KR20210090172A - Epn1을 표적화하는 항체 - Google Patents

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Abstract

다양한 암 세포의 표면에서 발현되는 항원인 엡신-1(EPN1)에 특이적인 항체가 본 명세서에 기재되어 있다. EPN1-발현 종양 세포를 특징으로 하는 다양한 유형의 암을 치료, 개선 및 진단하는 방법이 또한 개시되어 있다.

Description

EPN1을 표적화하는 항체
본 발명의 분야는 암의 치료 또는 검출을 위한 항체-기반 치료제에 관한 것이다.
인간 적응 면역계는 세포성(T 세포) 및 체액성(B 세포) 과정 둘 다를 통해 반응한다. 체액성 반응은 항원에 결합할 수 있는 표면 결합 면역글로불린(Ig) 분자를 발현하는 B 세포의 선택 및 클론 증폭을 초래한다. 체세포 과돌연변이 및 형체종류변환 과정은 클론 증폭과 일치하여 일어난다. 이들 과정은 함께 표적 항원에 대해 친화성 성숙된 항체의 분비로 이어지고 4가지 일반 부류(M, D, A, G 또는 E) 중 하나에 속하는 불변 도메인을 포함한다. 항체의 각각의 부류(IgM, IgD, IgA, IgG 및 IgE)는 세포 면역계와 별개의 방식으로 상호작용한다. 표적 항원에 대해 친화성 성숙된 항체의 특징은 1) 생식세포계열 유전자와 비교하여 뉴클레오타이드, 및 후속 아미노산 변화, 2) 표적 항원에 대한 높은 결합 친화성, 3) 다른 단백질과 비교하여 표적 항원에 대한 결합 선택성을 포함할 수 있다.
종양학 환자가 종양 세포 항원에 대해 면역 반응을 시작할 수 있다는 것은 잘 이해된다. 이러한 항원은 돌연변이된 단백질로 이어지는 종양 내 유전자 변화 또는 다르게는 면역계에 대한 정상적인 단백질의 비정상적인 제시로 인해 생길 수 있다. 비정상적인 제시는 신생아 단백질의 이소성 발현, 세포 표면에 대한 세포내 단백질의 잘못된 국재화, 또는 세포의 용해를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 과정을 통해 일어날 수 있다. 단백질의 글리코실화의 변화를 야기하는 효소의 비정상적인 발현은 또한 체액성 면역계에 의해 인식되는 비자가 항원의 생성을 초래할 수 있다.
암과 관련된 것을 포함하여, 질환-관련 단백질에 선택적으로 결합하는 항체는 치료 효능을 야기하는 방식으로 표적 단백질의 기능을 조절하는 데 성공적인 것으로 입증되었다. 돌연변이된, 또는 다르게는 비정상적인 단백질에 대한 항체 반응을 시작하는 인간 면역계의 능력은 환자의 면역 반응이 중요한 종양-동인을 인식하고 이의 기능을 조절할 수 있는 항체를 포함할 수 있음을 시사한다.
막 수송은 광범위한 세포성 과정의 조절에 기여한다. 세포 표면 수용체의 내재화는 성장 인자 수용체 매개 신호전달의 적절한 조절을 위한 중요한 메커니즘이다. 클라트린-코팅 소포를 통한 내재화는 세포 표면으로부터 암 관련 수용체의 내재화를 위한 하나의 경로를 나타낸다. 클라트린-코팅 소포에서 후속 내재화를 위해 클라트린-코팅 소공(clathrin-coated pit: CCP)으로 이들 수용체를 로딩하는 것은 경로의 첫번째 단계 중 하나이다. CCP로 수용체를 로딩하는 것은 부분적으로 어댑터 분자, 예컨대, 엡신-1(Epsin-1: EPN1)과의 상호작용에 의해 지시된다.
EPN1은 세포 막에 국재화하는 대략 60.3 kDa 단백질이다. 이는 PI(4,5)P2-, 유비퀴틴-, 및 클라트린/AP-2-상호작용 도메인을 포함한다. EPN1의 내인성 발현의 넉다운(knocking down) 발현, EPN1의 돌연변이 형태의 과발현, 또는 EPN1과 이의 카고(cargo) 분자의 상호작용을 차단하도록 설계된 작용제를 이용한 세포의 처리로 알려진 CCP-의존성 카고의 내재화를 저해할 수 있다. 이와 같은 카고의 예는 VEGFR 및 ERBB3이다.
본 발명은 VH 및 VL 프레임워크 및 각각 서열번호 4 및 8과 상관관계가 있는 상보적 영역을 가지는 엡신1(EPN1)-특이적 항체를 포함하여, 단백질, 즉 EPN1에 특이적인 항체, 또는 이의 단편뿐만 아니라, 각각 서열번호 9 내지 14에 해당하는 하나 이상의 상보성-결정 영역("CDR")인 H-CDR1, H CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L CDR2 및 L-CDR3을 가지는 EPN1-특이적 항체를 제공한다.
또한 EPN1-발현 종양 세포를 특징으로 하는 다양한 유형의 암을 치료, 개선 또는 진단하기 위한 조성물 및 방법이 본 발명에 의해 제공된다. 상기 조성물 및 방법의 실시형태는 천연-발생 항-EPN1 항체, 이의 단편, 이의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 실시형태는 단일-도메인 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, 단일 사슬 Fv 단백질("scFv"), 및 이황화 안정화 Fv 단백질("dsFv")을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 항체는 VH 영역과 VL 영역 간의 올바른 접힘 및 안정화에 필요한 잔기를 보존할 뿐만 아니라, 분자의 낮은 pI 및 낮은 독성을 보존하는 아미노산 서열 변형을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 치료 또는 진단 방법에서 사용되는 항체는, 특정 실시형태에서 치료제, 진단제, 또는 반감기 및 생체이용률-향상 분자를 포함하는 이펙터 분자에 접합될 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 다양한 재조합 발현 시스템에 의해 생성될 수 있다. 이와 같은 시스템은, 본 발명에 따른 항체에 대한 적절한 뉴클레오타이드 코딩 서열로 세포를 형질전환 또는 형질감염시킴으로써, 본 발명에 따른 항체를 발현하는데 이용될 수 있는 숙주-발현 벡터 시스템을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 숙주 발현 세포 시스템은 본 발명에 따른 항체를 코딩하는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 원하는 대로 항체 유전자 산물을 변형 및 가공할 수 있다.
상기 진술한 바와 같이, 본 발명의 항-EPN1 항체는 대상체에서 폐암 또는 흑색종과 같은 암을 예방, 치료, 또는 개선하기 위한 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다양한 실시형태에서, 치료적 유효량의 항체는 암 세포의 성장, 복제 또는 전이를 저해하거나, 암의 징후 또는 증상을 저해하기에 충분한 양으로 대상체에게 투여된다. 이러한 실시형태에서, 항체는 대상체에 대한 조성물의 투여 방식에 적합한 조성물로 제형화된다.
대상체에서 암의 존재를 진단 또는 모니터링하기 위해 본 발명의 항체를 사용하기 위한 조성물 및 방법과 관련하여, 암의 검출은 특정 실시형태에서는 시험관내에서, 또는 다른 실시형태에서는 생체내에서 수행될 수 있다. 본 발명의 실시형태는 또한 EPN1 양성 세포를 검출하기 위한 키트일 수 있다. 이와 같은 키트는 전형적으로 본 발명에 따른 항체 조성물, 키트가 설계된 특정 적용을 위한 완충액 및 시약, 및 교육자료를 포함할 것이다.
도 1은 살아있는 온전한 암 세포주 풀(pool)에 결합된 하이브리도마-생성 항-EPN1 항체 PR045-2H11의 검출을 나타내는 현미경사진. 형광단-표지 염소 항-인간 IgG 2차 항체를 LI-COR Odyssey® Sa 이미징 시스템과 함께 사용하여 PR045-2H11-생성 항체의 결합의 결합을 검출하였다.
도 2는 도 1에 도시된 웰의 서브세트에서 관찰된 형광 신호의 정량 분석결과. 중실 검정 막대는 잠재적인 스크리닝 히트를 나타내고, 점이 있는 막대는 배경 신호를 나타내며, 백색 개방형 막대는 양성 대조군 웰을 나타낸다.
도 3은 Attune™ NxT 기기(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))를 이용한 유세포분석에 의해 온전한 A549 폐암 세포주에 대하여 IMM20059 결합에 대해 관찰된 농도-의존성 결합 곡선. 형광단-표지 항-인간 2차 항체로 온전한 세포에 대한 IMM20059의 결합을 검출하였다.
도 4는 Attune™ NxT 기기(라이프 테크놀로지스)를 이용한 유세포분석에 의해 온전한 Huh7 간세포 암종 세포에 대하여 IMM20059 결합에 대해 관찰된 농도-의존성 결합 곡선. 형광단-표지 항-인간 2차 Ab로 온전한 세포에 대한 IMM20059의 결합을 검출하였다.
도 5는 2가지 엄격한(200mM 및 300mM NaCl) 세척 조건, 및 비세척 조건 하에서 65 kDa 단백질의 IMM20059에 의한 면역침전의 SDS-PAGE 해상도의 스캔 이미지.
도 6은 동족체 EPN2에 비한 EPN1에 대한 IMM20059의 선택성을 도시하는 정량적 도트 블롯 결과. 재조합 EPN1 또는 EPN2의 농도 증가에 대해 도트 블롯에 의해 IMM20059의 결합을 분석하였다.
도 7은 모 HEK293 및 CRISPR-기반 녹아웃에 의해 생성된 HEK293의 EPN1-/- 변이체의 유세포분석 결과. 고정 및 투과성 세포를 IMM20059 또는 상용 항-EPN1 mAb로 염색하였다. 형광단-표지 항-인간 2차 항체로 결합을 검출하였다.
도 8은 H460 인간 폐암 세포주에 대하여 IMM20059에 대해 관찰된 면역형광 염색 패턴을 나타내는 현미경사진. 형광단-표지 항-인간 2차 항체로 결합을 검출하였다.
도 9는 H460 인간 폐암 세포주에 대하여 항-EPN1 단클론성 항체에 대해 관찰된 면역형광 염색 패턴을 나타내는 현미경사진. 형광단-표지 항-마우스 2차 항체로 결합을 검출하였다.
도 10은 아미노산 서열 수준에서 인간 EPN1에 비해 100% 보존된 래트 EPN1 분자(RCSB PDB: 1edu)의 엡신 N-말단 상동성(ENTH) 도메인의 PyMOL-유래 표현. 진회색 그림의 잔기는 IMM20059에 대한 가교결합으로 확인된 단백질분해-유래 펩타이드를 포함한다. 연회색 리본의 잔기는 가교결합된 펩타이드의 외부이다. 구체의 잔기는 IMM20059에 직접 가교결합된 아미노산을 나타낸다.
도 11은 아미노산 수준에서 인간 EPN1에 비해 100% 보존된 래트 EPN1 분자(RCSB PDB: 1edu)의 엡신 N-말단 상동성(ENTH) 도메인의 PyMOL-유래 표현. 진회색 그림의 잔기는 IMM20059에 대한 가교결합으로 확인된 단백질분해-유래 펩타이드를 나타낸다. 연회색 리본의 잔기는 가교결합된 펩타이드의 외부이다. 구체의 잔기는 인간 EPN1과 인간 EPN2 간에 상이한 아미노산을 나타낸다. IMM20059 결합 부위 내의 위치는 EPN1 vs EPN2에 대한 특이성에 대한 근거를 제공한다.
도 12는 아미노산 수준에서 인간 EPN1에 비해 100% 보존된 래트 EPN1 분자(RCSB PDB: 1edu)의 엡신 N-말단 상동성(ENTH) 도메인의 PyMOL-유래 표현. 진회색 그림의 잔기는 IMM20059에 대한 가교결합으로 확인된 단백질분해-유래 펩타이드를 포함한다. 연회색 리본의 잔기는 가교결합된 펩타이드의 외부이다. 구체의 잔기는 인간 EPN1과 인간 EPN3 간에 상이한 아미노산을 나타낸다. IMM20059 결합 부위 내의 위치는 EPN1 vs EPN3에 대한 특이성에 대한 근거를 제공한다.
도 13은 인간, 래트, 및 마우스 EPN1 아미노산 서열의 다중서열 정렬. 인간 EPN1에서 ENTH 도메인의 밑줄친 영역은 IMM20059 결합 부위를 구성하는 아미노산 펩타이드에 해당한다. 뮤린 및 래트 EPN1은 이 영역 내에서 인간 EPN1과 100% 동일하며, 이는 뮤린 EPN1에의 교차반응에 대한 근거를 제공한다.
도 14는 인간 EPN1, EPN2, 및 EPN3 아미노산 서열의 다중서열 정렬. 인간 EPN1은 인간 EPN2 및 EPN3과 각각 56.7% 및 49.6% 동일하다.
도 15는 IMM20059가 뮤린 EPN1 항원과 교차반응함을 입증하는 유세포분석 결과. 뮤린 NIH3T3 및 인간 MFE296 세포주의 세포의 표면 및 세포내 염색을 수행하였다. IMM20059의 세포 표면 및 세포내 결합을 두 세포주의 풀에서 관찰하였다. 마우스 및 인간 EPN1 둘 다와 교차반응하는 것으로 알려진 상업적으로 입수가능한 항-EPN1 항체는 NIH3T3 및 MFE296 세포에 유사하게 결합하였다. 그러나, 상용 항체는 두 세포의 풀에서 세포 표면에서 EPN1과 상호작용하지 못하였다.
도 16은 HEK293의 EPN1-/- 변이체가 모 HEK293 세포보다 더 느리게 증식함을 입증하는, 세포 증식 분석 결과.
도 17은 C57Bl/6 마우스에서 성장한 B16F0 흑색종 종양 모델에서 관찰된 종양 성장을 도시하는 그래프. 동물 코호트를 아이소타입 대조군(파선, 검정색 원), 항-CTLA4(점선, 검정색 사각형), 또는 IMM20059(실선, 검정색 삼각형)로 복강내 주사(IP)를 통해 10 ㎎/㎏으로 매주 처리하였다.
본 명세서에 기재된 발명은, 서열번호 4 또는 이의 일부분, 및 서열번호 8 또는 이의 일부분에 해당하는 아미노산 서열을 포함하는 항체와 관련된 조성물 및 방법에 관한 것이다. 실제로, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 4 또는 이의 일부분에 해당하는 아미노산 서열과 적어도 90% 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열; 서열번호 8 또는 이의 일부분에 해당하는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열; 또는 이들 둘 다를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "서열 동일성"은 둘 이상의 아미노산 또는 핵산 서열 간의 유사성을 말한다. 서열 동일성은 전형적으로 동일성(또는 유사성 또는 상동성) 백분율의 관점에서 측정되며; 백분율이 더 높을수록 2개 서열의 유사성이 더 크다. 서열번호 4 또는 8에 해당하는 아미노산 서열을 포함하는 것에 추가적으로, 본 발명에 따른 항체는 상피 기원의 암종 세포를 포함하여 다양한 암종 세포의 표면에서 발현되는 항원인 EPN1에 특이적으로 결합한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 항체는 EPN1-발현 종양 세포를 특징으로 하는 다양한 유형의 암을 진단 또는 치료하는 방법에 유용한 조성물에 포함될 수 있다.
구조와 관련하여, 본 발명에 따른 "항체"는 적어도, 항원의 에피토프에 특이적으로 결합하는 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 가변 영역으로 구성된 폴리펩타이드 리간드를 말한다. 예를 들어, 항체는 중쇄 및 경쇄로 구성된 면역글로불린 분자일 수 있으며, 이들 각각은 각각 가변 중쇄("VH") 영역 및 가변 경쇄("VL") 영역으로 불리는 가변 영역을 가진다. 이와 함께, VH 영역 및 VL 영역은 항원에 대한 항체의 특이적 결합을 담당하는 가변 단편 "Fv"를 형성한다.
본 발명에 따른 항체는 온전한 면역글로불린, 또는 면역글로불린의 변이체, 또는 면역글로불린의 일부분일 수 있다. 천연 발생 면역글로불린은 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 가지며, 이들 각각은 불변 영역 및 가변 영역을 포함하고, 이황화 결합에 의해 상호연결된다. 람다("λ") 및 카파("κ")로 불리는 2가지 유형의 경쇄가 있다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는, 아이소타입으로도 알려진 5가지 주요 중쇄 부류, 즉 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE가 있다. 이의 가변 도메인에 추가적으로, 중쇄는 또한 3개의 불변 도메인(CH1, CH2, CH3)을 가진다. Ab의 불변 영역은, 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 구성요소(C1q)를 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
경쇄 및 중쇄 가변 영역은 상보성-결정 영역("CDR")이라고 하는 3개의 초가변 영역에 의해 중단된 "프레임워크" 영역을 포함한다. CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합을 담당한다. 상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 종 내에서 상대적으로 보존되며, 3차원 공간에서 CDR을 배치하고 정렬하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 3개의 CDR은 전형적으로 CDR1, CDR2, 및 CDR3(N-말단에서 시작하여 순차적으로 번호를 매김)으로 지칭되며, 종종 특정 CDR이 위치하는 사슬에 의해 확인된다. 따라서, 중쇄 CDR은 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3으로 지정되고; 마찬가지로 경쇄 CDR은 L-CDR1, L-CDR2, 및 L-CDR3으로 지정된다. 항체-결합 단편, 중쇄 및 경쇄 각각의 하나의 불변 도메인 및 하나의 가변 도메인은 Fab 단편으로 지칭된다. F(ab)'2 단편은 2개의 Fab 단편을 포함하고, 힌지 영역 아래에서 면역글로불린 분자를 절단함으로써 생성될 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 VH 및 VL 프레임워크 및 상보적 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 4 및 8과 상관관계가 있다. 보다 구체적으로, 이뮤노제네틱스(ImMunoGeneTics) 데이터베이스("IMGT") 번호매김 시스템을 기반으로(Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212 (1999)), H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3은 서열번호 4의 잔기 26 내지 33(서열번호　9), 51 내지 58(서열번호　10), 및 97 내지 113(서열번호　11)에 해당한다. 본 발명에 따른 항체의 유사 L-CDR1, L-CDR2, 및 L-CDR3 아미노산 서열은 서열번호 8의 잔기 27 내지 32(서열번호　12), 50 내지 56(서열번호　13), 및 89 내지 96(서열번호　14)에 해당한다. 본 발명에 따른 항체는 상기 CDR 서열 중 적어도 하나를 포함하고; 따라서, 항체의 CDR의 조합은, 예를 들어 (H-CDR1 및 L-CDR1); (H-CDR2 및 L-CDR2); (H-CDR3 및 L-CDR3); (H-CDR1, L-CDR1, H-CDR2 및 L-CDR2); (H-CDR1, L-CDR1, H-CDR3 및 L-CDR3); (H-CDR2, L-CDR2, H-CDR3 및 L-CDR3); 또는 (H-CDR1, L-CDR1, H-CDR2, L-CDR2, H-CDR3 및 L-CDR3)일 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 단클론성 항체이며, 이는 항체가 단일 클론 B-림프구 집단, 클론 하이브리도마 세포 집단, 또는 단일 항체의 유전자로 형질감염된 세포의 클론 집단, 또는 이들의 부분에 의해 생성됨을 의미한다. 단클론성 항체는 당업자에게 알려진 방법에 의해, 예를 들어 골수종 세포와 면역 림프구 세포의 융합으로부터 하이브리드 항체-형성 세포를 제조함으로써 생성된다.
본 발명에 따른 단클론성 항체는 또한 전형적으로 인간화된 단클론성 항체이다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른, "완전 인간" 항체라고도 하는 "인간" 항체는 인간 면역글로불린 유래의 인간 프레임워크 영역 및 CDR을 포함하는 항체이다. 예를 들어, 항체의 프레임워크 및 CDR은 동일한 기원의 인간 중쇄, 또는 인간 경쇄 아미노산 서열, 또는 둘 다로부터 유래된다. 대안적으로, 프레임워크 영역은 인간 항체로부터 기원할 수 있으며, 상이한 인간 항체 유래의 CDR을 포함하도록 조작될 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 또한 면역글로불린 단편일 수 있다. 본 발명에 따른 항체로 간주되는 면역글로불린 변이체의 예는 단일-도메인 항체(예컨대, VH 도메인 항체), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, 단일 사슬 Fv 단백질("scFv"), 및 이황화 안정화 Fv 단백질("dsFv")을 포함한다. VH 단일-도메인 항체는 중쇄 가변 도메인으로 이루어진 면역글로불린 단편이다. Fab 단편은 1가 항원-결합 면역글로불린 단편을 포함하며, 이는 파파인 효소로 전체 항체를 분해하여 온전한 경쇄 및 하나의 중쇄의 일부분을 산출함으로써 생성될 수 있다. 유사하게, Fab' 단편은 또한 1가 항원-결합 면역글로불린 단편을 포함하며, 이는 펩신 효소로 전체 항체를 분해한 다음, 환원시켜 온전한 경쇄 및 중쇄의 일부분을 산출함으로써 생성될 수 있다. 면역글로불린 분자 당 2개의 Fab' 단편이 얻어진다. (Fab')2 단편은 전체 항체를 후속 환원없이 펩신 효소로 처리하여 얻을 수 있는 2개의 Fab' 단편의 이량체이므로, Fab' 단량체는 2개의 이황화 결합에 의해 함께 유지된다. Fv 단편은 2개의 사슬로 발현되는 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 유전자 조작된 단편이다. 단일 사슬("sc") 항체, 예컨대, scFv 단편은, 유전적으로 융합된 단일 사슬 분자로서 적합한 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된, 경쇄의 VL 영역, 중쇄의 VH 영역을 포함하는 유전자 조작된 분자이다. 단일 사슬 항체의 이량체, 예컨대, scFV2 항체는 scFV의 이량체이며, 또한 "미니항체"로도 알려질 수 있다. dsFv 변이체는 또한 면역글로불린의 VL 영역 및 VH 영역을 포함하지만, 사슬은 사슬의 회합을 안정화시키기 위해 이황화 결합을 도입하도록 돌연변이되었다.
당업자는 항체의 보존적 변이체를 생성할 수 있음을 인식할 것이다. 항체 단편, 예컨대, dsFv 단편 또는 scFv 단편에서 이용되는 이와 같은 보존적 변이체는 VH 영역과 VL 영역 간의 올바른 접힘 및 안정화에 필요한 중요한 아미노산 잔기를 유지할 것이고, 분자의 낮은 pI 및 낮은 독성을 보존하기 위해 잔기의 전하 특징을 유지할 것이다. 아미노산 치환, 예컨대, 많아야 1개, 많아야 2개, 많아야 3개, 많아야 4개, 또는 많아야 5개 아미노산 치환이 VH 및 VL 영역에서 이루어져서 수율을 증가시킬 수 있다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 아미노산 치환 표는 당업자에게 잘 알려져 있다. 다음 6개의 아미노산 그룹은 서로에 대한 보존적 치환인 것으로 간주되는 아미노산의 예이다: i)　알라닌(A), 세린(S), 및 트레오닌(T); ii) 아스파르트산(D) 및 글루탐산(E); iii) 아스파라긴(N) 및 글루타민(Q); iv) 아르기닌(R) 및 라이신(K); v) 아이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 및 발린(V); 및 vi) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y) 및 트립토판(W).
본 발명에 따른 항체는 또한 내인성 항체의 배경에 대하여 생물학적 제제의 검출을 용이하게 하기 위해 "태깅된" 면역글로불린 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 보다 특히, 태깅된 CH3 도메인은 인간 IgG-유래 CH3 도메인의 AB, EF, 또는 CD 구조 루프 중 하나 이상에 통합된 이종성 항체 에피토프이다. CH3 태그는 바람직하게는 IgG1 하위부류 항체의 구조적 맥락에 통합되며, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함한 다른 인간 IgG 하위부류도 또한 본 발명에 따라 이용가능하다. "CH3 스캐폴드"로도 지칭되는 에피토프-태깅 CH3 도메인은 일반적으로 면역글로불린 Fc 부분의 형태로 중쇄 불변 영역을 가지는 본 발명의 임의의 항체로 통합될 수 있다. CH3 스캐폴드 태그, 및 이를 항체에 통합하는 방법의 예는 PCT 특허 출원 PCT/US19/32780에 개시되어 있다. 에프토프 태깅 CH3 스캐폴드를 검출하는 데 사용되는 항체는 일반적으로 본 명세서에서 "검출기 항체"로 지칭된다.
본 발명에 따른 항체의 치료 및 진단 유효성은 표적 항원에 대한 결합 친화성과 상관관계가 있다. 결합 친화성은 문헌[Frankel et al., Mol. Immunol., 16:101-106, 1979]에 의해 기재된 스캐차드(Scatchard) 방법의 변형에 의해 계산될 수 있다. 대안적으로, 결합 친화성은 항원으로부터 항체의 해리 속도에 의해 측정될 수 있다. 또한, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명(SPR), 경쟁 방사면역측정법, ELISA, 및 유세포분석법을 포함하는 다양한 다른 방법이 결합 친화성을 측정하는 데 사용될 수 있다.
항원에 "특이적으로 결합"하는 항체는 높은 친화성으로 항원에 결합하고 다른 관련이 없는 항원에 유의하게 결합하지 않는 항체이다. 항원에 대한 항체의 높은 친화성 결합은 항원 표적의, 항원 결정기라고도 알려진 에피토프에 대한 항체 CDR 중 하나 이상의 결합 상호작용에 의해 매개된다. 에피토프는 항원성 분자 상의 특정 화학 그룹 또는 펩타이드 서열이며, 이는 특정 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명에 따른 항체에 의해 특이적으로 결합되는 에피토프는, 예를 들어 하나 이상의 암 유형의 세포에 의해 발현되는 단백질 내에 포함될 수 있다. 일반적으로, 항체는 해리 상수 값("KD")이 50nM 이하인 경우 "높은 친화성 결합"을 나타낸다. 따라서, 항체와 엡신 1("EPN1") 또는 본 발명에 따른 항체의 에피토프를 포함하는 이의 일부분 간의 KD가 50nM 이하인 경우, 본 발명에 따른 항체는 높은 친화성 결합을 나타낸다. 예를 들어, KD 값이 40nM 이하, 30nM 이하, 20nM 이하, 10nM 이하, 9nM 이하, 8nM 이하, 7nM 이하, 6nM 이하, 5nM 이하, 4nM 이하, 3nM 이하, 2nM 이하, 또는 1nM 이하인 경우, 본 발명에 따른 항체는 EPN1에 대해 높은 친화성 결합을 나타낸다.
본 발명에 따른 항체의 높은 친화성 결합은, 예를 들어 EPN1을 발현하는 세포에 대한 결합과 관련하여 설명될 수 있다. 보다 특히, 본 발명에 따른 항체가 10nM 이하, 9nM 이하, 8nM 이하, 7nM 이하, 6nM 이하, 5nM 이하, 4nM 이하, 3nM 이하, 2nM 이하, 또는 1nM 이하의 반수 최대 유효 농도(EC50) 값을 나타내는 경우, 본 발명에 따른 항체는 EPN1-발현 세포에 대해 높은 친화성 결합을 나타낸다.
본 발명에 따른 항체의 치료 및 진단 용도는 면역접합체의 용도를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 면역접합체는 본 발명에 따른 항체에 연결된 이펙터 분자를 포함하는 키메라 분자이다. 본 명세서에 언급된 바와 같이, 이펙터 분자는 면역접합체가 표적화되는 세포에 대해 원하는 효과를 갖도록 의도된 면역접합체의 일부분이거나, 이펙터 분자가 본 발명에 따른 항체의 반감기 또는 생체이용률을 증가시키는 역할을 할 수 있다. 이펙터 분자의 일반적인 예는 치료제(예컨대, 독소 및 화학요법 약물), 진단제(예컨대, 검출 가능한 마커), 및 반감기 및 생체이용률-향상 분자(예컨대, 지질)를 포함한다.
이펙터 분자는 공유 및 비공유 부착 수단을 포함하여 당업자에게 알려진 임의의 수의 수단을 사용하여 본 발명에 따른 항체에 연결될 수 있다. 이펙터 분자를 항체에 부착하기 위한 절차는 이펙터의 화학 구조에 따라 다를 수 있다. 폴리펩타이드는 전형적으로 항체 상의 적합한 작용기와 반응하여 이펙터 분자의 결합을 초래하는 데 이용가능한 다양한 작용기, 예컨대, 카복실산(COOH) 기, 유리 아민(-NH2), 및 설파이드릴(SH) 기를 포함한다. 대안적으로, 본 발명에 따른 항체는 추가적인 반응성 작용기를 노출시키거나 부착하기 위해 유도체화될 수 있다. 유도체화는 다수의 알려진 링커 분자의 부착을 포함할 수 있다. 링커는 이펙터 분자에 항체를 연결하는 데 사용되는 임의의 분자일 수 있다. 예를 들어, 링커는 항체 및 이펙터 분자 둘 다에 대하여 공유 결합을 형성할 수 있다. 적합한 링커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 직쇄 또는 분지쇄 탄소 링커, 헤테로사이클릭 탄소 링커, 또는 펩타이드 링커를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이펙터 분자가 폴리펩타이드인 경우, 링커는 구성 아미노산의 측쇄를 통해 구성 아미노산에, 예컨대, 이황화 연결을 통해 시스테인에, 또는 말단 아미노산의 알파 탄소 아미노 및 카복실 기에 연결될 수 있다. 재조합 기술이 링커 펩타이드를 포함하여 2개 이상의 폴리펩타이드를 하나의 인접한 폴리펩타이드 분자로 만드는 데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 항체에 접합될 수 있는 치료제는 핵산, 단백질, 펩타이드, 아미노산 또는 유도체, 당단백질, 방사성동위원소, 지질, 탄수화물, 재조합 바이러스, 또는 소분자 약물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 핵산 치료 및 진단 모이어티는 안티센스 핵산, 단일 또는 이중 DNA와의 공유 가교를 위한 유도체화된 올리고뉴클레오타이드, 및 삼중나선 형성 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
치료제는 또한 본 발명의 특정 실시형태에서 화학요법제일 수 있다. 본 명세서에서 언급되는 바와 같이, 화학요법제는 비정상적인 세포 성장을 특징으로 하는 질환의 치료에 치료적 유용성을 가지는, 방사능제를 포함하는 임의의 화학 작용제이다. 이와 같은 질환은 종양, 신생물, 및 암뿐만 아니라, 과증식성 성장을 특징으로 하는 질환을 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 면역접합체는 적어도 하나의 암 유형, 또는 다른 과증식성 장애를 치료하기 위한 요법의 일부로서 대상체에게 투여될 수 있다. 화학요법 분자는 본 발명에 따른 항체에 직접 접합될 수 있거나, 치료 조성물, 예컨대, 약물, 핵산(예컨대, 안티센스 핵산), 또는 순환계에 대한 직접적인 노출로부터 보호될 수 있는 다른 치료 모이어티를 포함하는 리포좀 또는 미셀과 같은 연결된 캡슐화 시스템에 포함될 수 있다. 항체에 부착되는 리포좀을 제조하는 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,957,735호; 및 문헌[Connor et al., Pharm Ther 28:341-365, 1985] 참조).
상기 진술한 바와 같이, 본 발명에 따른 치료제는 또한 독소일 수 있다. 본 발명에 따른 항체에 연결될 수 있는 독소의 예는 아브린, 라이신, 슈도모나스 외독소("PE", 예컨대, PE35, PE37, PE38 및 PE40), 디프테리아 독소("DT"), 보톨리눔 독소, 사포린, 리스트릭토신(restrictocin), 겔로닌(gelonin), 보우가닌(bouganin), 및 이들의 변형 독소를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 그러나 일반적으로 본 발명의 맥락에서 독소는 세포에 독성이 있는 분자이다.
일부 상황에서, 면역접합체가 이의 표적 부위에 도달했을 때 항체로부터 이펙터 분자를 제거하는 것이 바람직하다. 따라서, 이러한 상황에서, 면역접합체는 표적 부위 근처에서 절단가능한 연결을 포함할 것이다. 본 발명에 따른 항체로부터 이펙터 분자를 방출하기 위한 링커의 절단은 효소 활성 또는 표적 세포 내부 또는 표적 부위 근처에서 면역 접합체에 가해지는 조건에 의해 촉발될 수 있다. 대안적으로, 표적 항원에 특이적으로 결합한 후, 본 발명에 따른 항체는 표적 항원을 발현하는 세포에 의해 내재화될 수 있다.
치료용 면역접합체를 포함하여 본 발명에 따른 치료용 항체는 대상체에서 질환을 예방, 치료, 또는 개선하는 방법에서 사용될 수 있다. 보다 특히, 본 발명에 따른 치료용 항체는 암, 예를 들어 폐암 또는 흑색종을 예방, 치료, 또는 개선하는 데 사용될 수 있다. 질환을 "예방"하는 것은 질환의 완전한 발병을 저해하는 것을 말한다. "치료"하는 것은 질환 또는 병리학적 병태의 징후 또는 증상의 발병이 시작한 후 이를 개선시키는 치료적 개입, 예컨대, 종양 부담의 감소 또는 전이 크기의 수 감소를 말한다. "개선"하는 것은 질환, 예컨대, 암의 징후 또는 증상의 수 또는 중증도의 감소를 말한다. 암을 예방, 치료, 또는 개선하는 방법은, 유효량의 본 발명에 따른 항체를 포함하는 조성물을 종양 성장 또는 전이를 저해하기 위해 대상체에게 투여하는 것을 필요로 할 수 있으며, 항체의 항원 표적을 발현하는 암이 있는 대상체를 선택하는 단계를 포함한다. 투여된 항체는 종양 세포와 접촉하고, 즉 항체가 이의 표적에 결합하고 세포독성 요법을 전달할 수 있는 종양 세포와 직접적으로 물리적으로 회합하여 배치된다.
"암"은 체내에서 비정상적인 세포의 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 다양한 질환의 광범위한 그룹을 말한다. 조절되지 않는 세포 분열 및 성장은 주변 조직을 침범하는 악성 종양의 형성을 초래하고 또한 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 먼 부위로 전이할 수 있다. "암" 또는 "암 조직"은 종양을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 방법에 의해 치료될 수 있는 암의 예는 폐암, 예컨대, 편평 세포 폐 암종 세포, 간암, 예컨대, 간세포 암종, 및 피부암, 예컨대, 흑색종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 실제로, 본 발명의 방법은, 예를 들어 폐암, 간암, 피부암, 유방암, 결장직장암, 위-식도 암종, 난소암, 전립선암, 신장암, 방광암, 갑상선암, 두경부의 편평 세포 암종, 췌장암, B 세포 림프종, 다발성 골수종, 비호지킨 림프종(NHL), 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 호지킨병, 또는 비호지킨 림프종(NHL)으로부터 선택되는 암으로부터 유래된 종양의 종양 크기 또는 전이, 또는 둘 다를 감소시키는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 다양한 방법에서, 치료적 유효량의 항체는 암 세포의 성장, 복제 또는 전이를 저해하거나, 암의 징후 또는 증상을 저해하기에 충분한 양으로 대상체에게 투여된다. 적합한 대상체는 암으로 진단된 대상체를 포함할 수 있으며, 여기서 종양 세포는 본 발명에 따른 항체의 표적 항원을 발현한다. 본 발명에 따른 항체의 치료적 유효량은 암의 중증도, 환자 건강의 일반적인 상태에 따라 다를 것이다. 항체의 치료적 유효량은 임상의 또는 다른 자격을 갖춘 전문가가 언급한 바와 같은 증상(들)의 주관적인 완화 또는 객관적으로 식별가능한 개선을 제공하는 것이다.
필요로 하는 대상체에게 투여되는 본 발명에 따른 항체는 조성물로 제형화된다. 보다 특히, 항체는 전신 투여, 또는 국소 투여, 예컨대, 종양내 투여용으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항체는 비경구 투여, 예컨대, 정맥내 투여용으로 제형화될 수 있다. 조성물은 대상체에게 투여하기 위한 단위 투약 형태로 제조될 수 있다. 투여 양 및 시기는 원하는 결과를 달성하도록 치료 임상의의 재량에 달려 있다.
본 발명에 따른 항체의 투여는 또한 다른 항암제, 예컨대, 화학요법제의 투여, 또는 치료적 처치, 예컨대, 종양의 수술적 절제를 수반할 수 있다. 임의의 적합한 항암제는 본 명세서에 개시된 항체와 조합하여 투여될 수 있다. 예시적인 항암제는, 예를 들어 유사분열 저해제, 알킬화제, 항-대사산물, 삽입성 항생제, 성장 인자 저해제, 세포 주기 저해제, 효소, 토포아이소머라제 저해제, 항-생존제, 생물학적 반응 조절제, 항-호르몬(예를 들어, 항-안드로겐) 및 항-혈관신생제와 같은 화학요법제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 항암 치료는 방사선 요법 및 암 세포를 특이적으로 표적화하는 다른 항체를 포함한다.
투여용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대, 수성 담체에 용해된 항체의 용액을 포함할 수 있다. 일반적으로, 담체의 특성은 이용되는 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 비경구 제형은 보통 비히클로서 약학적으로 및 생리학적으로 허용가능한 유체, 예컨대, 물, 생리 식염수, 평형염액, 수성 덱스트로스, 또는 글리세롤을 포함하는 주사가능한 유체를 포함한다. 고체 조성물, 예컨대, 분말, 환제, 정제, 또는 캡슐 형태의 경우, 통상적인 무독성 고체 담체는, 예를 들어 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 또는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 생물학적으로 중성인 담체에 추가적으로, 투여될 약학 조성물은 소량의 무독성 보조 물질, 예컨대, 습윤제 또는 유화제, 방부제, 및 pH 완충액 등, 예를 들어 소듐 아세테이트 또는 솔비탄 모노라우레이트를 포함할 수 있다. 전술한 담체 용액은 멸균되고 일반적으로 바람직하지 않은 물질이 없으며, 잘 알려진 통상적인 멸균 기법으로 멸균될 수 있다. 조성물을 pH 조절제 및 완충제와 같은 생리학적 조건에 근접하는 데 필요한 약학적으로 허용가능한 보조 물질, 및 독성 조절제, 예컨대, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 및 락트산나트륨를 포함할 수 있다. 이러한 제형에서 항체의 농도는 광범위하게 변할 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식 및 대상체의 필요에 따라 주로 유체 부피, 점도, 환자 체중 등을 기반으로 하여 선택될 것이다.
본 발명에 따른 항체를 투여하기 위한 선택사항은 느린 주입에 의한 투여, 또는 정맥내 푸쉬 또는 볼루스를 통한 투여를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 투여 전, 본 발명에 따른 항체 조성물은 동결건조 형태로 제공될 수 있고, 투여 전에 원하는 농도로 멸균 용액에서 재수화될 수 있다. 그 다음 항체 용액은 0.9% 염화나트륨, USP를 포함하는 주입 백에 첨가될 수 있으며, 일부 경우에 체중 ㎏ 당 0.5 내지 15 ㎎의 투약량으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 항체 조성물의 투여의 일 예에서, 더 높은 로딩 용량이 투여되고, 후속적으로 더 낮은 수준으로 유지 용량이 투여된다. 예를 들어, 4 ㎎/㎏의 초기 로딩 용량은 일부 90분의 기간에 걸쳐 주입된 다음, 이전 용량이 잘 용인되는 경우 4 내지 8주 동안 30분의 기간에 걸쳐 2 ㎎/㎏의 매주 유지 용량이 주입될 것이다.
본 발명에 따른 항체 조성물은 또한 제어된 방출 제형일 수 있다. 예를 들어, 제어된 방출 비경구 제형은 임플란트, 또는 유성 주사로 제조될 수 있다. 마이크로스피어, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 나노캡슐, 나노스피어, 및 나노입자를 포함하는 미립자 시스템은 또한 본 발명에 따른 항체 조성물을 전달하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 언급되는 바와 같이 마이크로캡슐은 중심 코어 구성요소로서 본 발명에 따른 항체를 포함한다. 마이크로스피어에서, 본 발명에 따른 항체는 입자 전체에 분산된다. 약 1 ㎛보다 작은 입자, 마이크로스피어, 및 마이크로캡슐은 일반적으로 각각 나노입자, 나노스피어, 및 나노캡슐로 지칭된다.
상기 기재한 바와 같이, 본 발명에 따른 항체는 또한 암(이에 제한되지 않음)과 같은 병리학적 병태의 존재를 진단 또는 모니터링하는 데 유용할 수 있다. 보다 특히, 본 발명의 방법은 본 발명에 따른 항체의 항원 표적 발현을 검출하는 데 유용하다. 검출은 시험관내 또는 생체내일 수 있다. 임의의 조직 샘플은 시험관내 진단 검출에 사용될 수 있고, 생검, 부검 및 병리학 시료 유래의 조직을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 생물학적 샘플은 조직의 절편, 예를 들어 조직학적 목적으로 취한 냉동 절편을 포함한다. 생물학적 샘플은 체액, 예컨대, 혈액, 혈청, 혈장, 가래, 척수액 또는 소변을 추가로 포함한다.
방법은 대상체 유래의 샘플, 예컨대, 생검을 본 발명에 따른 항체와 접촉시키는 단계; 및 샘플에 존재하는 표적 항원에 대한 항체의 결합을 검출하는 단계에 의해 대상체가 암에 걸렸는지를 결정한다. 대조군 샘플에서 항체의 결합과 비교하여 샘플에서 표적 항원에 대한 항체의 결합 증가는 대상체가 암, 예를 들어 폐암, 예컨대, 폐의 편평 세포 암종, 또는 간세포 암종, 또는 흑색종, 또는 본 발명에 따른 항체의 EPN1 항원 표적을 발현하는 상기 개시된 다양한 암을 포함하는 임의의 다른 유형의 암을 가진 것으로 확인한다. 일반적으로, 대조군 샘플은 암이 없는 대상체 유래의 샘플이다.
진단 방법은 민감도 및 특이성이 상이하다. 진단 분석의 "민감도"는 양성을 테스트하는 이환된 개체의 백분율(진양성의 백분율)이다. 진단 분석의 "특이성"은 1에서 위양성률을 뺀 값이며, 여기서 위양성률은 양성을 테스트한 질환이 없는 대상체의 비율로서 정의된다. 특정 진단 방법은 병태의 확정적인 진단을 제공하지 않을 수 있지만, 이는 방법이 진단에 도움이 되는 긍정적인 징후를 제공한다면 충분하다. "예후"는 병리학적 병태, 예컨대, 간암 또는 전이의 발생 확률(예를 들어, 중증도)이다.
본 발명의 항체는 검출 가능한 표지에 연결되어 진단제로서 유용한 면역접합체를 형성할 수 있다. 본 명세서에서 언급되는 바와 같이, 검출 가능한 표지는, 예를 들어 본 발명에 따른 항체의 항원 표적인 종양 세포 항원과 같은 질환의 존재와 상관관계가 있는 분자의 검출을 용이하게 하기 위해 본 발명에 따른 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되는 화합물 또는 조성물이다. 이와 같은 목적에 유용한 검출 가능한 표지는 당업계에 잘 알려져 있으며, 방사성 동위원소, 예컨대, 35S, 11C, 13N, 15O, 18F, 19F, 테크네튬-99m("99mTc), 131I, 3H, 14C, 15N, 90Y, 111In 및 125I; 형광단; 화학발광제; 효소 표지, 예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리 포스파타제; 바이오티닐 기; 2차 리포터에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩타이드 에피토프, 예컨대, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그; 및 자기 작용제, 예컨대, 가돌리늄 킬레이트를 포함한다. 본 발명에 따른 표지된 항체는 또한 "표지된 항체"로 지칭될 수 있다. 본 발명에 따른 일부 항체에 있어서, 표지는 다양한 길이의 스페이서 암에 의해 부착되어 잠재적인 입체 장애를 감소시킨다.
본 발명에 따른 항체를 사용하는 단계를 포함하는 진단 방법은 특정 적용에서 면역분석법일 수 있다. 면역분석법의 세부 사항은 이용되는 특정 형식에 따라 다를 수 있지만, 생물학적 샘플에서 본 발명에 따른 항체의 항원 표적을 검출하는 방법은 일반적으로 면역 복합체를 형성하는 면역학적 반응 조건 하에서 생물학적 샘플을 항원과 특이적으로 반응하는 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 생성된 면역 복합체의 존재는 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 항체는 진단 방법에서 1차 항체(1°　Ab)로서 기능할 수 있고, 본 발명에 따른 항체에 특이적인 표지된 항체는 2° Ab로서 기능한다. 면역 복합체의 간접적인 검출의 경우, 진단 방법을 위한 본 발명에 따른 항체의 사용은 또한 1차 항체(본 발명에 따른 항체)의 이의 표적 항원에 대한 결합을 검출하기 위해 표지된 2차 항체(2° Ab)의 사용을 포함할 것이다. 2차 항체에 적합한 검출 가능한 표지는 본 발명에 따른 직접 표지된 항체에 대한 상기 기재된 표지를 포함한다. 본 발명에 따른 진단 방법에서 사용되는 2° Ab는 또한 PCT 특허 출원 PCT/US19/32780에 기재된 바와 같이 CH3 에피토프 태그를 포함하는 본 발명에 따른 항체와 함께 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 "검출기 항체"일 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 또한 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 사용될 수 있다. 세포 집단의 FACS 분석은 세포를 분리하거나 분류하기 위한 다른 보다 정교한 검출 수준 중에서 복수의 색상 채널, 낮은 각도 및 둔한 광-산란 검출 체널, 및 임피던스 채널을 이용한다(미국 특허 제5,061,620호 참조).
상기 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 항체의 진단 적용에 사용되는 시약은 생물학적 샘플, 예컨대, 혈액 샘플 또는 조직 샘플에서 본 발명에 따른 항체의 항원 표적을 검출하기 위한 키트에서 제공될 수 있다. 이와 같은 키트는 피험자에서 암 진단들 확인하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항체를 포함하는 진단 키트는 생검으로부터 얻은 조직 샘플에서 종양 세포에 대한 조직학적 검사를 수행하는 데 사용될 수 있다. 보다 특정한 예에서, 키트는 폐 생검을 수행함으로써 얻은 조직 또는 세포에서 폐 암 세포를 검출하는 데 사용될 수 있는 본 발명에 따른 항체를 포함할 수 있다. 대안적인 특정 예에서, 키트는 간 생검에서 간세포 암종 세포를 검출하는 데 사용될 수 있는 본 발명에 따른 항체를 포함할 수 있다. 추가적으로, 대안적인 특정 예에서, 키트는 생검을 수행함으로써 얻은 조직 또는 세포에서 흑색종을 검출하는 데 사용될 수 있는 본 발명에 따른 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 항원 표적을 검출하기 위한 키트는 전형적으로 단클론성 항체, 또는 이의 단편, 예컨대, sFv 단편, VH 도메인, 또는 Fab의 형태로 본 발명에 따른 항체를 포함할 것이다. 항체는 상기 기재한 바와 같은 검출 가능한 마커, 예컨대, 형광성, 방사성, 또는 효소 표지에 의해 표지되거나 표지되지 않을 수 있다. 키트는 또한 일반적으로 본 발명에 따른 항체의 사용 수단을 개시하는 교육자료를 포함한다. 교육자료는 전자 형태, 예컨대, 휴대용 하드 드라이브로 작성될 수 있으며, 자료는 또한 시각적, 예컨대, 비디오 파일일 수 있다. 교육자료는 또한 응용 소프트웨어 프로그램, 예컨대, 지침을 제공하는 모바일 장치 또는 컴퓨터 "앱"에 대한 웹사이트 또는 링크를 언급할 수 있다. 키트는 또한 키트가 설계된 특정 적용을 용이하게 하는 추가적인 구성요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 또한 표지를 검출하는 수단(예컨대, 효소 표지에 대한 효소 기질, 형광성 표지를 검출하기 위한 필터 세트, 2차 항체와 같은 적절한 2차 표지 등)을 포함할 수 있다. 진단 목적으로 본 발명에 따른 항체를 사용하는 방법에서 통상적인 완충액 및 다른 시약이 또한 본 발명에 따른 키트에 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 다양한 재조합 발현 시스템에 의해 생성될 수 있다. 즉, 항체는 배양물 중 살아있는 세포에서 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열의 발현에 의해 생성될 수 있다. 본 발명에 따른 "단리된" 항체는 다른 생물학적 구성요소 환경, 예컨대, 세포, 단백질 및 세포기관으로부터 실질적으로 분리 또는 정제된 것이다. 예를 들어, 항체는, i) 로리법(Lowry method)에 의해 결정될 때 단백질의 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량%, 또는 99 중량% 초과, 대안적으로 99 중량% 초과; ii) 스피닝 컵 배열 결정장치의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 얻는 데 충분한 정도; iii) 환원 또는 비환원 조건 하에서, 쿠마시에 블루 또는 은 염색을 사용하여 SDS-PAGE에 의한 균질성까지 정제되는 경우 단리될 수 있다. 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 구성요소가 존재하지 않을 것이므로, 단리된 항체는 또한 재조합 세포 내 동일계내(in situ) 존재하는 본 발명에 따른 항체일 수 있다. 그러나, 일반적으로 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본 발명에 따른 항체에 적절한 뉴클레오타이드 코딩 서열로 세포를 형질전환 또는 형질감염시킴으로써, 다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 본 발명에 따른 항체를 발현하는 데 이용될 수 있다. 숙주-발현 세포의 예는, 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터 내에 포함된 항체 코딩 서열로 형질감염될 수 있는 박테리아, 예컨대, 이.콜라이(E.coli) 및 비.서브틸리스(B. Subtilis); 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모, 예컨대, 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 피치아(Pichia); 항체 코딩 서열을 포함하는, 바큘로바이러스(baculovin1s)와 같은 재조합 바이러스 발현 벡터로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 코딩 서열을 포함하는, 재조합 바이러스 발현 벡터, 예컨대, 콜리플라워 모자이크 바이러스("CaMV"), 또는 담배 모자이크 바이러스("TMV")로 감염된 식물 세포 시스템; 및 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터, 예컨대, 메탈로싸이오네인 프로모터 또는 신장 인자 I 알파 프로모터, 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터, 예컨대, 아데노바이러스 후기 프로모터, 및 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터를 포함하는 재조합 발현 작제물을 보유하는 포유동물 세포 시스템, 예컨대, COS, 중국 햄스터 난소("CHO") 세포, ExpiCHO, 아기 햄스터 신장("BHK") 세포, HEK293, Expi293, 3T3, NSO 세포(이에 제한되지 않음)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 각각 중쇄 및 경쇄 단편을 발현하기 위해 마우스 및 래트 신장 인자 1 알파 프로모터를 포함하는 이중 프로모터 벡터와 함께, 포유동물 세포, 예컨대, 인간 배아 신장 293(HEK293) 또는 이의 유도체, 예컨대, Expi293은 본 발명에 따른 항체에 효과적인 발현 시스템이며, 이는 발현되는 항체 분자에 대해 의도된 용도에 따라 유리하게 선택될 수 있다.
항체의 약학 조성물의 생성을 위해 본 발명에 따른 항체를 다량으로 생성하는 경우, 용이하게 정제되는 융합 단백질 생성물의 높은 수준의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이와 같은 벡터는 pUR278 벡터(Ruther et al. EMBO J. 2:1791 (1983))(여기서, 항체 코딩 서열은 융합 단백질이 생성되도록 락(lac) Z 코딩 영역이 있는 프레임에서 벡터 내로 개별적으로 결찰될 수 있음); plN 벡터(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985), 및 Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); 본 발명의 항체를 글루타티온 S-트랜스퍼라제("GST")와 융합시키는 pGEX 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 항체의 GST 융합 단백질 및 폴리펩타이드 태그는 가용성이며, 매트릭스 글루타티온-아가로스 비드에 흡착 및 결합한 다음 유리 글루타티온의 존재 하에 용리시킴으로써 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. 대조적으로, pGEX 벡터는 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계되어 클로닝된 표적 유전자 생성물(본 발명에 따른 항체)이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있게 한다.
본 발명에 따른 항체를 코딩하는 삽입된 서열(들)의 발현을 조절하거나 원하는 대로 유전자 생성물을 변형 및 가공하는 숙주 발현 세포 시스템이 또한 선택될 수 있다. 예를 들어, 글리코실화 및 가공, 예컨대, 단백질 생성물의 절단을 포함하는 변형은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 실제로, 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역후 가공 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 메커니즘을 가진다. 이를 위해, 1차 전사체의 적절한 가공뿐만 아니라, 본 발명에 따른 유전자 생성물의 글리코실화 및 인산화를 위한 적절한 세포 기구를 보유하는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 항체를 생성하는 데 사용되는 벡터는 특정 항체의 적어도 일부분을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 이와 같은 핵산 서열은 서열번호 3에 해당하는 DNA 서열, 또는 이의 일부분을 포함할 수 있다. 따라서, 프로모터와 같은 제1 핵산 서열과 기능적 관계에 있는 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된 본 발명에 따른 항체의 적어도 일부분을 인코딩하는 제1 핵산은 본 발명에 따른 핵산이다. 연결된 프로모터 서열이 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우 작동 가능한 연결이 존재한다. 일반적으로, 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 연속적이며, 또한 동일한 리딩 프레임에서 2개 이상의 단백질-코딩 영역을 연결할 수 있다.
본 발명에 따른 DNA 서열을 포함하는 핵산이 환경에서 다른 생물학적 구성요소, 예컨대, 세포, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 단백질 및 세포기관으로부터 실질적으로 분리되거나 정제될 때, 본 발명에 따른 "단리된 핵산"인 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산은 단리된 핵산이다.
본 발명에 따른 핵산은 또한 본 발명에 따른 항체를 인코딩하는 뉴클레오타이드의 축퇴 변이체를 포함한다. 보다 특히, "축퇴 변이체"는 본 발명에 따른 항체를 인코딩하지만 유전 암호의 결과로 퇴화하는 폴리뉴클레오타이드를 말한다. 본 발명에 따르면, 인코딩된 항체의 아미노산 서열이 본 발명에 따른 항체의 항원 표적에 특이적으로 결합하는 한, 모든 축퇴 뉴클레오타이드 서열이 포함된다.
실시예
하기 실시예는 EPN1에 결합하는 항체인 IMM20059의 단리 및 특성화를 설명한다.
실시예 1. 온전한 인간 암 세포의 표면에 결합하는 항체를 생성하는 인간 하이브리도마의 단리. 도 1은, 두경부암 환자의 림프절에서 단리된 인간 B 세포와, B5-6T 융합 파트너 세포주의 융합으로부터 생성된 PR045-2H11 하이브리도마 세포에 의해 생성된 Ab의 검출을 나타낸다. 본질적으로 미국 특허 제8,999,707호("Method of making hybrid cells that express useful antibodies")에 기재된 바와 같이 전기융합에 의해 인간 B 세포와 B5-6T 세포의 융합을 수행하였다. 융합 후, 하이브리도마를 도말하고 대략 2주 동안 성장시켰다. 그 다음 IgG-양성 하이브리도마로부터 컨디셔닝된 배지를 수집하고 암 세포주의 표면에 결합한 항체의 능력에 대해 스크리닝하였다. 형광단-표지 염소 항-인간 IgG 2차 Ab를 96-웰 플레이트용으로 구성된 LI-COR Odyssey™ Sa 이미징 시스템과 함께 사용하여 살아있는 온전한 암 세포주의 풀에 대한 PR045-2H11-생성 Ab의 결합을 검출하였다. 스크리닝 전에, 암 세포를 동일한 비율로 혼합하고 풀을 96-웰 플레이트에 분취하여 24 내지 48시간 동안 부착하도록 하였다. 하이브리도마 상청액을 0.1%의 최종 농도로 아지드화나트륨을 포함하는 배지에서 희석하였다. 3가지 상이한 양성 대조군을 스크리닝 분석에서 활성을 평가하는 데 사용하였다: 1) 항-바시긴(anti-basigin), 항-EGFR, 및 항-ERBB2(BCH)의 동일한 비율의 혼합물을 각각 100 ng/㎖의 농도로 시작하여 3점, 1:5 연속 희석으로 도말하였다; 2) 100 ng/㎖ 또는 20 ng/㎖의 각각의 항체를 포함하는 항-CEA 및 항-인테그린 mAb의 혼합물의 2점 적정; 및 3) 단일 농도의 항-CD29 mAb(500 ng/㎖). 2차 항체를 단독으로 음성 대조군으로 사용하였다. 대조군의 조합은 세포주 풀과 LI-COR 기기의 검출 범위에 걸쳐 다양한 절대 신호 강도를 제공하였다. PR045-2H11에 대한 검출 신호는 기준선 양성 대조군과 비교하여 177%의 신호 증가를 나타내었다. 기준선 양성 대조군과 비교하여 적어도 15%의 신호 증가를 나타내는 하이브리도마를 포함하는 모든 웰은 도 2에 도시되어 있다.
실시예 2. PR045-2H11 하이브리도마는 IGHV3/IGK 가변 도메인을 가지는 IgG를 생성한다. PR045-2H11-생성 Ab의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 PR045-2H11 하이브리도마 세포로부터 단리된 RNA의 RT-PCR 증폭에 의해 수득하고, 생성된 항체 cDNA에 서열결정 반응을 수행하였다. 서열번호 1은 PR045-2H11-생성 Ab의 VH에 해당하고 서열번호 5는 이의 VL에 해당한다. 여기서 사용되는 PCR 전략은 가변 도메인의 프레임워크 1의 5' 대부분에 해당하는 영역을 증폭시키도록 설계되지 않았다. Ig 중쇄 V("IGHV") 및 면역글로불린 카파 유전자좌("IGKL") 유전자 할당은 알려진 생식세포계열 유전자 서열과의 상동성을 기반으로 예측되었으며, VH 및 VL 서열의 진정한 5' 말단에 대한 대용물로 사용하였다.
VH 및 VL 도메인의 코딩 영역은 생식세포계열 서열과 각각 15개 및 14개 뉴클레오타이드만큼 상이한, 체세포 과돌연변이의 특징을 가진다. IGHV3-48*02의 프레임워크 1의 5' 말단에 해당하는 생식세포계열 서열을 사용하여 PR045-2H11 VH(서열번호 3)에 대한 전장 발현 단편을 생성하였다. IGKV3-11*01의 프레임워크 1의 5' 말단에 해당하는 생식세포계열 서열을 사용하여 PR045-2H11 VL(서열번호 7)에 대한 전장 발현 단편을 생성하였다. 추가적인 5' 및 3' 확장으로 서열번호 3 및 서열번호 7 도메인에 해당하는 단편을 합성하여 이중 프로모터 IgG1 발현 벡터로의 깁슨-스타일(Gibson-style) 클로닝을 용이하게 하였다. VH 및 VL 단편에 의해 인코딩되는 해당하는 단백질 서열이 각각 서열번호 4 및 서열번호 8에 정의되어 있다. 유사하게, PR045-2H11의 VH(서열번호 4) 및 VL(서열번호 8)을 인코딩하는 DNA 단편을 인간 IgG1 2개의 벡터 발현 시스템에 클로닝하였다. 두 벡터 시스템에 의해 인코딩되는 중쇄 및 경쇄의 전장 아미노산 서열은 각각 서열번호 15 및 서열번호 16에 해당한다.
실시예 3: PR045-2H11 Ab의 재조합 형태인 IMM20059는 종양 세포주의 표면에 결합한다. 표준 조건을 사용하여, PR045-2H11 Ab VH 및 VL 도메인을 포함하는 전장 IgG1 항체를 포유동물 세포주, 예컨대, 중국 햄스터 난소(CHO) 및 인간 배아 신장(HEK), 또는 이들 세포주의 유도체로의 일시적인 형질감염에 의해 재조합적으로 발현시켰다. 친화성 크로마토그래피에 의해 컨디셔닝된 배지로부터 IMM20059로서 지칭되는 재조합 항체를 정제하고, 완충액을 PBS로 교환한 다음, 유세포분석에 의해 활성을 분석하였다. IMM20059는 원래 PR045-2H11 하이브리도마-생성 항체와 일치하는 결합 활성을 나타내었다. IMM20059는 인간 암 세포, 무한증식된 정상 인간 세포주, 및 마우스 종양 세포주의 패널에 포함되는 세포의 표면에 다양한 정도로 결합한다(표 1). 도 3 및 4에 도시된 바와 같이, 유세포분석에 의해 분석할 때 IMM20059는 각각 A549 폐 선암 및 Huh7 간세포 암종 세포주의 표면에 대한 포화 결합을 나타낸다. IMM20059는 A549 및 Huh7에 각각 0.9 및 1.3 ㎍/㎖의 EC50으로 결합한다. 이러한 값은 6 내지 9nM의 EC50 값에 해당한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 4. IMM20059는 EPN1에 결합한다. IMM20059에 의해 결합된 표적 항원을 확인하기 위해 수행된 면역침강 실험은 대략 65 kDa 단백질의 밴드를 일관되게 확인해주었다(도 5). 면역침강 밴드의 질량분석 결과는 단백질을 EPN1로 확인해주었다. EPN1에 결합하는 IMM20059의 능력은 일련의 시험관내 분석에서 확인되었다. 도 6에 도시된 바와 같이, IMM20059는 재조합 EPN1의 동족체인 EPN2와 비교하여 재조합 EPN1에 용량-의존적 방식으로 선택적으로 결합한다.
그 다음 CDI 인간 프로테옴(휴프롯(HuProt)) 마이크로어레이-기반 고사양 항체 교차반응 분석을 사용하여 IMM20059를 스크리닝하였다. 분석에서, 대략 80%의 인간 프로테옴에 해당하는 단백질을 고유한 형식으로 마이크로어레이에 스폿팅하고 IMM20059의 특이성을 조사하는 데 사용하였다. 보다 구체적으로, IMM20059(1 ㎍/㎖)를 고유한 CDI 휴프롯 어레이에 대하여 4℃에서 밤새 인큐베이션하였으며, EPN1(오리진(Origene), 카탈로그 번호 TP307099)을 추가적인 대조군으로서 어레이에 추가하였다. 슬라이드를 세척하고 Alexa-647 접합 항-H+L 2차 항체를 이용하여 IMM20059 결합을 검출하였다. 2차 항체에 의해 결합된 비-특이적 히트를 임의의 분석에서 제거하였다. 표적 단백질에 대한 선택적인 결합을 전반적인 신호 강도, 각각의 슬라이드에서 복제물에 대한 결합의 재현성을 결정하는 Z-스코어, 및 가능한 표적에 대한 선택성의 차이를 결정하는 S-스코어의 조합에 의해 분석하였다. 상위 히트와 2위 히트 간의 S-스코어가 3 초과이면 상위 히트에 대한 특이성을 나타내는 것으로 간주된다.
표 2에 나타낸 바와 같이, IMM20059는 어레이에서 일반적으로 발견되는 EPN1 및 어레이에서 상위 6개의 히트 중 2개로서 추가된 EPN1의 대조군 스폿 둘 다에 결합하였다. 신호 강도는 이들 6가지 단백질의 각각에 대하여 최대 임계값을 초과하였으며, 이는 대안적인 단백질과의 일부 교차반응성에 대한 가능성을 시사한다. 고사양 분석에서 EPN3과 비교하여 IMM20059는 EPN1에 대한 선택성을 표시하였다. EPN3은 단백질 어레이에 존재하지만 선택적인 결합을 나타내지 않았다.
Figure pct00003
HEK293 세포에서 EPN1 유전자의 CRISPR-기반 파괴는 이들 세포에 결합하는 IMM20059의 능력을 무효화시킨다. IMM20059 및 상업적으로 입수가능한 항-EPN1 항체를 이용하여 고정 및 투과성 모 세포 및 EPN1-/- 세포의 유세포분석-기반 분석을 수행하였다. 두 항체 모두 EPN1-/- 클론에서 손실된 모 HEK293 세포에 대한 동등한 수준의 결합을 보여준다(도 7). 상업적 항-EPN1 mAb 및 IMM20059 둘 다에 의한 EPN1-/- 클론에 대한 잔류 결합은 어느 하나의 클론이 실제로 EPN1-발현 세포를 포함하거나 2개의 항체가 비-EPN1 표적 단백질과 유사한 정도로 교차반응하는 혼합 집단임을 시사한다.
IMM20059 및 상업적으로 입수가능한 마우스 항-huEPN1을 1차 항체로 사용하여 H460 인간 폐암 세포주에서 EPN1의 국소화를 시각화하였다. EPN1의 알려진 막 국소화와 일치하여, 두 항체는 결합된 1차 항체를 검출하기에 적절한 종 특이성을 가지는 형광단-표지된 2차 항체를 사용하여 면역형광으로 시각화했을 때 염색을 나타내었다(도 7 및 도 8).
표준 실행 완충액(10mM HEPES, 150mM NaCl, 0.005% 트윈(Tween)-20, 0.2 ㎎/㎖ BSA, pH 7.4)에서 25℃에서 BIAcore2000의 표면 플라즈몬 공명에 의해 재조합 EPN1과의 상호작용의 강도를 추가로 정의하였다. 150mM 인산을 이용하여 결합 사이클 사이에서 단백질 A 표면을 재생하였다. IMM20059, 또는 아이소타입 대조군을 CM5/단백질 A 센서 표면 상에서 포획하여 결합 및 대조군 표면을 생성하고; IMM20059를 대략 200 및 450 RU에서 포획하였으며, 아이소타입 대조군을 대략 600 RU의 밀도로 포획하였다. 가장 높은 농도로서 33.3nM로 시작하여 3배 희석 시리즈를 사용하여, 3가지 표면 각각에 대한 재조합 EPN1의 결합을 3중으로 테스트하였다. 고밀도(450 RU) 및 저밀도(200 RU) IMM20059 표면 둘 다에 대해 EPN1의 결합을 관찰하였다. 이러한 조건 하에서 테스트한 임의의 농도에서 아이소타입 대조군 표면에 대해 어떠한 결합도 관찰되지 않았다. 450 RU IMM20059 표면에 대하여 측정된 결합으로부터 얻은 이중-차감 데이터는 1:1 결합 모델에 적합하였다. 표 3에 개괄한 바와 같이, IMM20059는 950 +/- 10 pM의 평균 KD로 EPN1에 대한 재현가능한 결합을 보여주었다.
Figure pct00004
도트 블롯 결합 데이터와 일치하여, SPR 분석은 EPN2와 비교하여 IMM20059가 EPN1에 선택적으로 결합한다는 것을 입증하였다. 실행 완충액으로서 10mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 0.005% 트윈-20, 0.2 ㎎/㎖ BSA를 사용하여 CM5/단백질 A 센서 칩 상에서 4가지 상이한 표면 밀도(500, 1000, 2600 및 2800 RU)에서 IMM20059를 포획하였다. 실행 완충액에서 200nM 및 20nM 둘 다에 대하여 EPN1(오리진 카탈로그 번호 TP307099) 또는 EPN2(오리진 카탈로그 번호 TP310899)를 희석하고 25℃에서 고정화된 IMM20059에 결합하는 능력에 대해 분석하였다. 이러한 모든 조건 하에서, IMM20059는 EPN1에 강하게 결합하였지만(표 3) EPN2에 대한 어떠한 결합도 나타내지 못하였다. 그러나, 표 4에 상술된 바와 같이, EPN1에 대한 결합에 대해 관찰된 오프-속도(off-rate)는 IMM20059 표면 밀도에 따라 달라졌으며, 500 RU 표면에 대한 오프-속도는 2800 RU 밀도 표면에서 측정된 오프-속도보다 2.4배 더 빨랐다. 이들 데이터는 EPN1이 용액에서 또는 칩 표면에서 결합할 때 다량체화될 수 있으며, 이는 결합 상호작용에 대한 결합 효과를 유도하고 상호작용의 명백한 KD를 변경시킬 수 있는 가능성을 시사한다.
Figure pct00005
항체가 표준 실행 완충액에서 대략 50 RU의 밀도로 C1/단백질 A 센서 칩의 표면으로 포획될 때 IMM20059에 대한 EPN1의 결합을 평가하였다. C1 칩의 카복시메틸화되고 매트릭스가 없는 표면 및 저밀도의 IMM20059의 조합은 격렬한 결합을 제한할 것으로 예상된다. 25℃에서 표면 위로 실행 완충액에서 최대 200nM까지 EPN1의 3배 희석 시리즈를 통과시켰고 비슷한 온-속도(on-rate)로 IMM20059 표면에 결합하는 것으로 나타났다(표 5). 그러나, 관찰된 오프-속도는 이러한 조건 하에서 대략 한 자릿수 더 빨라서, 측정된 고유 결합 친화성을 대략 10배 감소시켰다.
Figure pct00006
실시예 5. IMM20059는 EPN1의 고도로 보존된 영역 내의 잔기에 결합한다. IMM20059에 의해 결합된 EPN1 상의 에피토프를 고해상도로 결정하기 위해 가교결합 시험을 수행하였다. GST-EPN1 융합 단백질(노부스 바이오로지칼스(Novus Biologicals), 카탈로그 번호 H00029924-P01; 서열번호 17)은 가교결합 실험을 위한 표적 항원의 역할을 하였다. IMM20059/EPN1 단백질 복합체를 형성하고, 중수소화된 가교결합제와 함께 인큐베이션한 다음, 트립신, 키모트립신, ASP-N, 엘라스타제 및 서모라이신을 이용하여 다중 효소 절단을 수행하였다. 가교결합된 펩타이드의 농축 후, 고해상도 질량분석법(nLC-LTQ-Orbitrap MS)으로 샘플을 분석하고 생성된 데이터를 XQuest 및 Stavrox 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
nLC-Orbitrap MS/MS 분석은 EPN1과 IMM20059 사이에서 8개의 가교결합된 펩타이드를 검출하였다(표 6). 상호작용은, EPN1의 엡신 N-말단 상동성("ENTH") 도메인의 2개 영역에 매핑되며, 이때 가교결합은 서열번호 18의 101, 111, 124, 135, 및 141번 아미노산 위치에서 확인된다. ENTH 도메인 내 이러한 가교결합의 물리적 위치는 래트 EPN1 ENTH 도메인(RCSB PDB: 1EDU)의 결정 구조로 모델링되었다. 인간 EPN1은 ENTH 도메인 전체에 걸쳐 100% 동일하고, 래트와 마우스 EPN1 둘 다에 대하여 전체적으로 96% 초과로 동일하다(도 13). 도 10에 도시된 바와 같이, EPN1에 대한 가교결합으로서 확인된 잔기는 서로 물리적으로 근접한 ENTH 도메인의 단일면에 위치한다.
종간 EPN1에서 보이는 동일성과 대조적으로, 인간 EPN1은 인간 EPN2 및 EPN3과 각각 단지 56.7% 및 49.6%만 동일하다(도 14). 도 11 및 12에 도시된 바와 같이, 다수의 아미노산 차이는 IMM20059에 대한 결합으로 확인된 인터페이스로 매핑된다. 이러한 차이는 EPN2 또는 EPN3과 비교하여 EPN1에 대한 IMM20059의 선택성에 대한 근거를 제공한다.
Figure pct00007
IMM20059 결합 부위 내에서 마우스 및 인간 EPN1 사이의 아미노산 동일성은 IMM20059가 마우스 EPN1에 결합할 수 있음을 예측한다. 이러한 예측은 마우스 암 세포주에 대하여 관찰된 유세포분석-기반 결합과 일치한다(표 1). 도 15는 인간 세포주 MFE296 및 마우스 세포주 NIH/3T3 둘 다에 대해 EPN1의 표면 풀이 전체 세포 EPN1의 분획을 나타낸다는 것을 보여준다. 세포는 표면 EPN1을 확인하기 위해 살아있는 세포로서 염색되거나, 표면 및 세포내 풀을 둘 다 확인하기 위해 투과화되었다. IMM20059 및 상업적으로 입수가능한 항-EPN1 단클론성 항체(클론 C-11)는 유사한 염색 패턴을 나타내었다.
실시예 6. EPN1 활성의 손실은 세포 성장을 저해한다. 세포 증식 분석에서 EPN1 유전자의 CRISPR-기반 녹아웃을 보유하는 다중 클론을 분석하였다. 도 16에 도시된 바와 같이, 모든 클론은 모 HEK293 세포와 비교하여 세포 성장률에서 통계적으로 유의한 감소를 나타내었다. 이는 잠재적으로 항체-기반 접근법으로 EPN1 기능의 파괴가 암 세포의 성장을 늦출 수 있다는 가설을 뒷받침한다.
실시예 7. IMM20059는 흑색종의 동계 모델에서 종양 성장을 늦춘다. C57Bl/6 마우스에서 동계 종양으로서 성장시킨 B16F0 흑색종 모델을 사용하여 종양 성장에 대한 IMM20059의 영향을 평가하였다. 확립된 B16F10 종양을 보유한 마우스(n > 8 /코호트)를 매주 복강내 주사를 통해 IMM20059를 10 ㎎/㎏의 용량으로 처리하고 캘리퍼 측정을 통해 평균 종양 부피를 계산하였다. 도 17에 도시된 바와 같이, IMM20059-처리 종양의 성장은 비히클-처리된 종양의 성장과 비교하여 현저하게 느려졌다. B16F10 종양의 성장을 적당히 저해하는 것으로 알려진 임상적으로 관련된 면역-종양학 체크포인트인 CTLA4를 표적화하는 항체를 이 실험에서 양성 대조군으로서 사용하였다.
서열 목록
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
SEQUENCE LISTING <110> Immunome, Inc. <120> Antibodies Targeting EPN1 <130> WO2020/072618 <140> PCT/US2019/054259 <141> 2019-10-02 <150> US 62/740,092 <151> 2018-10-02 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gactctcctg tgcagcctct ggattcacct tcagtatcca tagcctgaat tgggtccgcc 60 aggctccagg gaagggactg gagtgggttt cgtatattag tagtaacagt actaccatat 120 attacgcaga ctctgtgaag ggccgattca ccatctccag agacaatgcc aaggactccc 180 tgtatctgca aatgaacagc ctcagagacg aggacacggc tgtatattac tgtgcgagag 240 actactactg tactggtggt acctgcttct ttcttcctga cctctggggc cggggagccc 300 tggtcaccgt ctcctcagcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgc 354 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile His Ser Leu Asn 1 5 10 15 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Ser Ser Asn Ser Thr Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 35 40 45 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Ser Leu Tyr 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sapiens <400> 14 Gln Gln Arg Tyr Asn Trp Leu Thr 1 5 <210> 15 <211> 454 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile His 20 25 30 Ser Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Asn Ser Thr Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Tyr Cys Thr Gly Gly Thr Cys Phe Phe Leu Pro Asp 100 105 110 Leu Trp Gly Arg Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 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335 Lys Glu Asn Met Tyr Ala Val Gln Thr Leu Lys Asp Phe Gln Tyr Val 340 345 350 Asp Arg Asp Gly Lys Asp Gln Gly Val Asn Val Arg Glu Lys Ala Lys 355 360 365 Gln Leu Val Ala Leu Leu Arg Asp Glu Asp Arg Leu Arg Glu Glu Arg 370 375 380 Ala His Ala Leu Lys Thr Lys Glu Lys Leu Ala Gln Thr Ala Thr Ala 385 390 395 400 Ser Ser Ala Ala Val Gly Ser Gly Pro Pro Pro Glu Ala Glu Gln Ala 405 410 415 Trp Pro Gln Ser Ser Gly Glu Glu Glu Leu Gln Leu Gln Leu Ala Leu 420 425 430 Ala Met Ser Lys Glu Glu Ala Asp Gln Glu Glu Arg Ile Arg Arg Gly 435 440 445 Asp Asp Leu Arg Leu Gln Met Ala Ile Glu Glu Ser Lys Arg Glu Thr 450 455 460 Gly Gly Lys Glu Glu Ser Ser Leu Met Asp Leu Ala Asp Val Phe Thr 465 470 475 480 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Thr Asp Pro Trp Gly Gly Pro Ala Pro 485 490 495 Met Ala Ala Ala Val Pro Thr Ala Ala Pro Thr Ser Asp Pro Trp Gly 500 505 510 Gly Pro Pro Val Pro Pro Ala Ala Asp Pro Trp Gly Gly Pro Ala Pro 515 520 525 Thr Pro Ala Ser Gly Asp Pro Trp Arg Pro Ala Ala Pro Ala Gly Pro 530 535 540 Ser Val Asp Pro Trp Gly Gly Thr Pro Ala Pro Ala Ala Gly Glu Gly 545 550 555 560 Pro Thr Pro Asp Pro Trp Gly Ser Ser Asp Gly Gly Val Pro Val Ser 565 570 575 Gly Pro Ser Ala Ser Asp Pro Trp Thr Pro Ala Pro Ala Phe Ser Asp 580 585 590 Pro Trp Gly Gly Ser Pro Ala Lys Pro Ser Thr Asn Gly Thr Thr Ala 595 600 605 Gly Gly Phe Asp Thr Glu Pro Asp Glu Phe Ser Asp Phe Asp Arg Leu 610 615 620 Arg Thr Ala Leu Pro Thr Ser Gly Ser Ser Ala Gly Glu Leu Glu Leu 625 630 635 640 Leu Ala Gly Glu Val Pro Ala Arg Ser Pro Gly Ala Phe Asp Met Ser 645 650 655 Gly Val Arg Gly Ser Leu Ala Glu Ala Val Gly Ser Pro Pro Pro Ala 660 665 670 Ala Thr Pro Thr Pro Thr Pro Pro Thr Arg Lys Thr Pro Glu Ser Phe 675 680 685 Leu Gly Pro Asn Ala Ala Leu Val Asp Leu Asp Ser Leu Val Ser Arg 690 695 700 Pro Gly Pro Thr Pro Pro Gly Ala Lys Ala Ser Asn Pro Phe Leu Pro 705 710 715 720 Gly Gly Gly Pro Ala Thr Gly Pro Ser Val Thr Asn Pro Phe Gln Pro 725 730 735 Ala Pro Pro Ala Thr Leu Thr Leu Asn Gln Leu Arg Leu Ser Pro Val 740 745 750 Pro Pro Val Pro Gly Ala Pro Pro Thr Tyr Ile Ser Pro Leu Gly Gly 755 760 765 Gly Pro Gly Leu Pro Pro Met Met Pro Pro Gly Pro Pro Ala Pro Asn 770 775 780 Thr Asn Pro Phe Leu Leu 785 790 <210> 18 <211> 550 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Ser Thr Ser Ser Leu Arg Arg Gln Met Lys Asn Ile Val His Asn 1 5 10 15 Tyr Ser Glu Ala Glu Ile Lys Val Arg Glu Ala Thr Ser Asn Asp Pro 20 25 30 Trp Gly Pro Ser Ser Ser Leu Met Ser Glu Ile Ala Asp Leu Thr Tyr 35 40 45 Asn Val Val Ala Phe Ser Glu Ile Met Ser Met Ile Trp Lys Arg Leu 50 55 60 Asn Asp His Gly Lys Asn Trp Arg His Val Tyr Lys Ala Met Thr Leu 65 70 75 80 Met Glu Tyr Leu Ile Lys Thr Gly Ser Glu Arg Val Ser Gln Gln Cys 85 90 95 Lys Glu Asn Met Tyr Ala Val Gln Thr Leu Lys Asp Phe Gln Tyr Val 100 105 110 Asp Arg Asp Gly Lys Asp Gln Gly Val Asn Val Arg Glu Lys Ala Lys 115 120 125 Gln Leu Val Ala Leu Leu Arg Asp Glu Asp Arg Leu Arg Glu Glu Arg 130 135 140 Ala His Ala Leu Lys Thr Lys Glu Lys Leu Ala Gln Thr Ala Thr Ala 145 150 155 160 Ser Ser Ala Ala Val Gly Ser Gly Pro Pro Pro Glu Ala Glu Gln Ala 165 170 175 Trp Pro Gln Ser Ser Gly Glu Glu Glu Leu Gln Leu Gln Leu Ala Leu 180 185 190 Ala Met Ser Lys Glu Glu Ala Asp Gln Glu Glu Arg Ile Arg Arg Gly 195 200 205 Asp Asp Leu Arg Leu Gln Met Ala Ile Glu Glu Ser Lys Arg Glu Thr 210 215 220 Gly Gly Lys Glu Glu Ser Ser Leu Met Asp Leu Ala Asp Val Phe Thr 225 230 235 240 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Thr Asp Pro Trp Gly Gly Pro Ala Pro 245 250 255 Met Ala Ala Ala Val Pro Thr Ala Ala Pro Thr Ser Asp Pro Trp Gly 260 265 270 Gly Pro Pro Val Pro Pro Ala Ala Asp Pro Trp Gly Gly Pro Ala Pro 275 280 285 Thr Pro Ala Ser Gly Asp Pro Trp Arg Pro Ala Ala Pro Ala Gly Pro 290 295 300 Ser Val Asp Pro Trp Gly Gly Thr Pro Ala Pro Ala Ala Gly Glu Gly 305 310 315 320 Pro Thr Pro Asp Pro Trp Gly Ser Ser Asp Gly Gly Val Pro Val Ser 325 330 335 Gly Pro Ser Ala Ser Asp Pro Trp Thr Pro Ala Pro Ala Phe Ser Asp 340 345 350 Pro Trp Gly Gly Ser Pro Ala Lys Pro Ser Thr Asn Gly Thr Thr Ala 355 360 365 Gly Gly Phe Asp Thr Glu Pro Asp Glu Phe Ser Asp Phe Asp Arg Leu 370 375 380 Arg Thr Ala Leu Pro Thr Ser Gly Ser Ser Ala Gly Glu Leu Glu Leu 385 390 395 400 Leu Ala Gly Glu Val Pro Ala Arg Ser Pro Gly Ala Phe Asp Met Ser 405 410 415 Gly Val Arg Gly Ser Leu Ala Glu Ala Val Gly Ser Pro Pro Pro Ala 420 425 430 Ala Thr Pro Thr Pro Thr Pro Pro Thr Arg Lys Thr Pro Glu Ser Phe 435 440 445 Leu Gly Pro Asn Ala Ala Leu Val Asp Leu Asp Ser Leu Val Ser Arg 450 455 460 Pro Gly Pro Thr Pro Pro Gly Ala Lys Ala Ser Asn Pro Phe Leu Pro 465 470 475 480 Gly Gly Gly Pro Ala Thr Gly Pro Ser Val Thr Asn Pro Phe Gln Pro 485 490 495 Ala Pro Pro Ala Thr Leu Thr Leu Asn Gln Leu Arg Leu Ser Pro Val 500 505 510 Pro Pro Val Pro Gly Ala Pro Pro Thr Tyr Ile Ser Pro Leu Gly Gly 515 520 525 Gly Pro Gly Leu Pro Pro Met Met Pro Pro Gly Pro Pro Ala Pro Asn 530 535 540 Thr Asn Pro Phe Leu Leu 545 550 <210> 19 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Asn Ser Thr Thr Ile Tyr 1 5 10 15 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 20 25 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Tyr Asn Trp Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 1 5 10 <210> 21 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Asn Ser Thr Thr Ile Tyr 1 5 10 15 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 20 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg 1 5 <210> 23 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile His Ser Leu Asn 1 5 10 15 Trp Val Arg <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Ala Thr Leu Ser Cys Arg 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Ser Ile His Ser Leu Asn Trp 1 5 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Glu Asn Met Tyr Ala Val Gln Thr Leu Lys 1 5 10 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Asp Phe Gln Tyr Val Asp Arg 1 5 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Asp Phe Gln Tyr Val Asp Arg Asp Gly Lys 1 5 10 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Asp Gly Lys Asp Gln Gly Val Asn Val Arg Glu Lys 1 5 10 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Asp Gln Gly Val Asn Val Arg Glu Lys 1 5 <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Ala Lys Gln Leu Val Ala Leu Leu Arg Asp Glu Asp Arg 1 5 10 <210> 32 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Arg Asp Glu Asp Arg Leu Arg Glu Glu Arg Ala His Ala Leu Lys Thr 1 5 10 15 Lys Glu Lys Leu 20

Claims (30)

  1. 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(V L )를 포함하는 단백질인 엡신-1(Epsin-1)에 결합하되,
    A) VHC는 서열번호 2에 해당하는 아미노산 서열과 적어도 90% 상동성을 공유하는 아미노산을 포함하고;
    B) VLC는 서열번호 4에 해당하는 아미노산 서열과 적어도 90% 상동성을 공유하는 아미노산을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 하기의 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    서열번호 9에 해당하는 CDR-H1;
    서열번호 10에 해당하는 CDR-H2;
    서열번호 11에 해당하는 CDR-H3;
    서열번호 12에 해당하는 CDR-L1;
    서열번호 13에 해당하는 CDR-L2; 및
    서열번호 14에 해당하는 CDR-L3.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 엡신-1(EPN1)에 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편과 EPN1 간의 KD는 50nM 이하인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, 상기 KD는 1nM 이하인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편은 세포의 표면 상에서 발현된 항원에 결합한 후, 상기 세포에 의해 내재화되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 단편은 단리된 가변 중쇄(VH) 단일 도메인 단클론성 항체인, 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 단편은 단일 사슬(sc)Fv-Fc 단편인, 항원-결합 단편.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 면역글로불린 Fc 영역으로부터 유래된 CH3 도메인의 야생형 아미노산 서열의 적어도 하나의 변형을 포함하는, CH3 스캐폴드를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 항원-결합 단편은 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, 또는 Fab' 단편, 디아바디, 또는 반감기가 증가되었을 수 있는 임의의 단편을 포함하는, 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편은 단클론성인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 또는 인간화된, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 이중특이적인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 제13항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 이펙터 분자를 포함하는, 단리된 면역접합체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 이펙터 분자는 약물인, 단리된 면역접합체.
  16. 제14항에 있어서, 상기 이펙터 분자는 독소인, 단리된 면역접합체.
  17. 제14항에 있어서, 상기 이펙터 분자는 방사성 약물인, 단리된 면역접합체.
  18. 약학적으로 허용가능한 담체 중에 치료적 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 단리된 면역접합체를 포함하는, 조성물.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 표지화된, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  20. 제18항에 있어서, 상기 표지는 형광성, 효소, 또는 방사성 표지인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  21. 적어도 하나의 유형의 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 암을 앓고 있는 대상체를 선택하는 단계로서, 상기 암의 세포는 EPN1을 발현하는, 상기 대상체를 선택하는 단계, 및 상기 대상체에게 치료적 유효량의 제18항의 조성물을 투여하함으로써, 상기 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 종양 성장 또는 전이를 저해하는 방법으로서, 암을 앓고 있는 대상체를 선택하는 단계로서, 상기 암의 세포는 EPN1을 발현하는, 상기 대상체를 선택하는 단계, 및 상기 대상체에게 치료적 유효량의 제18항의 조성물을 투여함으로써, 종양 성장 또는 전이를 저해하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 암의 유형은 폐 암종, 흑색종 또는 간세포 암종인, 방법.
  24. 제1항에 따른 VH를 인코딩하는, 단리된 핵산 분자.
  25. 제1항에 따른 VL을 인코딩하는, 단리된 핵산 분자.
  26. 제23항에 있어서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 단리된 핵산 분자.
  27. 제24항에 있어서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 단리된 핵산 분자.
  28. 제29항의 단리된 핵산 분자를 포함하는, 발현 벡터.
  29. 제27항 및 제28항 중 적어도 하나의 단리된 핵산 분자를 포함하는, 단리된 발현 벡터.
  30. 제29항의 발현 벡터 또는 핵산 분자로 형질전환된, 단리된 숙주 세포.
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