CN108342445B - 一种三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法及β-胡萝卜素 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种三孢布拉霉发酵产β‑胡萝卜素的方法及β‑胡萝卜素，属发酵工程领域。上述方法包括：分别培养三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌，同时接种，发酵，发酵过程以调节剂控制发酵体系的pH值为5.8‑6.2，半连续培养，于发酵开始60h时放料，补料。调节剂为含有PO₄ ³⁺且不含金属离子及盐的酸性物质。发酵过程中采用的发酵培养基含有淀粉磷酸酯类物质。此方法简单，成本低廉，通过用含有PO₄ ³⁺且不含金属离子及盐的酸性物质控制发酵pH值并提供PO₄ ³⁺，避免带入过量的K⁺，加之配合使用淀粉磷酸酯类物质，以提高β‑胡萝卜素的产量。由此而得的β‑胡萝卜素产量较高，适于工业化生产。

Description

一种三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法及β-胡萝卜素

技术领域

本发明涉及发酵工程领域，且特别涉及一种三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法及β-胡萝卜素。

背景技术

现有发酵方法通常使用KH₂PO₄或K₂HPO₄等含PO₄ ³⁺的盐来提升磷酸化水平，同时提供了K⁺，增强细胞膜通透性，益于营养物质进入细胞。使用KH₂PO₄或K₂HPO₄等含PO₄ ³⁺的盐量过少则磷酸化水平不够，大幅降低了类胡萝卜素代谢通量，过多则会带入大量K⁺，使得菌体的细胞膜通透性变得过于强，β-胡萝卜素易由胞内转运至胞外，使得产物积累速率相应变慢，单位生产效率下降。

同时，现有三孢布拉霉发酵β-胡萝卜素以单罐发酵为主，鉴于其天然产量有限，本身发酵周期较长，在工艺上需开发出半连续培养或连续培养的工艺以进一步降低生产成本。

因此，需对现有的三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法进行改进。

发明内容

本发明的目的在于提供一种三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法，此方法简单，成本低廉，通过用含有PO₄ ³⁺且不含金属离子及盐的酸性物质控制发酵pH值并提供PO₄ ³⁺，避免带入过量的K⁺，加之配合使用淀粉磷酸酯类物质，以提高β-胡萝卜素的产量。

本发明的第二目的在于提供一种β-胡萝卜素，其由上述三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法生产而得，该β-胡萝卜素产量较高，适于工业化生产。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：

本发明提出一种三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法，包括以下步骤：

分别培养三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌，同时接种，发酵，发酵过程以调节剂控制发酵体系的pH值为5.8-6.2，于发酵开始60h时放料，补料并半连续培养。

调节剂为含有PO₄ ³⁺且不含金属离子及盐的酸性物质。

发酵过程中采用的发酵培养基含有淀粉磷酸酯类物质。

本发明还提出一种β-胡萝卜素，其由上述三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法生产而得。

优选地，所得的β-胡萝卜素的产量为4-5g/L。

本发明较佳实施例提供的三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法及β-胡萝卜素的有益效果是：

（1）一物多用，降低生产成本。

含有PO₄ ³⁺且不含金属离子及盐的酸性物质可用于调控pH，同时提供了大量PO₄ ³⁺，从而提高磷酸化水平。淀粉磷酸酯类物质在提供C源的同时也能提高磷酸化水平。同时使用以上物质，可将KH₂PO₄或K₂HPO₄的用量降至适宜水平，避免K⁺过量。

（2）简化操作，免除控糖工艺。

淀粉磷酸酯类物质作为迟效C源，不必控制补料流加葡萄糖。

（3）工艺简单，过程易调控。

（4）提高产量/成本比。

本发明较佳实施例所得的β-胡萝卜素产量较现有技术的产量更高，且同时采用半连续培养工艺，提高总产的同时，进一步降低能耗成本。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法及β-胡萝卜素进行具体说明。

本发明实施例提供的三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法包括以下步骤：

分别培养三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌，培养可参照如下方式：将原始三孢布拉霉正菌和原始三孢布拉霉负菌分别接种于含PDA培养基的斜面，于26-30℃（优选为28℃）的条件下培养4-8天（优选为6天），然后再转接于种子培养基中，于26-30℃、200-240rpm的条件下培养44-52h，培养过程中按1-2vvm的流量通入空气。优选地，接种于种子培养基后，于28℃、220rpm的条件下培养48h，培养过程中按1.5vvm的流量通入空气。

作为可选地，上述种子培养基例如可以包括1-3wt%的葡萄糖、2-4wt%的玉米浆干粉、0.5-1.5wt%的酵母浸膏、0.04-0.1wt%的磷酸二氢钾、0.005-0.015wt%的硫酸镁、0.02-0.04wt%的谷氨酸钠以及2-4wt%的葵花籽油溶液。

优选地，上述种子培养基可包括2wt%的葡萄糖、3wt%的玉米浆干粉、1wt%的酵母浸膏、0.07wt%的磷酸二氢钾、0.01wt%的硫酸镁、0.03wt%的谷氨酸钠以及3wt%的葵花籽油溶液。

将培养后的三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌同时接种发酵。同时接种例如可将培养的三孢布拉霉正菌以及培养的三孢布拉霉负菌按重量比为1：3-7同时接种于含有发酵培养基的发酵罐中。优选地，上述三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌的重量比为1：5，通过三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌按此比例有性结合，可较其它比例下产生更多的性激素三孢酸，提高β-胡萝卜素的代谢通量。

较佳地，接种所用的三孢布拉霉正菌及三孢布拉霉负菌的生物量干重均不低于10g/L，以确保发酵过程能够产生较大量的性激素三孢酸。

进一步地，同时接种后，可按1-2vvm（优选为1.5vvm）的流量向发酵罐中通入干燥压缩空气，然后于180-220rpm（200rpm）的搅拌转速下进行发酵。发酵过程中发酵体系的生物量干重优选不超过50g/L，以满足好氧需求。

由于发酵过程中，发酵体系的pH值会升高，若pH值过高，反而会不利于产生β-胡萝卜素。因此，本发明实施例中，发酵过程中加入调节剂以控制发酵体系的pH值为5.8-6.2。

较佳地，调节剂为含有PO₄ ³⁺且不含金属离子及盐的酸性物质，例如磷酸或植酸，优选为植酸。通过使用含有PO₄ ³⁺且不含金属离子及盐的酸性物质，尤其是植酸，可有效控制发酵pH值并提供PO₄ ³⁺，避免带入过量的K⁺，提高磷酸化水平。

值得说明的是，发酵过程中的pH值需全程检测，pH值大于6.2时，则及时补充调节剂。

作为可选地，上述发酵培养基含有淀粉磷酸酯类物质，优选地，淀粉磷酸酯类物质为磷酸化二淀粉磷酸酯。一方面，淀粉磷酸酯类物质在提供C源（迟效C源）的同时也能提高磷酸化水平，因调节剂（植酸）的加入量不大，淀粉磷酸酯类物质即可作为植酸的补充。另一方面，淀粉磷酸酯类物质含有淀粉，可替代普通淀粉，并且其在发酵过程中可水解为葡萄糖，从而减少普通葡萄糖的用量。此外，将调节剂与淀粉磷酸酯类物质共同使用，可将KH₂PO₄或K₂HPO₄的用量降至适宜水平，避免K⁺过量。

较佳地，本发明实施例的发酵液中P的含量可维持150ppm以上，以保持底物磷酸化高水平的物质基础。

作为可选地，上述发酵培养基例如可以含有0.8-1.2wt%葡萄糖、1.0-3.0wt%磷酸化二淀粉磷酸酯、0.8-1.2wt%酵母浸膏、1.8-2.2wt%玉米浆干粉、0.5-0.9wt%磷酸二氢钾、0.8-1.2wt%硫酸镁以及1.8-2.2wt%葵花籽油。

较佳地，发酵培养基可含有1wt%葡萄糖、2wt%磷酸化二淀粉磷酸酯、1wt%酵母浸膏、2wt%玉米浆干粉、0.7wt%磷酸二氢钾、1wt%硫酸镁以及2wt%葵花籽油。

发酵开始60h时开始放料，放料过程中的放料量例如可以为5-60vol%，也可以为30-50vol%。较佳地，放料时发酵体系中生物量不低于30g/L并且β-胡萝卜素含量不低于6wt%。

对应地，放料后对剩余的发酵体系进行补料，通过补料，以满足菌种生长所需的营养物质等，使其不断生长。将放料与补料相结合，一方面可延长培养周期，另一方面能够降低生产成本。

本发明实施中，补料是将三孢布拉霉正菌的种液和三孢布拉霉负菌的种液补充于发酵体系中，其补充比例可以为1:3-7，优选为1:5。

较佳地，为使不同阶段的发酵过程中，菌种所获得的营养物质均较充足且均匀，本发明实施例中补料采用馈料式补料法，也即每间隔10h向发酵罐中补入当时发酵液体积为4-6vol%的三孢布拉霉正菌的种液和三孢布拉霉负菌的种液。

接着，半连续培养至180-240h，放罐。

由上述方法较现有技术而言，能够使β-胡萝卜素的单位含量从8%左右升高至12%左右，产量从3.2g/L左右提升至4.5g/L左右（如3.7-4.8g/L）。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

将原始三孢布拉霉正菌和原始三孢布拉霉负菌分别接种于含有PDA培养基的斜面，于28℃的条件下培养6天，然后转接于种子培养基，于28℃、220rpm的条件下培养48h，培养过程中按1.5vvm的流量通入空气。

将培养的三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌按重量比为1：5的比例接种于含有发酵培养基的发酵罐中。接种时三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌的生物量干重均为15g/L。

同时接种后，按1.5vvm的流量向发酵罐中通入干燥压缩空气，然后于200rpm的搅拌转速下进行发酵。发酵过程中发酵体系的生物量干重可达到45g/L左右。发酵过程中加入植酸以控制发酵体系的pH值为5.8。

发酵60h时，按放料量为30vol%进行放料，此时，发酵体系中生物量为30g/L，β-胡萝卜素含量为6.02wt%。放料后每间隔10h额外向发酵罐中补入当时发酵液体积的5vol%的三孢布拉霉种液，此三孢布拉霉种液含有重量比为1：5的三孢布拉霉正菌种液与三孢布拉霉负菌种液。半连续培养至180h，放罐。

其中，种子培养基含有2wt%葡萄糖、3wt%玉米浆干粉、1wt%酵母浸膏、0.07wt%磷酸二氢钾、0.01wt%硫酸镁、0.03wt%谷氨酸钠和3wt%葵花籽油溶液。

发酵培养基含有1wt%葡萄糖、2wt%磷酸化二淀粉磷酸酯、1wt%酵母浸膏、2wt%玉米浆干粉、0.7wt%磷酸二氢钾、1wt%硫酸镁以及2wt%葵花籽油。

实施例2

将原始三孢布拉霉正菌和原始三孢布拉霉负菌分别接种于含有PDA培养基的斜面，于26℃的条件下培养8天，然后转接于种子培养基，于26℃、200rpm的条件下培养52h，培养过程中按1vvm的流量通入空气。

将培养的三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌按重量比为1：3的比例接种于含有发酵培养基的发酵罐中。接种时三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌的生物量干重均为12g/L。

同时接种后，按1vvm的流量向发酵罐中通入干燥压缩空气，然后于180rpm的搅拌转速下进行发酵。发酵过程中发酵体系的生物量干重为40g/L。发酵过程中加入植酸以控制发酵体系的pH值为6.2。

发酵60h时，按放料量为50vol%进行放料，此时，发酵体系中生物量为35.1g/L，β-胡萝卜素含量为6.5wt%。放料后每间隔10h额外向发酵罐中补入当时发酵液体积的4vol%的三孢布拉霉种液，此三孢布拉霉种液含有重量比为1：3的三孢布拉霉正菌种液与三孢布拉霉负菌种液。半连续培养至180h，放罐。

其中，种子培养基含有1wt%葡萄糖、2wt%玉米浆干粉、0.5wt%酵母浸膏、0.04wt%磷酸二氢钾、0.005wt%硫酸镁、0.02wt%谷氨酸钠和2wt%葵花籽油溶液。

发酵培养基含有0.8wt%葡萄糖、1wt%磷酸化二淀粉磷酸酯、0.8wt%酵母浸膏、1.8wt%玉米浆干粉、0.5wt%磷酸二氢钾、0.8wt%硫酸镁以及1.8wt%葵花籽油。

实施例3

将原始三孢布拉霉正菌和原始三孢布拉霉负菌分别接种于含有PDA培养基的斜面，于30℃的条件下培养4天，然后转接于种子培养基，于30℃、240rpm的条件下培养44h，培养过程中按2vvm的流量通入空气。

将培养的三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌按重量比为1：7的比例接种于含有发酵培养基的发酵罐中接种时三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌的生物量干重均为10g/L。

同时接种后，按2vvm的流量向发酵罐中通入干燥压缩空气，然后于220rpm的搅拌转速下进行发酵。发酵过程中发酵体系的生物量干重为50g/L。发酵过程中加入植酸以控制发酵体系的pH值为6.0。

发酵60h时，按放料量为40vol%进行放料，此时，发酵体系中生物量为32.4g/L，β-胡萝卜素含量为6.3wt%。放料后每间隔10h额外向发酵罐中补入当时发酵液体积的6vol%的三孢布拉霉种液，此三孢布拉霉种液含有重量比为1：7的三孢布拉霉正菌种液与三孢布拉霉负菌种液。半连续培养至180h，放罐。

其中，种子培养基含有3wt%葡萄糖、4wt%玉米浆干粉、1.5wt%酵母浸膏、0.1wt%磷酸二氢钾、0.015wt%硫酸镁、0.04wt%谷氨酸钠和4wt%葵花籽油溶液。

发酵培养基含有1.2wt%葡萄糖、3wt%磷酸化二淀粉磷酸酯、1.2wt%酵母浸膏、2.2wt%玉米浆干粉、0.9wt%磷酸二氢钾、1.2wt%硫酸镁以及2.2wt%葵花籽油。

实施例4

本发明实施例与实施例1的区别在于：调节剂为磷酸。

实施例5

本发明实施例与实施例1的区别在于：放料量为5vol%。

实施例6

本发明实施例与实施例1的区别在于：放料量为15vol%。

实施例7

本发明实施例与实施例1的区别在于：补料后，继续半连续培养至200h。

实施例8

本发明实施例与实施例1的区别在于：补料后，继续半连续培养至240h。

试验例1

重复实施上述实施例1-8，得到足够多的β-胡萝卜素。以通过现有普遍发酵方法生产而得的β-胡萝卜素为对照，对比所得的β-胡萝卜素的单位含量及产量，其结果如表1所示。

表1 β-胡萝卜素的单位含量（%）及产量（g/L）

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6	实施例7	实施例8	对照组
										单位含量	10.3	10.3	9.4	11.8	9.2	8.9	11.2	10.7	8.7
产量	4.8	4.3	4.6	4.2	3.8	3.7	4.4	4.4	3.1

由表1可以看出，实施例1-8所得的β-胡萝卜素较对照组所得的β-胡萝卜素无论是在单位含量还是产量上均更高，说明本发明实施例提供的三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法效果较佳。

对比实施例1及实施例4-6可以看出，实施例1所得的β-胡萝卜素的单位含量及产量均高于实施例4-6，说明实施例1的生产条件最优。对比实施例1与实施例7-8可以看出，三者所得的β-胡萝卜素的单位含量及产量均相差不大，说明补料后的半连续培养可至240h。

试验例2

以实施例1为例，设置对照组1-4，对照组1与实施例1的区别放料于发酵开始20h时进行，对照组2与实施例1的区别在于放料于发酵开始40h时进行，对照组3与实施例1的区别在于放料于发酵开始80h时进行，对照组4与实施例1的区别在于放料于发酵开始100h时进行，对比所得的β-胡萝卜素的单位含量及产量，其结果如表2所示。

表2 β-胡萝卜素的单位含量（%）及产量（g/L）

	实施例1	对照组1	对照组2	对照组3	对照组4
						单位含量	10.3	7.7	8.4	9.8	8.9
产量	4.8	2.8	3.0	3.6	3.2

由表2可以看出，实施例1较对照组1-4所得的β-胡萝卜素无论是在单位含量还是产量上均更高，说明在相同的发酵总周期内，放料开始时间设置于发酵开始后的60h最佳。

试验例3

以实施例1为例，设置对照组5和6，对照组5与实施例1的区别在于发酵过程中未加入植酸，对照组6与实施例1的区别在于发酵培养基中不含磷酸化二淀粉磷酸酯，对比所得的β-胡萝卜素的单位含量及产量，其结果如表3所示。

表3 β-胡萝卜素的单位含量（%）及产量（g/L）

	实施例1	对照组5	对照组6
				单位含量	10.3	8.7	8.6
产量	4.8	3.1	2.8

由表3可以看出，实施例1较对照组5和6所得的β-胡萝卜素无论是在单位含量还是产量上均更高，说明本发明实施例发酵过程中加入植酸以及发酵培养基中含有磷酸化二淀粉磷酸酯均有利于提高β-胡萝卜素的单位含量及产量。

试验例4

以实施例1为例，设置对照组7和8，对照组7与实施例1的区别在于接种所用的三孢布拉霉正菌及三孢布拉霉负菌的生物量干重均为8g/L，对照组8与实施例1的区别在于发酵过程中发酵体系的生物量干重为55g/L，对比所得的β-胡萝卜素的单位含量及产量，其结果如表4所示。

表4 β-胡萝卜素的单位含量（%）及产量（g/L）

	实施例1	对照组7	对照组8
				单位含量	10.3	6.0	5.8
产量	4.8	2.4	3.2

由表4可以看出，实施例1较对照组7和8所得的β-胡萝卜素无论是在单位含量还是产量上均更高，说明本发明实施例将接种所用的三孢布拉霉正菌及三孢布拉霉负菌的生物量干重控制在均不低于10g/L以及将发酵过程中发酵体系的生物量干重控制在不超过50g/L均有利于提高β-胡萝卜素的单位含量及产量。

试验例5

以实施例1为例，设置对照组9-14，对照组9与实施例1的区别在于放料量为3vol%，对照组10与实施例1的区别在于放料量为5vol%，对照组11与实施例1的区别在于放料量为15vol%，对照组12与实施例1的区别在于放料量为45vol%，对照组13与实施例1的区别在于放料量为60vol%，对照组14与实施例1的区别在于放料量为70vol%。对比所得的β-胡萝卜素的单位含量及产量，其结果如表5所示。

表5 β-胡萝卜素的单位含量（%）及产量（g/L）

	实施例1	对照组9	对照组10	对照组11	对照组12	对照组13	对照组14
								单位含量	10.3	8.9	9.9	9.8	10.1	10.0	8.6
产量	4.8	3.7	4.0	3.9	4.3	4.3	3.4

由表5可以看出，实施例1、对照组12和对照组13较对照组10和11所得的β-胡萝卜素无论是在单位含量还是产量上均更高，且对照组10-11较对照组9和对照组14更高，说明本发明实施例将放料量控制在30-60vol%较5-30vol%更有利于提高β-胡萝卜素的单位含量及产量，放料量低于5vol%对提高β-胡萝卜素的单位含量及产量影响不明显。

试验例6

以实施例1为例，设置对照组15-16，对照组15与实施例1的区别在于放料时发酵体系中生物量为25g/L，对照组16与实施例1的区别在于放料时β-胡萝卜素含量为5wt%。对比所得的β-胡萝卜素的单位含量及产量，其结果如表6所示。

表6 β-胡萝卜素的单位含量（%）及产量（g/L）

	实施例1	对照组15	对照组16
				单位含量	10.3	9.1	8.2
产量	4.8	3.6	4.0

由表6可以看出，实施例1较对照组15和16所得的β-胡萝卜素无论是在单位含量还是产量上均更高，说明本发明实施例将放料时发酵体系中生物量不低于30g/L并且β-胡萝卜素含量不低于6wt%有利于提高β-胡萝卜素的单位含量及产量。

综上所述，本发明实施例提供的三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法，此方法简单，成本低廉，通过用含有PO₄ ³⁺且不含金属离子及盐的酸性物质控制发酵pH值并提供PO₄ ³⁺，避免带入过量的K⁺，加之配合使用淀粉磷酸酯类物质，以提高β-胡萝卜素的产量。由上述三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法生产而得的β-胡萝卜素产量较高，适于工业化生产。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (7)

1.一种三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

分别培养三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌，同时接种，发酵，发酵过程以调节剂控制发酵体系的pH值为5.8-6.2，半连续培养，于发酵开始60h时放料并配合补料；

所述调节剂为植酸或磷酸；

发酵过程中采用的发酵培养基含有磷酸化二淀粉磷酸酯，所述磷酸化二淀粉磷酸酯占所述发酵培养基的1.0-3.0wt%。

2.根据权利要求1所述的三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法，其特征在于，接种所用的所述三孢布拉霉正菌及所述三孢布拉霉负菌的生物量干重均不低于10g/L。

3.根据权利要求1所述的三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法，其特征在于，发酵过程中所述发酵体系的生物量干重不超过50g/L。

4.根据权利要求1所述的三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法，其特征在于，放料过程中的放料量为30-60vol%。

5.根据权利要求1所述的三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法，其特征在于，放料时所述发酵体系中生物量不低于30g/L并且β-胡萝卜素含量不低于6wt%。

6.根据权利要求1所述的三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法，其特征在于，补料是将三孢布拉霉正菌的种液和/三孢布拉霉负菌的种液补充于所述发酵体系中。

7.根据权利要求6所述的三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素的方法，其特征在于，补料采用馈料式补料法，每间隔10h补入发酵液体积为4-6vol%的所述三孢布拉霉正菌的种液和所述三孢布拉霉负菌的种液。