CN106119280A - 与水稻粒长相关的蛋白OsJGL2及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蛋白OsJGL2编码基因在制备与水稻粒长相关的表达载体中的应用。蛋白OsJGL2在制备水稻粒长调控制剂中的应用。本发明还公开了一种与水稻粒长相关的蛋白OsJGL2的表达载体。过量表达水稻OsJGL2基因可引起水稻种子极显著增长增重。与野生型相比,转基因水稻粒长增长7.0%,千粒重增重15.6%。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及与水稻粒长相关的蛋白OsJGL2及其编码基因与应用。
背景技术
水稻是人类赖以生存的主要粮食作物之一,全球约有一半的人口以稻米为主食。世界稻米的供求矛盾越来越突出,提高产量是当今水稻育种的首要目标。粒重是影响作物产量的重要因素之一,增加谷粒的大小粒重,是提高水稻产量的有效途经之一,而谷粒的长度又是决定稻米质量的重要形态指标。既增加产量又提高稻米质量,是育种家追求的目标。相对于水稻其它产量性状而言,目前关于粒长基因的研究稍显滞后,真正分离到的粒长基因还很少。在禾本科材料中克隆与粒长相关的优良基因,对培育高产、优质水稻新品种具有重要的理论与实际意义。
发明内容
OsJGL2基因(GenBank登陆号XM_015770529.1)是水稻中功能未知基因,位于水稻第1号染色体上,无内含子,mRNA大小为1349bp,编码序列(CDS)大小为747bp,编码包含248个氨基酸残基的蛋白(GenBank登陆号XP_015626015.1),蛋白质分子量为26.72KD,等电点为8.1。在该蛋白质序列中,带电荷氨基酸78个,酸性氨基酸32个,碱性氨基酸33个,极性氨基酸55个,疏水氨基酸76个。GenBank数据库比对分析发现,OsJGL2蛋白序列具有推定的DUF1645保守结构域,与短花药野生稻(XP_006644418.1)、二穗短柄草(XP_003569426.1)、高粱(XP_002456032.1)、小米(XP_004969278.1)和玉米(NP_001143665.2)蛋白序列的同源性分别达到82%、56%、61%、65%和61%。OsJGL2蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示,OsJGL2蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.3所示。本发明构建出蛋白OsJGL2的表达载体,其序列如SEQ ID NO.1所示,命名为载体pCAMBIA1300+163+OsJGL2,将其转化到水稻中表达,发现过量表达水稻OsJGL2基因可引起水稻种子极显著增长增重。与野生型相比,转基因水稻粒长增长7.0%,千粒重增重15.6%。因此,蛋白OsJGL2编码基因可用于制备与水稻粒长相关的表达载体。蛋白OsJGL2可用于制备水稻粒长调控制剂。
附图说明
图1水稻OsJGL2基因的PCR扩增产物;M,Marker;1,PCR产物;
图2 OsJGL2的pMD18-T质粒酶切分析;M,Marker;C,未酶切质粒作为对照;1、2分别代表不同质粒酶切产物;
图3表达载体pCAMBIA1300+163的结构示意图;
图4表达载体pCAMBIA1300+163+OsJGL2酶切鉴定;M,Marker;C,未酶切质粒作为对照;1、2、3分别代表不同质粒酶切产物;
图5农杆菌介导水稻遗传转化;左上图为水稻愈伤组织的诱导;右上图为继代培养;左下图为抗性愈伤筛选;右下图为愈伤分化;
图6特异潮霉素引物鉴定转OsJGL2基因水稻;M,DNA分子量标准;1,无模板对照;2、3,野生型对照;4、5,阳性对照;6-24,转基因植株;
图7野生型与转OsJGL2基因水稻农艺性状的比较;Control,水稻野生型;OE,过表达株系;*P<0.05,**P<0.01,Student’s t test。
具体实施方式
基因克隆
PCR克隆引物,PCR等反应实验条件,克隆载体,来源及可能用到的內切酶,cDNA阳性克隆分析
人工合成一对引物,并在反向引物5’端加上BamHI酶切位点,正向引物所在序列附近含有NcoI酶切位点,无需添加。引物如下:
OsJGL2F:5'ACGCATCGTCACATCACAGAG 3'(21)(SEQ ID NO.4);
OsJGL2R:5'GGATCC TAGGCTTCAAGTCAAAGGTTCG 3'(28)(BamHI)(SEQ ID NO.5)。
利用此对引物,以水稻日本晴的总DNA为模板进行PCR。PCR条件为:热盖温度105℃,预变性95℃5min,95℃变性45s,61℃退火45s,72℃延伸60s,进行34个循环,72℃延伸10min。PCR体系见表1:
表1
使用TAE电泳缓冲液进行琼脂糖凝胶电泳,得到了大约900bp的片段(图1),命名为OsJGL2。
将上述OsJGL2扩增产物用TIANGEN的试剂盒进行胶回收,然后将回收片段连入PMD18-T载体(TAKARA)。连接体系如表2:
表2
连接2个小时,转化E.coli DH5α的感受态细胞,涂板,用氨苄霉素筛选。挑选单克隆,提取质粒后用NcoI和BamHI双酶切鉴定,结果如图所示,均有大约1000bp的目的条带(图2)。送1、2号对应的菌液测序,测序结果均与GenBank上基因序列完全一致。
基因功能验证详细过程
表达原载体及来源,表达原载体构建可能用到的內切酶
克隆得到OsJGL2基因,将其构建到表达载体,具体步骤如下:将连接有OsJGL2基因的克隆载体pMD18-T和表达载体pCAMBIA1300+163(图3)都用BamHI和NcoI进行双酶切并分别回收纯化,然后用T4连接酶连接后转化E.coli DH5α,挑取单菌落扩大培养后抽提质粒,BamHI和NcoI双酶切鉴定,最终获得连接有目的基因的过量表达载体pCAMBIA1300+163+OsJGL2(图4)。利用热激法将构建的表达载体转化到农杆菌EHA105菌株中。
基因转化方法,基因转化物种
采用农杆菌介导法将构建的表达载体转化到水稻SR59中,获得过量表达OsJGL2基因的水稻转基因株系。该实验过程如下:以SR59成熟种子诱导而来的愈伤组织为受体,经过农杆菌浸染、共培养、2次抗性愈伤组织潮霉素连续筛选(每次2周)、抗性愈伤组织分化、生根、炼苗等步骤获得潮霉素抗性植株(图5)。
转基因植物分子分析
利用潮霉素特异引物,对潮霉素抗性再生植株进行PCR检测(图6)。检测出含潮霉素基因的阳性株系13株。引物如下:
hptF:5'TTTAGCGAGAGCCTGACCTATTGC 3'(SEQ ID NO.6);
hptR:5'CGTCAACCAAGCTCTGATAGAGTTG 3'(SEQ ID NO.7);
转基因植物功能表型(图7)
对野生型和T1代转OsJGL2基因水稻的农艺性状进行对比观察和统计分析。与野生型的株高相比,三个株系无显著性差异。与野生型的分蘖数相比,OE-1和OE-2株系均显著高于野生型,OE-3株系与野生型无显著性差异。与野生型的剑叶长相比,OE-1显著短于野生型,OE-2显著长于野生型,OE-3株系与野生型无显著性差异。与野生型的剑叶宽相比,OE-1和OE-2显著大于野生型,OE-3株系与野生型无显著性差异。与野生型的穗长相比,三个株系无显著性差异。与野生型的每穗粒数相比,OE-1和OE-2株系均显著低于野生型,OE-3株系无显著性差异。
与野生型的千粒重相比,三个株系均极显著增重,OE-1株系增重6.3%,OE-2株系增重13.8%,OE-3株系增重15.6%。与野生型的粒长相比,三个株系均极显著增长,OE-1株系增长8.4%,OE-2株系增长8.2%,OE-3株系增长7.0%。与野生型的粒宽相比,三个株系无显著性差异。与野生型的粒厚相比,三个株系无显著性差异。
Claims (4)
1.蛋白OsJGL2编码基因在制备与水稻粒长相关的表达载体中的应用。
2.蛋白OsJGL2在制备水稻粒长调控制剂中的应用。
3.一种与水稻粒长相关的蛋白OsJGL2的表达载体,其特征在于,所述表达载体中含有权利要求1所述的蛋白OsJGL2编码基因。
4.如权利要求3所述的表达载体,其特征在于,所述表达载体序列如SEQ ID NO.1所示,命名为载体pCAMBIA1300+163+OsJGL2。
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