CN109929855B - 多糖裂解单加氧酶lpmo 9d编码基因及酶与制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源于嗜热毁丝霉菌的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D的编码基因及其酶的制备方法与应用。本发明所涉及的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D来源于嗜热毁丝霉菌(Thermoth elomyces thermophila ATCC 42464)。本发明还提供了一种制备该新型多糖裂解单加氧酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将该新多糖裂解单加氧酶的基因克隆到毕赤酵母表达载体上，获得可异源表达该酶的毕赤酵母重组菌株，用该菌株异源表达制备的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D可以降解PASC(用磷酸处理过的微晶纤维素)生成纤维寡糖和纤维寡糖酸。本发明提供的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D可广泛应用于化工、农业、饲料添加和医药等领域，具有较大的生产潜力和经济价值。

Description

多糖裂解单加氧酶LPMO 9D编码基因及酶与制备和应用

技术领域

本发明涉及一种多糖裂解单加氧酶的基因序列及其酶的制备方法和应用。本发明还提供了该多糖裂解单加氧酶的重组质粒和重组基因工程菌株。本发明的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D可广泛应用于农业、食品、饲料添加及医药等领域。

背景技术

随着经济的高速发展和人口的迅速增长，传统的化石能源如煤、石油等不可再生资源已经不能满足当今世界的经济发展需求。除太阳能和风能等洁净能源外，木质纤维素作为世界上最丰富的可再生资源，以其为原料开发和生产生物质燃料与化学品受到了各国的广泛关注。合理地利用这类资源将会对能源危机的缓解具有重大意义。目前工业上纤维素的转化需经过预处理和糖化两个流程，全程主要采用化学法和酶法联合降解纤维素，糖化过程中酶法的应用主要是通过由内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-1,4-D-葡萄糖苷酶组成的糖苷水解酶酶系降解纤维素，它们对于底物结晶区的降解效率较低，高温下活力易丧失，且成本较高，这使得传统的纤维素酶系难以满足工业应用的需求，限制了纤维素等生物质的高效利用。

多糖裂解单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases,LPMO)是一类通过氧化还原作用断裂生物质多糖(纤维素、几丁质和淀粉等)的氧化酶，它能破坏难溶性多糖物质的结晶区产生较为疏松开放的底物结构。它的出现提高了难溶性多糖的降解效率，使得生物质的高效转化成为可能。多糖裂解单加氧酶的来源非常丰富，目前已从细菌(如Streptomyces coelicolor A3(2))、真菌(如Neurospora crassa OR74A)和病毒(如Anomala cuprea entomopoxvirus CV6M)中发现该类酶的。目前已经报道的LPMO有49个，其中AA9家族有26个，AA10家族有19个，AA11家族有1个，AA3家族有3个；本发明中的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D来源于嗜热毁丝霉菌，属于AA9家族，具有区别于其他家族多糖裂解单加氧酶的耐高温性质，它在纤维素糖化过程的应用能提高反应温度缩短糖化时间和减小反应器受污染几率，且该酶的最适作用条件为酸性环境，较其他LPMO适用于工业上酸预处理后的纤维素处理，该酶是一个新型的LPMO，它的克隆表达为后续纤维素的高效降解奠定基础。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新型的来源于嗜热毁丝霉菌(Thermothelomycesthermophila ATCC 42464)的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备新型多糖裂解单加氧酶LPMO 9D的方法。

本发明的第三个目的是提供含有上述的多糖裂解单加氧酶lpmo 9D基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。

本发明的另一个目的是提供新型多糖裂解单加氧酶LPMO 9D在纤维素降解中的应用。

本发明所提供的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D，来源于嗜热毁丝霉菌(Thermothelomyces thermophila ATCC 42464)，其氨基酸序列具有如下特征中的至少一个：

1)序列表中SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-303或20-303位氨基酸残基序列，其中1-19位为信号肽，20-303位为有活性的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D的氨基酸序列。

2)将序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-303或20-303位氨基酸残基进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成具有多糖裂解单加氧酶活性不变的氨基酸序列。

本发明还提供了多糖裂解单加氧酶LPMO 9D的编码基因(命名为lpmo 9D)，具有下述核苷酸序列特征中的至少一个：

1)序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解纤维素的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。

3)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有多糖裂解单加氧酶活性的核苷酸序列。

本发明的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的LPMO 9D的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。

制备重组酶LPMO 9D的方法，是将编码基因lpmo 9D克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的多糖裂解单加氧酶。

所述的重组表达多糖裂解单加氧酶LPMO 9D的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。

用于重组表达的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如Escherichia coli BL21、Escherichia coli J9D09、Escherichiacoli DH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyces lactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillussubtilis 9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lactic acid bacteria COCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichoderma viride，Trichodermareesei，Aspergillus niger、Aspergillus nidulans等)、昆虫细胞(如Bombyx mori，Antharaea eucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO，幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)。

上述的多糖裂解单加氧酶在纤维素降解中可以应用，包括如下应用中的一种或二种；

1)在断裂纤维素糖苷键，获得纤维寡糖中的应用；

2)在氧化降解木质素等生物质，获得纤维寡糖和纤维寡糖酸中的应用；

所述多糖裂解单加氧酶LPMO 9D与纤维素酶系混合后，在协同降解纤维素、制备生物乙醇方面可以应用。

本发明的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D的基因序列是通过RT-PCR技术从嗜热毁丝霉菌(Thermothelomyces thermophila ATCC 42464)中克隆得到。该基因编码区长912bp，编码了303个氨基酸，理论分子量约31.53KDa,属于辅助活力酶AA9家族。重组毕赤酵母表达获得的LPMO 9D，在45℃、pH＝5.0的条件下可以氧化降解经过磷酸处理后的微晶纤维素(PASC)。本发明的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D与同家族已经研究的LPMO进行序列比对，结果发现同源性最高仅有44％，可广泛应用于农业、食品、饲料添加及医药等领域。

附图说明

图1:多糖裂解单加氧酶lpmo 9D基因的电泳检测；

各泳道加入的样品分别是：泳道1-BM 5000DNA Marker；泳道2-lpmo 9D PCR产物

图2:重组多糖裂解单加氧酶LPMO 9D表达的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)。各泳道加入的样品分别是：泳道1-预染蛋白分子量标准；泳道2-Pichia pastoris X-33/pPICZαA诱导96h后上清总蛋白；泳道3-Pichia pastoris X-33/pPICZαA-lpmo 9D诱导96h后上清总蛋白。

图3：LPMO 9D降解PASC的产物MALDI-TOF分析谱图。

具体实施方式

实施例1多糖裂解单加氧酶全长基因克隆

按真菌RNA提取试剂盒(上海生工，SK8659)操作步骤提取嗜热毁丝霉菌株Thermothelomyces thermophila ATCC 42464的RNA，按TaKaRa生物公司的cDNA第一链合成试剂盒(Code NO.:6210A)的操作步骤合成cDNA。根据目的基因的核苷酸序列设计引物，上游引物5′-GACC1TCGAGAAAAGACACTACATCTTTCAGCAGCTG-3′，下游引物：5′-CTACAAGCACTGGCTGTAGTAGTC-3′。以合成的cDNA为模板，采用TaKaRa生物公司的PrimerStar HS DNA聚合酶试剂盒(Code No.:R010A)进行PCR扩增。PCR反应条件为：98℃预变性2min，98℃变性10s,55℃退火5s,72℃延伸1min,共30个循环，72℃延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，切胶回收的目的片段经双酶切消化后，通过T4DNA连接酶将目的基因连接到表达载体pPICZαA上后测序。

实施例2多糖裂解单加氧酶基因序列分析

测序结果采用GenBank数据库中的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)分析，DNAMAN软件进行多序列比对，VectorNTI 8.0分析序列信息。获得的多糖裂解单加氧酶基因(命名为lpmo 9D)编码区长912bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。lpmo 9D编码303个氨基酸和1个终止密码子，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，蛋白质理论分子量为31.53kDa，预测等电点为6.16。SignalP分析表明，LPMO 9D的氨基酸序列中1-20位为信号肽。LPMO 9D的结构域特征与AA9家族成员更为相似，由此表明LPMO 9D为AA9家族的一名新成员。用SWISS-MODEL同源建模服务器(http://swissmodel.expasy.org)对多糖裂解单加氧酶LPMO 9D的蛋白质三维结构进行同源建模，结果显示构建的LPMO 9D结构模型的QMEAN(QMEAN为评价模型质量的分值)值属于可信范围值内，说明得到的LPMO 9D三维结构模型可信。

(1)SEQ ID No:1的信息(参见序列表)

(a)序列特征

*长度：912碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：嗜热毁丝霉菌Thermothelomyces thermophila

(2)SEQ ID No:2的信息(参见序列表)

(a)序列特征

*长度：303残基

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

SEQ ID NO.1

ATGAAGGGACTCCTCGGCGCCGCCGCCCTCTCGCTGGCCGTCAGCGATGTCTCGGCCCACTACATCTTTCAGCAGCTGACGACGGGCGGCGTCAAGCACGCTGTGTACCAGTACATCCGCAAGAACACCAACTATAACTCGCCCGTGACCGATCTGACGTCCAACGACCTCCGCTGCAATGTGGGTGCTACCGGTGCGGGCACCGATACCGTCACGGTGCGCGCCGGCGATTCGTTCACCTTCACGACCGATACGCCCGTTTACCACCAGGGCCCGACCTCGATCTACATGTCCAAGGCCCCCGGCAGCGCGTCCGACTACGACGGCAGCGGCGGCTGGTTCAAGATCAAGGACTGGGGTGCCGACTTTAGCAGCGGCCAGGCCACCTGGACCTTGGCGTCTGACTACACCGCCACGATTCCGGAATGTATTCCCCCCGGCGACTACCTGCTTCGCATCCAGCAACTCGGCATCCACAACCCTTGGCCCGCGGGCATCCCCCAGTTCTACATCTCTTGTGCCCAGATCACCGTGACTGGTGGCGGCAGTGCCAACCCCGGCCCGACCGTCTCCATCCCAGGCGCCTTCAAGGAGACCGACCCGGGCTACACTGTCAACATCTACAACAACTTCCACAACTACACCGTCCCTGGCCCAGCCGTCTTCACCTGCAACGGTAGCGGCGGCAACAACGGCGGCGGCTCCAACCCAGTCACCACCACCACCACCACCACCACCAGGCCGTCCACCAGCACCGCCCAGTCCCAGCCGTCGTCGAGCCCGACCAGCCCCTCCAGCTGCACCGTCGCGAAGTGGGGCCAGTGCGGAGGACAGGGTTACAGCGGCTGCACCGTGTGCGCGGCCGGGTCGACCTGCCAGAAGACCAACGACTACTACAGCCAGTGCTTGTAG

SEQ ID NO.2

MKGLLGAAALSLAVSDVSAHYIFQQLTTGGVKHAVYQYIRKNTNYNSPVTDLTSNDLRCNVGATGAGTDTVTVRAGDSFTFTTDTPVYHQGPTSIYMSKAPGSASDYDGSGGWFKIKDWGADFSSGQATWTLASDYTATIPECIPPGDYLLRIQQLGIHNPWPAGIPQFYISCAQITVTGGGSANPGPTVSIPGAFKETDPGYTVNIYNNFHNYTVPGPAVFTCNGSGGNNGGGSNPVTTTTTTTTRPSTSTAQSQPSSSPTSPSSCTVAKWGQCGGQGYSGCTVCAAGSTCQKTNDYYSQCL

实施例3lpmo 9D基因在毕赤酵母中的重组表达

以嗜热毁丝霉菌cDNA的基因组DNA为模板，利用设计的上游引物(5′-GACC1TCGAGAAAAGACACTACATCTTTCAGCAGCTG-3′，下游引物：5′-CTACAAGCACTGGCTGTAGTAGTC-3′。)按实施例1中程序扩增编码多糖裂解单加氧酶的成熟蛋白的基因序列(不包括信号肽基因)。PCR扩增产物和表达载体pPICZαA(美国Novagen公司)通过T4DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布在含100μg/mL博莱霉素的低盐Luria-Bertani培养基固体平板上，37℃培养12-16h，挑取单克隆，用上下游引物进行菌落PCR验证，结果得到大小正确的扩增产物；将正确的单克隆接入含有100μg/mL博莱霉素液体低盐Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；接着将该重组质粒送去华大基因(北京)测序，结果表明，Xho I和Not I酶切位点之间***了SEQ ID NO 1所示的lpmo 9D基因，且***方向正确，证明重组质粒构建成功，将该重组质粒命名为pPICZαA-lpmo 9D。

将pPICZαA-lpmo 9D转化毕赤酵母菌株X-33(美国Invitroge公司，V195-20)，然后按照该公司提供的操作步骤进行多糖裂解单加氧酶LPMO 9D的诱导表达。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测多糖裂解单加氧酶的表达情况，结果如图2所示，多糖裂解单加氧酶在甲醇诱导下有明显的表达。

实施例4多糖裂解单加氧酶LPMO 9D氧化降解PASC的产物分析

取5mg底物PASC，加入多糖裂解单加氧酶LPMO 9D(1μM)和抗坏血酸(1mM)，50℃反应24h后终止反应，离心除去不溶底物，取上清，用sevage法按照反应产物：sevage试剂＝4:1的比例振荡离心除去产物中蛋白质后用MALDI-TOF检测产物。

如图3所示，以PASC为底物，降解产物主要为DP＝2-7的寡糖以及DP＝2-6的糖酸，因此该酶可以被用于寡糖和糖酸的制备，并且可以与纤维素酶系协同降解纤维素提高纤维素降解效率，为纤维素的降解提供新的视角。

序列表

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 多糖裂解单加氧酶LPMO9D编码基因及酶与制备和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 912

<212> DNA

<213> 嗜热毁丝霉菌(Thermothelomyces thermophila)

<400> 1

atgaagggac tcctcggcgc cgccgccctc tcgctggccg tcagcgatgt ctcggcccac 60

tacatctttc agcagctgac gacgggcggc gtcaagcacg ctgtgtacca gtacatccgc 120

aagaacacca actataactc gcccgtgacc gatctgacgt ccaacgacct ccgctgcaat 180

gtgggtgcta ccggtgcggg caccgatacc gtcacggtgc gcgccggcga ttcgttcacc 240

ttcacgaccg atacgcccgt ttaccaccag ggcccgacct cgatctacat gtccaaggcc 300

cccggcagcg cgtccgacta cgacggcagc ggcggctggt tcaagatcaa ggactggggt 360

gccgacttta gcagcggcca ggccacctgg accttggcgt ctgactacac cgccacgatt 420

ccggaatgta ttccccccgg cgactacctg cttcgcatcc agcaactcgg catccacaac 480

ccttggcccg cgggcatccc ccagttctac atctcttgtg cccagatcac cgtgactggt 540

ggcggcagtg ccaaccccgg cccgaccgtc tccatcccag gcgccttcaa ggagaccgac 600

ccgggctaca ctgtcaacat ctacaacaac ttccacaact acaccgtccc tggcccagcc 660

gtcttcacct gcaacggtag cggcggcaac aacggcggcg gctccaaccc agtcaccacc 720

accaccacca ccaccaccag gccgtccacc agcaccgccc agtcccagcc gtcgtcgagc 780

ccgaccagcc cctccagctg caccgtcgcg aagtggggcc agtgcggagg acagggttac 840

agcggctgca ccgtgtgcgc ggccgggtcg acctgccaga agaccaacga ctactacagc 900

cagtgcttgt ag 912

Claims (6)

1.一种重组的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D在纤维素降解中的应用，其特征在于所述的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D编码基因如序列表中SEQ ID NO.1所示；所述的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D去除信号肽后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2的第20-303位所示；所述的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D对含纤维素类底物PASC有氧化降解活性，产物为寡糖和寡糖酸混合物。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：将多糖裂解单加氧酶LPMO 9D编码基因克隆入表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的多糖裂解单加氧酶。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的重组表达多糖裂解单加氧酶的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体中的一种。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于：用于重组表达多糖裂解单加氧酶的重组菌或转基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞中的一种。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于：包括如下应用中的一种或二种；

1）在断裂纤维素糖苷键，获得纤维寡糖中的应用；

2）在氧化降解木质素生物质，获得纤维寡糖和纤维寡糖酸中的应用；

3）在氧化降解木质素生物质，该酶具有耐高温性质，最适作用温度为50℃，在55℃温度条件下反应24h，酶活力仍能保持80％以上。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述多糖裂解单加氧酶LPMO 9D与纤维素酶系混合后，在协同降解纤维素、制备生物乙醇方面的应用。

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