CN101319219B - 一种生产脱氧紫色杆菌素的方法及其专用重组菌 - Google Patents
一种生产脱氧紫色杆菌素的方法及其专用重组菌 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101319219B CN101319219B CN2008101166013A CN200810116601A CN101319219B CN 101319219 B CN101319219 B CN 101319219B CN 2008101166013 A CN2008101166013 A CN 2008101166013A CN 200810116601 A CN200810116601 A CN 200810116601A CN 101319219 B CN101319219 B CN 101319219B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- violacein
- deoxidation
- gene cluster
- deoxidized
- coli
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- XAPNKXIRQFHCHN-QGOAFFKASA-N violacein Chemical compound O=C\1NC2=CC=CC=C2C/1=C(C(=O)N1)/C=C1C1=CNC2=CC=C(O)C=C21 XAPNKXIRQFHCHN-QGOAFFKASA-N 0.000 title claims abstract description 72
- LEJQUNAZZRYZKJ-UHFFFAOYSA-N violacein Natural products Oc1ccc2NCC(C3=CC(=C4/C(=O)Nc5ccccc45)C(=O)N3)c2c1 LEJQUNAZZRYZKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 32
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 26
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 18
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims abstract description 12
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 claims description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 12
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 11
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 claims description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 9
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims description 2
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 16
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 4
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000588879 Chromobacterium violaceum Species 0.000 description 3
- 241000587482 Duganella sp. Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006035 Tryptophane Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241001277594 Duganella Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000003570 biosynthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000001040 synthetic pigment Substances 0.000 description 2
- 101150002431 vioB gene Proteins 0.000 description 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 229940054051 antipsychotic indole derivative Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 150000002475 indoles Chemical class 0.000 description 1
- VVVPGLRKXQSQSZ-UHFFFAOYSA-N indolo[3,2-c]carbazole Chemical compound C1=CC=CC2=NC3=C4C5=CC=CC=C5N=C4C=CC3=C21 VVVPGLRKXQSQSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005544 indolocarbazole Drugs 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 235000010333 potassium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004323 potassium nitrate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000001057 purple pigment Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 101150073925 vioA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150061065 vioC gene Proteins 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种生产脱氧紫色杆菌素的方法及其专用重组菌。该方法是将脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇导入大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中获得的重组菌,该重组菌以色氨酸为底物发酵生产脱氧紫色杆菌素。其中,脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇,是将由VioA、VioB、VioC、VioD和VioE组成的紫色杆菌素合成基因簇中的VioD基因敲除,获得重组基因簇。所述重组菌是将所述的基因簇导入大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中获得的产脱氧紫色杆菌素的重组菌。本发明生产脱氧紫色杆菌素的方法产率较高,可以达到0.17g/L发酵液,且提取方便,分离纯化简单。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产脱氧紫色杆菌素的方法及其专用重组菌。
背景技术
紫色杆菌素(violacein)、脱氧紫色杆菌素是微生物的代谢产物,它属于吲哚衍生物,由两个色氨酸分子氧化缩合而成。自从19世纪末紫色杆菌素被发现以来,人们对其生物功能进行了大量的探索,发现它具有很强生物功能,越来越受人们关注。研究证明,紫色杆菌素具有很强的生物活性:(1)具有广谱的抗菌活性,如抗staploylococcous aureus、Bacillus sp,streptococcus sp,mycobacterium,Neisserig,pseudomonas(Sanchez et al.,Reevaluation of the ViolaceinBiosynthetic Pathway and its Relationship to Indolocarbazole Biosynthesis.Journal 2006.7,1231-1240);(2)抗氧化(Konzen et al.,Antioxidantproperties of violacein:possible relation on its biological function.Journal 2006.14,8307-8313);(3)抗肿瘤细胞(de Carvalho et al.,Cytotoxicactivity of violacein in human colon cancer cells.Journal 2006.);(4)抗病毒性;(5)抗原生动等等,还可以作为染料加工各种材质布料(Akira SHIRATA,Isolation of Bacteria Producing Bluish-Purple Pigment and Use for Dyeing.Japan Agricultural Research Quarterly.2000.34),总之,紫色杆菌素具有很高的医学价值及工业应用前景。
在已发现的产紫色杆菌素的菌株中,对紫色色杆菌(C.violaceum)的研究最为广泛。2003年,C.violaceum全基因组测序完成,为紫色杆菌素合成途径解析及应用提供了保证。但起初认为有4个相关基因控制整个紫色杆菌素的生物合成,直到最近,第5个基因才得以发现,整个代谢途径基本明朗化。紫色杆菌素的生物合成涉及一个基因簇,长约7.3k b,包括5个基因,分别是VioA、VioB、VioEVioC和VioD。
脱氧紫色杆菌素是紫色杆菌素合成途径的副产物,产量很低,分离困难,因此对其性质及生物活性研究较少。目前急需一种便利的方法来生产脱氧紫色杆菌素,加强对脱氧紫色杆菌素的研究和应用。
发明内容
本发明的目的是提供生产脱氧紫色杆菌素的方法及其专用重组菌。
本发明所提供的生产脱氧紫色杆菌素的方法,是将脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇导入大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中获得的重组菌,该重组菌以色氨酸为底物发酵生产脱氧紫色杆菌素。
其中,所述的脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇,是将由VioA、VioB、VioC、VioD和VioE组成的紫色杆菌素合成基因簇中的VioD基因敲除,获得重组基因簇。
其中,所述基因簇具体为如下1)或2)或3)的基因:
1)其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子;
2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码紫色杆菌素合成途径中的VioA、VioB、VioC和VioE四种酶的DNA分子;
3)与1)的基因具有90%以上的同源性,且编码紫色杆菌素合成途径中的VioA、VioB、VioC和VioE四种酶的DNA分子。
所述步骤3)中的DNA分子,与1)的DNA分子最好有95%以上的同源性。
上述严格条件可为在6×SSC,0.5% SDS的溶液中,在68℃下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。
本发明的另一个目的是提供一种产脱氧紫色杆菌素的重组大肠杆菌。
本发明所提供的产脱氧紫色杆菌素的重组大肠杆菌,是将所述的基因簇导入大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中获得的重组菌,命名为大肠杆菌BL-DV;大肠杆菌BL-DV已于2008年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区大屯路,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏编号为CGMCC No.2557。
含有所述基因簇的表达盒和含有所述基因簇或所述表达盒的重组表达载体也属于本发明的保护范围。
其中,所述重组表达载体具体可为在原核表达载体的多克隆位点***所述的基因簇或含有所述基因簇的表达盒。
大肠杆菌BL-DV CGMCC No.2557具体可用如下方法构建:将所述的重组表达载体导入大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL,获得产脱氧紫色杆菌素的重组菌。
本发明的大肠杆菌BL-DV CGMCC No.2557能以L-色氨酸为底物发酵生产脱氧紫色杆菌素。所述L-色氨酸的浓度优选为0.3-0.5g/L;所述发酵温度为10-37℃。
脱氧紫色杆菌素与紫色杆菌素均为蓝紫色,且产量很少,分离困难。用本发明的大肠杆菌BL-DV CGMCC No.2557生产脱氧紫色杆菌素的产率较高,可以达到0.17g/L发酵液,且提取方便,分离纯化简单;并且,本发明的重组菌BL-DV CGMCCNo.2557是大肠杆菌,方便控制,便于工业化生产。
附图说明
图1为重叠延伸PCR重组脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇。
图2为PCR扩增获得紫色杆菌素合成相关基因簇片段A、B和C的结果。
图3为色素高效液相色谱结果图。
具体实施方式
实施例1、产脱氧紫色杆菌素的重组菌BL-DV
1)构建脱氧紫色杆菌素合成途径的相关酶的重组表达载体
将杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056转接入液体培养基(淀粉15g/L、硫酸亚铁0.03g/L、硝酸钾1g/L、磷酸氢二钾0.7g/L、硫酸镁0.5g/L、色氨酸0.5g/L,调节pH为7.0),25℃,200rpm培养36小时,按上海生工基因组DNA提取试剂盒说明书提取杜擀氏B2菌基因组DNA。
根据紫色杆菌素基因簇序列,采用Oligo 7.10软件设计3对引物,引物序列如表1,其中P1、P2扩增vioA及部分vioB基因部分序列,扩增产物命名为片段A;P3、P4扩增部分vioB及vioC基因,扩增产物命名为片段B;P5、P6扩增vioE基因,扩增产物命名为片段C;P4和P5两条引物之间有48bp的重复序列(图1)。
表1.PCR引物设计
分别使用P1和P2、P3和P4及P5和P6引物及高保真Pfu DNA聚合酶对杜擀氏B2菌基因组DNA进行PCR扩增,PCR反应体系为50μL,DNA模板为0.5μg,上下游引物各25pmol,2.5U Pfu DNA聚合酶。
扩增片段A和B采用表2中的PCR程序I,扩增片段C采用表2中的PCR程序II。
表2.PCR扩增程序
PCR扩增获得紫色杆菌素基因簇片段A、B和C的结果如图2所示。
PCR产物片段B和C按1∶1的体积比混合,然后稀释10倍,作为进一步PCR扩增的模板。
PCR反应体系为50μL,上述含有片段B、C的混合物1.5μL,2.5U TaKaRa PfuDNA聚合酶。PCR反应程序为PCR程序III,当运行完第2步时停止程序,向反应体系中加入P3、P6引物各25pmol后接着运行PCR程序III中的3、4步骤,将片段B和C连接在一起形成片段D。用PCR产物试剂盒纯化片段D,将片段D克隆到pMD18-T载体中,获得pMD18-T-D载体,测序,测序结果表明片段D的核苷酸序列为序列表中序列1自5′末端第3058-6198位所示。
用Ase I和Not I双酶切片段A、Not I和Xhol I双酶切pMD18-T-D载体及NdeI和XholI双酶切表达载体pET30a,回收3057bp的片段A、3140bp的片段D和pET30a载体酶切后的大片段,将上述回收的三个片段在T4DNA连接酶的作用下连接构建重组表达载体pET30aVioΔD。将重组表达载体pET30aVioΔD转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞,转化产物涂于含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上,挑取转化子培养后采用碱裂解法提取质粒,筛选含***片断的阳性克隆,进行测序,测序结果表明VioΔD片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示,序列1自5′末端第1-1308位为VioA基因,编码紫色杆菌素合成途径中的VioA酶;自5′末端第1305-4322位为VioB基因,编码紫色杆菌素合成途径中的VioB酶;自5′末端第4323-5612位为VioC基因,编码紫色杆菌素合成途径中的VioC酶;自5′末端第5622-6197为VioE基因,编码紫色杆菌素合成途径中的VioE酶。VioΔD片段中不含有紫色杆菌素基因簇中的VioD基因。该VioΔD即为脱氧紫色干菌素合成相关基因簇。
2)表达宿主的选择
将重组载体pET30aVioΔD分别转入E.coli BL21及E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL,获得重组菌E.coli BL21-VioΔD及E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-VioΔD,以pET30a载体分别转入E.coli BL21及E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL,获得的重组菌E.coli BL21-pET30a和E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET30a为对照。
在LB培养基中37℃培养菌体浓度OD600为0.7,加入0.1mM IPTG,20℃诱导30h。将50mL发酵液在7000×g下离心10min,弃上清液,在沉淀物中加入无水乙醇5mL,用漩涡混合器将其混匀,然后在200W超声波清洗器中振荡0.5h,将振荡液9000×g离心5min,保留乙醇溶液。
在E.coli BL21-pET30a和E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET30a中没有得到蓝色物质;在E.coli BL21-VioΔD中也没有得到蓝色物质,而在E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-VioΔD中能合成蓝色素,表明重组表达载体pET30aVioΔD在E.coli BL21中合成脱氧紫色杆菌素的4个酶没有完全正确表达或者某些酶表达量很低,而在E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中合成脱氧紫色杆菌素的4个酶正确表达,说明脱氧紫色杆菌素合成基因簇中可能含有稀有密码子,将产脱氧紫色杆菌素的E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-VioΔD命名为大肠杆菌BL-DV;大肠杆菌BL-DV已于2008年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区大屯路,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏编号为CGMCC No.2557。
3)重组菌BL-DV CGMCC No.2557中合成的色素鉴定
重组菌BL-DV CGMCC No.2557的菌体经破碎乙醇提取后得到蓝紫色物质,将色素甲醇溶液进行高效液相色谱分析,使用Agilent-1100高效液相色谱仪,色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18,150mm×4mm,5μm;柱温30℃;洗脱剂为体积比为70%的甲醇水溶液;流速1.0mL/min;检测波长:570nm。
高效液相色谱检测结果如图3所示,由重组菌BL-DV CGMCC No.2557合成的色素与杜擀氏菌属Duganella B2紫色杆菌素副产物——脱氧紫色杆菌素保留时间一致(4.9min),并且只有一个峰值。上述实验结果表明,构建的载体pET30aVioΔD在菌株E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL成功表达合成脱氧紫色杆菌素相关的酶,并在体内催化合成脱氧紫色杆菌素。
图3中,I:杜擀氏菌属(Duganella sp.)B2 CGMCC №2056所产色素高效液相色谱图,第一峰为紫色杆菌素,第二峰为脱氧紫色杆菌素;II:重组菌BL-DV CGMCCNo.2557所产色素粗提物色高效液相谱图。
实例2、重组菌BL-DV CGMCC No.2557生产脱氧紫色杆菌素
对重组菌BL-DV CGMCC No.2557以L-色氨酸、加入诱导剂时的细胞浓度(OD600值)、诱导剂的量、诱导时间4因素为试验因素,以脱氧紫色杆菌素产量为指标,对上述四因素进行4因子3水平的正交试验,其结果见表3。
色素的提取同实施例1;色素浓度的测定是通过测定色素的乙醇溶液在最大吸收波长的吸光度值来衡量,Duganella sp B2所产脱氧紫色杆菌素测定波长为562nm,以无水乙醇作空白对照,通过吸光度值——色素浓度标准曲线得到相对应的色素浓度值,每个试验重复3次,取平均值,得到的吸光系数ε为9.0955l·g-1·cm-1。
表3.正交试验设计及结果
表3结果表明,在这4因素中,影响脱氧紫色杆菌素产量的主次顺序为细胞浓度>L-色氨酸>诱导时间>诱导剂的量,根据计算结果可知最佳组合应为在LB培养基中添加L-色氨酸0.4g/L,诱导剂的量1.0mmol/L,加诱导剂时的细胞浓度为OD600=0.8,20℃诱导30h。
在上述最佳条件下,进行三批验证试验,脱氧紫色杆菌素产量分别为0.183g/L、0.165g/L和0.153g/L,平均为0.167g/L。
序列表
<110>清华大学
<120>一种生产脱氧紫色杆菌素的方法及其专用重组菌
<130>CGGNARW81479
<160>1
<210>1
<211>6197
<212>DNA
<213>杜擀氏菌属(Duganella sp.)
<400>1
atgacaaatt attctgacat ttgcatagtt ggcgcaggca tagggggcct cagttgtgcg 60
acccagttga tcaacgccgc cgccggcaag aatttacgga tcagggtgtt cgacatggat 120
acgacggtgg gcgggcgcat ccagtcgcat aaagtagacg aggaggaaat cgccgaactc 180
ggcgccgccc gctactcgcc gcaactccat ccgcatttcg agcaactcat gcaggaatgc 240
gggctggcgc atgcgaccta ccctttcacc caggtggtgt cgctcgatca ggcgcaggag 300
aaactgaagg caactctgct gagcctgagt gcgatgctga aaaaacatcc gaacgattcc 360
ttccttgaat tcgtcagcca gtacctgggc gccgccgaag cgacccgcat gatcaaggcg 420
accggttacg acgccttgct gctgccggtg gtctcggcag cgatggccta cgacatcatc 480
aaaaagcacc cggaaacaca aagctttacc gaaaacgccg ccaacgagtg gcgctatgcc 540
accgacggct acagcgagct gctgcgtcag ttgcagcgcc aggcccagga cgccggcgtg 600
gaattccggc tggggcatcg cttgctgtcg gttgaaaagt ccggcaccga ccatgtcctc 660
gccttccgcc atatgggcga tactcagatg caccgggcgc gccatgtgat cacgaccctc 720
ccgccgaccg ccatgaagcg cctgaacatg gattttccgg ccgccttcag tcccttccag 780
tacgattccc tgcctttgtt caaaggattc ctgaccttcg aaacagcctg gtgggacgcg 840
ctcgggctga ccgacaaagt gctgatggcc gataatcctc ttcggaaaat ctacttcaag 900
ggcgacaaat acctggtgtt ctacaccgac agcgccagcg ccacctattg gcgggagtac 960
ctggagcaag gggaagacgt ttacctggac cgggtccgcc atcacctgaa agaagtgctg 1020
ccgctgaacg gtcagccgct gccgcagatc aaggcgcatt tttacaagca ctggccgcat 1080
ggcgtcgagt tcagcctgga gccggaagcc gagcatccag caaccctgct ccaccgcgac 1140
ggcatcatct cctgctcgga cgcgtatacc tcgcattgcg gctggatgga aggcagcttg 1200
atcagcgccg ggcacgctac ccgcctgttg ctggaacggc tcagccatcc gccagcacaa 1260
tccgggcacg actttaccct cgccacctct cttactgagc gcgcatgagc attctcgact 1320
ttccccgctt tcattttcgg gggtttgccc gcgctaatgt gcccactgcc aaccgcaata 1380
cgcacggcca tatcgatatc gcgacgaatg cggtatcgat cgcgggcgaa ccattcgacc 1440
tgagccgccc gccgtcggaa ttccatgagc acatgaaaca gcttgctccc aggttcgatg 1500
cggcgggcaa gccggatccg gagggcatct tcagcgaggc ggccggctac aatttttgcg 1560
gcaacaatca cttttcgtgg gaaaacgcca ggatcaccgg cgtccagctg cgcgatggcg 1620
aggtcgatac cgaggacgcg ctggtcggcg ccaagctggc cctgtgggga cattacaacg 1680
actatctgcg caccacggtc aaccgcgcca gatgggtcga caacaacccc gccgagccgg 1740
acaccaccct catttacgcg ggccagttca cgctcagcgg caagcaagcc acgcccaaca 1800
caccgagcct gttcagcgcc gatatcgggc aggcgcattc ggtacgctgg gtcggcagcg 1860
gccatatcag cgagcgcagc gggcattttc tcgacgatga attcggccgt tccaggctgt 1920
tccagttttc cgtggcgaag ctcgatccgc atttcctctt caatccggac acaccgctgc 1980
cggccagcat gcgcgccttg caagaggcgc ttgccgacga ggatgtgctg gggctgacgg 2040
tccagtatgc gctgttcaat atgtcgacgc cgcagaaacc cgattcgccg gtgttctacg 2100
acctggccgg cggcatcggc ctgtggcgcc gcgacgagct ggccacctat ccggccggcc 2160
gtttgctgct gccgcgccag agcagcctgg ggccggtact ggtgaaggtg catgcggacc 2220
gggtgtcggt gaatatgccg acggccatcc cgttcaccac gcgcgaggcc ggcgccgtgt 2280
ccgaacagca tcctacccat gcgctgggcg gcaagcttgc gctgggcgat ctcatgctgc 2340
acggtgccac cggcaagctg atcgcccgca tcccgcaaca gctgtacctc gactactggc 2400
gccatcatgg tgtcttcgat gtgccgctgc tccacccggc cacggcctcg ggttcgctca 2460
gcatgtccag cgcgcaggcg cagtgggacg aagccgactg ggtgctgcag tccgacagca 2520
accatctgta tctggaagcg cccaaccggc aacgacagca ggactttccg cagacgatca 2580
cggtacaaag ccgcttgcgc ggcgagctgg cggcgcatcc ggcgctgacg gcgcaggcgc 2640
aggatggcga gatcgtcggc gtgcgcgtgg cgccatcggc gctgggagtt ggctatgcgg 2700
acctgaccct cacgggccgc cgttcaggcg cgacccgcat catgctgggc gaggcacagg 2760
ggcagcagtt catcggcgcg agggtgctgc ccgacgactg gcatctggac gacataccgg 2820
ccgaacaggt cgattacgcc tttctctacc agcacgtgat gagctactac gagctggtct 2880
atcccttcat gtcggacaag gtgttcagcc tggcggacca ctgcaagtgc gaaacctatt 2940
cgcgcctgat gtggcagatg tgcgatccgc agaaccggga caagagctat tacatgccga 3000
gcacgcgtga actgtcgctg ccgaaatcgc gcctgttcct gaaatacctg acccaggtcg 3060
aagcggccgc caagtccacg cttcctcaag cggtcgcacc gcatgtcatc ggctgcaagg 3120
ccgagtggat cgccgagctg aaaaaggcga tcgacctgga actgtcgctc atgctgcagt 3180
acctgtacgc cgcgtatgcc attcccaact atgcgcaggg agtgaaactg gtcgaggccg 3240
gccgctggct gccggacgag ctggagctgg cctgcggcac cgaggaccgg cgccgcaaca 3300
gcggagcgcg tggcgccctg ctcgaaatcg cccatgaaga aatgattcac tacctgatgg 3360
tcaacaatgt gctgatggcg ctcggcgagc cgttctacgc cggcgccccg gcgctgggag 3420
aacaggcgcg ccagcgcttc ggcctggaca cggaatttgc cttcgaccct ttttccgagc 3480
atgtgctggc cagattcgtg cgtttcgagt ggcccgacta tcttcccacg cccggtaaat 3540
cgatcgccac cttctatgcg gcgatccgcc aggccgtggc cgatctgccc gatctgttcg 3600
acgccgacgg cggcaaacgc ggcggcgagc accacctgtt cctcaaagag ctcaccaacc 3660
gcgcctatcc cgcctatcag ctggaagtta gcgaccgcga cagcgcgctg ttcgcgctcg 3720
acttcgtcac cgaacagggc gaaggggtgg cggtggaatc gccccatttc gccgtgtcgc 3780
atttccagcg gctgcgcgcc ctggccggcc gcttttcggc acgcgaaaaa ccgttcgaac 3840
cggccgtgcc ggcgctgaaa aatccggtac tcgacccacg cgccgactgc accgtggtga 3900
ccgatcccaa ggcccgttcg ctgatgcagc tctaccaggg ctgctatgaa ctgaccttcg 3960
cgctgatggc gcaccacttc gcgcaaaagc cgctgggcag cctgcgccgc tcgcgcctga 4020
tgaatgcctc catcgacatc atgaccggtt tgctgcggcc cttgtcggcc gcgctgatga 4080
acatgccgtc cggcgtaccc gggcgcaacg ccggaccgcc cgtgcccggg ccggccgaca 4140
ccgccatcag cagtgactac agcctgggat gcgagctgct ggcgcagaaa tgcctggccc 4200
tggcgcagta cgcgcgcagc ctggaggccg aggtggccag cacggcgcag atcgacatgt 4260
tggagttctt taatcagcaa ctgaccgatt tatctcgggg aaagatgtca agagaggcct 4320
gaatgcacaa aatcatcatc gtgggcggcg gcctggcggg cagcctgacc gccacttatc 4380
tggcgcagcg cggacatgag gtccacgtta tcgaaaagcg cggcgatccg ctgcgggcgg 4440
agtcagccaa cgccgatccg gtcaactcgc gcgccattgg cgtgagcatg accgtgcgcg 4500
gcatcaaggc agtgctggcg gccggcatca gcaaggagga gctcgatcgg tgcggcgaac 4560
cggtcgtcgg catggcattt tcggtcggcg gcggccacaa ggtgcgcgaa ctgaccccgc 4620
tcgaaggctt gtttcccttg tcgctggacc gcaccgcgtt ccagcgcctg ctgaacaagt 4680
acgccgtcat gcacaaagtg aactattact tcgagcataa atgcctggac ctggacctgg 4740
acaagaaatc cgtgctgatc cagggcccgg acggcgcctt gcggcatctg caaggcgacc 4800
tgatcatcgg ggccgacggc gcccactccg ccgtgcggcg cgccatgcaa gccggcatgc 4860
ggcgcttcca gttcgaacaa tccttcttcc gccacggcta caagaccctg gtactgccga 4920
acgccgcggg actgggcttc cgcaaggatc tgctgtattt cttcggcatg gattccaagg 4980
gccagtttgc cggccgcgca gccaccatcc cggacggcag catcagcttc gccctctgcc 5040
tgccctacac cggcacgccc agcctggcca cgcgcgaccg cgccgccatg ggggagtttt 5100
tcagccgcta cttcggcatc ctgccaccgg ccagccggga agagctggtg aatcagttca 5160
tcgcgctgcc tagcaacgac ctcatcaatg tccgctccag caccttccat tacaagagca 5220
atgtcctgct gatcggcgat gcggcgcatg cgaccgcccc cttcctcggt cagggcatga 5280
acatggcgct ggaagacgtc tacgtcttca tcaccttgct ggaaaagcat cgcgatgacc 5340
tgggcctggt cttgtcggag tttacggggc agcgcaaggt gcaggccgac gccatgcagg 5400
atatggcgat cgccaactac gaaatgctga gcaacccgaa ttttattttc ttcctgcaaa 5460
cccgctacac ccgctacatg cacaagaaat ttcccagtgt ttatccgccc gacatggcgg 5520
agaagctgta cttcacatcg gttccctacg atgtgctgca acaaatccag aagaagcaaa 5580
acgtttggta caaacttgga agggtaaact aaggagacgc catgccaccg cacgccaccc 5640
cgccgctgct gccgatgcaa tggagcagcg cctacatctc gtattggtcg ccgatgcggg 5700
aagacgacga ggtcacttcc ggctattgct ggttcgacta tgcccgcgac atttgccgca 5760
tcgacggcct gttcaatccc tggtcggaaa aggagacggg acaccggctc tggatgtcgg 5820
aaatcggcga cgccaggcgc ggacaaagcc gcaaacagaa agtcgcttat gccagggagg 5880
cggagccggc cggcgtgaag ctgtacgagc gggcgctggc cgatgaggtc acgcccttcc 5940
acgagctgtt cctgccgcag gcgatcctga tcgacggcga agcgcgtcat gacggccgcc 6000
acacggtgct gggccaggcg gccgacgcct gggtggtgga gcggccgggc aaagccgcct 6060
cggtgttcta tctccaggcc ggcggcaatc acttgctgcg catggtcacc ggcaacgacg 6120
cgcagcatca gtcggtacgc gactttccga acttccttgc cggcgacatc gcggccagcg 6180
ttttcgtgtc ggaataa 6197
Claims (9)
1.一种脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇,其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子。
2.一种重组大肠杆菌,是将权利要求1所述的基因簇导入大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中获得的产脱氧紫色杆菌素的重组菌。
3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌,其特征在于:所述重组大肠杆菌为大肠杆菌BL-DV CGMCC No.2557。
4.含有权利要求1所述基因簇的表达盒。
5.含有权利要求1所述基因簇或权利要求4所述的表达盒的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体,其特征在于:所述重组表达载体为在原核表达载体的多克隆位点***权利要求1所述的基因簇或者权利要求4所述的表达盒。
7.构建权利要求2或3所述重组大肠杆菌的方法,是将权利要求5或6所述的重组表达载体导入大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL,获得产脱氧紫色杆菌素的重组菌。
8.一种生产脱氧紫色杆菌素的方法,是以L-色氨酸为底物利用权利要求2或3所述的重组菌发酵生产脱氧紫色杆菌素。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于:所述L-色氨酸的浓度为0.3-0.5g/L;所述发酵温度为10-37℃。
Priority Applications (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2008101166013A CN101319219B (zh) | 2008-07-11 | 2008-07-11 | 一种生产脱氧紫色杆菌素的方法及其专用重组菌 |
PCT/CN2009/000430 WO2010003304A1 (zh) | 2008-07-11 | 2009-04-22 | 产脱氧紫色杆菌素的重组菌及其应用 |
US13/003,227 US8778654B2 (en) | 2008-07-11 | 2009-04-22 | Recombinant bacteria for producing deoxyviolacein and uses thereof |
CN2009801258713A CN102099477A (zh) | 2008-07-11 | 2009-04-22 | 产脱氧紫色杆菌素的重组菌及其应用 |
JP2011516946A JP5632370B2 (ja) | 2008-07-11 | 2009-04-22 | デオキシビオラセインを産生する組み換え細菌及びその使用 |
BRPI0910514A BRPI0910514A2 (pt) | 2008-07-11 | 2009-04-22 | bactérias recombinantes para produção de deoxiviolaceína e seus usos. |
GB1100438.9A GB2473401B (en) | 2008-07-11 | 2009-04-22 | Recombinant bacteria for producing deoxyviolacein and uses thereof |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2008101166013A CN101319219B (zh) | 2008-07-11 | 2008-07-11 | 一种生产脱氧紫色杆菌素的方法及其专用重组菌 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101319219A CN101319219A (zh) | 2008-12-10 |
CN101319219B true CN101319219B (zh) | 2010-12-01 |
Family
ID=40179494
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2008101166013A Expired - Fee Related CN101319219B (zh) | 2008-07-11 | 2008-07-11 | 一种生产脱氧紫色杆菌素的方法及其专用重组菌 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101319219B (zh) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5632370B2 (ja) | 2008-07-11 | 2014-11-26 | ツィンファ ユニバーシティ | デオキシビオラセインを産生する組み換え細菌及びその使用 |
WO2011110932A1 (en) | 2010-03-12 | 2011-09-15 | Council Of Scientific & Industrial Research | Process for the production of violacein and its derivative deoxyviolacein containing bioactive pigment from chromobacterium sp. (mtcc 5522) |
CN101974580B (zh) * | 2010-09-06 | 2013-01-02 | 清华大学 | 一种制备色素的方法 |
CN102511484A (zh) * | 2011-10-24 | 2012-06-27 | 清华大学 | 一种微生物抑制剂 |
CN107365779A (zh) * | 2017-08-22 | 2017-11-21 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 利用谷氨酸棒状杆菌生产紫色杆菌素的方法 |
CN110643651B (zh) * | 2019-09-30 | 2022-11-04 | 大连民族大学 | 一种促进紫色色杆菌中脱氧紫色杆菌素表达的方法 |
CN112980864B (zh) * | 2021-03-10 | 2024-04-26 | 百缮药业(苏州)有限公司 | 一种合成抗癌药物中间体的重组大肠杆菌及其构建方法和应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101139564A (zh) * | 2007-08-08 | 2008-03-12 | 清华大学 | 一株杜擀氏菌及其应用 |
-
2008
- 2008-07-11 CN CN2008101166013A patent/CN101319219B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101139564A (zh) * | 2007-08-08 | 2008-03-12 | 清华大学 | 一株杜擀氏菌及其应用 |
Non-Patent Citations (9)
Title |
---|
August PR等.GenBank 序列号:AF172851,Chromobacterium violaceumviolacein biosynthetic gene cluster, complete sequence,10094 bp,DNA,linear.NCBI.2000,第1-5页. * |
August PR等.Sequence analysis and functional characterization of the violacein biosynthetic pathway from Chromobacterium violaceum.J Mol Microbiol Biotechnol2 4.2000,2(4),第513-519页. |
August PR等.Sequence analysis and functional characterization of the violacein biosynthetic pathway from Chromobacterium violaceum.J Mol Microbiol Biotechnol2 4.2000,2(4),第513-519页. * |
Balibar CJ等.In vitro biosynthesis of violacein from L-tryptophan by the enzymes VioA-E from Chromobacterium violaceum.Biochemistry45 51.2006,45(51),第15444-15457页. |
Balibar CJ等.In vitro biosynthesis of violacein from L-tryptophan by the enzymes VioA-E from Chromobacterium violaceum.Biochemistry45 51.2006,45(51),第15444-15457页. * |
王海胜等.杜檊氏菌B2的蓝色素成分的分离及化学结构解析.化工学报59 3.2008,59(3),第630-635页. |
王海胜等.杜檊氏菌B2的蓝色素成分的分离及化学结构解析.化工学报59 3.2008,59(3),第630-635页. * |
王海胜等.紫色杆菌素研究进展.化工进展27 3.2008,27(3),第315-321页. |
王海胜等.紫色杆菌素研究进展.化工进展27 3.2008,27(3),第315-321页. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101319219A (zh) | 2008-12-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101319219B (zh) | 一种生产脱氧紫色杆菌素的方法及其专用重组菌 | |
CN103667371B (zh) | 一种丹参素的生物生产方法 | |
Cadete et al. | Spathaspora brasiliensis sp. nov., Spathaspora suhii sp. nov., Spathaspora roraimanensis sp. nov. and Spathaspora xylofermentans sp. nov., four novel D-xylose-fermenting yeast species from Brazilian Amazonian forest | |
CN102099477A (zh) | 产脱氧紫色杆菌素的重组菌及其应用 | |
CN109735537A (zh) | 一种露湿漆斑菌A553单端孢霉烯合酶基因Tri5启动子及其应用 | |
CN108753669A (zh) | 一种腺嘌呤生产菌株及其构建方法和应用 | |
CN101565709B (zh) | 3-甾酮-9α-羟基化酶基因、3-甾酮-9α羟基化酶还原酶基因、相关载体和工程菌及应用 | |
CN101386834A (zh) | 生产紫色杆菌素的方法及重组菌 | |
CN101748069B (zh) | 一种重组蓝藻 | |
CN101368169B (zh) | 产脱氧紫色杆菌素的重组恶臭假单孢菌及其应用 | |
CN104593407B (zh) | 树干毕赤酵母基因表达***及其构建与应用 | |
CN107043730A (zh) | 用于生产吩嗪‑1‑甲酰胺的基因工程菌株、制备方法及用途 | |
CN102286398B (zh) | 一种生产高活性和高纯度利福霉素sv的方法 | |
CN106754776A (zh) | 一种催化木糖的比酶活提高的葡萄糖脱氢酶突变体 | |
CN117604044A (zh) | 生产香兰素的基因工程菌及其构建方法、应用 | |
CN102703367B (zh) | 一种制备紫色杆菌素的方法及其专用菌 | |
CN102181368B (zh) | 一种利用蓝藻将co2转化为丙酮及异丙醇的技术 | |
CN104561082B (zh) | 一株能够利用木糖的酵母Candida jeffriesii的表达*** | |
CN107142287A (zh) | 青蒿醛双键还原酶DBR1及其重组菌在制备二氢‑β‑紫罗兰酮中的应用 | |
CN104403969A (zh) | 一种可降解孔雀石绿的过氧化物酶及其制备方法 | |
CN103074356B (zh) | 用于敲除链霉菌基因的载体及其构建方法与应用 | |
CN102660484B (zh) | 一株固氮红细菌及其培养方法与应用 | |
CN104403956B (zh) | 木糖醇高温高产工程菌株的构建及应用 | |
CN102732534B (zh) | 厦霉素a和氧厦霉素的生物合成基因簇及其应用 | |
CN105524955A (zh) | 一种生物法制备可可碱的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20101201 Termination date: 20170711 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |