CN105579572B - 用于净化高密度粗细胞培养收获物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于净化具有高细胞密度的细胞培养液的方法。

Description

用于净化高密度粗细胞培养收获物的方法
本发明涉及细胞培养纯化领域。更具体地说，它涉及用于净化具有高细胞密度的粗细胞培养收获物的方法。
发明背景
在生产生物物质，如生物药品、疫苗和抗体的领域中的最新发展已经针对大规模生产产生了需要。需要稳固和高产方法以支持全球拥有足量的生物物质，以对抗各种疾病。
出于该原因，巨大的努力正在被投入优化用于生产生物物质的基于细胞的方法。在所述方法中，细胞以渐增的密度被培养，以获得更高的产物产量/体积。此类高细胞密度方法被披露于例如WO 2004099396、WO 2005095578或WO 2008006494中。将其内容通过引用结合在此。
WO 2008006494披露了用于在生物反应器中培养生产生物物质的细胞的方法，其中该细胞培养是经过分离***来循环的。所述分离***从具有比生物物质更低分子量的物质中分离出细胞和生物物质。这些细胞和生物物质在反应器中仍保留在一起，并且没有彼此分离。
WO 2005095578披露了用于在生物反应器中培养产生生物物质的细胞的方法，其中该细胞培养物经滤器模块来进行循环，导致具有比细胞培养物更低细胞密度并且包括生物物质的液体的流出物。在流出物中细胞和生物物质的浓度基本上比在生物反应器中的更低，因为在23天期间内灌注速率范围在1和13,7L/天之间。(即，处理体积比生物反应器的体积高20倍)。
所述优化的细胞培养方法依赖于在保持高生产力/细胞的情况下以高细胞密度(即，高于10x106个细胞/ml)培养细胞的能力。因此，它们提供了在单生物反应器中获得具有高浓度蛋白(即，抗体)的收获的溶液的方法。
以高密度培养细胞的方法倾向于积累大量的细胞碎片及其他杂质。纯化方法再往下必须将这些与细胞在一起的污染物丢弃，这是一个麻烦的操作。作为第一步骤，将固体物料如细胞和细胞碎片从细胞培养液中分离，该步骤称为净化。迄今使用的净化方法的实例包括离心、过滤(如微滤、深层过滤和通过绝对孔径膜过滤)和膨胀床层析。
更早时期已经描述了用于纯化生物物质如抗体的许多方法，例如，在范里斯(vanReis)等人，(生物技术与生物工程(Biotechnology and bioengineering)，1991，第38卷，第413-422页)中。所述参考文献描述了一种方法，该方法包括从发酵罐中回收细胞培养液并且通过切向流过滤进行细胞-蛋白分离的步骤。然而，所述方法仅在包括约0.5-4x106个细胞/mL的低密度细胞培养物的情况下进行。迄今没有披露也没有预期此类方法可以应用于包含高细胞密度的培养物。相反，可以从现有技术推断一个强有力的建议，即可以不将所述方法应用于包含高细胞密度的培养物上。例如，在涉及病毒生产领域的WO 2011/045381中，已经尝试直接净化具有高细胞密度的细胞培养物(参见WO 2011/045381的实例1)。在所述尝试过程中，由于滤器的快速堵塞，不能实现适当的净化。显然，处理的培养液的高细胞密度妨碍了纯化步骤并且使得切向流过滤(TFF)不适用于直接净化。仅在用曲通(Triton)(用于溶解细胞)随后用度米芬(DB)处理高细胞密度培养液后，该细胞培养液可以被进一步处理(通过净化)。在收获后，并不直接通过TFF处理粗细胞培养物。
基于这些结果，不会鼓励技术人员在净化滤器上直接(不用预处理)处理高细胞密度收获物，预期它会迅速阻塞。
当前正在使用并且被认为是处理高细胞密度培养物的当今技术水平的方法是例如在WO 2010/043700中或在西尔莫(Schirmer)等人(国际生物过程杂志(BioprocessInternational)，2010年1月，第32-39页)中所描述的。后者参考文献涉及一种方法，其中首先将收获物稀释，随后与Si-PEI小球混合，此后小球沉积并且将上清液通过深层过滤去除并过滤。
这种方法的缺点是，根据在收获物中的细胞浓度，首先将收获物稀释3-5倍，这意味着也将抗体滴度稀释3-5倍。其次，在该方法中大量使用的层析树脂是非常昂贵的并且不能重复使用。最后，从我们自己的经验与这项技术，我们已经看到回收是可变的。
由于细胞培养方法在扩大规模，并且细胞在以渐增的密度被培养，因此在工业中需要下游纯化方法，这些下游纯化方法与由其他人所描述的方法相比，使得能够处理高细胞密度悬浮液，优选地具有低成本、高可靠性以及增加的简易性。这尤其适用于重组蛋白和抗体生产领域。
发明概述
我们在此已经发现在没有初步稀释的情况下，可以将包含高细胞密度的粗细胞培养收获物连同分泌性蛋白在TFF装置上处理。尽管所述粗细胞培养收获物是非常浓稠的，并且包含高负荷的细胞碎片，但是它们被成功地净化并且没有观察到压力增加导致滤器的阻塞。
此外，根据本发明的方法比迄今使用的方法更快速并更廉价。不再需要昂贵的层析树脂和长时间的沉积步骤，并且该方法容易按比例扩大规模。
因此，本发明涉及用于净化粗细胞培养收获物的方法，该粗细胞培养收获物包括细胞连同分泌的所希望的蛋白，其中这些细胞在收获时处于至少15x106个细胞/ml的细胞密度，并且其中至少20％的所述细胞是有活力的，所述方法包括如下步骤：
a.在生物反应器中培养细胞到至少15x106个细胞/ml的细胞密度，以便获得包括所希望的分泌性蛋白的粗细胞培养收获物，
b.随后通过切向流过滤(TFF)处理在步骤a)中获得的基本上完整的粗细胞培养收获物，其中所述粗细胞培养收获物的处理体积是该生物反应器体积的小于两倍，在该生物反应器中已经产生粗细胞培养收获物，并且其中将这种所希望的蛋白从粗细胞培养液中分离；并且
c.回收在滤液中的这种所希望的蛋白。
在一个优选的实施例中，在没有预先稀释在步骤a)中获得的细胞培养液的情况下，使在步骤b)中的细胞培养液经受TFF。
在一些优选的实施例中，所述细胞在收获时处于至少50x106个细胞/ml的细胞密度。在其他优选的实施例中，所述细胞在收获时处于范围在至少50x106个细胞/ml和200x106个细胞/ml之间的细胞密度。
在其他优选的实施例中，这种所希望的蛋白是一种单克隆抗体。在另一个优选的实施例中，将在步骤b中回收的所希望的蛋白进一步纯化。
在其他优选的实施例中，用中空纤维滤器进行TFF。所述中空纤维滤器优选地包括范围在750Kda和0.65μm之间的孔径。
在其他优选的实施例中，在TFF装置中的中空纤维滤器包括范围在0.25和1mm之间的内腔直径。
附图简要说明
图1实验装置
发明详述
本发明涉及用于净化包含细胞连同分泌性蛋白的细胞培养液的方法，该细胞培养液包括高细胞密度。在本文的上下文中“粗细胞培养收获物”、“收获物”或“细胞培养液(cell broth)”意指用完整的细胞接种的细胞培养物，并且其进一步可以包括如下定义的培养基、连同分泌性蛋白。优选的，这些细胞是分泌蛋白的细胞。
“净化”意指从细胞培养液中分离固体材料如细胞和细胞碎片。根据本发明，分泌性蛋白是存在于细胞外的，并且因此将存在于细胞培养液中。在本发明中，“净化”意指从包含细胞的粗细胞培养收获物中分离分泌性蛋白。
在本发明的方法中，尤其当细胞密度极高的时候，来自生物反应器的起始材料被任选地稀释至优选的细胞密度。然而，根据本发明的所述粗细胞培养收获物的处理体积并没有超过生物反应器体积的两倍，在该生物反应器中已经产生该粗细胞培养收获物。出于本发明的目的，这样稀释的材料仍然由术语粗细胞培养收获物或细胞培养液所涵盖。优选地，在没有预先稀释粗细胞培养收获物的情况下，使粗细胞培养收获物或细胞培养液经受TFF。
此外，根据本发明，它是在步骤a)中获得的基本上完整粗细胞培养收获物或细胞培养液，其随后由TFF进行处理。“基本上完整的粗细胞培养收获物”意指至少70％的完整粗细胞培养收获物，优选地它意指至少80％的完整粗细胞培养收获物，更优选至少90％的完整粗细胞培养收获物并且甚至更优选至少95％的完整粗细胞培养收获物。
“分泌性蛋白”在此意指当其由细胞产生时，主要释放(主动地或被动地)到培养基中的蛋白。“所希望的”在此意指，蛋白是使用细胞有意生产的。
除非另有说明，在本申请中使用的“约”意指±10％。
根据本发明方法净化的粗细胞培养收获物或细胞培养液可以通过任何细胞培养方法来获得，该细胞培养方法适用于获得至少15x106个细胞/ml的哺乳动物细胞的细胞密度。在这方面适合的方法描述于例如WO 2005095578、WO 2004099396和WO 2008006494中。将其内容通过引用结合在此。根据本发明，通过培养哺乳动物细胞至高细胞密度来获得高细胞密度悬浮液。这种培养可以按(非限制)分批、补料分批或灌注模式进行。
在本发明的一个优选实施例中，所述粗细胞培养收获物中的细胞密度是至少约15x106个细胞/mL、例如至少约20x106个细胞/mL、例如至少约25x106个细胞/mL、例如至少约30x106个细胞/mL、例如至少约40x106个细胞/mL、例如至少约50x106个细胞/mL。
在本发明的另一个优选实施例中，所述粗细胞培养收获物中的细胞密度是例如，高达约150x106个细胞/mL、例如，高达约200x106个细胞/mL、例如，高达约250x106个细胞/mL、例如，高达约300x106个细胞/mL。
根据发明，净化的细胞培养液包括范围在10x106和300x106个细胞/mL之间，例如在约15x106和250x106个细胞/mL之间、例如在约30x106和200x106个细胞/mL之间、例如在约50x106和150x106个细胞/mL之间、例如在约70x106和130x106个细胞/mL之间、例如在约90x106和110x106个细胞/mL之间的细胞密度。
可以使用细胞计数器如Vi-CELLTM来测量细胞密度，该Vi-CELLTM使用了台盼蓝拒染法。其他适用的方法包括细胞计量术、细胞压积确定、或使用了电感带法的库尔特计数器。
此外，在本发明中，在净化之前细胞培养的活力保持高于20％。这意味着在培养物中总量细胞的至少20％在净化方法开始时是有活力的。在某些实施例中，在净化方法开始时，细胞培养物的活力是至少40％，在另外的实施例中是至少60％，在另外的实施例中是至少80％，在另外的实施例中是至少90％。活力可以使用技术人员可以使用的常规方法来测量，例如，台盼蓝拒染法、卡西细胞计数(Casy cell count)、等。
“培养基”在此意指细胞的胞外环境，该胞外环境包含营养素和其他支持细胞生长和生产的成分，但是还可包含废物和/或宿主细胞蛋白(HCP)和/或来自裂解细胞的材料。培养基的组成在细胞的培养历程期间会适时地有所不同，并且在净化阶段会耗尽一种或多种原始成分。
一旦蛋白质已经在细胞培养物中分泌，那么根据本发明，可以将所述蛋白质从高细胞密度悬浮液或粗细胞培养收获物中纯化。对所希望的蛋白进行这种纯化的第一步骤为净化粗细胞培养收获物。
净化
随后，将从之前培养步骤获得的粗细胞培养收获物净化，来去除沉淀杂质和细胞碎片。根据本发明，所述净化是用TFF装置进行的。所述TFF装置优选包括中空纤维(参见图1)。可替代地，TFF装置包括盒式滤器。在净化过程中，将分泌性蛋白用切向流过滤装置从粗细胞培养收获物中分离。分泌性蛋白典型地通过过滤装置切线过滤，并且在滤液中回收。切向流过滤是本发明的净化的稳固方法。
总的来说，所有类型的中空纤维滤器都可以用于本申请。在一个优选的实施例中，这些中空纤维是常用的来自WaterSep的Discover、Explorer、Investigator以及BioProducer滤器。也同样适用于本方法的其他滤器是来自仕必纯实验室(Spectrum Labs)的MidiKros、MiniKros、KrosFlo和CellFlo滤器。通用医疗(GE Healthcare)也以PS(聚砜)制作了各式各样的中空纤维滤器。用于中空纤维滤器的优选材料是聚醚砜(PES)、聚砜(PS)、改性的聚醚砜(m-PES)、混合的纤维素酯(ME)或陶瓷滤器。
根据本发明，这些滤器可以具有不同的孔径。根据本发明，这些中空纤维包括范围在250kDa和5μm之间，例如在约400kDa和4μm之间、例如在约500kDa和2.5μm之间、例如在约600kDa和1μm之间的孔径。在一个优选的实施例中，该孔径范围在750kDa和0.65μm之间。
在另一个优选的实施例中，该中空纤维滤器包括范围在0.1和6.0mm之间、例如在0.2和5mm之间、例如在0.2和3mm之间、例如在0.2和2mm之间的内腔直径。在一个优选的实施例中，该内腔直径范围在0.25和1mm之间。在一个甚至更优选的实施例中，该内腔直径约为0.5mm。
本发明的净化方法从细胞培养液去除至少70％、更可能至少80％、或甚至优选至少90％的全细胞和细胞碎片，而远离包含所希望的蛋白的悬液液。
在通过切向流过滤净化粗细胞培养收获物之后，回收所希望的蛋白。“回收”在此意指获得本质上不含细胞和细胞碎片的所希望的产物。根据本发明，在TFF装置的滤液中回收所希望的蛋白。细胞碎片以及其他杂质仍保留在滞留物中。
进一步纯化方法
为了进一步纯化获得自以上描述步骤的包括所希望蛋白的悬浮液，技术人员了解并可以在若干纯化步骤之间进行选择。它们包括，例如，过滤(如深层过滤、微滤、超滤、渗滤)、层析(如尺寸排阻层析、亲和层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水作用层析、固相金属亲和层析)、双水相萃取、沉淀或离心。舒卡(Shulka)等人，2007和凯利(Kelly)等人，2009提供了在本领域中常用的进一步纯化步骤的综述，特别是针对抗体纯化。
在免疫球蛋白作为所希望的蛋白的情况下：亲和层析、特别是蛋白A层析、以及阳离子交换层析是特别合适的分离方法。
在根据本发明的某些实施例中，可以将包含所希望蛋白的净化悬浮液通过超滤进行处理。超滤被用来浓缩包含所希望蛋白的悬浮液。可以将该悬浮液浓缩5至20倍。
在本发明的另一个实施例中，经过渗滤进行缓冲液交换。使用超滤器的渗滤、或缓冲液交换是一种用于去除并交换盐、糖以及类似物的方法。本领域技术人员已知缓冲液交换应该发生在哪种条件下并且哪种缓冲液适用于该步骤。
在本发明的另一个实施例中，以下步骤可以是阴离子交换层析步骤。在所述步骤过程中，蛋白质结合至带正电的材料上，例如膜、管筒或柱。随后的洗脱允许将蛋白与杂质分离并且保留宿主细胞DNA。在又另一个实施例中，可以将阴离子交换层析步骤用作一种流经***。
在某些实施例中，优选使用至少一种阴离子交换层析步骤。在阴离子交换层析步骤之后，这些蛋白可以是足够纯的。然而，在某些实施例中，进一步进行尺寸排阻层析步骤以增加该方法的稳固性。该步骤可以是在阴离子交换层析步骤之前或之后。
在本发明的任何具体实施例中，该阴离子交换产物可以渗滤到配制品缓冲液中并且进行无菌过滤。可替代地，另外的层析步骤(例如，阳离子交换)可以在具有改进杂质和/或病毒/朊病毒清除的稳固性的潜力的渗滤之前或之后添加。
无菌过滤步骤可以包含在该方法中，有助于消除生物负载。可以将产物通过0.22微米改性聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(例如密理博(Millipore)Millipak)过滤。
细胞培养***以及下游处理***的规模
本发明的这些方法是比例可调的。本发明中使用的细胞培养范围为从小规模培养(例如，1-10升流量)至中规模培养(例如，10-1000L流量)乃至大型商业规模的制备，如1000至10 000L生产流量。切向流过滤步骤规模随培养体积改变规模，而任选的和随后的步骤如阴离子交换层析随所希望蛋白的输入改变规模。因此，后者步骤的大小将基于生物反应器生产力估计量。
本发明使得从高密度粗细胞培养收获物(其可包含高浓度蛋白)中纯化蛋白变成可能。处理这些细胞悬浮液(其包含大量的细胞碎片和宿主细胞DNA)的可能性允许纯化大量蛋白质如抗体/体积的悬浮液。本发明的优点提供了用于处理具有高细胞密度的细胞培养批次的方法，这些细胞培养批次包含高浓度的所希望的蛋白，并且于此允许非常高的产量/处理体积。尽管本方法适用于大规模细胞培养，但是该方法也允许以较小规模培养细胞至较高细胞密度，并且仍然达到高产物产量，这些产物可以有效地被进一步处理。该方法提供了处理所希望蛋白的高度浓缩批次的可能性，该方法将对整个生物医药纯化产业具有很大的影响。
细胞
根据本发明的细胞可以是任何类型的细胞，优选哺乳动物细胞如CHO(中国仓鼠卵巢)细胞，杂交瘤，BHK(幼仑鼠肾)细胞，骨髓瘤细胞，人类细胞，例如HEK-293细胞，人类类淋巴母细胞，PER.C6细胞，小鼠细胞，例如NSO细胞，MDCK细胞，Vero细胞，羊水细胞，鸭细胞系，等。在一个优选的实施例中，在本发明的方法中的这些细胞是分泌蛋白的细胞。
在另一个优选的实施例中，在本发明的方法中的这些细胞是PER.C6细胞或其衍生物(参见美国专利5,994,128和美国专利7,291,484，将其内容通过引用结合在此)。PER.C6细胞由以ECACC号96022940保藏的细胞进行示例。
分泌性蛋白
可以由根据本发明细胞生产(例如，通过表达对其编码的重组基因)的分泌性蛋白是例如重组蛋白质，具体地而言为受体、酶、融合蛋白、血蛋白如来自凝血级联***的蛋白、多功能蛋白质例如像***、病毒或细菌蛋白(例如用于疫苗中的)；免疫球蛋白，例如像IgG或IgM、以及类似物。根据本发明的分泌性蛋白更优选地是免疫球蛋白或其部分并且是由细胞产生。在一个优选的实施例中，这种所希望的分泌性蛋白是单克隆抗体。优选地，可以将这些由细胞产生的蛋白用作药物制剂中的活性成分。
在以下实例中将进一步解释本发明。这些实例不以任何方式限制本发明。它们仅仅用以阐明本发明。
实例
实例1：
根据WO 2008006494中披露的方法，在无血清培养基中，在37℃下，在生物反应器中，将表达CR6261抗体的PER.C6细胞培养至约75x106个总细胞/ml的细胞密度。收获时细胞活力约为68％。
将2L的粗细胞培养收获物通过切向流过滤经过中空纤维以4000s-1剪切率进行过滤，直至入口压力开始急剧上升(相对应于在滞留物中约300x106个细胞/ml)。在TFF装置中使用的滤器是0.5μm孔径中空纤维滤器，该中空纤维滤器来自斯派实验室(SpectrumLaboratories)，具有0.5mm内腔直径和1050cm2表面积(cat#M1-M05E-360-F1N)。
在以下步骤中，开始渗滤。将滞留物用3个渗滤体积的1xPBS进行洗涤，并且然后进一步浓缩直至过滤由于高入口压力而不再可能进行。
在滞留物中最终的细胞浓度约为570x106个总细胞/ml。最终渗透量为3064g，稀释因子为1.6，并且实现了81％的产物回收率。这显示出，令人惊讶地，本发明方法适用于直接净化包含高密度产抗体细胞的细胞培养收获物。
实例2：
根据WO 2008006494中披露的方法，在无血清培养基中，在37℃下，在生物反应器中，将表达CR57抗体的PER.C6细胞培养至约82x106个总细胞/ml的细胞密度。收获时的细胞活力约为58％。
将1L的粗细胞培养收获物通过切向流过滤经过中空纤维以4000s-1剪切率进行过滤，直至入口压力开始急剧上升(相对应于在滞留物中约270x106个细胞/ml)。在TFF装置中使用的滤器是0.5μm孔径中空纤维滤器，该中空纤维滤器来自斯派实验室(SpectrumLaboratories)，具有0.5mm内腔直径和1050cm2表面积(cat#M1-M05E-360-F1N)。
在以下步骤中，开始渗滤。将滞留物用3个渗滤体积的1xPBS进行洗涤，并且然后进一步浓缩直至过滤由于高入口压力而不再可能进行。
在滞留物中最终的细胞浓度约为540x106个总细胞/ml。最终渗透量为1755g，因此稀释因子为1.7，并且实现了87％的产物回收率。这确认了，本发明方法适用于直接净化包含高密度产抗体细胞的细胞培养收获物。
实例3：
根据WO 2008006494中披露的方法，在无血清培养基中，在37℃下，在生物反应器中，将表达CR8020抗体的PER.C6细胞培养至约194x106个总细胞/ml的细胞密度。收获时的细胞活力约为85％。
将1L的粗细胞培养收获物通过切向流过滤经过中空纤维以4000s-1剪切率进行过滤，直至入口压力开始急剧上升(相对应于在滞留物中约300x106个细胞/ml)。在TFF装置中使用的滤器是0.5μm孔径中空纤维滤器，该中空纤维滤器来自斯派实验室(SpectrumLaboratories)，具有0.5mm内腔直径和1050cm2表面积(cat#M1-M05E-360-F1N)。
在以下步骤中，开始渗滤。将滞留物用3个渗滤体积的1xPBS进行洗涤，并且然后进一步浓缩直至过滤由于高入口压力而不再可能进行。
在滞留物中最终的细胞浓度约为610x106个总细胞/ml。最终渗透量为1780g，因此稀释因子为1.8，并且实现了97％的产物回收率。这显示出，令人惊讶地，甚至在约200x106个总细胞/ml的高细胞密度下，本发明方法仍适用于直接净化包含产抗体细胞的细胞培养收获物。
参考文献
卡门(Kamen)和亨利(Henry)，2004，发展和优化腺病毒生产方法(Developmentand optimization of an adenovirus production process)，基因医学杂志(J GeneMed)2004；6:S184-S192。
凯利(Kelley)等人，抗体的处理规模纯化(Process Scale Purification ofAntibodies)，由乌韦·戈特沙尔克(Uwe Gottschalk)编辑，版权2009，约翰威立国际出版公司(John Wiley&Sons,Inc.)，第一章：单克隆抗体的下游处理：目前的做法和未来的机会(Downstream processing of monoclonal antibodies:current practices andfuture opportunities)。
默恩韦泽(Morenweiser)等人，病毒载体和疫苗的下游处理(Downstreamprocessing of viral vectors and vaccines)，基因疗法(Gene Therapy)(2005)12,S103-S110。
西尔莫(Schirmer)B等人，通过提高细胞沉积初步净化非常高密度细胞培养收获物(Primary Clarification of Very High-Density Cell Culture Harvests ByEnhanced Cell Settling)，国际生物过程杂志(Bioprocess International)，2010年1月，第32-39页。
舒卡(Shulka)等人，单克隆抗体的下游处理-平台方法的应用(Downstreamprocessing of monoclonal antibodies-Application of platform approaches)，层析法期刊B(Journal of Chromatography B)，848(2007)28-39。
范赖斯(van Reis)R，伦纳德(Leonard)LC，舒(Hsu)CC，彼尔德(Builder)SE，通过切向流过滤从哺乳动物细胞培养中工业规模获得蛋白(Industrial Scale Harvest ofProteins from Mammalian Cell Culture by Tangential Flow Filtration)，生物技术与生物工程(Biotechnology and bioengineering)，第38卷，第413-422页(1991)。

Claims (6)

1.一种用于净化粗细胞培养收获物的方法，该粗细胞培养收获物包括细胞连同分泌的所希望的蛋白，其中这些细胞在收获时处于至少15x106个细胞/ml的细胞密度，并且其中至少20％的所述细胞是有活力的，所述方法包括如下步骤：
a.在生物反应器中培养细胞到至少15x106个细胞/ml的细胞密度，以便获得包括所希望的分泌性蛋白的粗细胞培养收获物，
b.随后通过切向流过滤(TFF)处理在步骤a)中获得的基本上完整的粗细胞培养收获物，其中所述粗细胞培养收获物的处理体积是该生物反应器体积的小于两倍，在该生物反应器中已经产生粗细胞培养收获物，并且其中将这种所希望的蛋白从粗细胞培养液中分离；并且
c.回收在滤液中的这种所希望的蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中这些细胞在收获时处于至少50x106个细胞/ml的细胞密度。
3.根据权利要求1所述的方法，其中这些细胞在收获时处于范围在至少50x106个细胞/ml和200x106个细胞/ml之间的细胞密度。
4.根据权利要求1或3中任一项所述的方法，其中这种所希望的蛋白是单克隆抗体。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中将在步骤c中回收的这种所希望的蛋白进一步纯化。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述TFF是用中空纤维滤器进行的。
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