CN105585619A - 与水稻籽粒粒长和粒重相关蛋白及其编码基因gl3-3与应用 - Google Patents

与水稻籽粒粒长和粒重相关蛋白及其编码基因gl3-3与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了与水稻籽粒粒长和粒重相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供了一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列3所示的氨基酸残基组成的蛋白质；2)将1)所示的蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明克隆了正向调控水稻粒长和粒重的基因GL3-3，将其导入日本晴，得到转基因水稻，转基因水稻的粒长和/或粒重大于日本晴水稻，该基因为水稻的高产优质育种提供了新的基因资源。

Description

与水稻籽粒粒长和粒重相关蛋白及其编码基因GL3-3与应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及与水稻籽粒粒长和粒重相关蛋白及其编码基因GL3-3与应用。
背景技术
粒重和粒形不仅是产量形成的重要因素之一，还影响垩白粒率、糙米率、精米率、整精米率等品质性状，从而影响稻米外观、碾磨、蒸煮和营养等品质(Webbetal.,1991；石春海等,1994；徐正进等，2004；孟庆虹等，2009)。发掘水稻粒重和粒形相关基因并明确其功能，不仅为水稻高产及优质育种提供优异的基因资源，而且有助于明确水稻粒重和粒形形成的分子机理，具有重要的理论和实践意义。
粒重受粒长、粒宽和粒厚等粒形性状以及籽粒灌浆共同决定，均属于数量遗传。目前已发现的控制水稻粒重的位点有近286个，其中精细定位的粒重QTL有gw3.1(Lietal.,2004)，qGW8.1(Xieetal.,2006)，gw9.1(Xieetal.,2008)，qGL7(Baietal.,2010)和qGL7-2(Shaoetal.,2010)。已克隆粒长及粒重基因GS3(Fanetal.,2006)、GL3.1(Qietal.,2012)、粒宽及粒重基因GW2(Songetal.,2007)、qSW5(Shomuraetal.,2008；Wengetal.,2008；Wanetal.,2008)GS5(Lietal.,2011)和GW8(Wangetal.,2012)。除此之外，仍然有许多影响粒形的QTL通过近等基因系被定位到(Xingetal.,2002；Thomsonetal.,2003；Lietal.,2004；Wangetal.,2012)。近些年来，水稻全基因组关联分析取得了重大突破，定位到了多个与粒形性状相关联的新位点(Huangetal.,2010；Zhaoetal.,2011；Huangetal.,2012)。从以上定位和克隆的QTL分布及数量情况来看，控制粒长、粒重的基因可能还很多。
发明内容
本发明的一个目的是提供与水稻籽粒粒长和粒重相关蛋白及其编码基因。
本发明提供的蛋白，命名为GL3-3，是如下1)或2)的蛋白质：
1)由序列表中序列3所示的氨基酸残基组成的蛋白质；
2)将1)所示的蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。
上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。
上述DNA分子为如下1)-5)中任一所述的DNA分子：
1)编码区为序列表中序列2所示的DNA分子；
2)编码区为序列表中序列2自5’末端第10-1570位核苷酸；
3)编码区为序列表中序列2自5’末端第102-1106位核苷酸；
4)在严格条件下与1)或2)或3)杂交且编码具有相同功能蛋白的DNA分子；
5)与1)或2)或3)具有90％以上同源性且编码具有相同功能蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
上述重组载体为将上述DNA分子***表达载体得到的重组载体，在本发明的实施例中，表达载体为pMDC32，重组载体为将序列表序列2自5’末端第10-1570位核苷酸***pMDC32载体的KpnI和PacI位点间(即双烟草花叶病毒启动子35S下游)得到的载体，命名为35S::GL3-3。
上述重组菌为将所述重组载体导入目的菌中得到的重组菌，在本发明的实施例中，目的菌为根癌农杆菌EHA105。
上述的蛋白、上述DNA分子、含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌在调控植物产量中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述产量通过籽粒粒长和/或粒重体现；
所述调控植物产量为提高植物籽粒粒长和/或粒重；
所述植物具体为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明提供的方法，为将上述DNA分子导入目的植物，得到转基因植物；
所述转基因植物具有如下1)和/或2)特征：
1)所述转基因植物的籽粒粒长大于所述目的植物；
2)所述转基因植物的籽粒粒重大于所述目的植物；
所述DNA分子通过权利要求4所述重组载体导入目的植物；
所述植物具体为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻。
上述的蛋白、上述DNA分子、含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌在培育高产植物中的应用也是本发明保护的范围；所述植物具体为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻。
本发明的实验证明，本发明克隆了正向调控水稻粒长和粒重的基因GL3-3，将其导入日本晴，得到转基因水稻，转基因水稻的粒长和/或粒重大于日本晴水稻，该基因为水稻的高产优质育种提供了新的基因资源。
本发明是这样实现的：
1、QTL扫描及定位：利用一个由水稻特大粒品种SLG-1(供体亲本，以下简称为SLG)和小粒品种日本晴(Nipponbare，轮回亲本,以下简称为Nip)构建的回交近交系(BILs)群体在三号染色体的末端标记RM1278附近初步定位到一个控制籽粒长度和粒重的QTLqGL3-3。利用在2013年北京中国农业大学上庄试验站种植的约2000株近等基因系的F2群体进行精细定位，将目标基因定位在标记RM14484和RM1278之间约280kb的区间内。
2、候选区域的关联分析与候选基因的确定：利用272份水稻微核心种质资源14X的高精度测序获得的候选区域极高密度的SNP数据(平均1kb内有7个SNP)，对精细定位到的候选区域进行关联分析。在高度关联的SNPs中，有19个集中分布在基因Os03g0183000的启动子区域。通过对该基因区域的序列比较分析，我们发现与日本晴相比，SLG中存在这些SNP位点，因此，将Os03g0183000确定为候选基因(即GL3-3)。该基因的编码产物具有一个保守的AP2结构域，属于AP2/EREBP家族。我们还发现在GL3-3基因启动子区域有很多与植物生长发育相关的顺式作用元件。
3、GL3-3的单倍型分析：依据GL3-3启动子区域的5个最显著的关联位点(包含4个SNP和一个indel)对本课题组搜集的水稻微核心种质中的247份材料进行单倍型分型分析，它们可以被分成四种单倍型；根据***发生分析，这四种单倍型又可以分成ClassA和ClassB两大类；其中，ClassA的籽粒长度显著长于ClassB。
4、GL3-3的功能验证：利用超表达技术，通过农杆菌介导的遗传转化，发现该基因表达量的升高能够使转化受体水稻“日本晴”的粒长从7.22mm增长到7.81mm；千粒重从21.14g增加到23.25g，达到极显著的差异。
附图说明
图1为水稻第三染色体定位的分子标记示意图
SSR标记序列参见http://www.gramene.org/。
图2为GL3-3的单倍型分析结果图
图3为根据***发生分析得到的四种单倍型聚类分析结果示意图。
图4为四种单倍型聚类分析得到的ClassA和ClassB两大类在籽粒长度的差异对比图
图5为表达载体pMDC32图谱
图6为PCR鉴定T0代转GL3-3水稻植株
图7为转OsGL3-3水稻植株的实时荧光定量PCR检测结果
图8为T2代转OsGL3-3水稻的粒长和粒重与阴性对照植株的表现型差异比较图
图9为T2代转OsGL3-3水稻T2代籽粒的表型
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
水稻品种SLG-1记载在如下文献中：马丽莲等.水稻大粒种植资源和遗传分析.植物学通报,2006,23(4):395-401；公众可从中国农业大学获得。
水稻品种日本晴记载在如下文献中：水稻品种“日本晴”.农业科技通讯.1973年02期；公众可从中国农业大学获得。
载体pMDC32记载在如下文献中：EvaM.Farre′andSteveA.Kay.PRR7proteinlevelsareregulatedbylightandthecircadianclockinArabidopsis.ThePlantJournal,2007,52:548–560；公众可从中国农业大学获得，该载体的结果示意图为图5。
根癌农杆菌EHA105记载在如下文献中：高世武等.影响根癌农杆菌EHA105感受态细胞转化效率因素的研究.热带生物学报.2012年3月第3卷第1期；公众可从中国农业大学获得。
实施例1、GL3-3蛋白及其编码基因的获得
1、GL3-3基因的定位
利用一个由水稻特大粒品种SLG(供体亲本)和小粒品种日本晴(Nipponbare，轮回亲本)构建的回交近交系(BILs)群体BC4F2共175个株系，考察各株系成熟后的千粒重、粒长、粒宽和粒厚，作为QTL定位的表型数据。同时，运用BSA法从均匀分布在水稻12条染色体上的1513对SSR标记中筛选出的多态性标记，标记带型与大粒亲本SLG一致，记为A，与日本晴一致，记为B，杂合记为H。利用Mapmaker3.0进行标记连锁作图，Group命令分组，Kosambi方法计算遗传距离。QTL扫描采用QTLIciMapping3.0(王建康等，2009)，以LOD值2.5作为QTL存在的阈值，同时计算加性和显性效应。QTL的命名原则采用McCouch等命名方法，连锁遗传图采用Liu等绘图方法在EXCEL2010中完成。检测到的粒形QTL中，覆盖了很多已克隆的基因所在的区域，例如粒长GS3(Fanetal.,2006)、粒宽GW2(Songetal.,2007)和GW8(Wangetal.,2012)等。同时，在三号染色体的末端标记RM1278附近扫描到一个新的控制籽粒长度和粒重的QTL，效应值达到19％。另外，在BC4F4等多个家系中都扫描到该QTL。
利用在2013年北京中国农业大学上庄试验站种植的约2000株NIL-F2群体进行精细定位，将目标基因定位在公共标记RM14484和RM1278之间约280kb的区间内(如图1)。
2、候选区域的关联分析与候选基因的确定
通过对其中272份水稻微核心种质资源14X的高精度测序获得了候选区域极高密度的SNP数据(平均1kb内有7个SNP)，对精细定位后的候选区域进行关联分析(有群体结构作为协变量进行群体矫正)。在高度关联的SNP中，有19个集中分布在基因Os03g0183000的启动子区域。通过对该基因区域的比较测序分析发现，与日本晴相比，SLG中存在这些SNP位点。该基因的编码蛋白(核苷酸序列为序列3)具有一个保守的AP2结构域，属于AP2/EREBP类转录因子家族。拟南芥中AP2/EREBP类转录因子成员AP2，参与确立花器官和花分生组织特征、抑制花分生组织的不确定性以及胚珠和种皮的发育(Ohtoetal.2005)；Ohto等还认为拟南芥AP2可能是通过影响糖代谢来调控种子的大小。另外，还发现在Os03g0183000基因启动子区域有很多与植物生长发育相关的顺式作用元件。因此，将该基因确定为候选基因GL3-3。GL3-3基因的启动子区核苷酸序列为序列1，全长cDNA核苷酸序列为序列表中序列2，该基因编码的蛋白命名为GL3-3，其氨基酸序列为序列表中序列3。
3、GL3-3的单倍型分析
依据GL3-3启动子区的5个最显著的关联位点(包含4个SNP和一个5’-indel)对本课题组搜集的水稻247份微核心种质进行单倍型分型分析，结果发现，它们可以被分成四种单倍型(图2)；运用软件MEGA5进行***发生分析，这四种单倍型又可以分成ClassA和ClassB两大类；而ClassA的籽粒长度显著长于ClassB(见图3和4)。
实施例2、GL3-3基因的功能验证
一、转GL3-3水稻的获得
1、重组载体的获得
取正常条件下培养的日本晴幼苗，Trizol法提取总RNA，纯化后用M-MLV反转录酶进行反转录得到cDNA。以该cDNA为模板，设计引物F1和引物R1进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化1580bp的DNA片段进行测序。
结果该PCR产物具有序列表序列2自5’末端第10-1570位核苷酸，其中自5’末端第102位至第1106位为GL3-3基因的开放阅读框。
上述引物的序列如下：
F1：5'-CGGGGTACCAAAGGCATTCGCAACACACA-3'(下划线碱基(4-9bp)为限制性内切酶KpnI的酶切识别序列)；
R1：5'-CCTTAATTAACCAAAATACATTACGACTGGAC-3'(下划线碱基(1571-1578bp)为限制性内切酶PacI的酶切识别序列)。
将上述获得1580bp的PCR产物用KpnI和PacI双酶切，得到的酶切产物与经经过同样酶切的载体pMDC32的骨架片段相连，得到重组载体。
经过测序，该重组载体为将序列表序列2自5’末端第10-1570位核苷酸***pMDC32载体的KpnI和PacI位点间(即双烟草花叶病毒启动子35S下游)得到的载体，命名为35S::GL3-3。
2、重组农杆菌的获得
将上述重组载体35S::GL3-3冻融法转化根癌农杆菌EHA105，获得含有重组载体35S::GL3-3的根癌农杆菌EHA105，即重组农杆菌EHA105/35S::GL3-3。
提取重组农杆菌EHA105/35S::GL3-3的质粒，KpnI和PacI酶切鉴定，得到1580bp，为阳性重组农杆菌。
3、转基因植物的获得和鉴定
用上述重组农杆菌EHA105/35S::GL3-3侵染水稻日本晴(以下也称为野生型水稻)的胚性愈伤组织，得到8个T0代转GL3-3水稻株系，具体方法如下：
1)、侵染液的制备
把重组农杆菌EHA105/35S::GL3-3平铺于含50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平的YEP培养基中，28℃培养2-3天。挑取单菌斑接种于YEP液体培养基中(50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平)，28℃，240rpm培养至OD600为0.8-1.0，按1％的接种量接种于YEP液体培养基中(50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平)，28℃，240rpm培养至OD600为0.5-0.6,离心收集菌体重悬于AAM培养基中28℃，240rpm培养至OD600为0.3-0.4作为侵染液。
2)、侵染和共培养
选取良好的水稻日本晴的胚性愈伤组织用步骤1)制备的侵染液浸泡30分钟后取出，用无菌滤纸吸去多余菌液，然后置于共培养培养基上培养2-3天。
3)、筛选培养
将经步骤2)共培养的愈伤组织用无菌水振荡清洗3-4次，再用500mg/L头孢霉素水溶液振荡洗涤40分钟，直至上清液完全清洁为止；取出愈伤组织，放入只带滤纸的无菌培养皿中0.4m/s风干4小时；转入延迟筛选培养基暗培养3-7天后再转入筛选培养基中筛选两轮(每轮3-4周)。
4)、分化培养获得转基因植株
将经步骤3)培养的愈伤组织在预分化培养基中暗培养2-3周后，再移到分化培养基中光照培养2-3周，待幼芽长至约1cM时转入壮苗培养基培养30天，揭去封口膜炼苗培养一周，然后移栽到土中，获得T0代转GL3-3水稻。
上述培养基配方如表2所示。
表2为培养基配方
注：NB培养基基本成分包括N6大量元素，B5微量元素，B5有机成分，150mg/L肌醇，300mg/L水解酪蛋白，500mg/L谷氨酰胺，600mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶。
5)PCR鉴定
对步骤4)获得的T0代转GL3-3水稻植株幼苗提取RNA，反转录得到cDNA作为模板，用引物5′-AAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACC-3′和5′-TCTACACAGCCATCGGTCCAGACG-3′进行PCR扩增。以野生型水稻为对照。
结果如图6所示，p为质粒35S::GL3-3，W为野生型水稻，1-8为T0代转GL3-3水稻，可以看出，得到919bp的目的片段为阳性T0代转GL3-3水稻。
共得到8个T0代转GL3-3水稻株系。
T0代表示转基因当代植株，T1代表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株，T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。
T0代转GL3-3水稻株系OE4、OE5种子播种，培育，直到得到T2转GL3-3水稻株系OE4、OE5。
采用同样的方法，将空载体pMDC32转入野生型水稻，得到T0代转空载体水稻，培育，得到T2代转空载体水稻。
4、转GL3-3水稻的实时荧光定量PCR检测
将野生型日本晴(WT)、T2转GL3-3水稻株系OE4、OE5在大田种植，每个株系10株。分别提取各株系植株叶片，利用TRIZOL试剂提取总RNA，以此RNA为模板，使用M-MLV反转录酶进行反转录得到cDNA，以此cDNA为模板，采用引物5’-ATGGCTTGCTTGATTACCGAA-3’和5’-AGACCCCGTAAAAGTAGCCCA-3’进行扩增，扩增GL3-3基因的特异片段(142bp)。
以Actin基因为对照，扩增该基因的引物为5’-ATTTGGCACCACACATTCTAC-3’和5’-ATAACCTTCGTAGATTGGGACT-3’，扩增出水稻Actin基因的特异片段(255bp)以作为内参进行实时定量分析。
实时荧光定量PCR在实时荧光定量PCR仪AppliedBiosystems7500RealTimePCRsystem(ABI,USA)上进行，一次平行试验设3次重复。利用LivakKJ和SchmittgenTD(2001)报道的方法，即2-ΔΔCT计算相对表达量。
ΔΔCT＝(CT.Target－CT.Actin)Timex－(CT.Target－CT.Actin)Time0
Timex表示任意时间点，Time0表示经actin校正后1倍量的目标基因表达。
结果如图7所示，与野生型水稻相比，T2转GL3-3水稻株系OE4、OE5中GL3-3基因的表达量明显高于野生型水稻。
二、转GL3-3水稻表型
将野生型日本晴(WT)、T2转GL3-3水稻株系OE4和T2代转空载体水稻种植大田后进行表型观察，每个株系20株，实验重复三次，结果取平均值。
统计各株系水稻粒长和千粒重，结果如图8所示，
野生型日本晴(WT)的粒长和千粒重分别为7.22mm和21.14g；
T2转GL3-3水稻株系OE4(OE)的粒长和千粒重分别为7.81mm和23.25g；
观察T2转GL3-3水稻株系OE4的种子表型，结果如图9，图中：上排谷粒为T2转GL3-3水稻株系，下排谷粒为野生型日本晴对照，可以看出，与野生型日本晴(WT)相比，T2转GL3-3水稻株系OE4(OE)的粒长显著增加。
野生型日本晴(WT)和T2代转空载体水稻结果无显著差异。
因此，可以看出，GL3-3基因可以提高水稻产量，通过提高水稻粒长和千粒重体现。

Claims (10)

1.一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：
1)由序列表中序列3所示的氨基酸残基组成的蛋白质；
2)将1)所示的蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。
3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为如下1)-5)中任一所述的DNA分子：
1)编码区为序列表中序列2所示的DNA分子；
2)编码区为序列表中序列2自5’末端第10-1570位核苷酸；
3)编码区为序列表中序列2自5’末端第102-1106位核苷酸；
4)在严格条件下与1)或2)或3)杂交且编码具有相同功能蛋白的DNA分子；
5)与1)或2)或3)具有90％以上同源性且编码具有相同功能蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求2或3所述DNA分子***表达载体得到的重组载体。
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将所述重组载体导入目的菌中得到的重组菌。
7.权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述DNA分子、含有权利要求2或3所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌在调控植物产量中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述产量通过籽粒粒长和/或粒重体现；
所述调控植物产量为提高植物籽粒粒长和/或粒重；
所述植物具体为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻。
9.一种培育转基因植物的方法，为将权利要求2或3所述DNA分子导入目的植物，得到转基因植物；
所述转基因植物具有如下1)和/或2)特征：
1)所述转基因植物的籽粒粒长大于所述目的植物；
2)所述转基因植物的籽粒粒重大于所述目的植物；
所述DNA分子通过权利要求4所述重组载体导入目的植物；
所述植物具体为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻。
10.权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述DNA分子、含有权利要求2或3所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌在培育高产植物中的应用；所述植物具体为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻。
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