CN105518028A - 与dll4和vegf特异性结合的新型双靶向蛋白及其用途 - Google Patents

与dll4和vegf特异性结合的新型双靶向蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及新型双靶向蛋白，其包含：与δ样配体4(DLL4)特异性结合的蛋白，和与血管内皮细胞生长因子(VEGF)特异性结合的抗体。

Description

与DLL4和VEGF特异性结合的新型双靶向蛋白及其用途
技术领域
本发明涉及一种新型双靶向蛋白，其包含：与δ样配体4(DLL4)特异性结合的蛋白和与血管内皮细胞生长因子(VEGF)特异性结合的抗体。
技术背景
已报道Notch信号传导在脊椎和无脊椎动物中是高度保守的且在发育的初始阶段决定细胞命运中起非常关键的作用。Notch信号传导已知为调节神经细胞、眼细胞、淋巴细胞、肌细胞、造血干细胞等分化的主要途径且还参与血管发育。哺乳动物具有四种Notch受体(Notch1、2、3和4)，且每种Notch受体作为具有300-350kDa大小的蛋白合成并在S1位点通过Golgi(高尔基)中的弗林蛋白酶样转化酶(furin-likeconvertase)裂解以在细胞表面形成异二聚体。此外，在哺乳动物中发现了四种Notch配体(锯齿状-1/2和δ样配体(DLL)1/3/4)。
活化的Notch信号传导已知在多种肿瘤模型中诱导肿瘤生成。当在大鼠的造血干细胞中表达活化的NotchNICD时，发生T-细胞白血病/淋巴瘤，且在约50％的T-ALL(T-细胞急性淋巴性白血病)中发现活化的Notch1。此外，在乳腺癌的情况中，发现Notch4受体在引入MMTV(鼠乳腺肿瘤病毒)的大鼠(CzechII)中过表达，且已报道乳腺肿瘤在这些小鼠中的发生。已报道Notch受体和配体和Notch信号传导靶标在多种癌症如子***，肺癌，胰腺癌，卵巢癌，乳腺癌和***癌中活化。已知Notch1受体与乳腺癌患者更差的预后相关且与***癌的转移相关。
δ样配体4(DLL4)(下文称为"DLL4")是与在血管内皮细胞中过表达的Notch蛋白结合的δ类配体之一。其已知为调节血管生成的主要因子。DLL4与在血管内皮细胞中过表达的Notch1或Notch4特定结合。已知尽管其也在正常血管中表达，但DLL4在癌症血管中高度过表达。血管生成指新血管从预先存在的血管形成的机制。具体地，在肿瘤中，血管生成由血管生成因子如VEGF(血管内皮细胞生长因子)引起从而向癌症组织的缺氧区补给氧气和营养物。已知肿瘤中的血管生成不仅在肿瘤生长中起关键作用，也在肿瘤转移中起重要作用。当阻断肿瘤中通过DLL4的Notch信号传导时，血管生成不能容易受到控制，且因此可抑制肿瘤的生长。此外，当通过DLL4的Notch信号传导受到抑制时，自身免疫性疾病可通过增加调节性T细胞(Treg)的数目而治疗(美国专利公开号2011-0189200)。例如，DLL4在癌症和自身免疫疾病的治疗中成为新的靶标。
同时，作为用于抑制血管生成的抗癌药物，靶向VEGF的(Genentech/Roche)已由FDA在2004批准且作为抗癌治疗剂已取得巨大成功。然而，近期的临床模型和临床前动物模型研究已表明所有固体肿瘤对VEGF抑制剂都不响应，且还报道了其中在初始阶段用VEGF抑制剂治疗一些肿瘤在一段时间后展示抗性的数个病例。此外，研究结果已报道，表明VEGF抑制剂的施用将癌细胞转变成更具侵略性且容易转移的癌细胞。这些研究报道推动了新型克服Avastin抗性或具有优于Avastin的效力的抗癌靶标的研究和开发。在这些新型抗癌靶标中，涉及DLL4/Notch信号传导途径的蛋白引起了关注。根据近日报道的研究结果，由于VEGF/VGEFR信号传导途径和DLL4/Notch信号传导途径通过不同机制影响血管生成，预期当两种信号传导途径都受到抑制时可获得较强的协同抗癌作用。
发明内容
技术问题
本发明做出了巨大的努力以开发可特异性与源自人的DLL4和VEGF结合的双靶向蛋白从而有效抑制DLL4/Notch和VEGF/VEGFR信号传导途径且可最小化免疫原性的风险。结果，本发明构建了与人VEGF特异性结合的新型人单克隆抗体，它是双靶向蛋白，其中与人DLL4特异性结合的新型ScFv(单链可变片段)与类似于IgG型Avastin的蛋白的C末端区连接，且发现这种双靶向蛋白不仅有效地抑制VEGF和VEGF受体间的相互作用，还抑制DLL4和Notch蛋白间的相互作用，因此显示优异的抗癌效果，由此完成本发明。
技术方案
本发明的目的在于提供双靶向蛋白，其包含：与DLL4特异性结合的蛋白和与VEGF(血管内皮细胞生长因子)特异性结合的抗体，其中所述与DLL4特异性结合的蛋白识别DLL4的包含由SEQIDNO:21所示的DLL4蛋白氨基酸序列中氨基酸残基第58-第65的氨基酸序列和第110-第115的氨基酸序列的构象表位。
本发明的另一目的是提供编码上述双靶向蛋白的多核苷酸、包含所述多核苷酸的表达载体和包含所述表达载体的转化子。
本发明的另一目的是提供用于产生双靶向蛋白的方法。
本发明的另一目的是提供包含上述双靶向蛋白的组合物。
本发明进一步的目的是提供用于治疗癌症的药物组合物，其包含上述双靶向蛋白。
本发明的另一目的是提供用于诊断癌症的组合物，其包含上述双靶向蛋白。
本发明的再一目的是提供使用上述双靶向蛋白用于诊断癌症的方法。
本发明的另一目的是提供DLL4的构象表位，其包含SEQIDNO:21所示的DLL4(δ样配体4)蛋白的氨基酸序列中氨基酸残基第58-第65和第110-第115。
本发明的另一目的是提供与DLL4特异性结合的单克隆抗体，其识别上文所述的构象表位。
本发明的另一目的是提供编码所述单克隆抗体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的表达载体和包含所述表达载体的转化子。
本发明的另一目的是提供用于治疗癌症的方法，其包括将上文所述的双靶向蛋白施用至疑似患有癌症的受试者的步骤。
优势效果
根据本发明的双靶向蛋白可通过VEGF和DLL4两者治疗癌症，并由于其包含与DLL4特异性结合的新型蛋白而展示优异的结合亲和力和抗癌效果。因此，其可在癌症治疗和诊断领域广泛使用。
附图简述
图1a和1b显示能够与DLL4和VEGF都结合的双靶向蛋白的结构。
图2a显示通过在CHO细胞中表达能与DLL4和VEGF两者结合的双靶向蛋白、纯化表达的蛋白和通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白所获得的结果。
图2b显示通过在CHO细胞中表达能与DLL4和VEGF两者结合的双靶向蛋白、纯化表达的蛋白和通过SEC-HPLC层析术分析纯化的蛋白所获得的结果。
图3显示实施的酶联免疫吸附测定法(ELISA)以检查双靶向蛋白与DLL4和VEGF结合的能力的结果。
图4a显示实施的Biacore试验以测量双靶向蛋白对于由双靶向蛋白所靶向的抗原DLL4的平衡解离常数(KD)的结果。
图4b显示实施的Biacore试验以测量双靶向蛋白对于由双靶向蛋白所靶向的抗原VEGF的平衡解离常数(KD)的结果。
图5显示实施ELISA以测量双靶向蛋白中和DLL4和VEGF的能力的结果。
图6显示人DLL4和MLCK2抗体在交联剂存在或不存在时形成复合物。
图7显示其中由SEQIDNO:21所示的DLL4氨基酸序列的氨基酸残基58-65组成的片段[FRVCLKHF])和由SEQIDNO:22所述的片段在人DLL4C2结构域(氨基酸残基27-174)上构成连续分子表面的模型。
图8显示实施的Western印迹以检查编码野生型和DLL4各自的胞外结构域的缺失片段的突变体蛋白的结合亲和力的结果。
图9a显示当实施用VEGF靶向抗体Avastin的处理时，血管内皮细胞的增殖以浓度依赖的方式受到抑制而无论DLL4存在与否。
图9b显示当实施用单独针对DLL4抗体的处理时，血管内皮细胞的增殖仅在具有DLL4的实验组中以依赖于抗DLL4抗体浓度的方式出现。
图9c显示当实施用双靶向蛋白处理时，无DLL4的实验组显示了与用Avastin抗体(黑色条状)处理相似的增殖抑制效果，且具有DLL4的实验组与Avastin(白色条状)相比显示了血管增殖抑制效果的减少。
图10显示Western印迹分析的结果，其表明与DLL4和VEGF结合的双靶向蛋白在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中显示抑制DLL4/Notch和VEGF/VEGFR信号传导途径的活性。
图11显示在裸鼠中构建的Avastin抗性的人SCH胃癌异种移植模型中与DLL4和VEGF结合的双靶向蛋白比Avastin具有更强的抗癌效果。
图12显示在裸鼠中构建的Avastin抗性的人A549肺癌异种移植模型中与DLL4和VEGF结合的双靶向蛋白比Avastin具有更强的抗癌效果。
实施发明的最佳模式
一方面，本发明提供双靶向蛋白，其包含：与DLL4特异性结合的蛋白和与VEGF(血管内皮细胞生长因子)特异性结合的抗体，其中所述与DLL4特异性结合的蛋白识别DLL4的包含由SEQIDNO:21所示的DLL4(δ样配体4)蛋白的氨基酸序列中氨基酸残基第58-第65和第110-第115的构象表位。
如本文使用的术语"双靶向蛋白"指能够与两种不同抗原(靶蛋白)结合的蛋白。具体地，双靶向蛋白天然并不存在且优选由基因工程方法或任何其他方法产生。
就本发明而言，双靶向蛋白可与在癌细胞中过表达的VEGF和在上皮细胞中过表达的DLL4两者结合。双靶向蛋白可以是抗体的形式。如本文使用的术语"双靶向蛋白"可与术语"双靶向抗体"、"双特异性抗体"或"双特异性抗体蛋白"交换使用。优选地，本发明的双靶向蛋白可靶向VEGF和DLL4作为抗原。根据本发明的双靶向蛋白形式包括其中特异性与VEGF结合的IgG类抗体和特异性与DLL4结合的蛋白彼此通过接头连接的双靶向蛋白形式，但并不限于此。根据本发明的双靶向蛋白的结构如图1a中示意图所示。
具体地，本发明的双靶向蛋白可包含由SEQIDNO:1所示的重链氨基酸序列和由SEQIDNO:20所示的轻链氨基酸序列，但不限于此。
如本文使用的术语"抗体"指包含与特定抗原发生免疫反应的免疫球蛋白分子的蛋白分子，其充当特异性识别抗原的受体。术语可包括所有多克隆抗体、单克隆抗体、全长抗体和抗体片段。此外，术语可包括通过基于工程产生的形式，如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)和异源抗体(例如双特异性抗体)。全长抗体具有两条全长轻链和两条全长重链，其中每条轻链与重链通过二硫键连接。全长抗体可包含IgA、IgD、IgE、IgM和IgG，和IgG的亚型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。此外，术语抗体可包括二价分子、双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体。具体地，所述可特异性地与VEGF结合的抗体可以是IgG型。
本发明中，双靶向蛋白可以是其中与VEGF(血管内皮细胞生长因子)特异性结合的免疫球蛋白G(IgG)型抗体和与DLL4(δ样配体4)特异性结合的全长抗体、Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG或scFv型蛋白彼此通过接头连接的形式。
通常而言，免疫球蛋白和scFv具有重链和轻链，且每条重链和轻链包含恒定区和可变区(所述区也称为结构域)。轻链和重链可变区包含四个框架区和三个高度可变区，也称为“互补决定区”(下文称为“CDR”)。CDR主要负责与抗原表位结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N-末端开始顺序编号，且还通常通过特定CDR定位的链识别。
本发明的双靶向蛋白包含与DLL4特异性结合的蛋白和与VEGF特异性结合的抗体，其对于源自人的DLL4和VEGF展示强的亲和力，有效地抑制DLL4表达细胞(例如癌细胞或血管内皮细胞)与Notch1或Notch4受体的结合，且还抑制其中表达VEGF受体的血管内皮细胞通过在癌细胞中过表达的VEGF活化的血管生成过程。因此，本发明的双靶向蛋白可在疾病如癌症的治疗中展示较强的治疗效果。
根据本发明的双靶向蛋白的VEGF特异性结合抗体和DLL4特异性结合蛋白可维持其特异结合，且具体地可同时抑制两种靶标(抗原)。因此，该抗体和蛋白比结合并抑制单一靶标的蛋白或抗体更加有效，且这些双靶向蛋白可同时抑制两种信号。
如本文使用的术语"抗体片段"指具有与抗原结合的能力的片段，且包括抗体的抗原结合形式，例如，Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG和scFv。具体地，术语"抗体片段"包括scFv(单链可变片段)，且特别是包括二价分子、双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体。
如本文使用的术语"scFv(单链可变片段)"指包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段并包含抗体VH和VL结构域，其中所述结构域可存在于单多肽链。
如本文使用的短语“双靶向蛋白，其包含：与DLL4特异性结合的蛋白和与VEGF(血管内皮细胞生长因子)特异性结合的抗体，其中所述与DLL4特异性结合的蛋白识别DLL4的包含由SEQIDNO:21所示的DLL4(δ样配体4)蛋白的氨基酸序列中氨基酸残基第58-第65和第110-第115的构象表位”可包括任何同时抑制DLL4和VEGF涉及的两种信号传导途径的双靶向蛋白。双靶向蛋白的VEGF特异性结合抗体和DLL4特异性结合蛋白可以是如上文所述的全长抗体和抗体片段形式。
如本文使用的短语“识别DLL4的包含由SEQIDNO:21所示的DLL4(δ样配体4)蛋白的氨基酸序列中氨基酸残基第58-第65和第110-第115的构象表位的与DLL4特异性结合的蛋白”指特异性地与DLL4的包含SEQIDNO:21所示的DLL4(δ样配体4)的氨基酸序列中氨基酸残基第58-第65和第110-第115的构象表位结合的蛋白。该蛋白意指可通过抑制癌症生长展示癌症治疗效果的蛋白。所述蛋白可以高亲和力与表位结合，并可发挥中和DLL4活性的功能。蛋白可阻断DLL4与Notch受体的结合，并抑制DLL4介导的信号传导。与DLL4的包含SEQIDNOs:21和22的氨基酸序列的构象表位特异性结合的蛋白可特定地为全长抗体、Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG或scFv(单链可变片段)的形式。
特异性与DLL4的包含SEQIDNO:21所示DLL4(δ样配体4)蛋白的氨基酸序列中氨基酸残基第58-第65和第110-第115的构象表位结合的蛋白，具体地，与DLL4特异性结合的蛋白可包含：重链可变区，其包含由SEQIDNO:2所示的重链CDR1、由SEQIDNO:3所示的重链CDR2和由SEQIDNO:4所示的重链CDR3；和轻链可变区，其包含由SEQIDNO:5所示的CDR1、SEQIDNO:6所示的CDR2和由SEQIDNO:7所示的CDR3。
更具体地，重链可包含由SEQIDNO:8所示的重链氨基酸序列，且轻链可包含由SEQIDNO:9所示的轻链氨基酸序列。然而，蛋白也可以是任何包含上文所述的CDR序列并与DLL4特异性结合以展示癌症治疗效果的蛋白。重链和轻链彼此可通过接头连接。
此外，本发明双靶向蛋白的DLL4特异性结合蛋白不仅可与人DLL4特异性结合，还可与小鼠DLL4结合，并可抑制DLL4和Notch蛋白间的相互作用。
本发明的实例中，识别了本发明的具有优异的抑制DLL4和VEGF生物活性的双靶向蛋白与DLL4特异性结合的抗体表位。具体地，本发明中，发现与DLL4的连续分子表面结合，所述连续分子表面包含DLL4氨基酸序列中的氨基酸残基第58-第65和第110-第115。因此，DLL4氨基酸序列中的氨基酸残基第58-第65(SEQIDNO:22)和/或第110-第115(SEQIDNO:23)可为根据本发明的特异性结合DLL4抗体的表位。更具体地，包含SEQIDNO:22和23的DLL4的分子表面区可为构象表位。
如本文使用的术语"δ样配体4(DLL4)"指与Notch受体结合的δ类配体的一种且优选指与Notch1或Notch2结合的蛋白，但不限于此。DLL4可为任何哺乳动物DLL4，但优选为人或小鼠DLL4。已知DLL4在多种肿瘤细胞包括肿瘤脉管中过表达并通过在异种移植模型中增加异常脉管的数目促进癌症生长。
因此，本发明的双靶向蛋白包含特异性与DLL4的含有SEQIDNO:21所示的DLL4(δ样配体4)蛋白的氨基酸序列中氨基酸残基第58-第65和第110-第115的构象表位特异性结合的蛋白，其可通过抑制DLL4的功能有效用于治疗癌症。关于DLL4的信息可从已知的数据库获得，包括NationalInstitutesofHealth的GenBank，且可以例如为GenBank登录号NM_019074.3(GeneID:54567和NCBI参考序列:NM_019074.3)的DLL4信息。DLL4可包含SEQIDNO:21的氨基酸序列。
如本文使用的术语"Notch受体"指介导Notch信号传导的蛋白，且可与Notch互换使用。Notch受体可以是介导Notch信号传导的任何蛋白。优选地，Notch受体可以是Notch1或Notch4受体，但不限于此。
如本文使用的短语"抑制人δ样配体4(DLL4)和Notch受体间的相互作用"意为本发明的DLL4特异性结合蛋白与DLL4结合以抑制DLL4和Notch受体间的相互作用。优选地，短语意为特异性针对DLL4的含有由SEQIDNO:21所示的DLL4(δ样配体4)蛋白的氨基酸序列中氨基酸残基第58-第65和第110-第115的构象表位的双靶向蛋白与DLL4结合以抑制DLL4和Notch1或Notch4受体间的相互作用，但不限于此。当本发明的双靶向蛋白特异性地与DLL4的含有由SEQIDNO:21所示的DLL4(δ样配体4)蛋白的氨基酸序列中氨基酸残基第58-第65和第110-第115的构象表位结合时，其通过与DLL4的结合阻止Notch受体的结构改变。因此，其预防Notch蛋白水解以抑制Notch信号传导。已知当DLL4在肿瘤中与Notch受体结合时，其增加血管大小并激活血管内皮细胞间的信号传导或癌细胞间的Notch信号传导，由此在肿瘤的增殖和转移中发挥作用。
因此，当肿瘤中DLL4的Notch信号传导受到抑制时，血管生成可不易控制，因而肿瘤生长可受到抑制。此外，当阻断DLL4时，细胞中在血管生成位点末端的侧抑制的丧失看起来引起过度出芽(sprouting)，导致具有低生产力的血管生成反应的减少，且可减少用于补给氧的灌注以诱导肿瘤周围的缺氧，获得抗肿瘤效果，甚至针对对于抗VEGF疗法显示抗性的肿瘤亦如此。
因此，本发明的包含可有效抑制DLL4和Notch间相互作用的DLL4特异性结合蛋白的双靶向蛋白可有效用于癌症的治疗。
如本文使用的短语"与VEGF特异性结合的抗体"或“VEGF特异性结合抗体”包括特异性与肿瘤细胞中抗原VEGF结合的全部抗体。具体地，抗体可为贝伐单抗一种靶向VEGF的治疗性抗体，但不限于此。这种与VEGF特异性结合的抗体可包括如上文所述的全长抗体或抗体片段，且可以是IgG抗体，但不限于此。VEGF是在血管生成中发挥重要作用的配体，且当抑制VEGF时，将不发生血管生成，且因此可治疗癌症。由USFDA批准的贝伐单抗(Genentech)是可稳定使用的治疗抗体。
特异性与VEGF结合的抗体，具体地可包含：含有由SEQIDNO:10所示的重链CDR1、由SEQIDNO:11所示的重链CDR2和由SEQIDNO:12所示的重链CDR3的重链可变区；和含有由SEQIDNO:13所示的轻链CDR1、由SEQIDNO:14所示的轻链CDR2和由SEQIDNO:15所示的轻链CDR3的轻链可变区。更优选地，特异性与VEGG结合的抗体可包含由SEQIDNO:16所示的重链可变区氨基酸序列和由SEQIDNO:17所示的轻链可变区氨基酸序列。然而，抗体还可为任何包含上文所述的CDR序列并可与VEGF特异性结合以展示癌症治疗效果的抗体。
根据本发明的双靶向蛋白的VEGF特异性结合抗体可与在肿瘤细胞中过表达的VEGF特异性结合，且因此可在表达VEGF的肿瘤细胞上富集本发明的双靶向蛋白。此外，其可通过结合VEGF展示抗癌活性。
如本文使用的术语"血管内皮细胞生长因子(VEGF)"指增强血管内皮细胞生长活性的生长因子类型且由多种类型的细胞包括巨噬细胞、平滑肌细胞和肿瘤细胞分泌。VEGF在胚胎血管生成中发挥重要作用，并发挥诱导血管生成的功能从而将氧气供给其中发生快速生长和代谢的肿瘤组织。VEGF蛋白及其受体所涉及的途径已作为成人中抗癌作用剂的靶信号传导途径而被研究。
此外，双靶向蛋白的VEGF结合位点意为抑制人VEGF和VEGF受体间的相互作用。具体地，其意为特异性针对VEGF的双靶向蛋白与VEGF结合以抑制VEGF和VEGFR-2间的相互作用，但不限于此。
就本发明而言，VEGF受体可以是与哺乳动物VEGF结合的任何蛋白。具体地，其可以是与人VEGF结合的蛋白。
当VEGF和VEGF受体间的相互作用被本发明的VEGF特异性双靶向蛋白抑制时，会抑制通过VEGF与VEGF受体的结合的VEGF/VEGF信号传导。已知当肿瘤中的VEGF和VEGF受体彼此结合时，癌症组织基质/内皮细胞中的VEGF/VEGF受体信号传导被活化以强烈抑制血管生成，与DLL4/Notch信号传导途径不同的是，其降低肿瘤中的血管数目并减弱血管功能，由此抑制癌症增殖和转移。
因此，本发明的特异性针对DLL4和VEGF的双靶向蛋白在癌症组织中显示通过不同机制抑制血管生成的能力，并因此可用作具有更佳抗癌活性的治疗剂。
具体地，双靶向蛋白可为其中与DLL4特异性结合的蛋白和与VEGF特异性结合的IgG(免疫球蛋白G)型抗体彼此通过接头连接的形式。
如本文使用的术语“接头”指任何可通过使用氢键、静电相互作用、范德华力、二硫键、盐桥、疏水性相互作用、共价键等连接两种不同融合配偶体(例如生物聚合物)的部分。具体地，接头可具有至少一个半胱氨酸残基，其在生理条件或其他标准肽条件(例如用于纯化或保存肽的条件)下参与至少一个二硫键。除连接融合配偶体，接头还可作为间隔发挥作用并提供融合配偶体间的空间或作为铰链以为偶联物提供柔性或刚性。接头可以是肽基接头或非肽基接头。融合配偶体间经由肽键或二硫键的直接连接在接头作用的范围内。
在本发明中，接头优选可为将DLL4特异性结合蛋白与VEGF特异性结合抗体连接的多肽，但其并不特定局限于此。更优选地，接头可以是将VEGF特异性结合抗体Fc区的C-末端与VEGF特异性结合抗体连接的肽基接头。更优选地，接头可以是包含GGGGS基序三次重复的氨基酸序列的肽基接头。GGGGS基序可以重复1-10次。最优选地，接头可包含SEQIDNO:18的氨基酸序列或由SEQIDNO:19的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。
接头肽(SEQIDNO:18)：GGGGSGGGGSGGGGS
接头多核苷酸(SEQIDNO:19):GGTGGAGGTGGCAGCGGTGGTGGCGGCAGTCCCGGTGGCGGCTCC
如本文使用的术语"非肽接头"指包含至少两个彼此可能通过非肽共价键连接的任何重复单元的生物兼容性接头。
在本发明中使用的非肽接头的实例包括聚乙二醇(PEG)均聚物、聚丙二醇均聚物、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、右旋糖酐(dextran)、聚乙烯基***、生物可降解的聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及其组合。优选地，非肽基接头可以是聚乙二醇均聚物。本领域已知的或可在现有技术水平容易制备的衍生物在本发明的范围内。更优选地，非肽基接头可为具有1-5kDa分子量的聚乙二醇均聚物。最优选地，其可以是具有3.4kDa分子量并在两末端包含醛基的接头，其可将VEGF特异性结合抗体与DLL4特异性结合蛋白连接。具体地，两末端的醛官能团在最小化非特异性反应中有效。
直接或间接经由接头连接的区包括Fc片段、Fab'、F(ab')2、Fab、Fv等，但不特定局限于此。双靶向蛋白可以是：其中DLL4特异性结合蛋白的整体或部分与VEGF特异性结合抗体的整体或部分连接的形式；或其中DLL4特异性结合蛋白的整体或部分与VEGF特异性结合抗体的整体或部分通过肽基接头连接的形式；或其组合，但双靶向蛋白不限于此。
此外，双靶向蛋白可为其中DLL4特异性结合蛋白的整体或部分与VEGF特异性结合抗体重链的整体或部分通过肽基接头连接的形式；其中DLL4特异性结合蛋白的整体或部分与VEGF特异性结合抗体轻链的整体或部分通过肽基接头连接的形式；或其组合。
在本发明的实例中，特异性与DLL4和VEGF结合的双靶向蛋白Avastin-DLL4BsAb通过将IgG型Avastin重链区的C-末端与scFv型DLL4结合蛋白通过接头连接构建以制备编码双靶向蛋白的多核苷酸，将多核苷酸***载体，将载体导入动物细胞，并从细胞分离Avastin-DLL4-结合双靶向蛋白。双靶向蛋白分子具有其中AvastinIgG抗体分子与DLL4的scFv通过接头连接的结构(图1)。还分离了在动物细胞中表达的Avastin-DLL4结合双靶向蛋白，并测量了其表达和纯度(图2a和2b)。此外，已发现Avastin-DLL4结合双靶向蛋白与靶标VEGF和DLL4特异性结合(图3)。此外，已表明双靶向蛋白对于每种抗原的结合亲和力与对照抗体相似。具体地，双靶向蛋对于人DLL4展示了30nM的KD值且对于人VEGF展示了0.126nM的KD值(表2和3)。此外，已表明由血管内皮细胞DLL4和人Notch1受体的结合和VEGF与VEGF受体的结合各引起的信号传导途径通过用双靶向蛋白的治疗有效抑制(图10)。这些结果表明本发明的特异性针对DLL4和VEGF的双靶向蛋白可有效阻断DLL4与Notch受体的结合和VEGF与VEGF受体的结合，由此提供抗癌效果。在Avastin抗性的人SCH胃癌和A549肺癌异种移植模型中发现了双靶向蛋白的抗癌效果(图11和12)。
另一方面，本发明提供编码双靶向蛋白的多核苷酸、包含所述多核苷酸的表达载体和导入所述表达载体的转化子。
包含编码根据本发明的双靶向蛋白的多核苷酸的表达载体并不具体受到限制，但可以是能够在真核或原核细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体，所述细胞包括哺乳动物细胞(例如人、猴、兔、大鼠、仓鼠或小鼠细胞)、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和细菌细胞(例如大肠杆菌)。优选地，其可以是包含至少一种选择性标记物且可操作地与合适的启动子连接由此多核苷酸可在宿主细胞中表达的载体。更优选地，载体可包含引入噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或反转录病毒载体的多核苷酸。
包含编码双靶向蛋白的多核苷酸的表达载体可以是包含编码双靶向蛋白的重链或轻链的每种多核苷酸的表达载体或包含编码双靶向蛋白的重链和轻链的全部多核苷酸的表达载体。
其中导入本发明的表达载体以形成转化子的细胞包括细菌细胞如大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)；酵母细胞；真菌细胞如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)；昆虫细胞如果蝇(Drosophila)或夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、人成淋巴细胞样(lymphoblastoid)、COS、NSO(小鼠骨髓瘤)、293T、Bowes黑素瘤细胞、HT-1080、BHK(幼仓鼠肾细胞)、HEK(人胚肾细胞)、PERC.6(人视网膜细胞)等；和植物细胞。本发明的实例中，使用CHO-S细胞作为宿主细胞。
如本文使用的术语"导入"指将包含编码双靶向蛋白的多核苷酸的载体递送入宿主细胞。该导入可通过多种本领域已知的方法实施，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-右旋糖酐介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体介导的转染、脂质体融合、脂质转染和原生质体融合。此外，转染意为将预期的材料使用病毒微粒通过感染的方式递送入细胞。此外，可将载体通过基因轰击导入宿主细胞。本发明中，导入可与转染互换使用。
另一方面，本发明提供用于产生双靶向蛋白的方法。
优选地，用于产生双靶向蛋白的方法可以是用于产生包含与DLL4特异性结合的蛋白和与VEGF(血管内皮细胞生长因子)特异性结合的抗体的双靶向蛋白的方法，所述方法包括步骤：(a)培养转化子以产生双靶向蛋白；和(b)回收步骤(a)中产生的双靶向蛋白。
更优选地，用于产生双靶向蛋白的方法可以是包括下列步骤的方法：(a)制备编码与VEGF特异性结合的抗体的多核苷酸和编码与DLL4特异性结合的蛋白的多核苷酸，且包含：含有由SEQIDNO:2所示的重链CDR1、由SEQIDNO:3所示的重链CDR2和由SEQIDNO:4所示的重链CDR3的重链可变区；和含有SEQIDNO:5所示的CDR1、SEQIDNO:6所示的CDR2和SEQIDNO:7所示的CDR3的轻链可变区；(b)将步骤(a)中制备的编码VEGF特异性结合抗体的多核苷酸的编码Fc区3’末端的多核苷酸部分与编码DLL4特异性结合蛋白的多核苷酸的5’末端通过接头连接，由此获得编码双靶向蛋白的多核苷酸；(c)克隆步骤(b)的编码双靶向蛋白的多核苷酸以制备表达载体；(d)将步骤(c)的表达载体导入宿主细胞以获得转化子，并培养转化子，和(e)回收来自步骤(d)的转化子的双靶向蛋白。
此外，用于产生双靶向蛋白的方法可以是包含下列步骤的方法：(a)制备编码与VEGF特异性结合的抗体的多核苷酸，和编码与DLL4特异性结合的蛋白的多核苷酸，且其包含：含有由SEQIDNO:2所示的重链CDR1、由SEQIDNO:3所示的重链CDR2和由SEQIDNO:4所示的重链CDR3的重链可变区；和含有由SEQIDNO:5所示的CDR1、由SEQIDNO:6所示的CDR2和由SEQIDNO:7所示的CDR3的轻链可变区；(b)克隆步骤(a)的编码双靶向蛋白的多核苷酸以制备表达载体；(c)将步骤(b)的表达载体导入宿主细胞以获得转化子，并培养转化子，和(d)回收来自步骤(c)的转化子的VEGF特异性结合抗体和DLL4特异性结合蛋白，并将VEGF特异性结合抗体的Fc区的C-末端与DLL4特异性结合蛋白的N-末端通过接头连接。
本发明的双靶向蛋白可通过已知的重组技术或生化方法产生，且可将抗体引入合适的宿主细胞并从转化子的培养基回收。
具体地，双靶向蛋白可通过已知的分离方法分离。例如，双靶向蛋白可适当地通过常规纯化步骤如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基分离，但不限于此。
另一方面，本发明提供包含双靶向蛋白的组合物。
另一方面，本发明提供用于治疗癌症的药物组合物，其包含双靶向蛋白。
所述双靶向蛋白可与DLL4和VEGF两者结合以抑制DLL4和VEGF与Notch和VEGF受体的结合，由此抑制癌症生长。DLL4/Notch受体和VEGF/VEGF受体如上文所述。当本发明包含特异性与DLL4和VEGF结合的双靶向蛋白的组合物在体内施用时，其可抑制癌症的发生/发展(development)、增殖或转移或阻止癌症进展，由此治疗癌症。
如本文使用的术语"癌症"包括全部种类的癌症而无限制，但癌症的实例可包括食道癌、胃癌、大肠癌、直肠癌、口腔癌、咽癌、喉癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、子***、子宫内膜癌、卵巢癌、***癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、骨癌、***癌、皮肤癌、脑癌、甲状腺癌、白血病、霍奇金氏病、淋巴瘤和多发性髓性血癌。如本文使用的术语"治疗"指通过施用所述组合物恢复和有利改变癌症症状的全部活动。
此外，本发明的药物组合物可进一步包含可药用载剂。
如本文使用的"可药用载剂"指不损害生物活性和施用的化合物的特性对生物体无刺激的载剂或稀释剂。作为配制为液体溶液的组合物中的可药用载剂，施用无菌和生物兼容性载剂。可药用载剂可以是生理盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射溶液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇，或其两种或多种组合。此外，本发明的组合物酌情可包含其他常规添加剂，包括抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。此外，本发明的组合物可配制为可注射形式如具有稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂协助的水溶液、悬液或乳液。此外，根据本发明的组合物可配制为丸剂、胶囊剂、颗粒或片剂形式。
本发明的药物组合物可以多种方式配制如口服或肠胃外制剂。对于制剂，可使用通常使用的稀释剂或赋形剂如填充剂、膨胀剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂等。包含根据本发明的化合物的药物组合物使用通常使用的稀释剂或赋形剂如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂或表面活性剂配制。用于口服施用的固体制剂包括片剂、丸剂、粉末、颗粒、胶囊等。这种制剂通过用至少一种赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等混合本发明的化合物制备。除了简单的权宜，还可添加润滑剂如硬脂酸镁、滑石等。用于口服施用的液体制剂如悬浮剂、内部溶液，乳剂、糖浆等可包括简单稀释剂，例如水和液体石蜡，以及多种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干剂、栓剂等。非水溶剂和悬浮剂可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，或可注射的酯如油酸乙酯制备。作为用于栓剂的基底，可使用Witepsol、Macrogol、吐温61、可可脂、月桂脂、甘油明胶(glycerogelatin)等。
所述药物组合物可具有选自下组的任一制剂：片剂、丸剂、粉末、颗粒、胶囊、悬浮剂、内部溶液、乳剂、糖浆、无菌水溶液、非水溶剂、冻干剂、栓剂。
本发明的药物组合物以药物上有效的量施用。
如本文使用的术语“药物上有效的量”指以合理的益处/风险比例应用至任何医学治疗足以治疗疾病的量。组合物的有效剂量水平可取决于受试者类型、疾病的严重性、受试者的年龄和性别、疾病类型、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径、***率、治疗持续时间、包括与组合物一起施用的药物的因素和其他医学领域已知的其他因素确定。本发明的药物组合物可单独或与其他治疗剂组合施用，且可与常规治疗剂顺序或同时施用。组合物可以单一或多重剂型施用。基于上述全部因素，以能够展示最大效果而不引起副作用的最小量施用组合物非常重要，且该量可由本领域的技术人员容易确定。
在本发明的一个实例中，发现本发明的双靶向蛋白可与VEGF和DLL4(图3、4a和4b)两者都结合，能中和DLL4(图5)，且在Avastin抗性的人SCH胃癌和A549肺癌异种移植模型中展示抗癌效果(图11和12)，指示所述双靶向蛋白可在用于治疗癌症的组合物中用作活性成分。
另一方面，本发明提供使用包含双靶向蛋白的组合物治疗癌症的方法。所述方法可包括施用药物上有效的量的药物组合物。
双靶向蛋白和药物上有效的量如上文所述。
治疗癌症的方法包括将包含连同可药用载剂的双靶向蛋白的药物组合物施用至患有癌症或疑似患有癌症的受试者。本文中，可药用载剂和癌症如上文所述。受试者的实例包括哺乳动物，其包括牛、猪、羊、鸡、狗和人。受试者可以是其中通过施用本发明的组合物治疗癌症的任何受试者。
在这种情况中，组合物可以液体、粉末、气雾剂、胶囊、肠溶片或栓剂的形式施用。本发明的组合物可腹膜内、静脉内、肌内、皮下、经皮、口服、局部、鼻内、肺内或直肠内施用，但不限于此。然而，由于口服施用时肽被消化，因此用于口服施用的组合物中的活性成分需经包衣或配制由此防止在胃中的降解。此外，药物组合物可通过任何通过其可将活性成分递送至靶细胞的装置施用。
另一方面，本发明提供用于诊断癌症的组合物，其包含双靶向蛋白。
所述双靶向蛋白和癌症如上文所述。
如本文使用的术语"诊断"意为检测病例状况的存在或特征。就本发明而言，术语“诊断”意为检测癌症的发病。
用于诊断癌症的根据本发明的组合物可如下使用。使用双靶向蛋白测量VEGF或DLL4蛋白在从疑似患有癌症的受试者分离的样品上的水平，且如果测量的VEGF或DLL4水平比在正常对照人中更高，则确定受试者患有癌症。
为此，用于测量蛋白的量的分析方法包括但不限于免疫印迹(Western印迹)、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、放射免疫测定法(RIA)、放射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组化染色、免疫沉淀测定法、补体固定测定法(complementfixationassay)、FACS和蛋白芯片测定法。正常对照样品和疑似患有癌症的受试者中VEGF或DLL4蛋白水平在可通过所述分析方法彼此进行比较，且因此可实际诊断疑似患有癌症的患者的癌症发病。
用于诊断癌症的根据本发明的组合物除双靶向蛋白可进一步包括本领域已知用于实施测量蛋白水平的方法所需的那些。
另一方面，本发明提供用于诊断癌症的方法，其包括步骤：(a)使用双靶向蛋白测量从疑似患有癌症的受试者分离的样品中VEGF或DLL4蛋白的水平；和(b)如果在步骤(a)中测量的VEGF或DLL4蛋白水平比在正常对照样品中更高，则确定受试者患有癌症。
此处双靶向蛋白、癌症、受试者、诊断和测量蛋白水平的方法(步骤)如上文所述。
如本文使用的术语"样品"意为包括全血、血清、血液、血浆、唾液、尿、痰、淋巴、脑脊液和组织间液，其中在癌症患者中在VEGF或DLL4表达水平上存在差异，但不限于此。
此外，本发明提供DLL4的包含由SEQIDNO:21所示的DLL4(δ样配体4)蛋白的氨基酸序列中氨基酸残基第58-第65和第110-第115的构象表位。
在本发明的实例中，交联的SEQIDNO:21的DLL4中的氨基酸残基通过交联反应和质谱识别。如图7所示，发现两个片段、由氨基酸残基第58-第65组成的氨基酸序列[FRVCLKHF]，和由氨基酸残基第110-第115组成的氨基酸序列(SEQIDNO:23)，其构成连续的分子表面，由此形成DLL4的表位。
另一方面，本发明提供与DLL4特异性结合的单克隆抗体，其识别所述构象表位。
具体地，所述单克隆抗体可包含含有由SEQIDNO:2所示的重链CDR1、由SEQIDNO:3所示的重链CDR2和由SEQIDNO:4所示的重链CDR3的重链可变区；和含有由SEQIDNO:5所示的CDR1、由SEQIDNO:6所示的CDR2和由SEQIDNO:7所示的CDR3的轻链可变区。更具体地所述重链可包含由SEQIDNO:8所示的重链可变区氨基酸序列，且轻链可变区可包含由SEQIDNO:9所示的轻链氨基酸序列。
另一方面，本发明提供编码单克隆抗体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的表达载体和导入所述表达载体的转化子。
此处，本发明的DLL4、单克隆抗体、载体、转化子等如上文所述。
另一方面，本发明提供用于治疗癌症的方法，其包括将双靶向蛋白施用至疑似患有癌症的受试者的步骤。
所述受试者是需要预防或治疗癌症的受试者，且可选自哺乳动物，包括需要对癌症和与其相似的症状进行治疗的人、牛、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、狗和猫，但不限于此。
如本文使用的术语"施用"意为将本发明的药物组合物通过任何合适的方法导入患者。本发明的药物组合物可通过多种口服或肠胃外途径施用，只要其到达合意的组织。
本发明的癌症治疗方法包括以治疗上有效的量施用双靶向蛋白或含有双靶向蛋白的药物组合物。对本领域的技术人员显而易见的是组合物合适的总每日剂量可在安全的医疗判断范围内由主治医师或兽医决定。此外，组合物可在其有效的量的优选范围内一次或数次施用。然而，基于本发明的目的，用于特定患者的特定治疗上有效的量将取决于多种因素，包括将获得的响应类型和程度、根据是否共同使用其他作用剂的特定组合物、患者年龄、体重、健康状况、性别和饮食、施用的时间和途径、组合物的分泌速率、治疗的持续时间、和与所述组合物组合或重合使用的其他药物，和其他医学领域中熟知的相似因素。
实施例
此后，本发明将进一步参照实施例进行详细说明。对本领域的技术人员显而易见的是这些实施例仅出于阐述目的而并不应认为是对本发明保护范围的限定。因此，本发明实质性的保护范围将通过所附的权利要求及其等同物限定。
实施例1：抗DLL4/VEGF双靶向蛋白的制备
实施例1-1:DLL4抗原的制备
作为人DLL4的胞外结构域抗原，使用购自R&DSystem的人DLL4蛋白(目录号:1506-D4/CF)。所述DLL4抗原包含DLL4氨基酸序列(登录号Q9NR61)的氨基酸残基27-524。所述蛋白的C-末端具有10-His标签。
制备对应DLL4胞外结构域特定区的抗原。该特定区包含氨基酸残基27-251。该区包含已知与Noth1受体结合的称为"DSL(δ/Serrate)/lag-2)"结构域的基序。使用标准重组DNA技术制备了包含编码与Fc蛋白融合的DLL4胞外结构域缺失片段(氨基酸残基27-251)多核苷酸上游的CMV启动子的哺乳动物表达载体质粒。使用一般重组DNA技术制备了与Fc蛋白融合的人DLL4嵌合体的编码DLL4缺失片段的其他构建体。制备的构建体瞬时转染入HEK293E细胞以表达包含与Fc蛋白融合的人DLL4氨基酸序列的氨基酸残基27-251的重组融合蛋白。为回收所述抗原蛋白，每72小时收集条件培养基，并重复该步骤四次。从条件培养基通过蛋白A亲和层析纯化抗原蛋白。
实施例1-2：噬菌体文库的制备
具有多样性的2.7x1010人scFv(单链可变片段)文库细胞在包含17g2XYTCM[胰蛋白胨(CONDA,1612.00)、10g酵母提取物(CONDA,1702.00),5gNaCl(Sigma,S7653-5kg)、34μg/ml氯霉素(Sigma,C0857)],2％葡萄糖(Sigma,G5400)和5mMMgCl2(Sigma,M2393)的培养基(3L)中于37℃培养2-3小时(OD600＝0.5-0.7)，其后将细胞用辅助噬菌体感染并在2XYTCMK培养基(2XYTCM、70μg/ml卡那霉素(Sigma,K1876)、1mMIPTG(ELPISBIO,IPTG025))中于30℃培养16小时。将培养的细胞离心(4500rpm,15分钟,4℃)，并将上清添加和溶解于4％PEG(Fluka,81253)6000和3％NaCl(Sigma,S7653)中，然后在冰上温育1小时。随后，将该溶液离心(8000rpm,20分钟,4℃)，并将沉淀添加和溶解于PBS中然后离心(12000rpm,10分钟,4℃)。将包含噬菌体文库的上清置于新鲜的管中并在4℃保存。
实施例1-3:噬菌体展示的淘选
为筛选与人DLL4结合的DLL4抗体，实施了3轮人DLL4抗原的淘选。
将10μg/mL的重组人DLL4(R&DSystem)溶液添加至免疫管，并在4℃将蛋白吸附于免疫管表面上过夜，然后将1％牛血清白蛋白溶液添加至免疫管以保护未与DLL4吸附的表面。将免疫管抽真空后，将分散于1％牛血清白蛋白的1012CFU的抗体噬菌体文库添加其中以与抗原结合。用PBS-T(磷酸盐缓冲盐水-0.05％吐温20)溶液洗涤未特异性结合的噬菌体，然后使用100mM三乙胺溶液回收残留的抗原特异性抗体。
回收的噬菌体用1Mtris缓冲液(pH7.4)中和并在37℃感染大肠杆菌ER25371小时，并将感染的大肠杆菌细胞铺板于包含羧苄青霉素的LB(Luria-Bertani)琼脂培养基并在37℃培养过夜。第二天，将培养的大肠杆菌细胞在4mL的SB(superbroth)-羧苄青霉素培养基中悬浮，并在其中添加15％甘油。将悬液的部分在-80℃保存，并将50μl残液在包含2％葡萄糖的SB-羧苄青霉素培养基中在37℃培养。
当培养基的吸光度在600nm(OD600)达到0.6时，通过离心回收培养基，且残留的材料在20mL的SB-羧苄青霉素培养基中再次悬浮，并将1012PFU的VCSM13辅助噬菌体添加其中，随后在37℃温育伴随缓慢搅拌。第二天，通过离心收集培养基，并在4％聚乙二醇8000(PEG8000)和3％氯化钠(NaCl)中于4℃沉淀30分钟，随后离心。去除上清，并在1mL的PBS中悬浮沉淀的噬菌体。使用悬浮的噬菌体作为文库重复上述淘选步骤，由此扩增/富集抗原特异性克隆。
为筛选与人DLL4蛋白的Notch1结合位点结合的抗体，实施数轮人DLL4蛋白和对应人DLL4特定区的检测片段(氨基酸残基27-251)的淘选。随后，将细胞铺板并培养于包含抗体基因的LB-羧苄青霉素琼脂培养基上以获得单克隆，随后将其接种并在400μl的SB-羧苄青霉素培养基中温育，其后通过添加IPTG诱导scFv型蛋白在大肠杆菌的周质中的表达。将大肠杆菌细胞悬浮于TES溶液(Tris、EDTA、蔗糖)中并将其在4℃放置1小时。随后，离心悬液以提取周质，随后用其通过ELISA技术检查重组人DLL4抗原和scFv间的结合。
使用辣根过氧化物酶(HRP)-抗HA抗体和四甲基联苯胺(TMB)底物检测结合的scFv。随后测序检测的抗原特异性抗体克隆。筛选的scFv的测序结果示于下表1中。
表1
将具有上述序列的抗DLL4抗体命名为“MLCK-2”。
实施例1-4:靶向DLL4和VEGF的双靶向抗体(双特异性抗体)的制备
将在实施例1-3中制备的人DLL4结合scFv型抗体与AvastinIgG型抗体通过使用接头连接，由此制备也可与人VEGF结合的双靶向蛋白表达载体(图1b)。
制备的双靶向蛋白具有SEQIDNO:1的重链氨基酸序列(VEGF-DLL4BsAb重链)和SEQIDNO:20的轻链氨基酸序列。所述重链包含含有由SEQIDNO:2所示的重链CDR1、由SEQIDNO:3所示的重链CDR2和由SEQIDNO:4所示的重链CDR3的重链可变区；和含有由SEQIDNO:5所示的CDR1、由SEQIDNO:6所示的CDR2和由SEQIDNO:7所示的CDR3的轻链可变区。
为在CHO细胞中使用双靶向蛋白表达载体产生抗体，将感兴趣的基因使用用于增加细胞内基因递送效力的聚合物转染入动物细胞，并将细胞在500-mlErlenmeyer烧瓶(CorningCostar)中于200ml每瓶的体积培养至总体积1L。将1L含有超低的IgG胎牛血清(InvitrogenCorp.)的RPMI培养基(InvitrogenCorp.)和CHO细胞培养基的混合物在温育器(Sanyo)温育4天，由此产生重组蛋白。收集细胞培养基并离心以从悬浮细胞分离包含重组蛋白的上清。并将上清通过0.22-μm真空过滤器过滤一次(Millipore)。
对于抗体纯化，首先从培养基使用重组蛋白A琼脂糖柱(HitrapMabSelectSure,5mL,GEhealthcare)纯化Avastin-DLL4BsAb双靶向抗体。具体地，将过滤的培养基装载于重组蛋白A琼脂糖柱上。将所述柱用20倍体积的50mMTris-Cl(pH7.5)、100mMNaCl缓冲液洗涤，并用10倍体积的50mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)洗涤以去除杂质。将抗体用5mM柠檬酸钠10mMNaCl缓冲液(pH3.4)洗脱并用1MTris-HCl缓冲液(pH8.0)中和。
对于二次纯化，使用HiLoadTM26/60Superdex200Prep级GL(GEHealthcare)去除Avastin-DLL4BsAb双靶向抗体的聚集。用2倍体积的50mM磷酸钠缓冲(pH6.0)、20mML-Arg平衡柱，然后允许纯化的Avastin-DLL4BsAb双靶向抗体穿过柱以根据大小将其分离。
通过SDS-PAGE分析使用柱纯化的组分(图2)，并通过使用AmiconUltra(30,000MWCO,Millipore)浓缩器浓缩阳性组分。使用相同的浓缩器，用磷酸缓冲液实施缓冲液替代和浓缩。最终，通过具有0.22μm孔径的注射过滤器无菌过滤抗体，并测量其吸光度(A280)以确定抗体浓度。
实施例2:通过ELISA分析针对DLL4和VEGF的双靶向蛋白的结合亲 和力
针对DLL4和VEGF的双靶向蛋白的结合亲和力使用基于ELISA的溶液竞争测定法评估。具体地，用50ng/ml的hVEGF(R&DSystems,cat:293-VE)和200ng/ml的rhDLL4(R&DSystems,cat:1506-D4/CF)以100μl每孔的量涂覆96孔板(Nunc-ImmunoPlate,NUNC,Rochester,NY)在4℃过夜，并将非特异性结合位点用BSA(牛血清白蛋白)阻断2小时。将在96孔微滴定板上的抗体从128nM和64nM稀释1/5倍，并将100μl的每份稀释液添加至用hDLL4和hVEGF蛋白涂覆的每孔。随后，将该板温育2小时，并用包含0.05％吐温20的PBS洗涤五次。为检测结合板的抗体，将HRP偶联的抗Fab抗体(Pierce,目录号31414))以1:40,000的比例稀释，转移至洗涤的96孔微滴定板，然后允许在37℃反应1小时。反应后，使用比色底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺；Sigma-Aldrich)实施显色。使用0.5mol/l的硫酸停止酶反应。使用SpectraMax190(分子装置)测量在450nm的吸收值。
如图3中所见，已表明本发明的双靶向蛋白确实特异性地结合其靶标(VEGF和DLL4)。
实施例3:测定DLL4和VEGF的DLL4/VEGF双靶向蛋白的平衡解离 常数(KD)
将实施例1中纯化的双靶向蛋白(双特异性抗体)命名为“Avastin-DLL4BsAb”，并如下分析针对抗原的纯化抗体的亲和力。为检查针对DLL4和VEGF的Avastin-DLL4BsAb双靶向抗体的结合亲和力差异，实施了BIACORE测定法。
具体地，在SPR分析中使用了BiacoreT200并将HBS-EP(10mMHEPES,pH7.4,150mMNaCl,3mMEDTA,0.15％表面活性剂P20)用作运行缓冲液。通过使用向导程序的表面制备靶标固定工具完成表面制备(条件：25℃,5μl/分钟)。在10mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)中稀释配体(hVEGF和hDLL4)至终浓度分别为5μg/ml和4μg/ml，然后通过针对每个测试组的靶标固定水平固定至CM5芯片的表面。在固定步骤中，包括了两种流动细胞作为一组，其中第一和第三流动细胞设置为空白，第二流动细胞具有固定至其表面的hVEGF，并将第四流动细胞设置为本实验中的hDLL4。由于非特异性结合和缓冲作用，将第一和第三流动细胞作为参照发挥作用以对实验的变化负责，且在该分析中，将扣除的RU值(Fc2-Fc1和Fc4-Fc3)用作实验结果。将与hVEGF和hDLL4结合的Avastin-DLL4BsAb双靶向抗体在运行缓冲液中稀释至100nM的最终摩尔浓度，系列稀释1/2倍，且分析5份稀释液的每份。将待分析的样品制备成具有高纯度和高浓度足以最少稀释多于100倍，由此最小化缓冲影响。全部分析通过使用向导程序完成，每次分析步骤之间包括对每个样品的重复筛选和再生步骤，从而实验的标准保持恒定。
实验结果通过Biaevaluation软件版本4.0分析。在该时间，为确定RU值(Fc2-Fc1和Fc4-Fc3)，将基线设为零，从全部传感图扣除在缓冲液注射部分(分析物，0nM)测量的值。随后，通过Bivalent结合模型分析获得的RU值以确定结合亲和力。待分析的因子包括ka(M-1s-1)、kd(s-1)和KD(M)。更具体地，ka是证明结合亲和力的解离常数(识别)，而kd是证明稳定性的解离常数。
下文表2显示分析针对hVEGF的双靶向蛋白的结合亲和力的结果，而表3显示分析针对hDLL4的双靶向蛋白的结合亲和力的结果。
表2
抗体 Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD
Avastin-DLL4BsAb 1.34E04 1.68E-06 1.26E-10
表3
抗体 Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD
Avastin-DLL4BsAb 1.94E04 5.87E-04 3.02E-08
如上表2和3中所见，平衡解离常数KD(M)通过用ka除以kd(kd/ka)计算。针对hVEGF的结合亲和力的分析结果表明KD值为约0.126nM，其与AvastinIgG(图4a和表2)的平衡解离常数相似，且针对hDLL4的结合亲和力的分析结果表明KD值为约30nM(图4b和表3)。这表明本发明的双靶向蛋白针对每种抗原的结合亲和力维持在高水平而无干扰。
实施例4:测定DLL4/VEGF双靶向蛋白的中和效果
使用基于ELISA的溶液竞争测定法评估Avastin-DLL4BsAb双靶向抗体的中和效果。具体地，将96孔微滴定板(Nunc-ImmunoPlate,NUNC,Rochester,NY)的每孔用100μl的500ng/ml的hNotch-1-hFc蛋白(R&DSystems)(在PBS中稀释)在4℃涂覆过夜，然后用BSA处理2小时以阻断非特异性结合位点。
将96孔微滴定板上的Avastin-DLL4BsAb双靶向抗体(纯化的蛋白)与0nM-140nM抗体浓度范围的抗原蛋白(人DLL4-His,600ng/ml)的系列稀释物预混合。将抗原/抗体混合物温育30分钟，然后转移至用DLL4受体hNotch-1蛋白(50ng/孔)预涂覆的微滴定板由此测量游离的抗体。随后，将所述板温育2小时并用包含0.05％吐温20的PBS洗涤五次。为检测与板结合的DLL4抗原，将HRP偶联的His抗小鼠IgG多克隆抗体试剂(Rocheappliedscience)以1:800的比例稀释，并将洗涤的微滴定板用稀释的抗体试剂处理，然后允许在37℃反应1小时。随后，使用比色底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺；Sigma-Aldrich)实施显色。使用0.5mol/L的硫酸停止酶反应。测量450nm的吸光度，且测量结果示于图5。实现与板涂覆的Notch1-hFc蛋白结合的人DLL4-His50％减少所需的抗体的量(IC50)示于下表4。
表4
克隆 IC50(nM)
VEGF-DLL4BsAb 1.12
如上表4中所见，本发明的双靶向蛋白显示了针对DLL4的低IC50值1.12nM，表明其具有可与单独的抗DLL4抗体相比的DLL4抑制活性。
实施例5:通过交联反应和质谱的表位映象(epitopemapping)
为鉴定由多个不连续的序列组成但构象上形成单分子表面的构象表位，使用了通过交联反应和质谱确定交联反应位置的技术。
实施例5-1:交联复合物的形成
抗原蛋白人δ样配体4(人DLL4、hDLL4，R&DSystems)和实施例1-3的MLCK2以2:1的比例彼此混合，然后将K200交联剂(CovalXAG)以0.2mg/ml的终浓度添加其中。允许混合物在室温反应3小时以形成抗原-抗体复合物，然后使用UltraflexIIMALDIToF质谱仪(BrukerDaltonics)分析反应产物的分子量。如图6中所示，可见当使用交联剂时，形成人DLL4和MLCK2抗体间1:1和2:1的复合物，与其中未使用交联剂的对照实验不同。然而，可见当允许单独的人DLL4或MLCK2抗体与交联剂反应时，未检测到任何多聚物或复合物，表明人DLL4/MLCK2抗体抗体复合物的形成由DLL4和MLCK2间的特定反应导致。
实施例5-2:通过蛋白酶形成片段
为识别交联的肽片段，将d0-DSS(二琥珀酰亚胺辛二酸酯)与d12-DSS以1:1的比例彼此混合并溶解于DMF以制备2mg/ml的溶液。将溶液添加至DLL4和MLCK2的2:1混合物至终浓度为0.2mg/ml并在室温进行交联反应3小时。反应产物通过使用DTT(二硫苏糖醇)和碘乙酰胺还原和烷基化而被修饰用于有效降解，并使用蛋白酶如胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶或ASP-N蛋白酶片段化。产生的片段通过Ultimate3000纳米液体层析***(Dionex)和LTQOrbitrapXL质谱仪(Thermo)分析，且获得的质谱数据通过Xquest(2.0版)软件和Stavrox(2.1版)软件分析以检测交联的肽对。结果，如下表5中所示，可检测到通过在hDLL4和MLCK2间的交联形成的肽对。
在DLL4上发生交联反应的位置为人DLL4氨基酸序列的氨基酸残基59、63、64和110。由氨基酸残基第58-第65组成的氨基酸序列[FRVCLKHF](SEQIDNO:22)和由氨基酸残基第110-第115组成的氨基酸序列[TWPGTF](SEQIDNO:23)的两片段构成人DLL4C2结构域(27-174)模型上的连续分子表面，如图7中所示。因此，可确定所述两序列为人DLL4的针对MLCK2抗体的表位。
表5
实施例6:通过Western印迹检查表位映射
人DLL4的丙氨酸取代突变组如下制备，其中在人DLL4细胞外蛋白区氨基酸序列中位置64(组氨酸)、65(苯丙氨酸)和69(缬氨酸)处的每个氨基酸中用丙氨酸取代。作为用于丙氨酸取代突变体的表达载体，使用了对应于如实施例1-1中所述的DLL4的胞外结构域的特定区的抗原制备中使用的载体。具体地，所述载体包含对应于人DLL4的特定区的氨基酸序列的氨基酸残基27-251的基因，且该区包含已知与Notch1受体结合的称为"DSL(δ/锯齿状(serrate))/lag-2)"的基序。
使用标准重组DNA技术制备了包含编码与Fc蛋白融合的DLL4胞外结构域缺失片段(氨基酸残基27-251)的多核苷酸上游的CMV启动子的哺乳动物表达载体质粒。为用丙氨酸取代载体中氨基酸残基64、65和69的每一处，使用了重组DNA技术(QuikChangeSite-DirectedMutagenesis,Agilent)，并使用Lipofectamine2000(Invitrogen)将突变体转染入HEK293E动物细胞且温育4天，其后回收表达培养基。作为对照，使用了编码野生型DLL4的胞外结构域的缺失片段(氨基酸残基27-251)的蛋白。
温育4天的突变体表达培养基在1000rpm于室温离心10分钟以去除悬浮的材料，然后通过0.45-μm注射器过滤。对于Western印迹分析，使用***(ForteBio)量化突变体表达培养基中的蛋白水平由此可将均匀的量的突变体装载于SDS凝胶上。随后，将20μl的每种突变体表达培养基装载于两个Novex4-12％Bis/Tris凝胶的每个上，并使用MOPS缓冲液在140V进行凝胶电泳50分钟。作为对照，使用了编码野生型DLL4胞外结构域的缺失片段(氨基酸残基27-251)的蛋白。完成电泳后，将蛋白条带转移至聚偏氟乙烯膜。实施共两个过程。在一个过程中，为检查当将DLL4胞外结构域的缺失片段(氨基酸残基27-251)装载于SDS凝胶上时，是否装载了均匀的量的突变体和野生型蛋白，将HRP偶联的抗人Fc抗体(1:10000)(Pierce目录号31413)结合至转移的膜，然后将膜用PBS-T洗涤三次。在另一方法中，为检查MLCK2抗体对突变体的结合亲和力，将MLCK2抗体(1μg/mL)首先与转移的膜结合，将膜用PBS-T洗涤三次，然后将HRP偶联的抗人Fab抗体(1:10000)结合至膜，随后用PBS-T洗涤三次。接下来，将AmershamECLWestern印迹检测试剂(GEHealthcare)应用至膜，使用ImageQuantLAS4000(GEHealthcare)实施信号检测。
如图8中所示，Western印迹分析的结果表明编码DLL4胞外结构域的缺失片段(氨基酸残基27-251)的突变体蛋白以均匀的量装载。此外，当检查针对突变体的MLCK2抗体的结合亲和力时，可见对于在位置64处的氨基酸突变体，MLCK2抗体的结合亲和力丧失，且对于在位置65处的氨基酸突变体，MLCK2抗体的结合亲和力显著减少。此外，已表明在位置69处的氨基酸突变体未影响MLCK2抗体的结合亲和力。
实施例7:分析DLL4/VEGF双靶向抗体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC) 的增殖的作用
为分析与DLL4和VEGF结合的双靶向抗体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的作用，在该实验中使用了购自Lonza的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。
对于HUVEC的培养，用包含1％明胶(Sigma)的PBS在室温涂覆T-烧瓶(Nunc)4-6小时，随后用PBS洗涤。将包含EGM-2SingleQuot(Lonza)的EBM-2用作培养基，细胞培养的密度维持在80％以下，并在37℃的5％CO2温育器中培养细胞。将6代前的细胞用于该实验。HUVEC增殖测定法以下述方式完成。首先，为制备hDLL4涂覆的板，实施试验一天前，在96孔板(BD)的碳酸盐缓冲液中将rhDLL4(R&DSystems)稀释至1mg/ml的终浓度，并将100ml的稀释rhDLL4接种于每孔，且将板在4℃温育过夜。此外，将HUVEC培养于补充了0.1％FBS的EBM-2基本培养基中培养24小时以最小化血清影响。在实验的第一天，将涂覆rhDLL4的板的每孔用PBS洗涤两次，且对于每测试组，将各hVEGF(50ng/mL)和抗体(Avastin:20mg/mL；单独的抗DLL4抗体:20mg/mL；Avastin-DLL4BsAb双靶向抗体:26mg/mL)用EBM-2基本培养基稀释，然后以一式三份添加至每孔，之后在室温温育20分钟。将饥饿24小时的HUVEC解离成为单细胞，并用EBM-2基本培养基稀释至4x103细胞/孔。稀释的细胞接种于用抗体处理的孔中，并在37℃于5％CO2温育器中温育96小时。完成细胞增殖后，将10μl的细胞计数试剂盒8(CCK-8,Dojino)添加至每孔并将板在37℃于5％CO2温育器中温育5小时。使用SpectraMax190(MolecularDevices)，测量样品在450nm的吸收且在不同测试组间比较了细胞增殖水平。
如图9的全部图所示(PBS处理组)，当DLL4/Notch信号传导激活时，血管内皮细胞的增殖将抑制约30％，与其中血管内皮细胞的增殖由VEGF激活的情况相反。在体内机制中，如上所述，已知VEGF抗体抑制肿瘤的血管生成由此抑制肿瘤的生长和转移，而DLL4抗体诱导肿瘤中异常血管(失活的血管)的过度生成以由此抑制肿瘤生长。可以说图9中的结果反映了VEGF和DLL4在体外的不同血管生成机制。
如图9a中所见，当用VEGF靶向抗体(Avastin)处理在血管内皮细胞的增殖中起关键作用的VEGF及其受体和VEGFR信号传导途径时，血管内皮细胞的增殖以浓度依赖的方式受到抑制，无论DLL4是否存在。然而，如显示通过用单独的DLL4靶向抗体处理获得的实验结果的图9b所示，在其中DLL4不存在的实验组中，抗体的浓度对血管内皮细胞的增殖无影响，且在其中DLL4存在的实验组中，血管内皮细胞的增殖以依赖于DLL4靶向抗体浓度的方式再次发生。在其中实施了用双靶向蛋白处理的情况中，在其中DLL4不存在的实验组中，双靶向蛋白显示与用Avastin抗体处理相似的增殖抑制效果(图9c；黑色条状)，但在其中DLL4存在的实验组中，双靶向蛋白的增殖抑制效果减少(图9a和9c；白色条状)。
从用DLL4靶向抗体处理的组未显示可与用单独的VEGF靶向抗体处理的情况相比较的增殖抑制效果的事实，可见本发明的双靶向抗体有效抑制了VEGF和DLL4信号传导途径两者。
实施例8:分析DLL4/VEGF双靶向抗体对DLL4/Notch和 VEGF/VEGFR信号传导途径的抑制活性
为检查与DLL4和VEGF结合的双靶向抗体对DLL4/Notch和VEGF/VEGFR信号传导途径的抑制活性，根据与实施例4中使用的相同的方法使用了HUVEC。具体地，实施试验一天前，用碳酸盐缓冲液稀释重组人DLL4(rhDLL4,R&DSystems)至终浓度为1mg/ml，然后将1ml/孔的稀释的rhDLL4添加至6孔板(BD)并在4℃温育过夜。对于未用rhDLL4处理的对照组，仅添加1ml/孔的碳酸盐缓冲液至板并在4℃温育过夜。下一天，从4℃冰箱取出DLL4涂覆的板并用PBS洗涤一次，并将1ml的EGM-2培养基添加至板的每孔。随后，将各抗体(Avastin:20mg/mL；DBZ：0.08mM；单独的DLL4靶向抗体:20mg/mL；单独的OncomedDLL4靶向抗体:20mg/mL；Avastin-DLL4BsAb双靶向抗体:26mg/mL)添加至每孔。每孔中培养基的最终体积为2ml且添加的抗体体积为培养基体积的二倍。将板在室温温育20分钟。在抗体处理过程中，取包含#2-#5代HUVEC的75T板，并从板去除培养基，然后将细胞解离成为单细胞。通过离心，在新鲜的EGM-2培养基中洗涤并重悬HUVEC。计数细胞后，将细胞稀释至5x105细胞/ml，并将1ml细胞接种于每孔并在5％CO2的温育器中于37℃温育1天。培养HUVEC一天后，将培养基从每孔去除，将细胞用PBS洗涤一次并用2ml包含0.2％FBS的EBM-2基本培养基处理。此外，每孔用每种在一天前处理的相同浓度的抗体(Avastin:20mg/mL；DBZ:0.08mM；单独的DLL4靶向抗体:20mg/mL；单独的OncomedDLL4靶向抗体:20mg/mL；Avastin-DLL4BsAb双靶向抗体:26mg/mL)处理，并将细胞在5％CO2的温育器中于37℃温育1天。随后，用100ng/mlhVEGF(R&DSystems)处理包含已用各抗体处理的HUVEC的每孔，并在5％CO2的温育器中于37℃温育5分钟。随后将板取出并迅速去除培养基。将细胞用PBS洗涤一次，并将150μl细胞裂解缓冲液(1％NP-40,20mMTris,137mMNaCl,10％甘油,2mMEDTA,1mM正钒酸钠,1x蛋白酶&磷酸酶抑制剂混合物)添加至每孔，震动板以散布裂解缓冲液。
随后，将板置于冰上，并使用刮刀从每孔收集HUVEC并放于1.5ml管中且允许置于冰上。每5分钟，将包含细胞的1.5ml管从冰上取走，涡旋三次，并再次置于冰上用于细胞裂解。随后，将样品在4℃和14000rpm离心10分钟，并将分离的上清转移至新鲜的管并称重。对于SDS-PAGE分析，将上清添加至5xSDS样品缓冲液并在100℃煮沸10分钟，随后进行SDS-PAGE分析。在该时间，制备的蛋白样品跑过4％-12％bis-TRIS凝胶，并根据其尺寸分离，且分离的蛋白用下列抗体进行Western印记(图10):NICD(细胞信号传导)、P-ERK(细胞信号传导)、ERK(细胞信号传导)、VEGFR2(细胞信号传导)、P-VEGFR2(细胞信号传导)和肌动蛋白(SantaCruz)。
如图10所示，本发明的双靶向抗体可将DLL4/Notch和VEGF/VEGFR信号传导途径抑制到与通过单独的DLL4靶向抗体和单独的VEGF靶向抗体所获得相似的水平。
实施例9:分析双靶向抗体在Avastin抗性的人SCH胃癌异种移植模型 中的抗癌活性
如在文献中报道的，人SCH人胃癌细胞对Avastin具有抗性。因此在使用SCH细胞的裸鼠异种移植模型中实施了对于双靶向抗体效果的实验。
具体地，将Avastin抗性的SCH胃癌细胞接种于雌性裸鼠，且当肿瘤大小达到平均200mm3时，将各抗体每周一次施用至小鼠以确认本发明的双靶向抗体的体内抗癌活性(图11)。在该关于裸鼠异种移植模型的体内实验中，施用结合于与人DLL4表位(DSL结构域)等同的小鼠DLL4表位(DSL结构域)的双特异性抗体Avastin-小鼠DLL4代替物(surrogate)双靶向蛋白代替靶向人DLL4的Avastin-DLL4双靶向抗体以证明双靶向抗体的优异抗癌效果。
如图11所示，体内实验的结果指示本发明的双靶向蛋白针对Avastin抗性的胃癌细胞具有显著增加的抗癌效果。
实施例10:分析双靶向抗体在Avastin抗性的人A549肺癌异种移植模型 中的抗癌活性
将A549细胞接种于用Avastin(2.5mg/kg/周)处理3个月的裸鼠中，由此获得即使用Avastin治疗后肿瘤生长而不减少其尺寸的Avastin抗性的A549癌细胞。分离肿瘤，然后离体温育Avastin抗性的A549细胞由此分析双靶向抗体的效果。
具体地，将Avastin抗性的A549肺癌细胞接种于雌性裸鼠中，且当肿瘤大小达到平均200mm3时，将各抗体每周两次施用至小鼠以确认本发明的双靶向抗体的体内抗癌活性(图12)。在该使用Avastin抗性的A549细胞的体内实验中，施用结合于与人DLL4表位等同的小鼠DLL4表位的双特异性抗体Avastin-小鼠DLL4代替物双靶向蛋白代替靶向人DLL4的Avastin-DLL4双靶向抗体从而证明双靶向抗体的优异抗癌效果。
如图12所示，体内实验的结果指示本发明的双靶向蛋白针对Avastin抗性的肺癌细胞具有显著增加的抗癌效果。
从上文，本发明所属领域的技术人员可理解的是，本发明可以其他具体的实施方案实施而不改变其技术精神和必需特征。就此，应该理解的是，上述实施例在全部方面都是说明性而非限制性的。本发明的保护范围应理解为包括所附权利要求的含义和范围，和全部源自其等同概念的改变和修饰形式，而不仅是详细的描述。

Claims (26)

1.一种双靶向蛋白，其包含：与DLL4特异性结合的蛋白和与VEGF(血管内皮细胞生长因子)特异性结合的抗体，其中所述与DLL4特异性结合的蛋白识别DLL4的包含由SEQIDNO:21所示的DLL4蛋白氨基酸序列中氨基酸残基第58-第65的氨基酸序列和第110-第115的氨基酸序列的构象表位。
2.权利要求1的双靶向蛋白，其中所述特异性地与DLL4结合的蛋白包含：
重链可变区，其包含具有由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的重链CDR1、具有由SEQIDNO:3所示的氨基酸序列的重链CDR2和SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的重链CDR3，和
轻链可变区，其包含具有由SEQIDNO:5所示的氨基酸序列的轻链CDR1、具有由SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的轻链CDR2和具有由SEQIDNO:7所示的氨基酸序列的轻链CDR3。
3.权利要求1的双靶向蛋白，其中所述双靶向蛋白的形式为：其中与DLL4特异性结合的蛋白和与VEGF特异性结合的IgG(免疫球蛋白G)型抗体彼此通过接头连接。
4.权利要求3的双靶向蛋白，其中所述接头是肽基接头或非肽接头。
5.权利要求4的双靶向蛋白，其中所述肽接头具有由SEQIDNO:18所示的氨基酸序列。
6.权利要求1的双靶向蛋白，其中所述与DLL4特异性结合的蛋白包含由SEQIDNO:8所示的重链氨基酸序列和由SEQIDNO:9所示的轻链氨基酸序列。
7.权利要求1的双靶向蛋白，其中所述特异性与VEGF结合的抗体包含：
重链可变区，其包含具有由SEQIDNO:10所示的氨基酸序列的重链CDR1、具有由SEQIDNO:11所示的氨基酸序列的重链CDR2和具有由SEQIDNO:12所示的氨基酸序列的重链CDR3，和
轻链可变区，其包含具有由SEQIDNO:13所示的氨基酸序列的轻链CDR1、具有由SEQIDNO:14所示的氨基酸序列的轻链CDR2和具有由SEQIDNO:15所示的氨基酸序列的轻链CDR3。
8.权利要求1的双靶向蛋白，其中所述与VEGF特异性结合的抗体包含具有由SEQIDNO:16所示的氨基酸序列的重链可变区和具有由SEQIDNO:17所示的氨基酸序列的轻链可变区。
9.权利要求8的双靶向蛋白，其中所述与VEGF特异性结合的抗体是贝伐单抗(Bevacizumab)。
10.权利要求1的双靶向蛋白，其中所述双靶向蛋白包含具有由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和具有由SEQIDNO:20所示的氨基酸序列的轻链可变区。
11.权利要求1的双靶向蛋白，其中所述与DLL4特异性结合的蛋白是全长抗体、Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG或scFv(单链可变片段)的形式。
12.多核苷酸，其编码权利要求1-11任一项的双靶向蛋白。
13.一种包含权利要求12的多核苷酸的表达载体。
14.一种引入权利要求13表达载体的转化子。
15.一种用于制备包含与DLL4特异性结合的蛋白和与VEGF(血管内皮细胞生长因子)特异性结合的抗体的双靶向蛋白的方法，所述方法包括步骤：(a)培养根据权利要求14的转化子以产生双靶向蛋白；和(b)回收步骤(a)中产生的双靶向蛋白。
16.一种包含权利要求1-11任一项的双靶向蛋白的组合物。
17.一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含权利要求1-11任一项的双靶向蛋白。
18.权利要求17的药物组合物，其中所述癌症选自下组：食道癌、胃癌、大肠癌、直肠癌、口腔癌、咽癌、喉癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、子***、子宫内膜癌、卵巢癌、***癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、骨癌、***癌、皮肤癌、脑癌、甲状腺癌、白血病、霍奇金氏病、淋巴瘤和多发性髓性血癌。
19.一种用于诊断癌症的组合物，其包含权利要求1-11任一项的双靶向蛋白。
20.一种用于诊断癌症的方法，其包括步骤：
(a)使用权利要求1-11任一项的双靶向蛋白测量从疑似患有癌症的受试者分离的样品中VEGF或DLL4蛋白的水平；和
(b)如果步骤(a)中测量的VEGF或DLL4蛋白的水平高于正常对照样品，则确定所述受试者患有癌症。
21.一种DLL4的构象表位，其包含由SEQIDNO:21所示的DLL4(δ样配体4)蛋白的氨基酸序列中氨基酸残基第58-第65和第110-第115。
22.一种与DLL4特异性结合的单克隆抗体，其识别权利要求21的构象表位。
23.一种编码权利要求22的单克隆抗体的多核苷酸。
24.一种包含权利要求23的多核苷酸的表达载体。
25.一种引入权利要求24的表达载体的转化子。
26.一种用于治疗癌症的方法，其包含将权利要求1-11任一项的双靶向蛋白施用至疑似患有癌症的受试者的步骤。
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