CN103981144A

CN103981144A - 自体血清抗原致敏dc-cik细胞的制备方法

Info

Publication number: CN103981144A
Application number: CN201410095323.3A
Authority: CN
Inventors: 黄浩; 邹畅
Original assignee: Unification Health Bio Tech Ltd Shenzhen
Current assignee: Unification Health Bio Tech Ltd Shenzhen
Priority date: 2014-03-17
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2014-08-13
Anticipated expiration: 2034-03-17
Also published as: CN103981144B

Abstract

本发明公开了一种自体血清抗原致敏DC-CIK细胞的制备方法，所述自体血清抗原致敏DC-CIK细胞的制备方法，包括步骤：A）自体血清抗原的制备；B）外周血单个核细胞的制备；C）DC的分离和培养；D）CIK细胞的诱导扩增；E）DC与CIK细胞共培养制备DC-CIK细胞。本发明所述方法培养的DC-CIK与常规培养制备的DC-CIK相比，其对CIK的增殖活性和杀瘤活性都明显增加，其增殖倍数平均达到了200-250倍，是传统培养方法的2-3倍；体外实验时杀瘤活性达到70-80%，明显高于常规方法培养的DC-CIK细胞。本方法工序简单，条件易控，对设备的要求较低，而所获得的DC-CIK细胞增殖效率更高。

Description

自体血清抗原致敏DC-CIK细胞的制备方法

技术领域

本发明属于细胞生物学、肿瘤免疫治疗领域，涉及使用自体肿瘤抗原致敏DC-CIK的制备方法和抗肿瘤过继免疫治疗应用。

背景技术

恶性肿瘤已成为中国死亡原因第一位，严重威胁着人民的健康与生命，肿瘤免疫治疗是临床用于肿瘤治疗的第四大疗法，其中肿瘤过继免疫细胞疗法在中国得到广泛的应用，目前国内开展最多的就是DC-CIK细胞过继性回输疗法。

DC细胞是机体内最重要的抗原提呈细胞，通过抗原摄取、加工及提呈，DC细胞可以有效诱导抗原特异性CD4和CD8 T淋巴细胞活化，从而激活机体获得性免疫反应。此外，DC同样可以激活NK细胞，增强其增殖能力及杀伤作用，从而增强天然免疫反应，共同发挥抗肿瘤作用。

CIK细胞即细胞因子诱导杀伤细胞，是将人外周血单个核细胞在体外与多种细胞因子共同培养一段时间后获得的非主要组织相容性复合体（MHC）限制性的细胞毒性T淋巴细胞，对肿瘤细胞具有高效的溶解毒性，DC与CIK细胞共培养后，可以有效提高了CIK的增殖能力和杀伤活性，更有利于提高DC-CIK的抗肿瘤免疫疗效，也是目前国内应用最为广泛的技术。

DC-CIK主要包括无抗原致敏的DC-CIK、肿瘤特异性抗原致敏的DC-CIK以及全肿瘤抗原致敏的DC-CIK。研究表明，经抗原致敏的DC和未经抗原致敏的DC均可以使得CIK的增殖能力和杀瘤活性升高，而且经过抗原致敏的DC能更好的协同刺激CIK细胞的增殖和活化，具有更好的杀瘤活性。因此，选用合适的抗原致敏DC成为DC-CIK疗效的一个关键性影响因素。

目前DC体外致敏所使用的抗原主要是已知的肿瘤特异性抗原、肿瘤细胞株裂解产物或者肿瘤标本裂解产物。由于大多数肿瘤的缺乏特异性抗原，而且肿瘤容易突变进而抵抗单一抗原的免疫攻击，因此特异性抗原致敏的DC临床应用受到很大限制。而肿瘤细胞株在培养过程中，表面抗原通常会发生改变，致敏DC后所获得的DC-CIK临床效果不佳，而肿瘤标本裂解产物只能用于手术前留取标本的患者，临床实际中进行DC-CIK治疗的患者大多为手术后的患者，难以获得新鲜的手术标本，这些都大大限制了DC-CIK的临床效果。而由于肿瘤患者的个体差异，即使是同种类型的肿瘤，所拥有的肿瘤抗原也大不相同，人工合成的抗原并不能广泛用于肿瘤患者的治疗。

目前常用的蛋白质浓缩技术包括透析袋浓缩法、冷冻干燥浓缩法、吹干浓缩法、超滤膜浓缩法、化学沉淀法等，超滤膜浓缩法和透析袋浓缩法比较先进但是说需要的成本较高，不利于推广，而其他方法大多容易造成血清的污染，难以用于细胞的培养，我们基于冻融可以使血清化学成分沉淀浓缩的原理，在不影响血清抗原活性的基础上，找到切实可行的自体血清抗原制备方法，并进而使用这些血清来致敏DC，培养特异性的经过抗原致敏后的DC-CIK细胞，用于临床。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种能获得高增殖活性和杀瘤活性的自体抗原致敏DC-CIK细胞的制备方法。

自体血清抗原致敏DC-CIK细胞的制备方法，包括以下步骤：

自体血清抗原的制备：外周血50-100ml，离心分离患者血清，加入终浓度为0.1-1.0mg/ml的亮抑蛋白酶抑制剂，混合均匀，随后用无菌离心管存储，置于-20℃以下环境冷冻24-48h，取出后在0-4℃环境中放置10-16h，吸取上层血浆部分，并弃去，灭活20-30min，微孔滤膜过滤，得到自体血清肿瘤抗原；

优选的：所述分离血清后蛋白浓缩后的蛋白处理条件为-20℃冷冻48h，随后在4℃环境中竖直放置16h，可以借助重力，帮助浓缩蛋白；所述灭活条件为56℃灭活补体成分30min；所述微孔滤膜为孔径为22μm及以下微孔滤膜。

外周血单个核细胞的制备：采用密度梯度离心法分离获得外周血单个核细胞（PBMC）。采用AIM-V无血清培养基悬浮分离的PBMC，按照0.5-1×10⁸/瓶的数量置于培养瓶中，细胞培养箱中静置1-3h，吸取未贴壁淋巴细胞用于CIK细胞的培养；贴壁细胞用于DC的培养。

DC的分离和培养：依据肿瘤标志物测定结果，在细胞贴壁后加入终浓度为5-20%的自体血清进行DC致敏，在培养第6-第7天加入终浓度为200-1000ng/ml的肿瘤坏死因子，得到自身抗原致敏后的DC。

CIK细胞的诱导扩增：上述未贴壁细胞按照CIK细胞培养常规方案进行。

DC与CIK细胞共培养制备DC-CIK：将上述抗原致敏后的DC与前述CIK细胞混合培养5-8天，收获自体抗原致敏DC-CIK细胞。

细胞组成：CD3+细胞占90%以上，其中CD3+CD4+细胞约在10-20%，CD3+CD8+细胞在60-80%，CD3+CD56+细胞约在10-20%。

本发明的另一目的在于制备由上述方法制备可以用于临床的抗肿瘤过继免疫活性细胞。

上述方法培养的DC-CIK与常规培养制备的DC-CIK相比，其对CIK的增殖活性和杀瘤活性都明显增加，其增殖倍数平均达到了200-250倍，是传统培养方法的2-3倍；体外实验时杀瘤活性达到70-80%，明显高于常规方法培养的DC-CIK细胞。使用上述方法，采用自体血清中抗原作为本人特异性肿瘤抗原，与单一的肿瘤特异性抗原相比，有效避免因肿瘤细胞突变对特异性抗原的抵抗作用；同肿瘤细胞株抗原相比，血清抗原是自体抗原，有效避免了细胞株在体外传代过程中造成的抗原结构的改变；面对手术后患者或者难以获得肿瘤标本的患者，有效避免了无肿瘤抗原可用的窘境。在肿瘤抗原制备的过程中，适量的蛋白酶抑制剂有效的保持了血清中肿瘤抗原的完整性；此外，本方法工序简单，条件易控，对设备的要求较低，而所获得的的DC-CIK细胞增殖效率更高。

附图说明

图1为血清冷冻时间及温度对浓缩后蛋白含量的影响（mg/ml）；

图2为血清溶解时间对浓缩后蛋白含量的影响；

图3为培养过程中的细胞生长曲线；

图4为培养细胞流式检测结果；CD3+细胞占90%以上，其中CD3+CD4+细胞约在10-20%，CD3+CD8+细胞在60-80%，CD3+CD56+细胞约在10-20%。

图5为培养的细胞对A549细胞的体外杀伤作用。

具体实施方式

下面以实例来说明本发明，但本发明并不受其限制。下面实例中凡未注明具体条件的实验方法，均为遵照常规方法和厂家操作说明进行。

常规采集晚期肺癌患者外周血50-100ml，5-15IU/ml的肝素钠抗凝，转速800g，离心10分钟，收集上层血浆部分（约1/3的液体层），加入终浓度为0.1-1.0mg/ml的亮抑蛋白酶抑制剂，混合均匀，随后用无菌离心管存储，置于-20℃以下环境冷冻24-48h（参见图1），取出后在0-4℃环境中放置10-16h（参见图2）；56℃灭活30min，0.22μm微孔滤膜过滤，得到自体血清肿瘤抗原。

密度梯度离心法分离PBMC，生理盐水等倍稀释沉淀的血细胞，人淋巴细胞分离液与稀释的血液按照1:2的比例加入离心管中，转速700g，离心20分钟，小心吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，1500转/分，离心8分钟，即得到外周血单个核细胞。

采用AIM-V无血清培养基悬浮分离的PBMC，按照1×10⁸/瓶的数量置于75cm²的培养瓶中，细胞培养箱中静置2h，轻轻晃动培养瓶，吸取未贴壁淋巴细胞用于CIK细胞的培养，贴壁细胞用于DC的培养。

DC培养和致敏：依照表1所示，抗原分为高、低、中表达3类。

表1 抗原表达分类

肿瘤标准物测定结果之和R	高抗原表达组T	中抗原表达组	低抗原表达组
				R	T≥10倍正常值	5倍正常值≤T＜10倍	T＜5倍正常值
致敏血清浓度	5%-10%	10%-15%	15%-20%

本实施例所使用的肿瘤标准物结果：CEA 149.7ng/ml（正常0-3.8 ng/ml）,CA125 16.04U/ml（正常0-35 U/ml）,CA199 22.87 U/ml（正常0-27 U/ml），肿瘤标志物测定结果为“超过10倍正常值”，在贴壁细胞培养的第3、5天分别加入终浓度为5-20%，优选为5-10%的自体血清进行DC致敏（参见图3），在培养第7天加入终浓度为200-1000ng/ml的肿瘤坏死因子，本患者实际使用浓度为800ng/ml，得到自身抗原致敏后的成熟DC。

DC与CIK细胞共培养制备DC-CIK：将上述抗原致敏后的DC与前述CIK细胞混合培养，7天左右，收获自体抗原致敏DC-CIK细胞（参见图3）。

与常规培养制备的DC-CIK相比，其对CIK的增殖活性和杀瘤活性都明显增加，其增殖倍数平均达到了200-250倍，是传统培养方法的2-3倍；体外实验时杀瘤活性达到70-80%，明显高于常规方法培养的DC-CIK细胞。

使用上述方法，采用自体血清中抗原作为本人特异性肿瘤抗原，与单一的肿瘤特异性抗原相比，有效避免因肿瘤细胞突变对特异性抗原的抵抗作用；同肿瘤细胞株抗原相比，血清抗原是自体抗原，有效避免了细胞株在体外传代过程中造成的抗原结构的改变；面对手术后患者或者难以获得肿瘤标本的患者，有效避免了无肿瘤抗原可用的窘境。在肿瘤抗原制备的过程中，适量的蛋白酶抑制剂有效的保持了血清中肿瘤抗原的完整性；此外，本方法工序简单，条件易控，对设备的要求较低，而所获得的的DC-CIK细胞增殖效率更高，有效提高了临床的疗效。

通过以上技术制备的患者特异性的DC-CIK细胞具有以下生物学特性：

细胞组成：CD3+细胞占90%以上，其中CD3+CD4+细胞约在10-20%，CD3+CD8+细胞在60-80%，CD3+CD56+细胞约在10-20%（参见图4）。

细胞增殖倍数：与常规DC-CIK培养技术相比，使用自体血清抗原致敏DC，培养的DC-CIK细胞增殖能力明显增加，因患者个体不同，普遍的增殖倍数在200-250倍，是常规方法的2-3倍。

细胞毒活性：与常规DC-CIK培养技术相比，以人肺癌细胞株A549为靶细胞，采集肺癌患者血清制备特异性DC-CIK细胞，按照不同的效靶比混合细胞，24小时平均杀伤活性如表2所示，明显优于常规培养方法（参见图5）。（n=10）

表2 常规与致敏DC-CIK细胞毒活性结果比较表

以上内容是结合具体情况对本发明的详细说明，不能认定本发明的具体实施就局限于这些说明，对于本发明所属具体领域的普通研究人员，在不脱离本发明具体模式的情况下，还可以做出一些简单的推演和替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.自体血清抗原致敏DC-CIK细胞的制备方法，包括以下步骤：

A)自体血清抗原的制备；

B)外周血单个核细胞的制备；

C)DC的分离和培养；

D)CIK细胞的诱导扩增；

E)DC与CIK细胞共培养制备DC-CIK细胞。

2.如权利要求1所述的自体血清抗原致敏DC-CIK细胞的制备方法，其特征是：所述的A)步骤为取外周血50-100ml，离心分离患者血清，加入终浓度为0.1-1.0mg/ml的亮抑蛋白酶抑制剂进行蛋白浓缩，随后用无菌离心管存储，置于-20℃以下环境冷冻24-48h，取出后在0-4℃环境中放置10-16h，吸取上层血浆部分并弃去；灭活20-30min，微孔滤膜过滤，得到自体血清肿瘤抗原。

3.如权利要求2所述的自体血清抗原致敏DC-CIK细胞的制备方法，其特征是：所述分离血清后蛋白浓缩后的蛋白处理条件为-20℃冷冻48h，随后在4℃环境中竖直放置16h；所述灭活条件为56℃灭活补体成分30min；所述微孔滤膜为孔径为22μm及以下微孔滤膜。

4.如权利要求1所述的自体血清抗原致敏DC-CIK细胞的制备方法，其特征是：所述的B)步骤为采用密度梯度离心法分离获得外周血单个核细胞(PBMC)；采用AIM-V无血清培养基悬浮分离的PBMC，按照0.5-1×10⁸/瓶的数量置于培养瓶中，细胞培养箱中静置1-3h，吸取未贴壁淋巴细胞用于CIK细胞的培养；贴壁细胞用于DC的培养。

5.如权利要求1所述的自体血清抗原致敏DC-CIK细胞的制备方法，其特征是：所述的C)步骤为依据肿瘤标志物测定结果，在细胞贴壁后加入终浓度为5-20％的自体血清进行DC致敏，在培养第6至第7天加入终浓度为200-1000ng/ml的肿瘤坏死因子，得到自身抗原致敏后的DC；

6.如权利要求1所述的自体血清抗原致敏DC-CIK细胞的制备方法，其特征是：所述的E)步骤为将上述抗原致敏后的DC与前述CIK细胞混合培养5-8天，收获自体抗原致敏DC-CIK细胞。

7.如权利要求1-6任一项所述的自体血清抗原致敏DC-CIK细胞的制备方法，其特征是：所述DC-CIK细胞的细胞组成为CD3⁺细胞占90％以上，其中CD3⁺CD4⁺细胞在10-20％，CD3⁺CD8⁺细胞在60-80％，CD3⁺CD56⁺细胞在10-20％。