CN105505853B - 一种用于bhk-21细胞高密度悬浮培养的低血清培养基及其在***病毒增殖中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于BHK‑21细胞高密度悬浮培养的低血清培养基及其在***病毒增殖培养中的应用。本发明通过研究BHK‑21细胞生长过程中葡萄糖等营养物质的代谢水平和相互调节，提出了个性化BHK‑21细胞低血清培养基，包含氨基酸部分、维生素部分、平衡盐部分和其它添加物部分。使用本发明培养基用于BHK‑21细胞的高密度悬浮培养，能够大大提高细胞对营养物质的有效利用率，降低代谢副产物浓度，从而提高细胞培养效能；此外，采用本发明培养基培养获得的BHK‑21细胞，对FMDV不同血清型敏感性增加，病毒有效抗原146S含量得到大幅度提高，可达到细胞生长的高效性、细胞生长的可控性及代谢副产物浓度最低化的目的，使生物制品的生产效率更高，生产成本更低，具有显著的经济效益。

Description

一种用于BHK-21细胞高密度悬浮培养的低血清培养基及其在 ***病毒增殖中的应用
技术领域
本发明涉及一种BHK-21细胞全悬浮高密度低血清个性化培养基的研制及其在***病毒增殖中的应用，属于兽用生物制药领域。
背景技术
随着生物制品技术的快速发展，我国现行***灭活疫苗生产工艺，从使用传统的转瓶贴壁细胞培养，发展为生物反应器大规模细胞悬浮培养。利用生物反应器进行大规模细胞培养，可以大幅度提高规模化动物细胞培养的单位产量，实现细胞的高密度培养、高密度表达，同时可以简化生产工艺，降低生产成本，保证大规模生产的产品质量。而普通培养基无法满足反应器中细胞的高密度培养，也不能够支持反应器独特的培养方式。在国外个性化培养基已成为培养基发展的主流，已被普遍使用并产生极大的经济效益。适宜的培养基配方可提高细胞的培养密度和细胞活率，提高病毒产量。因此如何根据规模化细胞培养工艺的不同，研发个性化培养基，提高目标产品的稳定性、产出率，是目前本领域的研究热点和难点。
本发明根据现有的细胞株、细胞培养方式，目的产物及生产工艺，细胞代谢及营养物质的需求，确立培养基设计方案，建立各种营养物质的检测方法，分析细胞代谢流，设计培养基配方，与商业化培养基比较，血清含量降低30％，细胞对营养物质的有效利用率提高，代谢副产物浓度降低，提高了BHK-21细胞的培养密度和细胞活率，细胞产能增加28％，经***病毒增殖，细胞对FMDV不同血清型敏感性增加，抗原含量稳定且提高幅度达43％，从而保证在稳定的细胞培养过程下，兼顾培养细胞的高密度水平和生产病毒抗原的高浓度，生产高质量的病毒疫苗，为目标产品品质的提高和产业化生产奠定了基础。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种低成本、成分较为明确的适用于BHK-21细胞高密度悬浮培养的低血清个性化培养基。
本发明的目的之二是提供所述培养基在BHK-21细胞高密度悬浮培养中的用途。
本发明的目的之三是提供所述培养基在病毒增殖中的用途。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
1、研制培养基策略方法由以下步骤完成：
(1)、细胞基础培养液的配制与准备
称取MEM培养基粉末溶于一定量蒸馏水(蒸馏水温度低于40℃)中，充分搅拌溶解，用氢氧化钠或盐酸调节pH值至6.95～7.15，最后定容即得BHK-21细胞悬浮培养用培养基。
(2)、细胞复苏与培养
从悬浮BHK-21细胞工作库取细胞一支，复苏后静置培养于T100细胞方瓶内，传2～3代，细胞长满单层后用胰蛋白酶消化，补加适量细胞培养液转移至1000ml三角瓶中，37℃振荡悬浮培养，摇床转速为90r/min，pH值为7.0～7.2，每日用NaHCO3调pH值。待细胞培养体积达到规定数量后，收集细胞，转入5L生物反应器中培养，培养设定参数：温度为37.0～37.5℃，pH值为7.0～7.2，DO值为60.0％～80.0％，搅拌转速为80～120r/min，培养50h传代培养。
(3)、BHK-21细胞在基础培养基中细胞生长代谢参数的控制
①按上述步骤2中所得到的细胞在5L生物反应器进行批式培养，以细胞密度和细胞活率为评价指标，在培养0h、24h、48h、72h和96h取细胞样，在4℃、1000rpm条件下离心5min，留取细胞上清液；
②将上述①所得细胞上清液进行主要营养物质葡萄糖和谷氨酰胺检测分析，葡萄糖和谷氨酰胺浓度和采用NOVA PLUS 100生化分析仪测定；
③将上述①所得细胞上清液进行主要营养物质氨基酸的检测分析，氨基酸浓度采用柱前衍生法，超高液相色谱仪分析，衍生试剂采用乙腈稀释至一定浓度的PITC和TEA溶液，备用；
④将上述①所得细胞上清液进行主要代谢副产物氨和乳酸的检测分析，采用NOVAPLUS 100生化分析仪检测。
(4)、培养基配方的确定
结合上述步骤(3)的细胞代谢流监测结果，确定主要影响细胞生长代谢的各个营养物质的含量，特别是葡萄糖浓度不低于16.0mmol/L、谷氨酰胺浓度不低于4.5mmol/L，两者浓度比例约3.5:1；在细胞培养结束时氨基酸不低于初始含量5％；确定了细胞代谢过程中对副产物的耐受浓度，即乳酸浓度不高于19mmol/L、氨浓度不高于8mmol/L，从而确定了BHK-21细胞个性化低血清培养基配方，并将其命名为ZN-MEM。
(5)培养基配方的实际效果验证
5.15L和500L生物反应器连续传代培养
将上述步骤4得到的ZN-MEM培养液，在5L和500L生物反应器进行BHK-21细胞的悬浮培养，设定参数：温度为37.0～37.5℃，pH值为7.0～7.2，DO值为60.0％～80.0％，搅拌转速为60～80r/min，培养0h、24h、48h、72h和96h细胞样品，800r/min进行离心，留上清液，采用细胞分析仪分析，考察BHK-21细胞在不同规模培养条件下，细胞密度和细胞活率变化情况。
结果：培养48小时传代，细胞密度均在3.8×106个/ml以上，且其活率均高于94％。
5.2低血清培养细胞的病毒增殖效果
取上述步骤5.1中500L生物反应器收获的细胞，分别接种***病毒A型、O型和Asia 1型，设定控制参数：温度为36.5～37.0℃，pH值为7.4～7.6，DO值为
60.0％～70.0％，搅拌转速为40～60r/min。当细胞病变率达90％以上，收获病毒，记录收获病毒的时间，按常规法测定收获病毒液的TCID50、LD50和有效抗原146S含量。
结果：经检测，收获病毒液的TCID50、LD50均符合疫苗工业化生产要求，相较于常规方法，细胞病变时间缩短约14％，有效抗原146S含量提高43％。
在上述研究的基础上，本发明提出了一种用于BHK-21细胞高密度悬浮培养的低血清培养基，命名为ZN-MEM，包括氨基酸部分，平衡盐部分，维生素部分、其它添加物、血清以及蒸馏水，pH值7.0～7.2，其中，血清添加浓度为1％(v/v)，其它各原料物质在培养基中的终浓度为：
①氨基酸部分，包括：
②平衡盐部分，包括：
③维生素部分，包括：
④其它添加物，包括：
在本发明中，优选的，其它各原料物质在培养基中的终浓度为：①氨基酸部分，包括：
②平衡盐部分，包括：
③维生素部分，包括：
④其它添加物，包括：
进一步的，本发明还提出了所述的培养基在进行BHK-21细胞的悬浮培养中的用途。
在本发明中，优选的，所述的悬浮培养，其培养条件为：接种密度为0.50×106个/ml，培养温度为37.0～37.5℃，pH值为7.0～7.2，DO值为60.0％～80.0％，搅拌转速为60～80r/min，培养48h进行传代。
更进一步的，本发明还提出了所述的培养基在以BHK-21细胞作为宿主细胞进行病毒增殖中的用途。
在本发明中，优选的，所述的病毒增殖包括向经本发明所述的培养基培养得到的BHK-21细胞接种病毒，设定控制参数为：温度为36.5～37.0℃，pH值为7.4～7.6，DO值为60.0％～70.0％，搅拌转速为40～60r/min，进行病毒增殖培养。
其中，所述的病毒为优选***病毒，更优选为FMD/O/MYA98/BY/2010、FMD/Re-AWH/09型或FMD/Asia1JSL/06。
本发明通过研究BHK-21细胞对葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸等营养物质的代谢水平和多因素相互调节，改变或调节培养基中各种成分的种类、数量和比例，优化细胞培养环境，研制出适合于BHK-21悬浮细胞专用的个性化低血清培养基，保证在稳定的细胞培养过程下生产高质量的病毒疫苗。与当前商业化培养基相比，其优点如下：
1.细胞质量提升
1)细胞产能提高
应用本发明的个性化培养基ZN-MEM，大大提高了细胞对营养物质的有效利用率，降低了代谢副产物浓度，优化了细胞生长环境，细胞生长速率增加，培养细胞的终密度大大提高，由原来的2.5×106cells/ml，增至3.8～5.0×106cells/ml，比市售培养基培养细胞密度增加近1.5～2倍，细胞生长状态稳定，细胞产能增加28％以上；
2)细胞活性提高
避免了营养物质的过剩或缺乏，降低了培养液中有毒代谢副产物的浓度，使细胞营养环境最优化，有效资源得到循环利用，同时降低了规模化细胞培养过程中细胞凋亡率，细胞活性提高；
3)细胞扩增比率提高
细胞生长速度快，市售的BH21细胞培养基细胞传代放大比例1:4左右，而应用优化的培养基细胞扩增比例1:6～1:10，提高了40％，单位时间内细胞产量提高。同时，细胞扩增比例的提高，减少了动力设备与加压设备，大大降低成本，产生间接经济效益。
2、疫苗抗原质量提升
以BHK-21细胞为基质，应用本发明的个性化培养基，优化了细胞培养环境，提高了培养细胞密度和细胞活率，细胞产能增加，细胞对FMD不同型病毒感染的敏感性及表达水平提高，使得***完整病毒粒子146S的含量得到大幅度的提高，146S含量达商业化培养的2倍以上，为***产品品质的提高奠定了基础。
3、培养基经济成本降低
目前，动物***预防接种中使用的***油佐剂灭活疫苗，细胞生产占其生产直接成本的80％以上。应用常规培养基细胞生产过程中，平均每升营养液直接成本为5.8元，使用本发明的个性化培养基培养细胞，每升营养液成本降低至4.9元，每升营养液细胞成本下降约18％。以年生产***疫苗15亿毫升计算，需要细胞营养液约7.5亿毫升，年产生直接经济约60万元以上。
另外，血清浓度比商业化培养基降低了30％，间接地又降低了生产成本，减轻了后续浓缩纯化工艺的压力，降低了疫苗生产过程中可能存在的潜在生物安全风险。
4、培养基配制过程精简化
本发明的个性化培养基配制过程简单，试剂可溶性增强，不需要投入大量的时间和劳动力，一定程度节约了人员的投入。
综上，使用本发明的个性化培养基培养细胞，细胞培养特性提高，细胞产量增加，疫苗的有效抗原含量和免疫效果得到提高；利用本发明的个性化培养基培养的细胞生产***病毒，疫苗生产直接成本大大降低，目前，该培养基在我公司中试生产线上成功应用，并产生了显著的经济效益，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为BHK-21细胞增殖过程中所需氨基酸种类和含量分布图；
图2为细胞增殖所需氨基酸量；
图3为细胞增殖所需葡萄糖量；
图4为细胞代谢副产物浓度变化；
图5为不同规模下培养细胞稳定性传代图；
图6为BHK-21细胞在四种培养基中细胞形态；
图7为BHK-21细胞在四种培养基中批式培养的生长曲线；
图8为BHK-21批式培养过程中葡萄糖和乳酸浓度的变化；
图9为BHK-21批式培养过程中谷氨酰胺和氨浓度的变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例一BHK-21细胞营养代谢研究及培养基配方的确定
1材料
1.1 BHK-21细胞取自中农威特生物科技股份有限公司建立的BHK-21悬浮细胞工作细胞库，批号为BHK-21/W/S-201202，经放大培养检验合格后使用。
1.2血清新生牛血清，购自合格供应商，按照中农威特生物科技股份有限公司新生牛血清内控质量标准检验合格后使用。
1.3试剂与设备
主要试剂：美国waters氨基酸分析色谱柱(5μm，150×4.6mmol)；20种氨基酸标样；乙腈(色谱纯)；醋酸钠(分析纯)；醋酸(分析纯)；三乙胺(TEA)；苯异硫氰酸酯(PITC)等。
主要仪器：细胞分析仪(德国INNOVATIS公司)；美国Waters高效液相色谱仪；NOVAPLUS 100生化分析仪；5L生物反应器(美国NBS)；显微镜(日本Olympus)；5L生物反应器(美国NBS)，
1.4细胞基础培养液：称取一定量MEM培养基粉末溶于一定量蒸馏水(蒸馏水温度低于40℃)中，充分搅拌溶解，用氢氧化钠或盐酸调节pH值至6.95～7.15，最后定容即得BHK-21细胞悬浮培养用基础培养液。
2方法
2.1主要测定方法
2.1.1细胞计数与分析
2.1.1.1取样：用无菌的吸管吸取细胞；
2.1.1.2加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，用移液器吸取细胞样品20ul与CASY TON细胞分析缓冲液10ml反复混匀，用细胞分析仪进行分析。
2.1.1.3检测：根据细胞分析仪测定的结果，计算细胞活率、密度及细胞生长比率，确定细胞的增殖能力。
2.1.2氨基酸检测分析：采用HPLC进行检测
2.2细胞培养及方法
2.2.1细胞复苏与培养
①从悬浮BHK-21细胞工作库取细胞一支，迅速置于40℃水浴中解冻；
②将①所得到的细胞在1000rpm转速下，离心4min，弃上清，加入适量含有5％血清的培养液重悬，复苏后静置培养于T100细胞方瓶内，传2～3代，细胞长满单层后用胰蛋白酶消化；
③将②所得到的细胞转移至250ml三角瓶中，37℃振荡悬浮培养，摇床转速为90r/min，pH值7.0～7.2，每日用NaHCO3调pH值，培养50h传代培养；
④待细胞培养体积达到100ml，细胞密度3.0×106cells/ml，细胞活率93％以上，逐级放大，收集细胞，转入5L生物反应器培养，设定参数：温度为37.0～37.5℃，pH值为7.0～7.2，DO值为60.0％～80.0％，搅拌转速为80～120r/min，培养50h传代培养。
2.2.2 BHK-21细胞氨基酸、葡萄糖及代谢副产物需求研究
1)按上述步骤2中④所得到的细胞在5L生物反应器进行批式培养，以细胞密度和细胞活率为评价指标，在培养0h、24h、48h、72h和96h取细胞样，在4℃、1000rpm条件下离心5min，留取细胞上清液；
2)将上述1)所得细胞上清液进行主要营养物质葡萄糖和谷氨酰胺检测分析，葡萄糖和谷氨酰胺浓度采用NOVA PLUS 100生化分析仪测定；
3)将上述1)所得细胞上清液进行主要营养物质氨基酸的检测分析，氨基酸浓度采用超高液相柱前衍生法，具体步骤为：
①样品预处理：对需要检测的细胞培养基，以1000r/min、4℃条件离心10min，取上清备用；
②衍生试剂的配制：分别取12uL的PITC和144uL的TEA用乙腈稀释至1000uL，备用；
③样品衍生反应：取上清液200uL，同时分别取PITC、TEA各100uL，涡旋振荡30s，室温萃取1h，立即用等体积正己烷终止10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，备用，样品的衍生方法与标准品同；
④流动相:A和B两种溶液梯度洗脱。A液为醋酸钠溶液；B液为乙腈溶液，C液为洗液，即20％的乙腈溶液；流动相在使用之前经0.22μm滤膜过滤，并用超声波脱气10min；
⑤标准曲线制定:将含20种氨基酸的标准溶液进行稀释，浓度分别为0.1mmol/L、0.25mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L；
⑥平衡色谱柱:先用C液对氨基酸分析柱进行清洗，再用A液平衡色谱柱，待基线平衡为止；
⑦运行样品:上样体积为20uL，流速为1ml/min，运行时间65min，柱温30℃，检测波长254nm；
⑧冲洗仪器及色谱柱，冲洗顺序为C液60ml以上，B液30ml以上；
⑨数据处理，计算氨基酸含量。
2.2.3培养基配方的优化与应用
依据上述步骤2.2.2检测到的细胞生长代谢参数，结合细胞代谢流监测结果，确定主要影响细胞生长代谢的各个营养物质的含量，使其细胞培养结束时，营养物质的含量不低于5％，细胞代谢过程中副产物氨浓度小于8mM、乳酸浓度小于19mM的耐受浓度极限值，进行主要营养物质的补充或降低，从而对基础目录培养基MEM进行了调整。
3结果
3.1氨基酸、葡萄糖及代谢副产物对细胞增殖的影响通过HPLC法测定细胞接种后0h和48h培养基中20种氨基酸含量，并联合细胞生长代谢水平，确定每增长一个细胞所需各种氨基酸的量，如图1所示，进而对细胞生长过程中氨基酸的代谢进行监控。
细胞增殖所需的氨基酸量、葡萄糖量以及细胞代谢副产物浓度变化分别如图2-图4所示。
3.2 BHK-21细胞批式培养过程中主要代谢物质浓度的变化
表1批式培养过程中主要代谢物质浓度的变化
3.3培养基配方确定及验证
结合上述细胞代谢流监测结果，确定主要影响细胞生长代谢的各个营养物质的含量及细胞代谢过程中对副产物的耐受浓度，来设计培养基配方，命名为ZN-MEM，所述培养基包括氨基酸部分，平衡盐部分，维生素部分、其它添加物、血清以及蒸馏水，pH值7.0～7.2，其中，血清添加浓度为1％(v/v)，其它各原料物质在培养基中的终浓度如下表2所示：
表2
实施例二个性化培养基在不同培养规模下的应用
1材料
1.1BHK-21细胞取自中农威特生物科技股份有限公司建立的BHK-21悬浮细胞工作细胞库，批号为BHK-21/W/S-201201，经放大培养检验合格后使用。
1.2血清新生牛血清，购自合格供应商，按照中农威特生物科技股份有限公司新生牛血清内控质量标准检验合格后使用。
1.3培养基
本发明的BHK-21低血清培养基ZN-MEM，所述培养基包括氨基酸部分，平衡盐部分，维生素部分、其他添加物、血清以及蒸馏水，pH值7.0～7.2，其中，血清添加浓度为1％(v/v)，其他各原料物质在培养基中的终浓度如下表3所示：
将研制的ZN-MEM培养基配方委托培养基厂家进行加工，以配制50L培养液为例，其配制方法为：
①量取90％-95％总体积的注射用水，待温度降至35～40℃，称量当量50L干粉培养基，即0.925kg干粉(不含有谷氨酰胺，Pluronic F-68以及血清)溶于其中，搅拌至少50min使之充分溶解；
②在上述步骤①得到的溶液中加入谷氨酰胺36.5g，搅拌15min；
③在上述步骤②得到的溶液中加入抗剪切保护剂Pluronic F-68 50.0g，搅拌15min；
④在上述步骤③得到的溶液中加入1％(v/v)血清，充分混匀；
⑤在上述步骤④得到的溶液中加入一定量4.0mol/L氢氧化钠或1.0mol/L盐酸溶液，调pH值为7.0～7.2；
⑥在上述步骤⑤得到的溶液中加入冷却的注射用水，定容至终体积50L；
⑦在上述步骤⑥得到的溶液用孔径0.22μm的滤芯除菌过滤，置4℃保存。
1.4试剂与设备
主要试剂：美国Waters氨基酸分析色谱柱(5μm，150×4.6mmol)；20种氨基酸标样；乙腈(色谱纯)；醋酸钠(分析纯)；醋酸(分析纯)；三乙胺(TEA)；苯异硫氰酸酯(PITC)；
主要仪器：细胞分析仪(德国INNOVATIS公司)；显微镜(日本Olympus)；美国Waters高效液相色谱仪；NOVA PLUS 100生化分析仪、5L生物反应器(美国NBS)，500L生物反应器(自主设计委托生物反应器厂家生产)。
2方法
2.1细胞计数与分析
2.1.1取样：用无菌的吸管吸取细胞；
2.1.2加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，用移液器将细胞样品20ul与CASY TON细胞分析缓冲液10ml反复混匀，用细胞分析仪进行分析。
2.1.3检测：根据细胞分析仪测定的结果，计算细胞活率、密度及细胞生长比率，确定细胞的增殖能力。
2.2细胞复苏与培养
①从悬浮BHK-21细胞工作库取细胞一支，迅速置于40℃水浴中解冻；
②将①所得到的细胞在1000rpm转速下，离心4min，弃上清，加入适量含有5％血清的培养液重悬，复苏后静置培养于T100细胞方瓶内，传2～3代，细胞长满单层后用胰蛋白酶消化；
③将②所得到的细胞转移至250ml三角瓶中，37℃振荡悬浮培养，摇床转速为90r/min，pH值为7.0～7.2，每日用8％NaHCO3调pH值，待细胞培养体积达到规定数量后，收集细胞，以备后续作细胞种子。
2.3 BHK-21细胞在5L生物反应器传代培养
将上述2.2收集的细胞转入5L生物反应器中培养，接种密度为0.50×106cells/ml，培养体积4000ml，培养设定参数：温度37℃、DO值为68％、pH值为7.0、转速120r/min，均自动控制。培养48h，传代培养40日(20代)。
2.4BHK-21细胞在500L生物反应器传代培养
将上述收集的细胞种子在500L生物反应器上扩大培养，接种密度0.55×106个/ml，反应器控制参数：温度为37.0℃、DO值为70.0％、pH值为7.1、转速100r/min，均自动控制。培养48h，传代培养40日(20代)。
3、结果
结合细胞代谢流监测结果，确定主要影响细胞生长代谢的各个营养物质的含量及细胞代谢过程中对副产物的耐受浓度，对此培养基进行5L和500L不同规模细胞悬浮培养的应用验证，不同规模下培养细胞稳定性传代情况如图5所示，表明应用本发明确定的培养基连续培养BHK-21细胞40日(20代)，密度均在3.5×106个/ml以上，且其活率均高于94％，因此，此培养基ZN-MEM可应用于BHK-21细胞大规模培养。
实施例三不同培养基培养的BHK21细胞对病毒增殖的影响
1材料和方法
1.1材料
1.1.1细胞
BHK-21-P细胞购自ATCC，来源：Hamster Syrian Kidney，中农威特生物科技股份有限公司保存，试验细胞已传F18代。
1.1.2培养基
BHK-21细胞商业化的低血清培养基，即：BHK-21MEM、BHK-21GMEM、SLM BHK-21，分别命名为A、B和C培养基；本发明培养基ZN-MEM，命名为D培养基，配方与实施例二中的培养基相同。
1.1.3培养基添加物
谷氨酰胺、Pluronic F-68、柠檬酸铁、转铁蛋白、腐胺、激素、脂类物质购于SIGMA公司，大豆蛋白水解物、超滤植物蛋白胨、酵母提取物等购于北京试剂公司。
1.1.4其它试剂与设备
碳酸氢钠、氢氧化钠、盐酸等常用试剂为国产分析纯，
主要仪器：细胞计数仪(德国INNOVATIS公司)，NOVA PLUS 100生化分析仪(美国Nova Biomedical公司)，倒置显微镜(日本Olympus)等。
1.2方法
1.2.1 BHK-21细胞复苏与悬浮培养
①从悬浮BHK-21细胞工作库取细胞一支，迅速置于40℃水浴中解冻；
②将①所得到的细胞在1000rpm转速下，离心4min，弃上清，加入适量含有5％血清的培养液重悬，复苏后静置培养于T100细胞方瓶内，传2～3代，细胞长满单层后用胰蛋白酶消化；
③将②所得到的细胞转移至250ml三角瓶中，37℃振荡悬浮培养，摇床转速为90r/min，pH值7.0～7.2，每日用8％NaHCO3调两次pH值，待细胞培养体积达到100ml，取上述处于对数生长期的细胞，按1:6～1:10转入1000ml三角瓶中扩大培养。
1.2.2 BHK-21细胞在不同培养基中的批式培养
取生长良好的无血清BHK-21悬浮细胞，以同一初始密度0.60×106cells/ml分别接种于A、B、C和D四种培养基中，在37℃、100r/min、PH值为7.0培养条件下进行批式培养。在培养至0h、24h、48h、72h、96h和120h取细胞样品，倒置显微镜下进行形态学观察，以细胞密度和细胞活率为评价指标，分析细胞生长情况。
1.2.3主要营养物质和代谢副产物等细胞代谢参数的测定
取上述批式培养过程中0h、24h、48h和96h细胞样品，800r/min进行离心，留上清液，采用NOVA PLUS 100生化分析仪分析，检测BHK-21细胞在不同无血清培养基条件下，细胞培养液中的谷氨酰胺、葡萄糖、氨、乳酸浓度。
1.2.4不同培养基培养的BHK21细胞对***病毒增殖的影响
取A、B、C和D培养基培养的细胞，分别接种***病毒Re-A WH/09型、O/MYA98/BY/2010和FMD/Asia1JSL/06毒株，设定控制参数：温度为36.5～37.0℃，pH值为7.4～7.6，DO值为60.0％～70.0％，搅拌转速为40～60r/min。当细胞病变率在90％以上，收获病毒，记录收获病毒的时间，按常规法测定收获病毒液的TCID50、LD50和有效抗原146S含量。
2结果
2.1 BHK-21细胞在不同无血清培养基中细胞培养形态的比较
BHK-21细胞在四种培养基中细胞形态如图6所示，可见BHK-21细胞在上述四种养基中培养，细胞形态差异较大，其中D图中优化的培养基培养的细胞形态优于其它A、B和C培养基，细胞透亮、饱满、圆润，边界清晰，细胞大小正常(一般在10.0～11.0μm)。
2.2 BHK-21细胞在不同培养基中批式培养细胞生长曲线比较
BHK-21细胞在四种培养基中批式培养的生长曲线如图7所示。从图7可知，在批式培养的整个过程中，优化的D培养基细胞生长最快，细胞活率高，在培养至72h，最大活细胞密度达8.42×106cells/ml，细胞活率96.88％。可见，优化的D培养基更适合于BHK-21细胞培养。
2.3主要营养物质和代谢副产物等细胞代谢参数的测定
应用NOVA PLUS 100生化分析仪，对培养0h、24h、48h和96h细胞上清液进行谷氨酰胺、葡萄糖、氨及乳酸浓度的测定。
BHK-21批式培养过程中葡萄糖和乳酸浓度的变化如图8所示，BHK-21批式培养过程中谷氨酰胺和氨浓度的变化如图9所示。
从图8、9可见，BHK-21细胞在四种培养基培养条件下，细胞培养液中的主要营养物质葡萄糖和谷氨酰胺浓度均随着培养时间的延长而逐渐降低，呈培养前期下降较快、中后期下降减缓的趋势，细胞培养上清液中的乳酸和氨浓度均随着培养时间的延长而不断累积。
通过比较发现，D培养基中葡萄糖和谷氨酰胺浓度较低，其代谢副产物氨和乳酸浓度也较低(乳酸和氨浓度达到19mM、8mM时，对BHK-21细胞的生长产生严重的抑制作用)，说明D培养基中葡萄糖和谷氨酰胺浓度比例达到最优化，从而优化了细胞代谢途径，可促进细胞的增殖。
2.4不同培养基培养的BHK-21细胞对***病毒增殖的影响
表3不同培养基培养的BHK-21细胞对***病毒增殖的影响
表3结果表明：用上述四种培养基培养的BHK-21悬浮细胞生产***病毒液TCID50、LD50均达到工业化生产的要求，而自制的低血清培养基D生产的不同型***病毒的细胞病变时间缩短，有效抗原146S含量提高43％，优于A、B、C商业化培养基，这为FMD高品质疫苗生产奠定了基础。
3结论
用自行研制的个性化培养基与三种商业化的低血清培养基分别培养BHK-21细胞，研究BHK-21细胞在不同培养基中的生长与病毒增殖状况，结果表明，BHK-21细胞在优化的D培养基中培养，优于A、B、C商业化培养基，培养的细胞饱满、透亮，细胞生长速度较快，细胞代谢副产物氨和乳酸浓度低，能连续稳定传代培养，细胞密度提高28％左右，生产的***病毒液有效抗原含量提高43％，能保证高品质疫苗的生产。

Claims (8)

1.一种用于BHK-21细胞高密度悬浮培养的低血清培养基，其特征在于由氨基酸部分，平衡盐部分，维生素部分、其他添加物、血清以及蒸馏水组成，pH值7.0～7.2，其中，血清添加浓度为1％v/v，其他各原料物质在培养基中的终浓度为：
①氨基酸部分，包括：
②平衡盐部分，包括：
③维生素部分，包括：
④其它添加物，包括：
2.根据权利要求1所述的一种用于BHK-21细胞高密度悬浮培养的低血清培养基，其特征在于由氨基酸部分，平衡盐部分，维生素部分、其他添加物、血清以及蒸馏水组成，pH值7.0～7.2，其中，血清添加浓度为1％v/v，其他各原料物质在培养基中的终浓度为：
①氨基酸部分，包括：
②平衡盐部分，包括：
③维生素部分，包括：
④其它添加物，包括：
3.权利要求1或2所述的培养基在进行BHK-21细胞的悬浮培养中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的悬浮培养，其培养条件为：接种密度为0.50×106个/ml，培养温度为37.0～37.5℃，pH值为7.0～7.2，DO值为60.0％～80.0％，搅拌转速为60～80r/min，培养48h进行传代。
5.权利要求1或2所述的培养基在以BHK-21细胞作为宿主细胞进行病毒增殖中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述的病毒增殖包括向经权利要求1或2所述的培养基培养得到的BHK-21细胞接种病毒，设定控制参数为：温度36.5～37.0℃，pH值为7.4～7.6，DO值为60.0％～70.0％，搅拌转速为40～60r/min，进行病毒增殖培养。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于所述的病毒为***病毒。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于所述的***病毒为FMD/O/MYA98/BY/2010、FMD/Re-A WH/09和FMD/Asia1JSL/06毒株。
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