CN101723927B - 一种儿茶素单体egcg工厂化生产分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

一种儿茶素单体EGCG工厂化生产分离纯化方法，采用KR100-5C18为柱填料，分别以25％、75％乙醇水溶液为洗脱剂，进行柱层析，按时间或体积收集儿茶素单体EGCG目标液，对儿茶素单体EGCG目标液进行回收浓缩、结晶、冷冻干燥得儿茶素单体EGCG成品。本发明解决了实验室成果向工厂化生产的转化难题，产量大、方法简便、成本低廉、纯度高、大大缩短的操作时间，整个生产过程绿色无污染，单体提取率及产品纯度均达99.9％。

Description

一种儿茶素单体EGCG工厂化生产分离纯化方法

技术领域

本发明涉及一种儿茶素单体提取分离技术工艺的改进，特别是一种儿茶素单体EGCG工厂化生产分离纯化方法。

背景技术

儿茶素是茶叶中重要的一类天然活性物质，属于黄烷醇类化合物，1929年由日本人首次提取分离出来。它由八种左右的单体组成，即D、L-儿茶素(D、L-C)，L-表儿茶素(L-EC)，L-表没食子儿茶素(L-EGC)，D、L-没食子儿茶素(D、L-GC)，L-表儿茶素没食子酸酯(L-ECG)，L-儿茶素酸酯(L-CG)、L-表没食子儿茶素没食子酸酯(L-EGCG)、L-没食子儿茶素没食子酸酯(L-GCG)。由于CG、ECG、GCG、和EGCG中发生了儿茶素与没食子酸的酯化作用，故称其为酯型儿茶素；而没有发生酯化作用的C、EC、GC、EGC称为非酯型儿茶素，各儿茶素的结构较为相似，有些为同分异构体，结构的主要区别在于羟取代的数量和位置不同。各种单位的含量也因茶叶品质不同各异，一般来说其中的两类酯型儿茶素-epigallocatechin gallate(EGCG)和-epicatechin gallate(ECG)含量较大，药理活性最强。研究表明茶多酚的主体化合物儿茶素既是理想的天然抗氧化剂、抗衰老以及抑菌、抗艾滋病病毒等多种独特功效。近年来，世界发达国家积极推进儿茶素应用产品的开发，以其作为天然抗氧化剂和自由基清除剂，已广泛应用于食品加工、医药保健和日用化工等领域。

目前分离儿茶素的方法一般分为二步：首先从茶末中提取含有儿茶素的茶多酚粗制品(TP)；其次从粗提物中纯化分离儿茶素组分。若要得到儿茶素中的各种单体组分，则需进一步经过柱色谱法、半制备高效液相色谱法(HPLC)纯化或者其它仪器方法纯化。由于儿茶素各组分的化学结构与性质十分相近，采用一般的方法很难分离，根据资料分析，目前分离制备儿茶素单体的方法主要有以下几种：

(1)柱层析分离法 

该方法是将茶多酚粗品经一定的溶剂溶解后，上柱分离，用洗脱剂洗脱，收集儿茶素。柱层析的关键是柱填料与洗脱剂的选择。国内外报道的柱填料有三大类型：吸附型柱、离子交换柱、凝胶柱。这种分离方法繁琐、费时、产品纯度不高、还有溶剂残留。

(2)高效液相(HPLC)制备色谱法 

制备型HPLC主要用于分离纯化出儿茶素的单体组分。工艺流程是TP粗品经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱分离纯化出儿茶素混合物，一般以不同梯度的丙酮水溶液作洗脱剂，分离得到酯型儿茶素和非酯型儿茶素两组流分，再经HPLC制备柱分离纯化，采用甲醇／水为洗脱剂，进一步纯化得到儿茶素单体组分，所得儿茶素产品纯度较高，但存在成本高，周期长后期溶剂难以完全除尽等缺点。

(3)高速逆流色谱法(HSCCC)

高速逆流色谱法是80年代发展起来的新技术，其特点是高速运转产生的重力场使固定相能在分离柱中实现高的保留，从而大大提高了分离能力，该法属仪器分离法，溶剂***中各溶剂在分液漏斗中混合后，上层为固定相，灌入色谱分离柱；下层为流动相，将TP粗品溶解成5％-10％的溶液。当流动相流经色谱柱时，儿茶素各组分得到分离。这种分离方法是在两相之间进行的，克服了使用固体吸附材料造成的样品不可逆吸附或降解的缺点，样品可最大限度的得以回收。但该方法成本高，制备量小，目前难以普及。

发明内容

本发明的目的是通过对现有儿茶素单体提取分离技术工艺的改进，提供一种分离纯化操作步骤简单、分离效率高、制备量大的儿茶素单体EGCG工厂化生产分离纯化方法。

本发明的目的是这样实现的：一种儿茶素单体EGCG工厂化生产分离纯化方法，包括以下步骤：

a、单柱萃取分离：将粗制茶多酚溶液和洗脱剂上柱，柱高15m，直径55cm，用75％乙醇作洗脱剂，控制茶多酚溶液流速700-900L／min，乙醇流速1500-1700L／min，萃取时间1.5-2小时，用减压真空回收含L-表没食子儿茶素没食子酸酯儿茶素单体EGCG的洗脱液，再将其贮存待层析；

b、低压柱层析纯化：以KR100-5C18为柱填料，柱高2.8m，以25％乙醇水溶液为洗脱剂，洗脱流速450L／min，对回收浓缩后待纯化的含L-表没食子儿茶素没食子酸酯儿茶素单体EGCG的洗脱液进行柱层析，按时间或体积收集儿茶素单体EGCG目标液，对儿茶素单体EGCG目标液进行回收浓缩、结晶、冷冻干燥得儿茶素单体EGCG成品。

本发明采用KR100-5C18柱层析，分别以25％、75％乙醇作为洗脱剂，进行预分离及纯化实验，可将粗制茶多酚中的主要六个儿茶素(EGCG／GCG／ECG／DL-C／EG／GCG／EGC)实现连续高效的分离。该方法操作简便，产量大、成本低廉、溶剂无毒，单体提取率及产品纯度均较高，并可实现EGCG一次性公斤级以上的制备，经济效益十分可观。

本发明具有三方面的有益技术效果：

(1)第一次分离采用25％乙醇做洗脱剂替代了目前常用的丙酮等其他水溶液洗脱剂，具有以下优点：

a、一次性分离主要酯型儿茶素EGCG(含有GCG)与ECG，分离效果及分离效率均较高，且非酯型儿茶素、咖啡因以茶色素可同时分离出去，解决了已报道得到茶多酚经匍聚糖凝胶Sephadex LH-20层析后，一般只能将原料茶多酚中的儿茶素分为酯型和非酯型儿茶素两类，而EGCG与ECG、EGC无法分离的问题，可大大降低后续纯化手续；

b、分离效果好，色带均匀，不易拖尾和产生气泡；

c、溶剂回收方便，由于收集液均为儿茶素单体的水乙醇液，采用真空减压浓缩回收，回收十分快速方便，缩短了与后续纯化的连接过程，而其他溶剂水溶液洗脱液体由于含有水成分，收集液不易充分浓缩。

(2)EGCG柱层析纯化方法采用柱层析技术，大大简化了目前报道的半制备HPLC纯化等工艺，只需经过常规的柱层析***即可完成单体EGCG的分离提纯，色谱纯度99％，且EGCG一次性纯化制备降低了生产成本；整个分离、纯化过程采用乙醇及25％乙醇水溶液，兼容性及连续性强，且极易回收，廉价无毒，避免了半制备HPLC纯化溶剂带来的安全问题。

具体实施方式

一种儿茶素单体EGCG工厂化生产分离纯化方法，包括以下步骤：

a、单柱萃取分离：将粗制茶多酚溶液和洗脱剂上柱，柱高15m，直径55cm，用75％乙醇作洗脱剂，控制茶多酚溶液流速700-900L／min，乙醇流速1500-1700L／min，洗脱剂用量4000L，萃取时间1.5-2小时，用减压真空回收含L-表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG的洗脱液，再将其贮存待层析；

b、低压柱层析纯化：以KR100-5C18为柱填料，柱高2.8m，以25％乙醇水溶液为洗脱剂，洗脱流速450L／min，洗脱剂用量800L，对回收浓缩后待纯化的含L-表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG的洗脱液进行柱层析，按时间或体积收集儿茶素单体EGCG目标液，对儿茶素单体EGCG目标液进行回收浓缩、结晶、冷冻干燥得儿茶素单体EGCG成品。

实施实例1：

(1)首先投入1200kg茶叶，用去离子水加温浸泡茶叶，浸泡三次；

(2)抽滤茶水； 

(3)分别将两次抽滤混合液浓缩；

(4)上层析柱； 

①填料的预处理：称取KR100-5C18300kg，用洗脱剂25％乙醇400kg充分溶胀(也可以用80℃温水浸泡1.5小时)。

②将溶胀好的填料慢慢倒入层析柱，使其均匀沉降，待沉降到2.75m时，关闭上料口，用输送泵将5-8倍柱床体积的25％乙醇输入柱内淋洗，以平衡柱子。

③上柱：约200L萃取多酚浸膏溶液，用输送泵输入柱内，待样品完全渗入柱内后，再接上收集器，用低压输送泵输入25％乙醇开始收集，第一段为EGC，依次为DL-C、CAF、EGCG、EC、GCG、ECG，洗脱流速为450L／min，共收集800L。

④采用高效液相色谱仪，分别对收集液的成分和含量进行定性分析。

(5)合并EGCG(含ECG)儿茶素单体的洗脱液，在100L真空浓缩机组浓缩40分钟(含固量在45左右)。

①装柱：将溶胀好的填料缓慢倒入柱内，使其均匀沉降，待沉降到2.75m时，关闭填柱口阀门，用输送泵输送5-8倍的50％乙醇淋洗，以平衡柱子。

②上柱：将浓缩后EGCG(ECG)固含量在50左右的儿茶素单体收集液，用输送泵输入柱内，待样品完全渗入柱内后，采用高级液相色谱法，对收集液的成分、含量进行定性分析，合并含EGCG儿茶素单体的洗脱液，在50L减压浓缩机组，浓缩至含45％的固含量后， 进一步纯化结晶，冷冻干燥得成品10.065kg，纯度为99.9％。

实施实例2：

儿茶素单体L-表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG和L-表儿茶素没食子酸酯ECG的预分离方法：KR100-5C18为柱填料，以25％乙醇为洗脱剂，工艺条件为：柱高2.8m，洗脱流速450L／min，一次性上样量(TP)可达400L，洗脱剂用量800L，可实现粗制茶多酚原料中儿茶素(EGCG与ECG／GCG)的有效分离。技术效果：EGCG(含EGC)单体洗脱率为98.45％，纯度可达98.66％，ECG单体洗脱率为98.64％，纯度达98.62％，提取率88.57％。

儿茶素单体L-表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG纯化方法：分离得到的EGCG(ECG)，真空减压浓缩至40L，再经KR100-5C18柱层析分离纯化，具体工艺条件为：洗脱剂为50％乙醇，柱高2.8m，洗脱流速450L／min，洗脱剂用量800L，洗脱率可达98％以上，纯度达99.9％以上，提取率88.57％，且无色素残留。

Claims (1)

1.一种儿茶素单体EGCG工厂化生产分离纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)首先投入1200kg茶叶，用去离子水加温浸泡茶叶，浸泡三次；

(2)抽滤茶水；

(3)分别将两次抽滤混合液浓缩；

(4)上层析柱：

①填料的预处理：称取KR100-5C18 300kg，用洗脱剂25％乙醇400kg充分溶胀；

②将溶胀好的填料慢慢倒入层析柱，使其均匀沉降，待沉降到2.75m时，关闭上料口，用输送泵将5-8倍柱床体积的25％乙醇输入柱内淋洗，以平衡柱子；

③上柱：约200L萃取多酚浸膏溶液，用输送泵输入柱内，待样品完全渗入柱内后，再接上收集器，用低压输送泵输入25％乙醇开始收集，第一段为EGC，依次为D、L-C、CAF、EGCG、EC、GCG、ECG，洗脱流速为450L/min，共收集800L；

④采用高效液相色谱仪，分别对收集液的成分和含量进行定性分析；

(5)合并含ECG的EGCG儿茶素单体的洗脱液，在100L真空浓缩机组浓缩40分钟；

①装柱：将溶胀好的填料缓慢倒入柱内，使其均匀沉降，待沉降到2.75m时，关闭填柱口阀门，用输送泵输送5-8倍的50％乙醇淋洗，以平衡柱子；

②上柱：将浓缩后EGCG及ECG固含量在50左右的儿茶素单体收集液，用输送泵输入柱内，待样品完全渗入柱内后，采用高级液相色谱法，对收集液的成分、含量进行定性分析，合并含EGCG儿茶素单体的洗脱液，在50L减压浓缩机组内，浓缩至含45％的固含量后，进一步纯化结晶，冷冻干燥得成品。