CN106119280A - 与水稻粒长相关的蛋白OsJGL2及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了蛋白OsJGL2编码基因在制备与水稻粒长相关的表达载体中的应用。蛋白OsJGL2在制备水稻粒长调控制剂中的应用。本发明还公开了一种与水稻粒长相关的蛋白OsJGL2的表达载体。过量表达水稻OsJGL2基因可引起水稻种子极显著增长增重。与野生型相比，转基因水稻粒长增长7.0％，千粒重增重15.6％。

Description

与水稻粒长相关的蛋白OsJGL2及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及与水稻粒长相关的蛋白OsJGL2及其编码基因与应用。
背景技术
水稻是人类赖以生存的主要粮食作物之一，全球约有一半的人口以稻米为主食。世界稻米的供求矛盾越来越突出，提高产量是当今水稻育种的首要目标。粒重是影响作物产量的重要因素之一，增加谷粒的大小粒重，是提高水稻产量的有效途经之一，而谷粒的长度又是决定稻米质量的重要形态指标。既增加产量又提高稻米质量，是育种家追求的目标。相对于水稻其它产量性状而言，目前关于粒长基因的研究稍显滞后，真正分离到的粒长基因还很少。在禾本科材料中克隆与粒长相关的优良基因，对培育高产、优质水稻新品种具有重要的理论与实际意义。
发明内容
OsJGL2基因(GenBank登陆号XM_015770529.1)是水稻中功能未知基因，位于水稻第1号染色体上，无内含子，mRNA大小为1349bp，编码序列(CDS)大小为747bp，编码包含248个氨基酸残基的蛋白(GenBank登陆号XP_015626015.1)，蛋白质分子量为26.72KD，等电点为8.1。在该蛋白质序列中，带电荷氨基酸78个，酸性氨基酸32个，碱性氨基酸33个，极性氨基酸55个，疏水氨基酸76个。GenBank数据库比对分析发现，OsJGL2蛋白序列具有推定的DUF1645保守结构域，与短花药野生稻(XP_006644418.1)、二穗短柄草(XP_003569426.1)、高粱(XP_002456032.1)、小米(XP_004969278.1)和玉米(NP_001143665.2)蛋白序列的同源性分别达到82％、56％、61％、65％和61％。OsJGL2蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示，OsJGL2蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.3所示。本发明构建出蛋白OsJGL2的表达载体，其序列如SEQ ID NO.1所示，命名为载体pCAMBIA1300+163+OsJGL2，将其转化到水稻中表达，发现过量表达水稻OsJGL2基因可引起水稻种子极显著增长增重。与野生型相比，转基因水稻粒长增长7.0％，千粒重增重15.6％。因此，蛋白OsJGL2编码基因可用于制备与水稻粒长相关的表达载体。蛋白OsJGL2可用于制备水稻粒长调控制剂。
附图说明
图1水稻OsJGL2基因的PCR扩增产物；M，Marker；1，PCR产物；
图2 OsJGL2的pMD18-T质粒酶切分析；M，Marker；C，未酶切质粒作为对照；1、2分别代表不同质粒酶切产物；
图3表达载体pCAMBIA1300+163的结构示意图；
图4表达载体pCAMBIA1300+163+OsJGL2酶切鉴定；M，Marker；C，未酶切质粒作为对照；1、2、3分别代表不同质粒酶切产物；
图5农杆菌介导水稻遗传转化；左上图为水稻愈伤组织的诱导；右上图为继代培养；左下图为抗性愈伤筛选；右下图为愈伤分化；
图6特异潮霉素引物鉴定转OsJGL2基因水稻；M，DNA分子量标准；1，无模板对照；2、3，野生型对照；4、5，阳性对照；6-24，转基因植株；
图7野生型与转OsJGL2基因水稻农艺性状的比较；Control，水稻野生型；OE，过表达株系；*P<0.05,**P<0.01,Student’s t test。
具体实施方式
基因克隆
PCR克隆引物，PCR等反应实验条件，克隆载体，来源及可能用到的內切酶，cDNA阳性克隆分析
人工合成一对引物，并在反向引物5’端加上BamHI酶切位点，正向引物所在序列附近含有NcoI酶切位点，无需添加。引物如下：
OsJGL2F：5'ACGCATCGTCACATCACAGAG 3'(21)(SEQ ID NO.4)；
OsJGL2R：5'GGATCC TAGGCTTCAAGTCAAAGGTTCG 3'(28)(BamHI)(SEQ ID NO.5)。
利用此对引物，以水稻日本晴的总DNA为模板进行PCR。PCR条件为：热盖温度105℃，预变性95℃5min，95℃变性45s，61℃退火45s，72℃延伸60s，进行34个循环，72℃延伸10min。PCR体系见表1：
表1
使用TAE电泳缓冲液进行琼脂糖凝胶电泳，得到了大约900bp的片段(图1)，命名为OsJGL2。
将上述OsJGL2扩增产物用TIANGEN的试剂盒进行胶回收，然后将回收片段连入PMD18-T载体(TAKARA)。连接体系如表2：
表2
连接2个小时，转化E.coli DH5α的感受态细胞，涂板，用氨苄霉素筛选。挑选单克隆，提取质粒后用NcoI和BamHI双酶切鉴定，结果如图所示，均有大约1000bp的目的条带(图2)。送1、2号对应的菌液测序，测序结果均与GenBank上基因序列完全一致。
基因功能验证详细过程
表达原载体及来源，表达原载体构建可能用到的內切酶
克隆得到OsJGL2基因，将其构建到表达载体，具体步骤如下：将连接有OsJGL2基因的克隆载体pMD18-T和表达载体pCAMBIA1300+163(图3)都用BamHI和NcoI进行双酶切并分别回收纯化，然后用T4连接酶连接后转化E.coli DH5α，挑取单菌落扩大培养后抽提质粒，BamHI和NcoI双酶切鉴定，最终获得连接有目的基因的过量表达载体pCAMBIA1300+163+OsJGL2(图4)。利用热激法将构建的表达载体转化到农杆菌EHA105菌株中。
基因转化方法，基因转化物种
采用农杆菌介导法将构建的表达载体转化到水稻SR59中，获得过量表达OsJGL2基因的水稻转基因株系。该实验过程如下：以SR59成熟种子诱导而来的愈伤组织为受体，经过农杆菌浸染、共培养、2次抗性愈伤组织潮霉素连续筛选(每次2周)、抗性愈伤组织分化、生根、炼苗等步骤获得潮霉素抗性植株(图5)。
转基因植物分子分析
利用潮霉素特异引物，对潮霉素抗性再生植株进行PCR检测(图6)。检测出含潮霉素基因的阳性株系13株。引物如下：
hptF：5'TTTAGCGAGAGCCTGACCTATTGC 3'(SEQ ID NO.6)；
hptR：5'CGTCAACCAAGCTCTGATAGAGTTG 3'(SEQ ID NO.7)；
转基因植物功能表型(图7)
对野生型和T1代转OsJGL2基因水稻的农艺性状进行对比观察和统计分析。与野生型的株高相比，三个株系无显著性差异。与野生型的分蘖数相比，OE-1和OE-2株系均显著高于野生型，OE-3株系与野生型无显著性差异。与野生型的剑叶长相比，OE-1显著短于野生型，OE-2显著长于野生型，OE-3株系与野生型无显著性差异。与野生型的剑叶宽相比，OE-1和OE-2显著大于野生型，OE-3株系与野生型无显著性差异。与野生型的穗长相比，三个株系无显著性差异。与野生型的每穗粒数相比，OE-1和OE-2株系均显著低于野生型，OE-3株系无显著性差异。
与野生型的千粒重相比，三个株系均极显著增重，OE-1株系增重6.3％，OE-2株系增重13.8％，OE-3株系增重15.6％。与野生型的粒长相比，三个株系均极显著增长，OE-1株系增长8.4％，OE-2株系增长8.2％，OE-3株系增长7.0％。与野生型的粒宽相比，三个株系无显著性差异。与野生型的粒厚相比，三个株系无显著性差异。

Claims (4)

1.蛋白OsJGL2编码基因在制备与水稻粒长相关的表达载体中的应用。
2.蛋白OsJGL2在制备水稻粒长调控制剂中的应用。
3.一种与水稻粒长相关的蛋白OsJGL2的表达载体，其特征在于，所述表达载体中含有权利要求1所述的蛋白OsJGL2编码基因。
4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体序列如SEQ ID NO.1所示，命名为载体pCAMBIA1300+163+OsJGL2。
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