实施方案来诊断或检测的例示性病症包括Ly6E阳性癌症，诸如Ly6E阳性乳腺癌(包括Her2阳性乳腺癌，Her2阴性乳腺癌，Her2阴性/激素受体阳性(Her2-/ER+/PR+)乳腺癌，三重阴性(Her2-/ER-/PR-)乳腺癌)，Ly6E阳性结肠癌，Ly6E阳性结直肠癌(包括腺癌)，Ly6E阳性黑素瘤，Ly6E阳性卵巢癌(包括卵巢浆液性腺癌)，Ly6E阳性胰腺癌(包括胰管腺癌)，Ly6E阳性肺癌，Ly6E阳性非小细胞肺癌(例如鳞状或非鳞状，诸如腺癌)，Ly6E阳性胃癌，Ly6E阳性食道癌，Ly6E阳性头和颈癌，Ly6E阳性肾癌，Ly6E阳性软组织癌，Ly6E阳性黑素瘤，和Ly6E阳性子宫内膜癌。在一些实施方案中，Ly6E阳性癌症是得到大于“0”的抗Ly6E免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)得分的癌症，这对应于>90％的肿瘤细胞中染色很弱或无染色。在一些实施方案中，Ly6E阳性癌症以1+，2+或3+水平表达Ly6E，如在本文实施例4中所述条件下定义的。在一些实施方案中，1+，2+，和3+免疫组织化学染色是依照表3确定的。在一些实施方案中，Ly6E阳性癌症是根据检测Ly6EmRNA的逆转录酶PCR(RT-PCR)测定法，表达Ly6E的癌症。在一些实施方案中，RT-PCR为定量RT-PCR。
在某些实施方案中，提供经标记的抗Ly6E抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如发荧光，发色，电子致密，化学发光，和放射性标记物)，以及例如经由酶促反应或分子相互作用间接检测的模块，诸如酶或配体。例示性标记物包括但不限于放射性同位素32P，14C，125I，3H，和131I，荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明(rhodamine)及其衍生物，丹酰，伞形酮，萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456)，萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联)，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶，生物素/亲合素，自旋标记物，噬菌体标记物，稳定的自由基，等等。在另一个实施方案中，标记物为正电子发射体。正电子发射体包括但不限于68Ga，18F，64Cu，86Y，76Br，89Zr，和124I。在一个特定实施方案中，正电子发射体为89Zr。
F.药物配制剂
通过混合具有期望纯度的本文所述抗Ly6E抗体或免疫缀合物与一种或多种任选的药学可接受载剂来制备此类抗体或免疫缀合物的药物配制剂(Remington′sPharmaceuticalSciences16thedition,Osol,A.Ed.(1980))，处于冻干配制剂或水性溶液形式。一般地，药学可接受载剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐，和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖，二糖，和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性药学可接受载剂进一步包括间质药物分散剂，诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(BaxterInternational,Inc.)。某些例示性sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和No.2006/0104968。一方面，将sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性冻干抗体或免疫缀合物配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性抗体或免疫缀合物配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后者配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的多于一种活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。例如，在一些情况中，可能期望进一步提供铂复合物，例如用于治疗Ly6E阳性癌症，诸如例如Ly6E阳性乳腺癌(包括Her2阳性乳腺癌，Her2阴性乳腺癌，Her2阴性/激素受体阳性(Her2-/ER+/PR+)乳腺癌，三重阴性(Her2-/ER-/PR-)乳腺癌)，或Ly6E阳性胰腺癌，或Ly6E阳性结肠癌，或Ly6E阳性结直肠癌，或Ly6E阳性黑素瘤，或Ly6E阳性卵巢癌，或Ly6E阳性非小细胞肺癌(例如鳞状或非鳞状，诸如腺癌)，或Ly6E阳性胃癌，或Ly6E阳性食道癌，或Ly6E阳性头和颈癌，或Ly6E阳性肾癌，或Ly6E阳性软组织癌，或Ly6E阳性子宫内膜癌。
活性组分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递***中(例如脂质体，清蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington′sPharmaceuticalSciences16thedition,Osol,A.Ed.(1980)。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体或免疫缀合物的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品形式，例如膜或微胶囊。
要用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。
G.治疗性方法和组合物
可以在例如治疗性方法等方法中使用本文中提供的任何抗Ly6E抗体或免疫缀合物。
一方面，本文中提供的抗Ly6E抗体或免疫缀合物用于抑制Ly6E阳性细胞增殖的方法，该方法包括在允许抗Ly6E抗体或免疫缀合物结合细胞表面上的Ly6E的条件下将细胞暴露于抗Ly6E抗体或免疫缀合物，由此抑制细胞增殖。在某些实施方案中，该方法是体外或体内方法。在又一些实施方案中，该细胞为乳腺癌细胞(包括Her2阳性乳腺癌细胞，Her2阴性乳腺癌细胞，Her2阴性/激素受体阳性(Her2-/ER+/PR+)乳腺癌细胞，三重阴性(Her2-/ER-/PR-)乳腺癌细胞)，或胰腺癌细胞，或结肠癌细胞，或结直肠癌细胞，或黑素瘤癌细胞，或卵巢癌细胞，或非小细胞肺癌细胞(例如鳞状或非鳞状，诸如腺癌)，或胃癌细胞，或食道癌细胞，或头和颈癌细胞，或肾癌细胞，或软组织癌细胞，或子宫内膜癌细胞。
体外细胞增殖的抑制可使用可购自Promega(Madison，WI)的CellTiter-GloTM发光细胞存活力测定法来测定。该测定法基于存在的ATP(他是代谢活性细胞的一项指标)的量化来测定培养物中的可存活细胞的数目。参见Crouchetal.(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88；美国专利No.6,602,677。该测定法可以以96或384孔形式进行，使之适应自动化高通量筛选(HTS)。参见Creeetal.(1995)AntiCancerDrugs6:398-404。该测定法规程牵涉直接向培养细胞添加单一试剂(试剂)。这导致细胞溶解和通过萤光素酶反应产生的发光信号的生成。发光信号与存在的ATP的量成正比，后者直接与培养物中存在的可存活细胞的数目成正比。可以通过光度计或CCD照相机成像装置来记录数据。发光输出表述成相对光单位(RLU)。
另一方面，提供作为药物使用的抗Ly6E抗体或免疫缀合物。又一些方面，提供在治疗方法中使用的抗Ly6E抗体或免疫缀合物。在某些实施方案中，提供用于治疗Ly6E阳性癌症的抗Ly6E抗体或免疫缀合物。在某些实施方案中，本发明提供在治疗具有Ly6E阳性癌症的个体的方法中使用的抗Ly6E抗体或免疫缀合物，该方法包括对个体施用有效量的抗Ly6E抗体或免疫缀合物。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。
又一方面，本发明提供抗Ly6E抗体或免疫缀合物在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗Ly6E阳性癌症。在又一个实施方案中，该药物用于治疗Ly6E阳性癌症的方法，该方法包括对具有Ly6E阳性癌症的个体施用有效量的该药物。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。
又一方面，本发明提供用于治疗Ly6E阳性癌症的方法。在一个实施方案中，该方法包括对具有此类Ly6E阳性癌症的个体施用有效量的抗Ly6E抗体或免疫缀合物。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，如下文所描述的。
依照任何上述实施方案的Ly6E阳性癌症可以是例如Ly6E阳性乳腺癌(包括Her2阳性乳腺癌，Her2阴性乳腺癌，Her2阴性/激素受体阳性(Her2-/ER+/PR+)乳腺癌，三重阴性(Her2-/ER-/PR-)乳腺癌)，Ly6E阳性结肠癌，Ly6E阳性结直肠癌(包括腺癌)，Ly6E阳性黑素瘤，Ly6E阳性卵巢癌(包括卵巢浆液性腺癌)，Ly6E阳性胰腺癌(包括胰管腺癌)，Ly6E阳性肺癌，Ly6E阳性非小细胞肺癌(例如鳞状或非鳞状，诸如腺癌)，Ly6E阳性胃癌，Ly6E阳性食道癌，Ly6E阳性头和颈癌，Ly6E阳性肾癌，Ly6E阳性软组织癌，Ly6E阳性黑素瘤，和Ly6E阳性子宫内膜癌。在一些实施方案中，Ly6E阳性癌症是在本文所述条件下得到大于“0”的抗Ly6E免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)得分的癌症，这对应于>90％的肿瘤细胞中染色很弱或无染色。在另一个实施方案中，Ly6E阳性癌症以1+，2+或3+水平表达Ly6E，如在本文所述条件下定义的。在一些实施方案中，Ly6E阳性癌症是根据检测Ly6EmRNA的逆转录酶PCR(RT-PCR)测定法，表达Ly6E的癌症。在一些实施方案中，RT-PCR为定量RT-PCR。
依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。
又一方面，本发明提供药物配制剂，其包含本文中提供的任何抗Ly6E抗体或免疫缀合物，例如供任何上述治疗性方法中使用。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗Ly6E抗体或免疫缀合物和药学可接受载剂。在另一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗Ly6E抗体或免疫缀合物和至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。
可以在疗法中单独地或与其它药剂组合地使用本发明的抗体或免疫缀合物。例如，可以与至少一种别的治疗剂共施用本发明的抗体或免疫缀合物。在某些实施方案中，别的治疗剂为铂复合物，例如用于治疗Ly6E阳性癌症，诸如例如Ly6E阳性乳腺癌(包括Her2阳性乳腺癌，Her2阴性乳腺癌，Her2阴性/激素受体阳性(Her2-/ER+/PR+)乳腺癌，三重阴性(Her2-/ER-/PR-)乳腺癌)，Ly6E阳性结肠癌，Ly6E阳性结直肠癌(包括腺癌)，Ly6E阳性黑素瘤，Ly6E阳性卵巢癌(包括卵巢浆液性腺癌)，Ly6E阳性胰腺癌(包括胰管腺癌)，Ly6E阳性肺癌，Ly6E阳性非小细胞肺癌(例如鳞状或非鳞状，诸如腺癌)，Ly6E阳性胃癌，Ly6E阳性食道癌，Ly6E阳性头和颈癌，Ly6E阳性肾癌，Ly6E阳性软组织癌，Ly6E阳性黑素瘤，和Ly6E阳性子宫内膜癌。
上文记录的此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的治疗剂和/或佐剂之前，同时，和/或之后发生本发明的抗体或免疫缀合物的施用。也可以与放射疗法组合使用本发明的抗体或免疫缀合物。
可以通过任何合适手段(包括胃肠外，肺内，和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用)来施用本发明的抗体或免疫缀合物(和任何别的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适路径(例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射)进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点的多次施用，推注施用，和脉冲输注。
本发明的抗体或免疫缀合物会以一种与较好医学实践一致的方式配制，定剂量，和施用。在此背景中考虑的因素包括所治疗的具体病症，所治疗的具体哺乳动物，患者个体的临床状态，病症的起因，药剂递送部位，施用方法，施用日程表，及医学从业人员知道的其它因素。抗体或免疫缀合物无需但任选与一种或多种当前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体或免疫缀合物的量，病症或治疗的类型，及上文讨论的其它因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用路径，或者以本文所述剂量的约1-99％，或者以凭经验/在临床上确定为适宜的任何剂量和任何路径使用。
对于疾病的预防或治疗，本发明的抗体或免疫缀合物(当单独地或与一种或多种其它别的治疗剂组合地使用时)的适宜剂量会取决于要治疗的疾病的类型，抗体或免疫缀合物的类型，疾病的严重性和过程，施用抗体或免疫缀合物是出于预防还是治疗目的，先前的疗法，患者的临床史和对抗体或免疫缀合物的响应，及主治医师的斟酌。抗体或免疫缀合物恰当地以一次或一系列治疗施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)的抗体或免疫缀合物可作为施用于患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开的施用或是通过连续输注。取决于上文所述因素，一个典型日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于几天或更长时间的重复施用，取决于状况，治疗一般会持续直至出现疾病症状的期望遏制。抗体或免疫缀合物的一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此，可以对患者施用一剂或多剂约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。此类剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2剂至约20剂，或例如约6剂抗体)。可施用一个较高的初始加载剂量，接着是一个或多个较低的剂量。然而，其它剂量摄生法可能是有用的。这种疗法的进展易于通过常规技术和测定法来监测。
应当理解，可使用本发明的免疫缀合物和抗Ly6E抗体二者实施任何上述配制剂或治疗性方法。
H.制品
在本发明的另一方面，提供一种制品，其包含对于治疗，预防和/或诊断上文所述病症有用的材料。制品包括容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，管形瓶，注射器，IV溶液袋，等。容器可以自多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器装有单独或与另一种组合物组合有效治疗，预防和/或诊断病症的组合物，并且可具有无菌存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体或免疫缀合物。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外，制品可包括(a)其中装有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的抗体或免疫缀合物；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中该组合物包含别的细胞毒剂或其它方面治疗剂。本发明的这个实施方案中的制品可进一步包括包装插页，其指示可使用组合物来治疗特定状况。或者/另外，制品可进一步包括第二(或第三)容器，其装有药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，林格(Ringer)氏溶液或右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场看期望的其它材料，包括其它缓冲液，稀释剂，滤器，针，和注射器。
I.本发明的序列
在本发明的另一方面，提供对于上文所述病症的治疗，预防和/或诊断有用的下述序列。
III.实施例
下文是本发明方法和组合物的实施例。应当理解，根据上文提供的一般性描述，可实施各种其它实施方案。
实施例1-人Ly6E基因表达
GeneLogic概况：为了分析多份人肿瘤和正常活检样品中的Ly6EmRNA表达，自GeneLogic公司获得Affymetrix数据。为探针集ID202145_at显示的分析是使用HGU133Plusv2基因芯片对3,879份正常人组织样品(绿色符号)，1,605份人癌症组织样品(红色符号：1,291份原代的和314份转移的)，和3,872份人非癌症疾病组织样品(蓝色符号)进行的。使用AffymetrixMAS(MicroarrayAnalysisSuite)版本5.0软件将微阵列数据标准化，其中样品表达值定标至休整均值500。
这项分析显示Ly6E在乳腺，胰腺，结肠，肺和卵巢癌等等中特异性过表达，在正常组织中检测到低/无Ly6E(图2)。
原位杂交(ISH)：依照MethodsMolBiol.2006；326:255-64中建立的方法对卵巢癌组织微阵列(TMA)实施原位杂交以评估Ly6E的流行度。
正向引物GTGCCTGATCTGTGCCCTTGG-SEQIDNO：45。
反向引物CCCGGAAGTGGCAGAAACCC-SEQIDNO：46。
探针序列：
GTGCCTGATCTGTGCCCTTGGTCCCAGGTCAGGCCCACCCCCTCCACCTCCACCTGCCCCAGCCCCTGCCTCTGCCCAAGTGGGCCAGCTGCCCTCACTTCTGGGGTGGATGATGTGACCTTCCTTGGGGGACTGCGGAAGGGACGAGGGTTCCCTGGAGTCTTACGGTCCAACATCAGACCAAGTCCCATGGACATGCTGACAGGGTCCCCCAGGGAGACCGTGTCAGTAGGGATGTGTGCCCTGGCTGTGTACGTGGGTGTGCAGTGCACGTGAGAGCACGTGGCGGCTTCTGGGGGCCATGTTTGGGGAGGGAGGTGTGCCAGCAGCCTGGAGAGCCTCAGTCCCTGTAGCCCCCTGCCCTGGCACAGCTGCATGCACTTCAAGGGCAGCCTTTGGGGGTTGGGGTTTCTGCCACTTCCGGG-SEQIDNO：47。
结果指示47/65份(72％)分析的卵巢肿瘤显示Ly6E表达(数据未显示)。
免疫组织化学(IHC)：对在载玻片上封固的4μm厚***固定，石蜡包埋(FFPE)组织切片实施免疫组织化学。将载片在二甲苯中脱石蜡，并经由分级醇至蒸馏水来再水合。将载片用靶物修复液(Dako，Carpinteria，CA，USA)于99℃预处理20分钟。然后分别用KPL封闭液(KierkegaardandPerryLaboratories，Gaithersburg，MD，USA)和亲合素/生物素封闭液(VectorLaboratories，Burlingame，CA，USA)处理载片。用磷酸盐缓冲盐水中的3％牛血清清蛋白(Roche，Basel，Switzerland)中的10％马血清(LifeTechnologies，Carlsbad，CA，USA)封闭非特异性IgG结合。将一抗小鼠抗Ly6E克隆10G7.7.8稀释至10μg/mL，并在载片上于室温温育60分钟。
漂洗载片，与马抗小鼠IgG生物素化二抗(VectorLabs)一起温育，接着在VectastainABCElite试剂(VectorLabs)中温育。然后将载片在Pierce金属增强DAB(ThermoScientific；Fremont，CA)中温育，复染色，脱水并盖上盖片。
根据使用小鼠抗Ly6E克隆10G7.7.8进行的IHC研究，Ly6E的流行度检测为乳腺癌中27-36％，胰腺癌中约40％，结肠癌中约26％，黑素瘤中17-26％，NSCLC中约29％(数据未显示)。
正常组织使用小鼠抗Ly6E克隆10G7.7.8进行的免疫组织化学：对一组正常人和食蟹猴组织，在人和食蟹猴二者的胃和唾液腺中检测到低和中等Ly6E表达，在食蟹猴的肾上腺皮质的一个细胞亚群中检测到低至中等Ly6E表达且在人标本中程度更低，而且在膀胱的移行上皮(transitionalepithelium)中检测到中等Ly6E表达(仅检查了食蟹猴)。下文表2将综合性的一组人和食蟹猴正常组织中使用小鼠抗Ly6E克隆10G7.7.8测定的免疫组织化学(IHC)Ly6E表达列表。低至中等Ly6E表达限于以灰色突显的组织(肾上腺皮质，宫颈，唾液腺，胃和膀胱)。
表2
实施例2-定量PCR(QRTPCR)
对来自Origene，Rockville，MD(HMRT102)，含有来自一组48种正常组织的DNA第一条链的人主要组织qPCR阵列针对Ly6ERNA表达进行测定。平行测定一组选定癌细胞系和组织(乳腺和胰腺)中的Ly6E表达。使用来自AppliedBiosystems(ABI，FosterCity，CA)的试剂，仪器和软件建立Taqman测定法。设计引物-探针集，其中引物在用报告染料FAM和淬灭染料TAMRA双重标记的发荧光探针侧翼。
用于RPL19的引物-探针集：
正向引物-5’AGCGGATTCTCATGGAACA(SEQIDNO：48)；反向引物-5’CTGGTCAGCCAGGAGCTT(SEQIDNO：49)；和探针-5’TCCACAAGCTGAAGGCAGACAAGG(SEQIDNO：50)。
用于Ly6E的引物-探针集：
正向引物-5’AGAAGGCGTCAATGTTGGT(SEQIDNO：51)；反向引物-5’CACTGAAATTGCACAGAAAGC(SEQIDNO：52)；和探针-5’TTCCATGGGCATCAGCTGCTG(SEQIDNO：53)。
结果指示正常组织中的Ly6E转录物表达与乳腺和胰腺癌中的Ly6E表达相比较低(图3)。
实施例3-家兔单克隆抗体生成
给三只家兔免疫接种细菌(大肠杆菌)生成的带His标签的Ly6E(YenZym，SouthSanFrancisco，CA)。使用标准方案对测试采血评估针对Ly6E的血清滴度。发现一只家兔具有较好的免疫应答，选择它作为脾切除和单克隆融合的候选。
最后一次IV抗原强化后4天，实施脾切除。分离脾细胞，将200x106个淋巴细胞与100x106个融合配偶细胞融合，并分配到20块96孔板(Epitomics，Burlingame，CA)上。在标准条件下培养板。
使用标准ELISA方案筛选板，板用50ng人Ly6E每孔包被。选出11个克隆，并在24孔板中扩增。确认7个克隆是抗Ly6E抗体阳性的。从这7个克隆中选出3个使用有限细胞稀释法进行亚克隆。自亚克隆系选出3个杂交瘤进行扩增和冷冻，包括克隆GEN-93-8-1。
进一步测试后，选出GEN-93-8-1进行分子克隆和HEK293细胞中的重组表达。简言之，使用TuboCapture试剂盒(Qiagen，产品目录#72232)遵循制造商的说明书自杂交瘤细胞分离mRNA，然后使用寡dT引物逆转录成cDNA。PCR扩增重链可变区(VH)。PCR完整轻链(LC)。使用限制酶HindIII和KpnI消化PCR扩增的VH区。使用限制酶HindIII和NotI消化PCR扩增的LC。使用QiagenQIAquickPCR纯化试剂盒(产品目录#28014)纯化消化产物。纯化后，将VH和LC连接入重链或轻链表达载体中，并转化入DH5α细胞(MCLab，产品目录#DA-100)中。挑取转化菌落，并使用相应限制酶通过预期大小(VH大约440bp，LC大约740bp)确认***物。使用TT5引物对带有预期大小的***物的质粒测序。重链可变区和轻链可变区的序列显示于图4，及分别在SEQIDNO：28和27中。
在6孔板中将轻链和重链表达载体共转染入293细胞中。转染后5天收集上清液，并针对相应抗原进行测试。另外，测量IgG浓度。使用蛋白A自细胞培养物上清液纯化抗Ly6E抗体克隆GEN-93-8-1。
实施例4-恶性和正常组织中及原代肿瘤模型中的Ly6E表达，通过免疫组织化学测定
在VentanaDiscoveryXT自动染色仪(VentanaMedicalSystems；Tucson，AZ)上实施免疫组织化学(IHC)。将***固定，石蜡包膜全组织和组织微阵列切片脱石蜡，并用CC1溶液(VentanaMedicalSystems)预处理60分钟，接着与0.2μg/mL抗Ly6E抗体克隆GEN-93-8-1或未免疫家兔IgG(克隆DA1E，CellSignalingTechnologies；Danvers，MA)一起于37℃温育60分钟。实施检测，使用32分钟OmniMap抗家兔辣根过氧化物酶(HRP)温育和二氨基联苯胺(DAB)(VentanaMedicalSystems)，接着是苏木精II(VentanaMedicalSystems)复染色。
染色强度得分考虑了染色强度和标记细胞比例二者。阳性表达定义为超过50％的肿瘤细胞中有染色。表3中定义了强度得分。
表3：IHC打分
通过在人乳腺癌(N＝90，包括三重阴性乳腺肿瘤(N＝39)和Her2-/激素受体+(HR+)乳腺肿瘤(N＝51))，胰腺腺癌(N＝78)，非小细胞肺癌(N＝276，包括腺癌(N＝205)和鳞状细胞癌(N＝71))，卵巢癌(N＝57)，头/颈鳞癌(N＝61)，胃腺癌(N＝94)，和结直肠腺癌(N＝106)组织微阵列上实施的IHC评估家兔抗Ly6E抗体克隆GEN-93-8-1对人肿瘤的反应性。
Ly6EIHC的结果呈现于表4。在乳腺癌样品中，94％的TNBC案例和81％的Her2-/HR+案例通过IHC染色是Ly6E阳性的，其中79％的TNBC案例和61％的Her2-/HR+案例显示中等或强的染色水平(通过IHC的2+或3+)。
在一组Her2+和Her2-乳腺癌样品中，87％(130个案例)通过IHC染色是Ly6E阳性的。在65％-68％的乳腺癌中看到中等或强水平(2+或3+)的表达。定位本质上是胞质/膜的。在正常和正常附近癌乳腺组织二者中记录到弱至中等Ly6E表达。相反，如上所述，使用小鼠抗Ly6E克隆10G7.7.8进行的IHC研究只在27-36％的乳腺癌中检测到Ly6E。
Ly6E在胰管腺癌中高度表达，其中89％的样品(69个案例)通过IHC为Ly6E染色阳性，而且63％显示中等或强染色水平(通过IHC的2+或3+)。无一正常胰腺样品(N＝5)显示Ly6E表达。相反，如上所述，使用小鼠抗Ly6E克隆10G7.7.8进行的IHC研究只在约40％的胰腺癌中检测到Ly6E。
Ly6E在非小细胞肺癌症中表达，其中89％的腺癌和83％的鳞状细胞癌通过IHC为Ly6E染色阳性，其中64％的腺癌和46％的鳞状细胞癌显示中等或强染色水平(通过IHC的2+或3+)。相反，如上所述，使用小鼠抗Ly6E克隆10G7.7.8进行的IHC研究只在约29％的非小细胞肺癌中检测到Ly6E。
肺癌中的染色主要在胞质/膜。在正常肺泡巨噬细胞中记录到约1+的染色(N＝12)，尽管不清楚染色是否是对Ly6E或含铁血黄素特异性的。在正常肺细胞中没有观察到染色。
在结直肠癌样品中，64％(68个案例)通过IHC染色是Ly6E阳性的，其中11％的案例显示中等或强染色水平(通过IHC的2+或3+)。在大约三分之二的阳性样品中，Ly6E染色极化至癌细胞的顶表面。所测试的正常结肠样品没有显示Ly6E表达(N＝2)。相反，如上所述，使用小鼠抗Ly6E克隆10G7.7.8进行的IHC研究只在约26％的结肠癌中检测到Ly6E。
在卵巢癌中，77％的案例通过IHC染色是Ly6E阳性的，其中53％的案例显示中等或强染色水平(通过IHC的2+或3+)。在头和颈鳞癌中，85％的案例通过IHC染色是Ly6E阳性的，其中42％的案例显示中等或强染色水平(通过IHC的2+或3+)。最后，在胃腺癌中，70％的案例通过IHC染色是Ly6E阳性的，其中31％的案例显示中等或强染色水平(通过IHC的2+或3+)。
未免疫同种型对照在0.2μg/mL在所有对照样品上是阴性的。
表4：多种人癌症中的Ly6EIHC
IHC＝免疫组织化学。
注意：染色强度考虑了染色强度和在>50％的肿瘤细胞中观察到染色二者：
阴性＝无可检测信号；1+＝弱信号；2+＝中等信号；3+＝强信号。
实施例5-人和食蟹猴正常组织中的相对Ly6E表达，通过IHC染色
用家兔抗Ly6E抗体GEN-93-8-1对正常人组织微阵列(TMA)染色。在脾，乳腺，肾上腺，唾液腺，子宫颈，和子宫内膜中观察到弱(1+)阳性染色，而且在大脑皮质和小脑中观察到中等(2+)阳性染色。用相同抗Ly6E抗体染色的正常食蟹猴组织揭示正常乳腺组织中的弱(1+)表达及脾，子宫内膜，和膀胱上皮中的中等(2+)染色。见表5。
表5：人和食蟹猴正常组织中的Ly6E表达，通过IHC染色
实施例6-抗体药物缀合物的生成
对于大规模抗体生产，在CHO细胞中生成抗体hu9B12.v12。将编码VL和VH的载体转染入CHO细胞中，并通过蛋白A亲和层析自细胞培养液纯化IgG。
vcMMAEADC的生成：通过将hu9B12.v12或对照抗gD抗体缀合至药物-接头模块MC-vc-PAB-MMAE来生成抗Ly6E抗体-药物缀合物(ADC)，这在本文中有描述。方便起见，药物-接头模块MC-vc-PAB-MMAE在这些实施例中及在附图中有时称作“vcMMAE”或“VCE”。在缀合之前，使用依照WO2004/010957A2中记载的方法学的标准方法用TCEP部分还原抗体。使用依照例如Doroninaetal.(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784及US2005/0238649A1中记载的方法学的标准方法将部分还原的抗体缀合至药物-接头模块。简言之，将部分还原的抗体与药物-接头模块组合以容许药物-接头模块缀合至抗体中还原的半胱氨酸残基。淬灭缀合反应，并纯化ADC。测定每一种ADC的药物载荷(每个抗体的平均药物模块数)，对于抗Ly6E抗体和抗gD对照抗体，在3.3和4.0之间。
实施例7-抗Ly6EADC在异种移植物小鼠模型中的体内功效及癌细胞系的IHC染色
乳腺癌细胞系HCC1569(CRL-2330)和胰腺癌细胞系SU.86.86(CRL-1837)得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。CHO-K1S是CHO-K1的悬浮细胞系衍生物。HCC1569X2细胞系是亲本HCC1569细胞系(ATCC，CRL-2330)为体内生长而优化的衍生物。在雌性TaconicNCr裸鼠的右体侧中皮下注射亲本HCC1569细胞，收获一个肿瘤，切碎，并在体外培养，得到HCC1569X1细胞系。再次在雌性TaconicNCr裸鼠的右体侧中皮下注射HCC1569X1系，试图改进细胞系的生长。自这项研究收集一个肿瘤，再次适应体外生长，生成HCC1569X2细胞系。这种细胞系及自这种系衍生的肿瘤表达Ly6E。
异种移植物模型：在自上文所述细胞系衍生的异种移植物模型中或在原代患者衍生的肿瘤模型中评估抗Ly6E抗体药物缀合物(ADC)的功效，后一项实验是在Oncotest(Freiburg，Germany)和XenTech(Genopole，France)进行的。
所有在Genentech(SouthSanFrancisco，CA)进行的研究均依照实验动物护理和使用指南(Ref:InstituteofLaboratoryAnimalResources(NIHpublicationno.85-23),Washington,DC:NationalAcademiesPress；1996)。所有在Oncotest进行的实验均得到地方当局批准，而且依照德国动物福利法指南(Tierschutzgesetz)进行。通过TheDirectiondesServicesVétérinaires,Ministèredel′AgricultureetdelaPêche,France获得了在XenTech的CERFE设备中使用动物的授权(协议No.A91-228-107)。动物护理和庇护依照欧洲公约STE123。在XenTech进行的所有实验会依照法国关于实验室动物保护的立法并依照当前有效的，法国农业与渔业部颁给Truong-AnTRAN博士的，关于用脊椎动物进行实验的许可证(No.A91-541；日期：2010年12月21日；有效期：5年)实施。6至9周龄雌性免疫缺陷小鼠在背部右体侧中皮下接种，并自每组9-10只小鼠测定平均肿瘤体积及SD。
对于用自细胞系衍生的异种移植物进行的功效研究，在含Matrigel的HBSS中给来自Taconic的NCR裸鼠接种5x106个细胞，或者在含Matrigel的HBSS中给来自CharlesRiver的C.B-17SCID(自交)小鼠接种2x106个细胞。将0.36mg***植入物用于HCC1569X2异种移植物模型。对于在XenTech和Oncotest用肿瘤外植体进行的功效研究，给来自Harlan或CharlesRiver的无胸腺裸鼠或NMRInu/nu小鼠植入来自模型HBCx-8，HBCx-9，MAXF-1162和PAXF-1657的，原代乳腺或胰腺癌患者衍生的材料。当肿瘤体积达到大约80-200mm3时(第0天)，将动物随机分组，每组9-10只，并以适宜剂量施用单次静脉内(IV)注射媒介对照或ADC。直至研究结束，每周两次测量肿瘤体积。
如图5至10所示，家兔抗Ly6E抗体克隆GEN-93-8-1比先前的免疫组织化学抗体小鼠抗Ly6E抗体克隆10G7.7.8要更加灵敏。
在HCC1569X2乳腺癌异种移植物模型中，用GEN-93-8-1进行的免疫组织化学显示3+染色，而10G7.7.8显示更低的1+/2+染色。分别见图5，小图E和D。HCC1569X2乳腺癌细胞是Her2/neu+且ER-/PR-/p53-的。HCC1569X2乳腺癌异种移植物模型对人源化抗Ly6E(hu9B12v12)ADC(MC-vc-PAB-MMAE)(2mg/kg和4mg/kg)敏感。见图5，小图A。
在SU.86.86胰腺癌异种移植物模型中，用GEN-93-8-1进行的免疫组织化学显示2+染色，而10G7.7.8显示更低的1+/2+染色。分别见图6，小图E和C。SU.86.86胰腺癌异种移植物模型对人源化抗Ly6E(hu9B12v12)ADC(MC-vc-PAB-MMAE)(1mg/kg和3mg/kg)敏感。见图6，小图A。
在HBCx-9乳腺癌异种移植物模型中，用GEN-93-8-1进行的免疫组织化学显示2+染色，而10G7.7.8显示更低的1+染色。分别见图7，小图D和C。HBCx-9乳腺癌细胞是三重阴性(Her2-/ER-/PR-)的。HBCx-9乳腺癌异种移植物模型对人源化抗Ly6E(hu9B12v12)ADC(MC-vc-PAB-MMAE)(8mg/kg和12mg/kg)敏感。见图7，小图A。
在HBCx-8乳腺癌异种移植物模型中，用GEN-93-8-1和10G7.7.8进行的免疫组织化学显示1+/2+染色；然而，与用10G7.7.8进行的染色相比，用GEN-93-8-1进行的染色更加强健且同质。分别见图8，小图C和D。HBCx-8乳腺癌细胞是三重阴性(Her2-/ER-/PR-)的。HBCx-8乳腺癌异种移植物模型对人源化抗Ly6E(hu9B12v12)ADC(MC-vc-PAB-MMAE)(12mg/kg)敏感。见图8，小图A。
在MAXF-1162乳腺癌异种移植物模型中，用GEN-93-8-1进行的免疫组织化学显示强健的2+染色(在中央缺氧区中有一些1+染色)，而10G7.7.8显示不太同质的1+/2+染色。分别见图9，小图D和C。MAXF-1162乳腺癌细胞具有Her2扩增。MAXF-1162乳腺癌异种移植物模型对人源化抗Ly6E(hu9B12v12)ADC(MC-vc-PAB-MMAE)(4mg/kg，8mg/kg，和12mg/kg)敏感。见图9，小图A。
在PAXF-1657胰腺癌异种移植物模型中，用GEN-93-8-1进行的免疫组织化学显示强健的2+染色，而10G7.7.8显示弱+/-染色。分别见图10，小图D和C。PAXF-1657胰腺癌异种移植物模型对人源化抗Ly6E(hu9B12v12)ADC(MC-vc-PAB-MMAE)(2mg/kg，4mg/kg，8mg/kg，和12mg/kg)敏感。见图10，小图A。
总之，与10G7.7.8相比，GEN-93-8-1显示更加强健且同质的IHC染色。
尽管为了清楚理解的目的已经通过例示和实施例的方式较为详细地描述了上述发明，说明书和实施例不应解释为限制发明范围。通过述及明确收录本文中引用的所有专利和科学文献的完整公开内容。

Claims (35)

1.一种结合Ly6E的分离的抗体，其中该抗体包含(a)包含SEQIDNO:34的氨基酸序列的HVR-H3，(b)包含SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-L3，和(c)包含SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-H2。
2.权利要求1的抗体，其中该抗体包含(a)包含SEQIDNO：32的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQIDNO：33的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQIDNO：34的氨基酸序列的HVR-H3。
3.权利要求1或2的抗体，其中该抗体包含(a)包含SEQIDNO：29的氨基酸序列的HVR-L1，(b)包含SEQIDNO：30的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQIDNO：31的氨基酸序列的HVR-L3。
4.权利要求1至3任一项的抗体，其包含(a)与SEQIDNO：28的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与SEQIDNO：27的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
5.权利要求1至4任一项的抗体，其包含SEQIDNO：28的VH序列。
6.权利要求1至5任一项的抗体，其包含SEQIDNO：27的VL序列。
7.一种抗体，其包含SEQIDNO：28的VH序列和SEQIDNO：27的VL序列。
8.权利要求1至7任一项的抗体，其为单克隆抗体。
9.权利要求8的抗体，其为小鼠抗体，家兔抗体，人抗体，人源化抗体，或嵌合抗体。
10.权利要求1至9任一项的抗体，其为选自IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，和IgG4的IgG。
11.一种分离的核酸，其编码权利要求1至10任一项的抗体。
12.一种宿主细胞，其包含权利要求11的核酸。
13.一种生成抗体的方法，其包括培养权利要求13的宿主细胞，使得该抗体生成。
14.一种免疫缀合物，其包含权利要求1至13任一项的抗体和细胞毒剂。
15.一种药物配制剂，其包含权利要求14的免疫缀合物和药学可接受载剂。
16.权利要求1至10任一项的抗体，其是与标记物缀合的。
17.权利要求16的抗体，其中该标记物为正电子发射体。
18.权利要求17的抗体，其中该正电子发射体为89Zr。
19.一种检测生物学样品中的人Ly6E的方法，其包括在允许权利要求1至10和16至18任一项的抗Ly6E抗体结合天然存在人Ly6E的条件下将该生物学样品与该抗Ly6E抗体接触，并检测该抗Ly6E抗体和该生物学样品中的天然存在人Ly6E之间是否形成复合物。
20.权利要求19的方法，其中该抗Ly6E抗体为权利要求7的抗体。
21.权利要求20或21的方法，其中该生物学样品为乳腺癌样品，胰腺癌样品，结肠癌样品，结直肠癌样品，黑素瘤癌样品，卵巢癌样品，非小细胞肺癌样品，食道癌样品，头和颈癌样品，肾癌样品，软组织癌样品，子宫内膜癌样品，或胃癌样品。
22.一种用于检测Ly6E阳性癌症的方法，其包括(i)将经标记的抗Ly6E抗体施用于具有或怀疑具有Ly6E阳性癌症的受试者，其中该经标记的抗Ly6E抗体包含权利要求1至10任一项的抗Ly6E抗体，并(ii)检测该受试者中的该经标记的抗Ly6E抗体，其中检测到该经标记的抗Ly6E抗体指示该受试者中的Ly6E阳性癌症。
23.权利要求22的方法，其中该经标记的抗Ly6E抗体为经标记的权利要求7的抗体。
24.权利要求22或23的方法，其中该经标记的抗Ly6E抗体包含与正电子发射体缀合的抗Ly6E抗体。
25.权利要求24的方法，其中该正电子发射体为89Zr。
26.一种将癌症患者鉴定为具有Ly6E阳性癌症的方法，其包括在允许权利要求1至10和16至18任一项的抗Ly6E抗体结合天然存在人Ly6E的条件下将来自该患者的癌样品与该抗Ly6E抗体接触，并检测该抗Ly6E抗体和该癌样品中的天然存在人Ly6E之间是否形成复合物。
27.权利要求26的方法，其中如果检测到该抗Ly6E抗体和癌症活检样品中的天然存在人Ly6E之间的复合物的话，将该癌症患者鉴定为具有Ly6E阳性癌症。
28.一种选择癌症患者用包含抗Ly6E抗体的免疫缀合物治疗的方法，其包括在允许权利要求1至10和16至18任一项的抗Ly6E抗体结合天然存在人Ly6E的条件下将来自该患者的癌样品与该抗Ly6E抗体接触，并检测该抗Ly6E抗体和该癌样品中的天然存在人Ly6E之间是否形成复合物。
29.权利要求28的方法，其中如果检测到该抗Ly6E抗体和癌症活检样品中的天然存在人Ly6E之间的复合物的话，选择该癌症患者。
30.权利要求28或29的方法，其中该免疫缀合物包含如下抗Ly6E抗体，该抗Ly6E抗体包含(a)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的HVR-H2，(c)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的HVR-L1，(e)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的HVR-L2，和(f)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-L3。
31.权利要求30的方法，其中该抗Ly6E抗体包含SEQIDNO：5的VH序列和SEQIDNO：3的VL序列。
32.权利要求28至31任一项的方法，其中该免疫缀合物包含与细胞毒剂缀合的抗Ly6E抗体。
33.权利要求26至32任一项的方法，其中该癌样品为乳腺癌样品，胰腺癌样品，结肠癌样品，结直肠癌样品，黑素瘤癌样品，卵巢癌样品，非小细胞肺癌样品，食道癌样品，头和颈癌样品，肾癌样品，软组织癌样品，子宫内膜癌样品，或胃癌样品。
34.权利要求21或33的方法，其中该乳腺癌样品来自Her2阳性乳腺癌，Her2阴性乳腺癌，Her2阴性/激素受体阳性(Her2-/ER+/PR+)乳腺癌，或三重阴性(Her2-/ER-/PR-)乳腺癌。
35.权利要求21或33的方法，其中该胃癌样品来自Her2阳性胃癌或Her2阴性胃癌。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108289966A (zh) * 2015-09-24 2018-07-17 北卡罗来纳-查佩尔山大学 用于减少转移的方法和组合物

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2852404B1 (en) 2012-05-21 2017-07-26 Genentech, Inc. ANTI-Ly6E ANTIBODIES AND IMMUNOCONJUGATES AND METHODS OF USE
US9290578B2 (en) * 2013-10-21 2016-03-22 Genentech, Inc. Anti-Ly6E antibodies and methods of use
CR20160271A (es) 2013-12-16 2016-12-02 Genentech Inc Compuestos peptidométicos y sus conjugados de anticuerpo-fármaco
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
CN108064246A (zh) 2015-06-15 2018-05-22 基因泰克公司 抗体和免疫结合物
JP7105235B2 (ja) 2016-12-01 2022-07-22 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 免疫ｐｅｔイメージングのための放射性標識された抗ｐｄ－ｌ１抗体
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
EA201991673A1 (ru) 2017-02-10 2020-01-17 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Меченные радиоактивным изотопом антитела к lag3 для иммуно-пэт-визуализации
CN110997013B (zh) 2017-07-24 2022-09-20 瑞泽恩制药公司 抗cd8抗体和其用途
WO2021113648A1 (en) * 2019-12-06 2021-06-10 The University Of North Carolina At Chapel Hill Affinity molecules that direct the metabolism and polarization of macrophages and synergize the immune checkpoint blockade therapy
TW202406934A (zh) * 2022-05-03 2024-02-16 美商建南德克公司 抗Ｌｙ６Ｅ抗體、免疫結合物及其用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040185040A1 (en) * 2001-11-21 2004-09-23 Celltech R & D Limited Modulating immune responses
US20090130108A1 (en) * 2006-03-21 2009-05-21 The Regents Of The University Of California N-Cadherin and Ly6 E: Targets for Cancer Diagnosis and Therapy
US20120225060A1 (en) * 2011-03-03 2012-09-06 Apexigen, Inc. Anti-il-6 receptor antibodies and methods of use

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5773223A (en) 1993-09-02 1998-06-30 Chiron Corporation Endothelin B1, (ETB1) receptor polypeptide and its encoding nucleic acid methods, and uses thereof
US6913756B1 (en) 1998-04-29 2005-07-05 The Uab Research Foundation Monoclonal antibodies specific for anthrax and peptides derived from the antibodies thereof
US7387772B1 (en) 1999-06-22 2008-06-17 Immunimedics, Inc. Chimeric, human and humanized anti-CSAP monoclonal antibodies
EP1229934B1 (en) 1999-10-01 2014-03-05 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US7303749B1 (en) 1999-10-01 2007-12-04 Immunogen Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US20050123925A1 (en) 2002-11-15 2005-06-09 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
EP2357006B1 (en) 2002-07-31 2015-09-16 Seattle Genetics, Inc. Drug conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
KR20050048615A (ko) * 2002-08-19 2005-05-24 제넨테크, 인크. 종양의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
AU2003271186A1 (en) 2003-10-14 2005-04-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Double specific antibodies substituting for functional protein
EP1725249B1 (en) 2003-11-06 2014-01-08 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
US20090324604A1 (en) 2004-01-07 2009-12-31 Chiron Corporation M-csf specific monoclonal antibody and uses thereof
JP5064037B2 (ja) 2004-02-23 2012-10-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド 複素環式自壊的リンカーおよび結合体
JP5234734B2 (ja) 2004-06-01 2013-07-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗体−薬物結合体および方法
ES2669510T3 (es) 2004-09-23 2018-05-28 Genentech, Inc. Anticuerpos y conjugados modificados por ingeniería genética con cisteína
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
US20060094676A1 (en) 2004-10-29 2006-05-04 Ronit Lahav Compositions and methods for treating cancer using compositions comprising an inhibitor of endothelin receptor activity
WO2006060533A2 (en) 2004-12-01 2006-06-08 Genentech, Inc. Conjugates of 1, 8-bis-naphthalimides with an antibody
US20070134243A1 (en) 2004-12-01 2007-06-14 Gazzard Lewis J Antibody drug conjugates and methods
US20090226465A1 (en) 2005-10-31 2009-09-10 Jackson David Y Macrocyclic depsipeptide antibody-drug conjugates and methods
US20070269442A1 (en) 2006-05-19 2007-11-22 Robert J. Webber Chimeric monoclonal antibody recognizing iNOS
KR101667062B1 (ko) 2008-07-15 2016-10-17 제넨테크, 인크. 안트라시클린 유도체 접합체, 그의 제조 방법 및 항-종양 화합물로서의 그의 용도
JP5713923B2 (ja) 2009-02-27 2015-05-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド タンパク質標識方法及び組成物
GB0922434D0 (en) * 2009-12-22 2010-02-03 Ucb Pharma Sa antibodies and fragments thereof
EP2538981B1 (en) 2010-02-23 2017-12-20 F. Hoffmann-La Roche AG Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US9000130B2 (en) 2010-06-08 2015-04-07 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JP5889912B2 (ja) 2010-11-17 2016-03-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド アラニニルメイタンシノール抗体コンジュゲート
EP2852404B1 (en) 2012-05-21 2017-07-26 Genentech, Inc. ANTI-Ly6E ANTIBODIES AND IMMUNOCONJUGATES AND METHODS OF USE
US9290578B2 (en) * 2013-10-21 2016-03-22 Genentech, Inc. Anti-Ly6E antibodies and methods of use
CA2957354A1 (en) * 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
CN108064246A (zh) * 2015-06-15 2018-05-22 基因泰克公司 抗体和免疫结合物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040185040A1 (en) * 2001-11-21 2004-09-23 Celltech R & D Limited Modulating immune responses
US20090130108A1 (en) * 2006-03-21 2009-05-21 The Regents Of The University Of California N-Cadherin and Ly6 E: Targets for Cancer Diagnosis and Therapy
US20120225060A1 (en) * 2011-03-03 2012-09-06 Apexigen, Inc. Anti-il-6 receptor antibodies and methods of use

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANIEL S. GREEN等: "Characterization of the interferon alpha inducible protein LY6E", 《ABSTRACT/CYTOKINE》 *
HUGHES M等: "Ly6e expression is restricted to syncytiotrophoblast cells of the mouse placenta", 《PLACENTA》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108289966A (zh) * 2015-09-24 2018-07-17 北卡罗来纳-查佩尔山大学 用于减少转移的方法和组合物

Also Published As

Publication number Publication date
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