CN105567696B - 一种培育抗大豆花叶病毒转基因植物的方法 - Google Patents

一种培育抗大豆花叶病毒转基因植物的方法 Download PDF

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Abstract

一种培育抗大豆花叶病毒转基因植物的方法，属植物生物技术领域。本发明提供的方法包括SEQ‑1所示的RNA片段或互补于该片段的序列。所述RNA片段可以干扰大豆花叶病毒的复制和运动，从而抑制大豆花叶病毒症状的发展。本发明还提供了一种培育抗大豆花叶病毒转基因植物的方法，包括如下步骤：在目标植物中表达所述RNA分子，获得对大豆花叶病毒抗性显著提高的转基因植物。本发明对于培育广谱抗大豆花叶病毒植物具有重要的应用价值。

Description

一种培育抗大豆花叶病毒转基因植物的方法
技术领域
本发明属植物生物技术领域，具体地，涉及一种培育抗大豆花叶病毒转基因植物的方法。
背景技术
大豆花叶病毒病(soybean mosaic virus, SMV)是由大豆花叶病毒引起的一类世界性大豆病害，也是我国各大豆主产区最重要的病害之一。SMV一般可造成大豆平均减产10-30%，严重年份和地区甚至造成大面积绝产。SMV还常常造成籽粒斑驳，严重影响大豆籽粒的外观品质和商品价值。在分类学上，SMV属马铃薯Y病毒科 (Potyviridae) 马铃薯Y病毒属 (Potyvirus)，主要通过受侵染的种子，蚜虫和机械接种方式传播。随着全球范围内大豆种质资源交流，新型病毒株系的出现和致病力强弱的变化，我国大豆抗SMV育种工作面临的形势也更加严重。由于化学防治困难且易造成环境安全等问题，生产上对大豆花叶病毒的防治主要依赖于抗SMV大豆品种的培育。研究表明，由于SMV 存在复杂的株系分化，大豆对SMV 的抗性又具有株系专化性，因此，寄主的抗性易随着病毒株系的变异而丧失，培育广谱、抗性持久的抗病品种也成为防治大豆花叶病毒病的根本途径。
RNA沉默（RNA interference，RNAi）是植物抵抗外来核酸（病毒、转座子等）入侵以保持自身基因组完整性的一种防御机制。病毒入侵寄主细胞后，其双链RNA（double-strandRNA, dsRNA）被植物DCL (Dicer-like)核酸酶加工为vsiRNA (virus short interferingRNA)，随后vsiRNA 与AGO 蛋白结合，降解与vsiRNAs 互补配对的长链病毒RNA，从而阻止病毒的进一步侵染。许多研究表明，在植物中表达部分病毒基因组序列片段，产生的dsRNA可以有效抑制病毒的侵染。在大豆抗SMV研究方面，Wang等将携带SMV 3’-UTR的外壳蛋白基因CP导入大豆，其中2个转基因株系对SMV抗性水平较受体品种显著提高。Furutani 等将SMV- CP基因导入大豆，接种鉴定结果表明，转基因大豆植株对SMV侵染具有较高的抗性水平。分析表明，在转基因大豆的整个发育阶段，SMV-CP序列特异小RNA 只出现在真叶阶段，在后续生长阶段则没有表达。Zhang等和 Kim等将SMV-CP基因序列反向重复片段（invertedrepeat，IR）导入大豆，接种鉴定结果表明，转基因大豆能够有效抵御SMV的侵染，其抗SMV水平显著高于受体品种。最近，Gao等将参与转录后基因沉默（post-transcriptional genesilencing，PTGS)的负调控因子SMV HC-Pro基因IR片段导入大豆，接种鉴定表明，转基因大豆对SMV抗性显著提高。可见，利用宿主介导SMV编码基因RNAi沉默是提高大豆抗SMV的有效手段，更为重要的是，利用RNAi干扰技术为同时抗多种病毒及病毒不同生理小种提供了一条更为有效的技术途径。但目前已有的研究主要是通过RNAi介导SMV-CP或SMV-HC-Pro基因沉默提高大豆抗SMV水平，而对其他参与SMV侵染、复制、运动等过程关键基因RNAi沉默介导的SMV抗性研究则尚未见到相关报道。
与Potyvirus属其他病毒成员类似，SMV基因组为单链正义RNA，其基因组共编码11个不同功能的成熟蛋白。P3蛋白是由SMV基因组编码的一个关键蛋白。研究表明，P3蛋白不仅在病毒复制和运动过程中发挥着重要的作用，同时与感染寄主症状表型密切相关，并在一定程度上决定了病毒侵染的寄主范围。最近研究表明，P3蛋白是携带Rsv1抗性位点大豆基因型的无毒决定因子。携带Rsv4抗性位点大豆基因型的无毒决定因子也位于P3蛋白序列内部，并在SMV致病中发挥着重要的作用。研究表明，Rsv1编码蛋白可以识别P3蛋白，并诱发大豆产生Rsv1 基因介导的超敏感反应（hypersensitive response，HR）。尽管目前尚没有直接证据表明P3蛋白与植物非宿主抗性机制有关，但也提示P3蛋白在决定大豆宿主范围中发挥着重要的作用，并与SMV致病性有关。因此，抑制SMV-P3基因的转录和翻译可以干扰或影响SMV的致病性，并在一定程度上影响SMV的宿主范围。基于上述理解，本研究基于宿主RNAi介导SMV-P3基因沉默干扰SMV的复制和运动，获得了对SMV抗性显著提高的转基因大豆。在此研究基础上，提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育抗大豆花叶病毒转基因植物的方法。
本发明提供的RNA片段如SEQ-1所示，可以为双链RNA片段也可以为单
链RNA片段。所述RNA片段可以干扰大豆花叶病毒的复制和运动，从而抑制大豆花叶病毒症状的发展。
本发明提供的双链DNA片段如SEQ-2所示。所述DNA片段可以通过所述RNA片段反转录获得cDNA片段，或是通过人工合成获得。
本发明还提供一种含有特异DNA片段如SEQ-3所示的质粒。所述特异性DNA片段包括DNA片段1，DNA片段2，以及位于所述DNA片段1和DNA片段2之间的间隔序列。所述DNA片段1和DNA片段2反向互补。所述DNA1片段1如SEQ-2所示。
所述特异性DNA片段从上游至下游可依次包括如下元件：启动子，所述DNA片段1，所述间隔片段，所述DNA片段2和终止子。所述启动子可为组成型，叶片表达特异型或病毒诱导型启动子，所述叶片表达特异型启动子优选为菜豆叶片特异启动子RBSC2。
含有上述质粒的重组菌或转基因细胞系也属于本发明保护的范围。
本发明还保护所述RNA片段，所述双链DNA片段，或以上任一所述质粒可用于在培育抗大豆花叶病毒转基因植物中的应用。
本发明还提供一种培育抗大豆花叶病毒转基因植物的方法，包括如下步骤：在目标植物中表达所述RNA分子，获得对大豆花叶病毒抗性显著提高的转基因植物。所述“在目标植物中表达所述RNA分子”的实现方式具体如下：将以上所述质粒导入目标植物。所述目标植物和转基因植物为双子叶植物，所述双子叶植物为大豆，更具体可为栽培大豆。所述质粒可通过农杆菌介导法、基因枪法、花粉管介导法等导入目标植物。
本发明还保护所述RNA片段，所述双链DNA片段，或以上任一所述质粒在制备大豆花叶病毒抑制剂中的应用。
本发明还保护一种大豆花叶病毒抑制剂，它的活性成分为所述RNA片段，所述双链DNA片段，或以上任一所述质粒。
以上任一所述大豆花叶病毒具体可为大豆花叶病毒SC-3株系。
尽管本发明只用SC-3病毒株系进行了抗病接种鉴定，但所述RNA片段是基于多个大豆花叶病毒株系的保守序列，具有广谱性，所以对其它大豆花叶病毒株系也具有相同的抑制效果。
本发明对于培育广谱抗大豆花叶病毒转基因植物（特别是大豆）具有重要的应用价值。
附图说明
图1为重组质粒pTF101.1-P3的结构示意图
图2为T0代PAT试纸条阳性苗PCR鉴定结果. M, DNA标准分子量; Ctl+, 质粒pTF101.1-P3; Wt, 非转化植株; 1～6为随机选取的PAT试纸条阳性植株.
图3为T1～T3代转基因大豆PCR跟踪鉴定结果. M, DNA标准分子量; Ctl+,质粒pTF101.1-P3; Wt, 非转化植株; 1～6为转基因大豆B013不同单株; 7～12为转基因大豆B115不同单株.
图4为T1代转基因大豆Southern杂交鉴定结果. M, DNA标准分子量;Ctl+, 质pTF101.1-P3; Wt, 非转化植株; 1～6为转T1代转基因植株B013, B115, B127,B128,B163, B166. 植物基因组DNA(50μg)用HindⅢ酶切后，用DIG标记bar基因探针进行检测.
图5为T3代转基因大豆植株田间接种SMV SC-3叶片症状表现.
具体实施方式：
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法所作的修改或替换，均属于本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域技术人员所熟知的常规方法。实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
质粒pHANNIBAL-attB5-RBSC2-attB2：公众可以从吉林省农业科学院农业生物技术研究所获得。
栽培大豆品种Williams82和沈农9号：公众可以从国家作物种质资源数据库（http://www.cgris.net/query/croplist.php）获得。
大豆花叶病毒3号株系（SC-3株系）：为我国大豆产区主要流行SMV株系，公众可以从吉林省农业科学院植物保护研究所获得。参考文献：郑翠明, 常汝镇, 邱丽娟, 吴宗璞,高凤兰. 大豆种质资源对SMV3号株系的抗性鉴定. 大豆科学, 2000, 19(4): 299-306.。
实施例中所用到的各种培养基配方见表1。MS合成盐购自Sigma公司，货号为M5524。B5合成盐购自Sigma公司，货号为G5768。
实施例1. 具有抑制大豆花叶病毒功能的片段的发现
对GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) 中登录的26个SMV株系进行序列比对，发现大豆花叶病毒的P3基因存在保守区，在该保守区内最终确定了302bp的片段，位于P3基因自5’端第99-400位核苷酸，如SEQ-2所示。预期通过该片段编码的RNA抑制大豆花叶病毒。所述SEQ-2片段转录的RNA序列为SEQ-1所示的单链RNA。
实施例2. 抗大豆花叶病毒转基因植物的获得与鉴定
1. RNAi重组质粒的构建
（1）合成序列表的SEQ-2所示的双链DNA分子。
（2）以步骤1合成的双链DNA分子为模板，采用SMV-P3-F和SMV-P3-R组成的引物对，用KOD FX 高保真酶（日本TOYOBO公司）进行PCR扩增，
得到PCR扩增产物。
SMV-P3-F：5’-CCGCTCGAGTCTAGATCTCTTGATGGGCTTGGTTTC-3’
SMV-P3-R：5’-GGGGTACCAAGCTTGGTTGTTGGATGCTTTTCTTTC-3’
SMV-P3-F与SMV-P3-R中，下划线标注酶切识别序列，其中“CTCGAG”为限制性内切酶XhoⅠ的酶切识别序列，“TCTAGA” 为限制性内切酶XbaⅠ的酶切识别序列，“GGTACC” 为限制性内切酶KpnⅠ的酶切识别序列，“AAGCTT” 为限制性内切酶HindⅢ的酶切识别序列。
PCR反应条件为：95℃ 2 min；94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 5min。
用1.0%琼脂糖凝胶电泳回收纯化PCR扩增产物，产物大小为331bp。
（3）用限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ双酶切步骤（2）的PCR扩增产物,并回收酶切产物。
（4）用限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ双酶切质粒pHANNIBAL-attB5- RBSC2-attB2，回收载体骨架序列（约5.9kb）。
（5）将步骤（3）的酶切产物和步骤（4）的载体骨架序列连接,得到重组质粒pHANNIBAL-RBSC2-revP3。
（6）用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切步骤（2）的PCR扩增产物，并回收酶切产物。
（7）用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切重组质粒pHANNIBAL-RBSC2 -revP3，回收载体骨架序列（约6.2kb）。
（8）将步骤（6）的酶切产物和步骤（7）的载体骨架序列连接，得到重组质粒pHANNIBAL-RBSC2-P3 RNAi。
（9）用限制性内切酶SpeⅠ和EcoRⅠ双酶切质粒pHANNIBAL-RBSC2-P3 RNAi，回收约2.88kb酶切小片段（该片段自上游至下游依次包括菜豆叶片特异启动子RBSC2，正义RNA片段的编码序列，间隔内含子序列，反义RNA片段的编码序列和OCS终止子）。酶切DNA片段两端均为粘末端。
（10）用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切质粒pTF101.1，回收载体骨架序列（约9.5kb），DNA酶切片段两端均为粘末端。
（11）将步骤（9）的酶切小片段和步骤（10）的载体骨架序列连接（限制性内切酶SpeⅠ与XbaⅠ为同尾酶，其酶切后的粘性末端序列相同），得到RNAi重组质粒pTF101.1-P3。
2. 转基因大豆植株的获得
（1）采用冻融法将重组质粒pTF101.1-P3导入农杆菌EHA101，得到重组农杆菌。
（2）用附表1中的CCM液体培养基重悬农杆菌，得到OD600nm=0.5-0.8的菌悬液备用。
(3) 选取栽培大豆Williams82和沈农9号种子，在含有氯气的密闭容器中灭菌12-16个小时。
（4）取步骤（3）中灭菌后的种子，种脐朝下置于GM培养基平板上，23℃暗培养24小时。
（5）用无菌解剖刀沿种脐切开，并去掉腋芽，在腋芽上方子叶节位置轻微划伤，然后置于步骤（2）得到的菌悬液中浸泡30-40分钟。
（6）完成步骤（5）后，将种子移至铺有无菌滤纸的CCM培养基平板上，23℃暗培养4-5天。
（7）完成步骤（6）后，将种子转移至SIM培养基上，25℃，16h（光）/8h（暗）条件下培养，每2-3周继代1次。
（8）将诱导出丛生芽的外植体上的子叶切去，置于SEM培养基平板上，25℃，16h（光）/8h（暗）条件下培养，每2-3周继代1次，继代时切去褐化的愈伤组织。
（10）当再生芽生长至4-8cm时，将再生芽切下，然后转移至RM培养基平板上，25℃，16h（光）/8h（暗）条件下培养。
（11）待抗性芽长至3-5 cm，且长出健壮的根时，移至炼苗室驯化3-5天，然后转移至温室中生长，得到T0代植株。
（12）对移栽至温室的T0代植株进行PAT试纸条（LibertyLink strips，Envirologix，USA）检测。试纸条检测阳性的植株即初步鉴定为转基因植株。
3. 转基因大豆分子鉴定
（1）剪取PAT试纸条阳性植株叶片进行PCR检测。提植株叶片的基因组DNA，采用P3-F和P3-R组成的引物进行PCR扩增，扩增片段大小为727bp。
P3-F：5’-ACCTCAACTCCACCAGCATC-3’
P3-R：5’- TACTCTCAACTTTTATCTTCTTCGTC-3’
部分幼苗PCR鉴定结果见图2。
（2）PAT试纸条和PCR检测阳性T0代植株自交后即获得T1代株系。采用500mg/L 除草剂-草丁膦进行喷施，7天后非转基因苗出现叶片黄化或枯死现象，而转基因植株则表现正常。
（3）剪取T1代转基因植株叶片进行Southern杂交检测。采用高盐CTAB法提取高纯度大豆基因组DNA。HindⅢ酶切总DNA(～50μg)后，用0.8%琼脂糖凝胶分离酶切片段。采用高盐转移法，将酶切片段转移至带正电荷的Hybood TM-N+尼龙膜（Amersham，USA）上。以pTF101.1-P3为模板，采用BAR-F和BAR-R引入对扩增bar基因片段，扩增片段大小为441bp。利用DIG随机引物标记试剂盒（Roche，USA）标记探针。
BAR-F：5’-GCACCATCGTCAACCACTACATCGAG-3’
BAR-R：5’- TGAAGTCCAGC TGCCAGAAACCCAC-3’
采用Roche 公司的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ试剂盒进行分子杂交。杂交温度为42 ℃，洗膜条件为2×SSC (含0.1% SDS)，37 ℃条件下洗膜2 次，每次5 min；0.5×SSC (含0.1% SDS)，66 ℃条件下洗膜2 次，每次15 min。然后利用BCIP/NBT在杂交膜上化学显色。部分转基因大豆Southern杂交检测结果见图3。
（4）收获Southern杂交阳性的T1代植株自交后得到的种子，播种后长出T2代幼苗，继续采用500mg/L 除草剂-草丁膦和PCR进行跟踪检测，并去除非转基因植株，直至获得纯合的转基因株系。部分转基因大豆PCR跟踪检测结果见图4。
4. 转基因大豆抗病性鉴定
采用人工摩擦接种法，对T2代和T3代转基因大豆株系B115、B127、B128、B013、B163和B166进行抗大豆花叶病毒鉴定。其中，株系B115、B127和B128来源于大豆品种Williams82, 株系B013、B163和B166来源于大豆品种沈农9号。鉴定生理小种为我国大豆产区主要流行SMV株系SC-3。待大豆植株第一片三出复叶出现时进行接种鉴定，于开花前后进行抗性调查。抗性鉴定试验重复3次，每个重复鉴定植株30株。大豆花叶病毒鉴定植株病情级别划分标准见表2。
病情指数计算方法如下：
大豆花叶病毒抗性分级标准为：高抗（IM）：无可见***症状, 病情指数为0；抗病（R）：病情指数在1%-20%之间；中抗（MR）：病情指数在21%-35%之间；中感（MS）：病情指数在36%-50%之间；感病（S）：病情指数在51%-70%之间；高感（HS）：病情指数大于70%。
鉴定结果表明，接种大豆花叶病毒株系SC-3后，对照非转基因大豆出现叶片严重皱缩、花叶和植株矮化等SMV感染典型症状，而转基因大豆植株症状则表现轻微或是无明显症状，如图5所示。在鉴定的6个株系中，B127和B163对SMV抗性最强，病情指数降低至4.37～11.11%，另外4个株系对SMV也表现出较高的抗性水平。连续2代（T2代和T3代）鉴定结果均表明，6个株系的病情指数均显著低于对照非转基因大豆Williams82（病情指数36.81-45.24）和SN9（病情指数39.80-46.97%），具体抗性鉴定结果见表3。
本实验表明，将重组RNAi表达载体导入植物，可以显著提高植物对大豆花叶病毒的抗性。
序列表
SEQ-1序列：
1 UCUCUUGAUG GGCUUGGUUU CACCUUCUAU UCUAAUUCAC AUGUAUCGUA UGAAGCAUUU
61 UGAGAAAGGG GUAGAGUUGU GGAUAAGUAA AGAACAUAGU GUGGCAAAGA UUUUCAUCAU
121 AUUGGAACAA CUCACCAAGA GGGUCGCUGC AAAUGACGUG UUACUUGAGC AACUUGAAAU
181 GAUUUCAGAA ACUUCUGAGA GAUUCAUGAG CAUUCUAGAG GACUGUCCUC AAGCGCCACA
241 GUCAUACAAG ACGGCAAAAG AUUUGUUGAC AAUAUACAUA GAAAGAAAAG CAUCCAACAA
301 CC
SEQ-2序列：
1 TCTCTTGATG GGCTTGGTTT CACCTTCTAT TCTAATTCAC ATGTATCGTA TGAAGCATTT
61 TGAGAAAGGG GTAGAGTTGT GGATAAGTAA AGAACATAGT GTGGCAAAGA TTTTCATCAT
121 ATTGGAACAA CTCACCAAGA GGGTCGCTGC AAATGACGTG TTACTTGAGC AACTTGAAAT
181 GATTTCAGAA ACTTCTGAGA GATTCATGAG CATTCTAGAG GACTGTCCTC AAGCGCCACA
241 GTCATACAAG ACGGCAAAAG ATTTGTTGAC AATATACATA GAAAGAAAAG CATCCAACAA
301 CC
SEQ-3序列：
1 TCTCTTGATG GGCTTGGTTT CACCTTCTAT TCTAATTCAC ATGTATCGTA TGAAGCATTT
61 TGAGAAAGGG GTAGAGTTGT GGATAAGTAA AGAACATAGT GTGGCAAAGA TTTTCATCAT
121 ATTGGAACAA CTCACCAAGA GGGTCGCTGC AAATGACGTG TTACTTGAGC AACTTGAAAT
181 GATTTCAGAA ACTTCTGAGA GATTCATGAG CATTCTAGAG GACTGTCCTC AAGCGCCACA
241 GTCATACAAG ACGGCAAAAG ATTTGTTGAC AATATACATA GAAAGAAAAG CATCCAACAA
301 CCCAATTGGT AAGGAAATAA TTATTTTCTT TTTTCCTTTT AGTATAAAAT AGTTAAGTGA
361 TGTTAATTAG TATGATTATA ATAATATAGT TGTTATAATT GTGAAAAAAT AATTTATAAA
421 TATATTGTTT ACATAAACAA CATAGTAATG TAAAAAAATA TGACAAGTGA TGTGTAAGAC
481 GAAGAAGATA AAAGTTGAGA GTAAGTATAT TATTTTTAAT GAATTTGATC GAACATGTAA
541 GATGATATAC TAGCATTAAT ATTTGTTTTA ATCATAATAG TAATTCTAGC TGGTTTGATG
601 AATTAAATAT CAATGATAAA ATACTATAGT AAAAATAAGA ATAAATAAAT TAAAATAATA
661 TTTTTTTATG ATTAATAGTT TATTATATAA TTAAATATCT ATACCATTAC TAAATATTTT
721 AGTTTAAAAG TTAATAAATA TTTTGTTAGA AATTCCAATC TGCTTGTAAT TTATCAATAA
781 ACAAAATATT AAATAACAAG CTAAAGTAAC AAATAATATC AAACTAATAG AAACAGTAAT
841 CTAATGTAAC AAAACATAAT CTAATGCTAA TATAACAAAG CGCAAGATCT ATCATTTTAT
901 ATAGTATTAT TTTCAATCAA CATTCTTATT AATTTCTAAA TAATACTTGT AGTTTTATTA
961 ACTTCTAAAT GGATTGACTA TTAATTAAAT GAATTAGTCG AACATGAATA AACAAGGTAA
1021 CATGATAGAT CATGTCATTG TGTTATCATT GATCTTACAT TTGGATTGAT TACAGTTGGG
1081 AAATTGGGTT CGAAATCATC AAATTGGGTT GTTGGATGCT TTTCTTTCTA TGTATATTGT
1141 CAACAAATCT TTTGCCGTCT TGTATGACTG TGGCGCTTGA GGACAGTCCT CTAGAATGCT
1201 CATGAATCTC TCAGAAGTTT CTGAAATCAT TTCAAGTTGC TCAAGTAACA CGTCATTTGC
1261 AGCGACCCTC TTGGTGAGTT GTTCCAATAT GATGAAAATC TTTGCCACAC TATGTTCTTT
1321 ACTTATCCAC AACTCTACCC CTTTCTCAAA ATGCTTCATA CGATACATGT GAATTAGAAT
1381 AGAAGGTGAA ACCAAGCCCA TCAAGAGA
序列表
SEQ-1序列：
1 UCUCUUGAUG GGCUUGGUUU CACCUUCUAU UCUAAUUCAC AUGUAUCGUA UGAAGCAUUU
61 UGAGAAAGGG GUAGAGUUGU GGAUAAGUAA AGAACAUAGU GUGGCAAAGA UUUUCAUCAU
121 AUUGGAACAA CUCACCAAGA GGGUCGCUGC AAAUGACGUG UUACUUGAGC AACUUGAAAU
181 GAUUUCAGAA ACUUCUGAGA GAUUCAUGAG CAUUCUAGAG GACUGUCCUC AAGCGCCACA
241 GUCAUACAAG ACGGCAAAAG AUUUGUUGAC AAUAUACAUA GAAAGAAAAG CAUCCAACAA
301 CC
SEQ-2序列：
1 TCTCTTGATG GGCTTGGTTT CACCTTCTAT TCTAATTCAC ATGTATCGTA TGAAGCATTT
61 TGAGAAAGGG GTAGAGTTGT GGATAAGTAA AGAACATAGT GTGGCAAAGA TTTTCATCAT
121 ATTGGAACAA CTCACCAAGA GGGTCGCTGC AAATGACGTG TTACTTGAGC AACTTGAAAT
181 GATTTCAGAA ACTTCTGAGA GATTCATGAG CATTCTAGAG GACTGTCCTC AAGCGCCACA
241 GTCATACAAG ACGGCAAAAG ATTTGTTGAC AATATACATA GAAAGAAAAG CATCCAACAA
301 CC
SEQ-3序列：
1 TCTCTTGATG GGCTTGGTTT CACCTTCTAT TCTAATTCAC ATGTATCGTA TGAAGCATTT
61 TGAGAAAGGG GTAGAGTTGT GGATAAGTAA AGAACATAGT GTGGCAAAGA TTTTCATCAT
121 ATTGGAACAA CTCACCAAGA GGGTCGCTGC AAATGACGTG TTACTTGAGC AACTTGAAAT
181 GATTTCAGAA ACTTCTGAGA GATTCATGAG CATTCTAGAG GACTGTCCTC AAGCGCCACA
241 GTCATACAAG ACGGCAAAAG ATTTGTTGAC AATATACATA GAAAGAAAAG CATCCAACAA
301 CCCAATTGGT AAGGAAATAA TTATTTTCTT TTTTCCTTTT AGTATAAAAT AGTTAAGTGA
361 TGTTAATTAG TATGATTATA ATAATATAGT TGTTATAATT GTGAAAAAAT AATTTATAAA
421 TATATTGTTT ACATAAACAA CATAGTAATG TAAAAAAATA TGACAAGTGA TGTGTAAGAC
481 GAAGAAGATA AAAGTTGAGA GTAAGTATAT TATTTTTAAT GAATTTGATC GAACATGTAA
541 GATGATATAC TAGCATTAAT ATTTGTTTTA ATCATAATAG TAATTCTAGC TGGTTTGATG
601 AATTAAATAT CAATGATAAA ATACTATAGT AAAAATAAGA ATAAATAAAT TAAAATAATA
661 TTTTTTTATG ATTAATAGTT TATTATATAA TTAAATATCT ATACCATTAC TAAATATTTT
721 AGTTTAAAAG TTAATAAATA TTTTGTTAGA AATTCCAATC TGCTTGTAAT TTATCAATAA
781 ACAAAATATT AAATAACAAG CTAAAGTAAC AAATAATATC AAACTAATAG AAACAGTAAT
841 CTAATGTAAC AAAACATAAT CTAATGCTAA TATAACAAAG CGCAAGATCT ATCATTTTAT
901 ATAGTATTAT TTTCAATCAA CATTCTTATT AATTTCTAAA TAATACTTGT AGTTTTATTA
961 ACTTCTAAAT GGATTGACTA TTAATTAAAT GAATTAGTCG AACATGAATA AACAAGGTAA
1021 CATGATAGAT CATGTCATTG TGTTATCATT GATCTTACAT TTGGATTGAT TACAGTTGGG
1081 AAATTGGGTT CGAAATCATC AAATTGGGTT GTTGGATGCT TTTCTTTCTA TGTATATTGT
1141 CAACAAATCT TTTGCCGTCT TGTATGACTG TGGCGCTTGA GGACAGTCCT CTAGAATGCT
1201 CATGAATCTC TCAGAAGTTT CTGAAATCAT TTCAAGTTGC TCAAGTAACA CGTCATTTGC
1261 AGCGACCCTC TTGGTGAGTT GTTCCAATAT GATGAAAATC TTTGCCACAC TATGTTCTTT
1321 ACTTATCCAC AACTCTACCC CTTTCTCAAA ATGCTTCATA CGATACATGT GAATTAGAAT
1381 AGAAGGTGAA ACCAAGCCCA TCAAGAGA

Claims (11)

1.SEQ-1所示的RNA片段或互补于该片段的序列。
2.SEQ-2所示的单链DNA片段。
3.含有特异性片段的质粒，所述特异性DNA片段包括DNA片段1，DNA片段2，以及位于所述DNA片段1和DNA片段2之间的间隔序列，所述DNA片段1和DNA片段2反向互补，所述DNA片段1如SEQ-2所示。
4.权利要求3所述质粒，其特征在于：所述特异性DNA片段从上游至下游依次包括如下元件：启动子，所述DNA片段1，所述间隔片段，所述DNA片段2和终止子。
5.含有权利要求3或权利要求4所述质粒的重组菌或转基因细胞系。
6.权利要求1所述RNA片段，权利要求2所述DNA片段，权利要求3或权利要求4所述质粒在培育抗大豆花叶病毒转基因植物中的应用。
7.一种培育抗大豆花叶病毒转基因植物的方法，包括如下步骤：在目标植物中表达权利要求1所述的RNA分子，获得对大豆花叶病毒抗性显著提高的转基因植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在目标植物中表达权利要求1所述RNA分子的实现方式如下：将权利要求3或权利要求4所述质粒导入目标植物。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其特征在于：所述目标植物和转基因植物为双子叶植物，所述双子叶植物为大豆。
10.权利要求1所述RNA片段，权利要求2所述DNA片段，权利要求3或权利要求4所述质粒在制备大豆花叶病毒抑制剂中的应用。
11.一种大豆花叶病毒抑制剂，其活性成分为权利要求1所述RNA片段，权利要求2所述DNA片段，权利要求3或权利要求4所述质粒。
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