CN114829371A - 使用透析过滤缓冲液强化的病毒过滤 - Google Patents

使用透析过滤缓冲液强化的病毒过滤 Download PDF

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Abstract

纯化包含感兴趣的生物分子和杂质的样品的方法和***，包括在生物反应器中表达所述感兴趣的生物分子，以形成包含所述感兴趣的生物分子和杂质的产物样品；将所述产品样品进行过滤以形成澄清的产物样品；将所述澄清的产物样品进行亲和层析法以去除杂质；随后将所述产物样品进行透析过滤，然后进行病毒过滤和任选的浓缩。透析过滤步骤中(和因此在病毒过滤步骤中)使用的缓冲液是产物最终配方所需的缓冲液。

Description

使用透析过滤缓冲液强化的病毒过滤
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年12月12日提交的美国临时申请号62/947,082和于2020年7月8日提交的美国临时申请号63/049,293的优先权。各申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及用于纯化生物分子包括治疗抗体和含Fc的蛋白质的高效工艺和***。
背景技术
制造生物分子如蛋白质或者病毒尤其是重组蛋白质的一般方法通常涉及两个主要步骤：(1)蛋白质在宿主细胞中表达，然后(2)蛋白质的纯化。第一个步骤涉及将所需宿主细胞于生物反应器中生长以引导蛋白质的表达。为此目的使用的细胞系的一些例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、骨髓瘤(NSO)细菌细胞如大肠杆菌和昆虫细胞。当蛋白质以所需水平表达，蛋白质就会从宿主细胞中取出收获。悬浮颗粒如细胞、细胞碎片、脂质和其他不溶物质通常会在下游纯化方法从含有蛋白质的液体中移除，得到澄清的含有感兴趣蛋白质和其他可溶性杂质的溶液。
第二个步骤涉及收获的蛋白质的纯化以移除方法过程中固有的杂质。收获物和下游操作的主要目标是将产物(例如表达的蛋白质)与可溶/不可溶杂质分开。杂质的例子包括宿主细胞蛋白质(HCP，不是所需或靶蛋白质的蛋白质)、核酸、内毒素、病毒、蛋白质变体、蛋白质聚集物和细胞培养基成分/添加剂。这种纯化特别涉及几种层析法步骤，其包括在固体基质例如多孔琼脂、聚合物或玻璃或膜基吸附物上的亲和层析法、结合/洗脱模式阳离子交换层析法、流式阴离子交换层析法、疏水性相互作用等中的一或多种。
一个方法模板的例子包括通过离心进行初步澄清，通过过滤进行二次澄清，和一系列层析方法，其涉及结合/洗脱模式的蛋白质A亲和性，然后是结合/洗脱模式的阳离子交换，然后是流式阴离子交换。蛋白质A柱通过亲和机制捕获感兴趣的蛋白质或靶蛋白质，而大块杂质通过柱被丢弃。之后，蛋白质通过从柱中洗脱而回收。由于大部分感兴趣的蛋白质的等电点(PI)在碱性(8-9)范围，因此在通常加工条件(pH低于蛋白质PI)是带正电荷的，它们被结合在第二柱的阳离子交换树脂上。其他带正电荷的杂质也被结合在此树脂上。然后感兴趣的蛋白质在杂质保持与树脂结合的情况下(pH,盐浓度)从这个柱中洗脱以回收。阴离子交换柱是典型地以流式模式操作，这样任何带负电荷的杂质结合树脂，而带正电荷的感兴趣的蛋白质都在流经流体中回收。接下来是下游纯化方法，可以进行病毒过滤，然后是超滤/透析过滤以调节缓冲***和在最终填充单元操作之前浓缩产物以完成制造方法。此方法产生高度纯化和浓缩的蛋白质溶液，这对用于人类且必须通过卫生当局如食品药品监督管理局(FDA)批准使用的治疗蛋白质来说可能尤其重要。
图1说明了一个传统方法。此方法包括细胞收获步骤，其涉及使用离心法以移除细胞培养液中的细胞和细胞碎片，然后使用深层过滤。细胞收获步骤之后是捕获步骤，如蛋白质A亲和纯化步骤，然后是病毒灭活。病毒灭活后通常有一或多个层析法步骤，也被称作精制(polishing)步骤，其通常包括阳离子交换层析法和/或阴离子交换层析法和/或疏水性相互作用层析法和/或混合模式层析法和/或羟磷灰石层析法中的一或多种。所述精制步骤后是病毒过滤和超滤/透析过滤，以完成这个方法。
捕获步骤可使用蛋白质A树脂，如
Figure BDA0003687916350000022
A树脂，其是刚性的蛋白质A亲和层析法树脂，或者
Figure BDA0003687916350000021
Ultra Plus介质，两种都可从EMD Millipore公司购买，特别是含有Fc区域的抗体。其它以结合和洗脱模式操作的树脂也可适用于捕获。结合和洗脱层析法包括(1)产物上上样至靶结合量，(2)产物从柱中洗脱和(3)清洁以准备树脂再次使用。
在病毒过滤中的一个问题是在以过滤量L/m2过滤料流的过程中，滤器阻力(psi/LMH)的增加(或者浸透性LMH/psi的损失，其中LMH是升/m2/h)。结合这些术语，人们可以将恒定进料流量操作期间的压力上升和恒压过滤期间的流量下降进行比较。这些改变通常被描述为过滤器堵塞并且可以大大限制L/m2过滤量并因此增加加工成本$/L。一些可以造成堵塞的机制包括高分子量(HMW)杂质的保留或治疗蛋白质产物聚集物的保留。随着聚集物大小增加且接近用于过滤病毒的膜要保留的病毒的大小时，它们会沉积在膜的表面和孔中。这种沉积可能和通透性损失有关。蛋白质也可以被滤器部分保留，增加其在滤器中的内在浓度、粘度和渗透压，产生堵塞效应。
基于大小的膜过滤在大多生物药剂学分子制造过程中提供重要的病毒去除保障。卫生当局期待在哺乳动物病毒中生产的每个治疗蛋白质都使用病毒过滤步骤以管理病毒污染的风险，从而授予销售许可。很多研究已经测试了产物聚集物的形成机制，这些聚集物如何污染病毒移除滤器，以及如何通过吸附性预滤器移除聚集物以保持滤器流量。在一定通量后，预滤器可能会被聚集物或HMW饱和，并且这些物质开始穿过然后开始堵塞滤器。高产物浓度与强化加工一体的新模式(如双特异性抗体)让过早堵塞滤器的情况更加普遍，即使使用吸附性预滤器。
生物治疗性制剂寻找促进稳定性和避免在小瓶中聚集以延长保质期的透析过滤缓冲溶液条件。使用小量分析技术将蛋白质特性和聚集联系起来，生物治疗性制剂化学家快速筛选多种缓冲***和赋形剂浓度以开发合适的透析过滤溶液。这些目的反映了寻找病毒滤器进料溶液条件以避免病毒滤器堵塞的目标。因此，可以考虑将病毒过滤步骤的位置从UF/DF之前(即上游)移到UF/DF之后(即下游)以利用DF缓冲液的稳定作用和堵塞减少。这可使人们以比之前更高的通量或更高的浓度运行以便以更有效和更具成本效益的方式制造生物分子如单体克隆抗体(Mabs)。
发明内容
现有技术的问题已被本文公开的实施方案克服，其提供了一种制造生物分子的方法和***。在一些实施方案中，在生物分子在透析过滤缓冲液中的情况下进行病毒过滤。优选地，所述透析过滤缓冲液和产物最终配方中使用的缓冲液相同，以确保产物稳定性和长保质期。可以实现减少的病毒过滤面积(virus filtration aera)。
本文公开的实施方案包括纯化和分离来自细胞培养液的感兴趣的生物分子。在某些实施方案中，公开的方法和***包括浓缩然后进行下游纯化过程。在某些实施方案中，所述下游纯化过程可包括通过一或多个层析柱的依次纯化。
在某些实施方案中，公开了一种纯化包含感兴趣的生物分子和杂质的样品的方法，所述方法包括在生物反应器中表达所述感兴趣的生物分子以形成包含所述感兴趣的生物分子和杂质的产物样品；将所述产物样品进行过滤以澄清所述产物样品；和将浓缩的产物样品进行亲和层析法以从中去除杂质。在某些实施方案中，来自生物反应器的产物样品(例如收获的细胞培养物)在进行亲和层析法前进行一或多个澄清步骤。所述一或多个澄清步骤可以包括离心、切向流过滤、深层过滤和无菌过滤中的一或多种。
在某些实施方案中，所述亲和层析法使用蛋白质A亲和配体。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括将浓缩的产物样品进行病毒灭活步骤。
在某些实施方案中，所述方法包括将浓缩的产物样品进行精制步骤。在一些实施方案中，所述精制步骤包括阴离子交换层析法、阳离子交换层析法和疏水相互作用层析法中的一或多种。在一些实施方案中，可以进行病毒灭活和精制二者。
在某些实施方案中，在病毒过滤之前进行透析过滤步骤。在一些实施方案中，所述透析过滤步骤直接在病毒过滤的上游进行，中间没有单元操作。在不同的实施方案中，选择所述透析过滤步骤中使用的一或多个缓冲液以匹配产物最终配方所需的一或多个缓冲液。因此，在随后的病毒过滤步骤中使用的缓冲液与最终配方所需的缓冲液相同。
在某些实施方案中，所述生物分子是选自重组抗体、重组单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体和抗体片段的抗体。在一些实施方案中，所述生物分子是蛋白质。在其他实施方案中，所述生物分子是病毒，如用于基因治疗的相关腺病毒(AAV)载体。在这种情况下，可以使用病毒过滤来滤过AAV产物，同时留下较大的外来或内源病毒污染物。
在某些实施方案中，公开了一种用于纯化感兴趣的生物分子的***，所述***包括生物反应器；滤器，如生物反应器下游的用于澄清的深层滤器；在滤器下游串联配置的至少两个亲和层析柱；在所述至少两个亲和层析柱下游的病毒灭活步骤或者病毒过滤去除步骤；位于所述病毒灭活步骤或病毒过滤去除步骤下游的一或多个阴离子交换、阳离子交换或疏水性相互作用交换层析柱，用于纯化/精制；位于所述一或多个纯化/精制单元下游的一或多个超滤器，配置为以浓缩模式或透析过滤模式运行(例如，对于批量TFF操作，这可以是以不同方式依次运行的相同滤器，对于单程TFF，这可以是以不同方式运行的多个连续的(sequential)滤器)；在所述一或多个超滤器下游的病毒滤器；以及任选包括在所述病毒滤器下游的超滤单元，用于浓缩所述感兴趣的生物分子。
在一些实施方案中，所述至少两个亲和层析柱各自包括蛋白质A亲和配体。在一些实施方案中，正好有两个亲和层析柱。
附图简述
图1是工业中使用的传统纯化方法的图示；和
图2是依照某些实施方案的纯化***的图示。
发明详述
在以下描述中，术语"选择的生物分子"、"靶生物分子"或"分子"、"靶蛋白质"、"感兴趣的生物分子或蛋白质"或类似术语均指生物分子制造方法的产物。
术语"污染物"、"杂质"和"碎片"在本文可互换使用，指任何外来或不良分子，包括生物学大分子如DNA、RNA、一或多种宿主细胞蛋白质、内毒素、脂质、蛋白质聚集物和一或多种添加剂，它们可能存在于含有正在与一或多种外来或不良分子分离的感兴趣的产物的样品中。此外，这样的污染物可能包括在分离过程之前可能发生的步骤中使用的任何试剂。
如本文所用，术语"样品"是指含有待纯化的靶分子如靶蛋白质的任何组合物或混合物。样品可以来自生物学或其他来源。生物学来源包括真核和原核来源，如植物和动物细胞、组织和器官。在一些实施方案中，样品包括含有待纯化的感兴趣的蛋白质的生物药物制品。在一个特定的实施方案中，所述样品是含有待纯化的感兴趣的蛋白质的细胞培养物料。所述样品还可能包括与靶蛋白质或感兴趣的蛋白质混合的稀释剂、缓冲剂、洗涤剂和污染物质、碎片等。所述样品可以是"部分纯化的"(即已经过一或多个纯化步骤，如过滤步骤)或可以直接从生产所述靶分子的宿主细胞或生物体获得(例如，所述样品可以包括收获的细胞培养液)。
如本文所用，短语"基本上由……组成"将权利要求的范围限制为特定的材料或步骤以及那些不实质影响请求保护的主题的基本和新颖性特征的材料或步骤。该术语允许包括不实质性影响所考虑的装置、***或方法的基本和新颖性特征的要素或步骤。因此，表述"基本上由……组成"或"基本上组成为"意味着所提及的实施方案、特征、成分、步骤等必须存在，而其他实施方案、特征、成分、步骤等可以存在，条件是其存在不实质性影响所提及的实施方案、特征、成分、步骤等的性能、特性或效果。允许对样品或产物没有实质性影响的操作或步骤的存在。例如，一种基本上由纯化包含感兴趣的生物分子和杂质的样品组成的方法，基本上组成为：在生物反应器中表达所述感兴趣的生物分子以形成包含所述感兴趣的生物分子和杂质的产物样品；将所述产物样品进行过滤以形成澄清的产物样品；将所述浓缩的产物样品进行亲和层析法以去除所述浓缩的产物样品中的杂质；将所述产物样品进行病毒灭活；将所述产物样品进行纯化/精制，例如用离子交换层析法；通过透析过滤将所述产物样品进行缓冲液交换，然后将所述样品进行病毒过滤，除了在生物反应器和病毒过滤操作之间、特别是在透析过滤和病毒过滤之间进行的其他步骤或单元操作，这将实质改变产物样品的组成。
在某些实施方案中，作为方法的起始材料的样品可能会根据其生长的细胞系以及生长和收获的条件而变化。例如，在大多数CHO细胞方法中，细胞向细胞壁外培养基中表达分子。人们在收获过程中尽量不破坏细胞以减少混合物中的杂质量。然而，一些细胞在生长和收获过程中可能由于剪切力或其他处理条件而破裂或死亡和裂解，使其内容物溢出到混合物中。在细菌细胞***中，生物分子通常与细胞壁保持在一起或者它实际上可能是细胞壁的一部分(蛋白质A)。在这些***中，细胞壁需要被破坏或裂解以回收感兴趣的生物分子。
待纯化的靶分子可以是任何生物分子，优选是蛋白质，特别是在任何宿主细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、荷兰Crucell公司提供的
Figure BDA0003687916350000041
细胞系、骨髓瘤细胞如NSO细胞、其他动物细胞如小鼠细胞、昆虫细胞，或微生物细胞如大肠杆菌或酵母中生产的重组蛋白质。此外，混合物可以是来自于被改造成产生含有感兴趣的生物分子的转基因液体的动物的液体如乳或血液。最佳的靶蛋白质是抗体、免疫粘附素和其他抗体样分子，如包括CH2/CH3区域的融合蛋白。例如，这种产品和方法可用于纯化来自在表达RhuMAb的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生长的从条件化的收获的细胞培养液(HCCF))的重组人源化单克隆抗体如RhuMAb。
在某些实施方案中，在下游纯化过程中，一系列具有所需化学功能性的纯化介质被用来实现可溶杂质的去除，而产物保留在溶液中且流过纯化介质，产生含有产物的纯化流。合适的纯化介质形式包括衍生膜、功能化层析介质或任何其他多孔材料，具有所需化学功能性以和各种杂质相互作用，从而使介质能够通过静电、疏水或亲和相互作用捕获杂质。鉴于杂质的性质复杂多样，可以将具有不同化学功能性的多种纯化介质串联设置以去除多种具有不同化学性质的杂质。
在某些实施方案中，公开了一种从样品中纯化靶分子的方法，其中所述方法包括：(a)在生物反应器中表达蛋白质以形成蛋白质样品；(b)将蛋白质样品进行过滤如深层过滤；(c)将得到的蛋白质样品进行蛋白质A亲和层析法，其采用一或多个亲和层析单元。
还公开了一种从样品中纯化靶分子的***，包括生物反应器；滤器单元，如深层过滤单元；一或多个亲和层析柱，如与所述过滤单元流体连通的一或多个蛋白质A亲和层析柱；任选存在的位于所述一或多个亲和层析柱下游的一或多个病毒灭活单元；任选存在的在所述亲和层析柱下游的精制阶段，其可包括阴离子交换层析柱、阳离子交换层析柱和疏水相互作用层析柱中的一或多种；透析过滤单元；病毒过滤单元；以及在所述病毒过滤单元下游的超滤单元。
在一些实施方案中，所述***中的不同设备之间有连接线。这些设备线性连接，由此***中的每个设备与***中所述设备之前和之后的设备流体连通。
在一些实施方案中，根据本发明的***中使用的生物反应器是一次性的或次抛的生物反应器。在一些实施方案中，所述***被密封在无菌环境中。
在一些实施方案中，起始样品是细胞培养物。这种样品可以在生物反应器中提供。在某些实施方案中，所述生物反应器是灌注式生物反应器。
在一些实施方案中，捕获步骤可包括结合和洗脱层析装置，其包括至少两个分离单元，每个单元包括相同的层析介质，例如蛋白质A亲和介质。在一个特定的实施方案中，蛋白质A介质包括蛋白质A配体偶联刚性亲水聚乙烯醚聚合物基质。在其他实施方案中，蛋白质A配体可以与琼脂糖或可控孔隙玻璃偶联。蛋白质A配体可以基于来自金黄色葡萄球菌的蛋白质A的天然结构域或者是天然结构域的变体或片段。在一个特定的实施方案中，蛋白质A配体来自金黄色葡萄球菌蛋白质A的C结构域。分离单元被串联连接起来以彼此流体连通，由此液体可以从一个分离单元流向下一个。
透析过滤可用于缓冲液交换、脱盐和/或样品浓缩，例如从含有感兴趣的生物分子的溶液中去除、替换或降低盐或溶剂的浓度。在某些实施方案中，样品可以在超滤膜上循环，并返回到回流容器，在那里加入新鲜的缓冲液，同时去除渗透液。
在一些实施方案中，如图2所示，在病毒过滤的上游，优选其直接上游，含有靶分子的样品进行透析过滤，这通常采用切向流过滤(TFF)模式的超滤膜。在切向流过滤(TFF)的情况下，液体沿着过滤介质的表面被切向泵送，施加的压力迫使一部分液体通过过滤介质到达滤液一侧。透析过滤导致用所需的缓冲液取代含有靶分子的液体，并允许适当调节或调整溶液条件，包括pH和电导率。超滤器可以以浓缩模式或透析过滤模式使用。对于批量TFF操作，这些可以是以不同方式依次运行的相同滤器。对于单程TFF，这些可以是以不同方式运行的连续的(sequential)滤器。
适合用于透析过滤的超滤膜包括再生纤维素和聚醚砜基膜，如MilliporeSigma公司出售的ULTRACEL和BIOMAX膜。
优选地，使用连续或恒定体积透析过滤，其中以与产生滤液相同的速度添加缓冲液。
选择用于透析过滤步骤的一或多种缓冲液优选是产物例如药物产物的最终配方所需的缓冲液。这样，随后的病毒过滤步骤用最终配方缓冲液进行。本领域技术人员会知道哪些缓冲液适合于正在生产的特定产物。例如，对于I.V.注射用药物ERBITUX(西妥昔单抗)，合适的缓冲液是10mM一水柠檬酸。对于REOPRO(阿昔单抗)，合适的缓冲液是70mM磷酸钠。
在最终配方缓冲液中进行病毒过滤后，可根据需要对产物进行浓缩如通过超滤。

Claims (17)

1.一种纯化包括感兴趣的生物分子和杂质的样品的方法，包括在生物反应器中表达所述感兴趣的生物分子，以形成包含所述感兴趣的生物分子和杂质的产物样品；将所述产物样品进行过滤，以形成产物样品；将所述产物样品进行亲和层析，以从所述产物样品中去除杂质，以及随后在病毒过滤之前将所述产物样品进行透析过滤。
2.权利要求1的方法，其中所述亲和层析包括蛋白质A亲和配体。
3.权利要求1的方法，进一步包括在所述透析过滤的上游使所述浓缩的产物样品进行病毒灭活步骤。
4.权利要求3的方法，进一步包括在所述病毒灭活步骤的下游和在所述透析过滤的上游使所述c产物样品进行精制步骤。
5.权利要求4的方法，其中所述精制步骤包括阴离子交换层析法、阳离子交换层析法和疏水相互作用层析法中的一或多种。
6.权利要求1的方法，其中所述生物分子是抗体，选自重组抗体、重组单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体和抗体片段。
7.权利要求1的方法，其中所述生物分子是蛋白质。
8.权利要求1的方法，其中所述生物分子是病毒。
9.权利要求1的方法，其中所述透析过滤步骤包括透析过滤缓冲液，并且其中所述病毒过滤包括病毒过滤缓冲液具有与所述透析过滤缓冲液基本相同的组成的病毒过滤。
10.一种纯化感兴趣的生物分子的***，包括：
a.生物反应器；
b.在所述生物反应器下游的过滤单元，用于澄清从所述生物反应器排出的产物样品；
c.在所述过滤单元下游串联配置的至少两个亲和层析柱，用于接收来自所述过滤单元的澄清的产物流；
d.位于所述至少两个亲和层析柱下游的病毒灭活滤器；
e.位于所述病毒灭活滤器下游的一或多个阴离子交换、阳离子交换或者疏水相互作用交换层析柱；
f.位于所述一个或多个阴离子交换、阳离子交换或者疏水相互作用交换层析柱下游的透析过滤单元；和
g.位于所述透析过滤单元下游的病毒过滤单元。
11.权利要求10的***，其中所述至少两个亲和层析柱各自包括蛋白质A亲和配体。
12.权利要求10的***，配置为以批量模式操作。
13.权利要求10的***，配置为以连续模式操作。
14.一种纯化感兴趣的生物分子的***，包括：
a.生物反应器；
b.在所述生物反应器下游的过滤单元，用于澄清从所述生物反应器排出的产物样品；
c.在所述过滤单元下游的串联配置的至少两个亲和层析膜单元，用于接收来自所述过滤单元的澄清的产物流；
d.位于所述至少两个亲和层析膜单元下游的病毒灭活滤器；
e.位于所述病毒灭活滤器下游的一或多个阴离子交换、阳离子交换或者疏水相互作用交换层析膜单元；
f.位于所述一或多个阴离子交换、阳离子交换或者疏水相互作用交换层析膜单元下游的透析过滤单元；和
g.位于所述透析过滤单元下游的病毒过滤单元。
15.权利要求14的***，其中所述至少两个亲和层析单元各自包括蛋白质A亲和配体。
16.权利要求14的***，配置为以批量模式操作。
17.权利要求14的***，配置为以连续模式操作。
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