CN105505816A - 一株少动鞘氨醇单胞菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株少动鞘氨醇单胞菌及其应用，属于生物工程技术领域。所述的少动鞘氨醇单胞菌命名为少动鞘氨醇单胞菌Y5(Sphingomonas？paucimobilis？Y5)，保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为：CCTCC？NO：M？2015523。该菌株可利用碳源，氮源，无机盐和水，在合适的条件下发酵生产威兰胶。本发明的菌株糖转化率和威兰胶产量较高，具有一定的应用价值。该菌株发酵生产的威兰胶品质好，1％水溶液粘度达到3500mPa·S，耐酸碱，150℃时粘度基本不变。该菌株发酵时糖转化率较高，达到55％～60％，产量较高，达到了25～32g/L(干重)。

Description

一株少动鞘氨醇单胞菌及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体是涉及一株少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)及其在发酵生产威兰胶中的应用。

背景技术

威兰胶(welangum编号S-130)是由某些产碱杆菌Alcaligenessp.或鞘氨醇单胞菌Sphingomonassp.合成的微生物杂多糖，是美国斯比凯可公司(CPKelco)20世纪80年代继黄原胶、结冷胶之后开发的第3代微生物胞外多糖之一，其分子量高达数百万。它的结构骨架由D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖重复单元构成，侧链由单一的L-甘露糖或L-鼠李糖构成，结构如图1所示；威兰胶水溶液具有假塑性流体特征，其低浓度水溶液具有很高的粘度，并具有良好的稳定性，温度升高至150℃时，其黏度基本不变，其耐温极限值比黄原胶高20～30℃。威兰胶水溶液对酸、碱稳定，其黏度在pH2～13范围内基本不受影响；威兰胶溶液具有独特的剪切稀释性能，这一点在石油钻井中发挥突出的作用。威兰胶溶液的独特性质超越许多其它多糖，可作为增稠剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、润滑剂、成膜剂和粘合剂应用于石油、混凝土、食品、油墨等工业。

目前仅美国Kelco公司商业化生产威兰胶，国内尚无商业化生产的报道，国内研究尚处于实验室研究的起步阶段。

发明内容

为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株少动鞘氨醇单胞菌。

本发明的另一目的在于提供上述少动鞘氨醇单胞菌的应用。上述的少动鞘氨醇单胞菌应用于发酵生产威兰胶，并提供发酵生产威兰胶的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一株少动鞘氨醇单胞菌，所述的少动鞘氨醇单胞菌命名为少动鞘氨醇单胞菌Y5(SphingomonaspaucimobilisY5)，保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为：CCTCCNO：M2015523；保藏起始日期为2015年9月11日。

所述的少动鞘氨醇单胞菌Y5是本申请发明人从酒精废水处理厂活性污泥分离并筛选得到。

所述的少动鞘氨醇单胞菌Y5，在营养琼脂(NA)平板上菌落形态见图2，为圆形，黄色，湿润，凸起生长，菌落直径为1～5mm；显微镜检为革兰氏阴性细菌，氧化酶试验为阳性，接触酶试验为阴性。

所述的少动鞘氨醇单胞菌Y5，对少动鞘氨醇单胞菌Y5的16srDNA进行测序与分子比对，其与鞘氨醇单胞菌(sphingomonassp.)16srDNA核苷酸序列同源性为98％。其中少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)Y5的16srDNA序列如SEQIDNO:1所示。

所述的少动鞘氨醇单胞菌Y5，经梅里埃API20NE鉴定条鉴定为少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)。

本发明所述的少动鞘氨醇单胞菌Y5(SphingomonaspaucimobilisY5)可用于发酵生产威兰胶。

当小量摇床发酵培养时，所述发酵生产威兰胶的具体方法为：从活化的少动鞘氨醇单胞菌Y5菌种斜面挑取1～2环菌种接种到种子培养基，28～32℃，180～200r/min摇床培养16～18h得到种子液，然后按5％～10％(v/v)接种量接种到发酵培养基，摇床培养条件为28～32℃，200～250r/min发酵65～72h；发酵液经回收过程获得威兰胶。

当大量发酵罐培养时，所述发酵生产威兰胶的具体方法为：从活化的少动鞘氨醇单胞菌Y5菌种斜面挑取1～2环菌种接种到种子培养基，28～32℃，180～200r/min摇床培养16～18h得到种子液，然后按5％～10％(v/v)接种量接种到发酵培养基，发酵罐培养条件为温度28～32℃，搅拌速度400～800r/min发酵65～72h，通气量1.0vvm，pH6.0～7.0，罐压0.01～0.03Mpa；发酵液经回收过程获得威兰胶。

所述的种子培养基的成份及含量为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，K₂HPO₄·7H₂O2g/L，MgSO₄·7H₂O0.1g/L，溶剂为水。

所述的发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐；发酵培养基初始pH6.0～8.0；所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉类水解液中的一种或几种，用量为40～60g/L；所述的氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、NaNO₃中的一种或几种，用量为3～5g/L；所述的无机盐为K₂HPO₄·7H₂O和MgSO₄·7H₂O，用量分别为2～4g/L和0.1～0.3g/L。

作为优选的实施方式，所述的发酵培养基还包括表面活性剂，所述的表面活性剂为吐温80，司盘，脂肪酸甘油酯的一种或几种，用量为0.5～1g/L。

在威兰胶的生产方法中，所述的产品回收过程包括预处理、提取、干燥、粉碎和过筛过程，具体步骤如下：

1)预处理：发酵液经80℃灭活20min，蛋白酶处理结合离心、过滤除去菌体和不溶性杂质；

2)提取：加入1.5～2倍体积有机溶剂提取；

3)干燥：有机溶剂分离得到的沉淀60℃干燥；

4)粉碎：所得干燥的威兰胶用粉碎机粉碎；

5)过筛：粉碎后的威兰胶过60～120目筛，即得不同规格的威兰胶产品。

步骤2)中所述的有机溶剂为乙醇、甲醇或异丙醇中的一种或几种。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1)本发明分离筛选得到一株少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)Y5，可利用碳源，氮源，无机盐和水，在合适的条件下发酵生产威兰胶，所需营养成分简单，操作方便。

2)该菌株发酵生产的威兰胶品质好，1％水溶液粘度达到3500mPa·S，耐酸碱(pH2～13范围类性质稳定)，耐高温(温度升高至150℃时粘度基本不变)。

3)该菌株发酵时糖转化率较高，达到55％～60％，产量较高，达到了25～32g/L(干重)。

附图说明

图1为威兰胶的分子结构骨架示意图；

图2为少动鞘氨醇单胞菌Y5在营养琼脂上的菌落形态图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)Y5的分离筛选

分离：取酒精废水厂的活性污泥样品，用无菌水作10倍梯度稀释，然后涂布于LB琼脂平板，30℃培养。

初筛：挑取个头大，有粘性，表面光滑，湿润的单菌落用于复筛。

复筛：初筛挑取的单菌落分别接种于液体培养基(葡萄糖30g/L，蛋白胨3g/L，酵母粉1g/L，K₂HPO₄·7H₂O2g/L，MgSO₄·7H₂O0.2g/L)，30℃，200r/min摇床培养，最终筛选出发酵液粘度和粗糖产量高的菌株少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)Y5。

实施例2少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)Y5的鉴定

1)菌落形态与镜检，结果如图2所示：

在营养琼脂(NA)平板上菌落形态为圆形，黄色，湿润，凸起生长，菌落直径为1～5mm；显微镜检为革兰氏阴性细菌。

2)氧化酶与接触酶检验：

氧化酶试验为阳性，接触酶试验为阴性。

3)16srDNA鉴定：

用接种环挑取2～5个菌落转移至TE中，37℃温育1.5h，加入NaCl和CTAB溶液混匀，65℃温育10min，加入酚-氯仿-异戊醇溶液抽提，离心10min，吸取上清转移至新的EP管内，再用氯仿-异戊醇提取2次，转移至新的EP管中，再加入异丙醇沉淀DNA，4℃静置20min，离心弃上清，加入70％乙醇洗涤沉淀，加入TE，溶解沉淀。-20℃保存。将上述提取的总DNA稀释10倍作为模板，以F27(CCGGATCCAGAGTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT)和R1492(CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC)作为引物扩增待测细菌的16srDNA。扩增物由上海英骏生物技术有限公司进行测序，测序结果提交到GENBANK(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行比对，结果表明与Sphingomonassp.ZJ01同源性达到98％，归属于鞘氨醇单胞菌属。其中：扩增待测细菌的16srDNA的测序序列结果如下：

4)API鉴定：

用灭菌的棉拭子挑取新鲜的菌落，接种至API20NE接种液中，制成浊度为2个麦氏单位的菌悬液。将菌悬液接种至API20NE鉴定条，30℃培养48h观察生化反应，并用API鉴定***软件分析，得到鉴定结果为：试验条API20NEV7.0，生化谱0463340，有意义的分类单位为Sphingomonaspaucimobilis，鉴定％为99.8，T值(T指数)0.93。

实施例3少动鞘氨醇单胞菌Y5发酵生产的微生物多糖检测分析。

菌株发酵生产的多糖聚合物溶于水，不溶于醇、酮等有机溶剂。

通过苯酚-硫酸法和硫酸-咔唑法测得多糖样品中葡萄糖醛酸含量为12％；通过薄层色谱、气相色谱和化学定糖法测得该多糖是由D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-甘露糖和L-鼠李糖组成；通过气相色谱法测得分析样品中甘露糖:葡萄糖:鼠李糖＝1:3.0:4.5；通过高碘酸氧化法测定多糖中糖苷键类型主要为1→4键和1→3键。

通过上述实验结果表明多糖聚合物属于威兰胶。

将上述获得的少动鞘氨醇单胞菌送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏信息如下：所述的少动鞘氨醇单胞菌命名为少动鞘氨醇单胞菌Y5(SphingomonaspaucimobilisY5)，保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为：CCTCCNO：M2015523；保藏起始日期为2015年9月11日。

实施例4

种子培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，K₂HPO₄·7H₂O2g/L，MgSO₄·7H₂O0.1g/L，初始pH7.2，溶剂为水。

发酵培养基：蔗糖40g/L，蛋白胨4g/L，K₂HPO₄·7H₂O2g/L，MgSO₄·7H₂O0.1g/L，初始pH7.2，溶剂为水。

接种活化的少动鞘氨醇单胞菌SphingomonaspaucimobilisY5保藏号CCTCCM2015523于种子培养基培养16h制成种子液，然后将种子液接种到装有40mL发酵培养基的250mL三角瓶中，接种量为5％(v/v)，温度28℃，250r/min摇床发酵培养65h，发酵完成后的发酵液粘度为9500mPa·S，经过提取最后得威兰胶产品干重21.5g/L，取该威兰胶样品粉碎后过80目筛，1％水溶液粘度为3000mPa·S。

实施例5

种子培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，K₂HPO₄·7H₂O2g/L，MgSO₄·7H₂O0.1g/L，初始pH7.2，溶剂为水。

发酵培养基：葡萄糖55g/L，牛肉膏4g/L，K₂HPO₄·7H₂O2.3g/L，MgSO₄·7H₂O0.1g/L，吐温800.5g/L，初始pH7.2，溶剂为水。

接种活化的少动鞘氨醇单胞菌SphingomonaspaucimobilisY5保藏号CCTCCM2015523于种子培养基培养18h制成种子液，然后将种子液接种到装有40mL发酵培养基的250mL三角瓶中，接种量为5％(v/v)，温度30℃，250r/min摇床发酵培养72h，发酵完成后的发酵液粘度为12000mPa·S，经过提取最后得威兰胶产品干重30.3g/L，取该威兰胶样品粉碎后过100目筛，1％水溶液粘度为3500mPa·S。

实施例6

种子培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，K₂HPO₄·7H₂O2g/L，MgSO₄·7H₂O0.1g/L，初始pH7.2，溶剂为水。

发酵培养基：葡萄糖50g/L，牛肉膏4g/L，K₂HPO₄·7H₂O2.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.1g/L，初始pH7.5，溶剂为水。

接种活化的少动鞘氨醇单胞菌SphingomonaspaucimobilisY5保藏号CCTCCM2015523于种子培养基培养18h制成种子液，然后将种子液接种到发酵培养基中，接种量为5％(v/v)，发酵温度30℃，通气1.0vvm，搅拌速度600r/min，用2mol/LNaOH和HCl溶液控制pH7.0±0.2，发酵72h；发酵完成后的发酵液粘度为10000mPa·S，发酵液除菌后加入2倍体积无水乙醇提取24h，8000g离心20min，弃去上清液，再用95％乙醇洗涤沉淀2次，将沉淀物于60℃烘干至恒重，得威兰胶产品30g/L，干燥后的威兰胶粉碎过100目筛，所得威兰胶产品的1％水溶液粘度为3200mPa·S，高于黄原胶的1200mPa·S。

实施例7

种子培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，K₂HPO₄·7H₂O2g/L，MgSO₄·7H₂O0.1g/L，初始pH7.2，溶剂为水。

发酵培养基：玉米淀粉水解液7L(最终还原糖浓度为42g/L)，牛肉膏25g/L，KH₂PO₄17.5g/L，MgSO₄0.7g/L，表面活性剂吐温803.5g/L，初始pH7.0，溶剂为水。

接种活化的少动鞘氨醇单胞菌SphingomonaspaucimobilisY5保藏号CCTCCM2015523于种子培养基培养16h制成种子液，发酵培养基中，接种量为4％(v/v)，发酵温度30℃，通气1.0vvm，搅拌速度650r/min，用2mol/LNaOH和HCl溶液控制pH7.0±0.2，发酵70h，发酵完成后的发酵液粘度为9000mPa·S，发酵液除菌后加入2倍体积异丙醇提取，取沉淀物于60℃干燥，干燥后的威兰胶粉碎过80目筛，得到威兰胶产品，该威兰胶产品的1％水溶液粘度为2900mPa·S，产量为29.5g/L(干重)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株少动鞘氨醇单胞菌，其特征在于：所述的少动鞘氨醇单胞菌命名为少动鞘氨醇单胞菌Y5(SphingomonaspaucimobilisY5)，保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为：CCTCCNO：M2015523；保藏起始日期为2015年9月11日。

2.权利要求1所述的少动鞘氨醇单胞菌用于发酵生产威兰胶。

3.根据权利要求2所述的少动鞘氨醇单胞菌用于发酵生产威兰胶，其特征在于：所述发酵生产威兰胶的具体方法为：从活化的少动鞘氨醇单胞菌Y5菌种斜面挑取1～2环菌种接种到种子培养基，28～32℃，180～200r/min摇床培养16～18h得到种子液，然后按体积百分含量5％～10％接种量接种到发酵培养基，摇床培养条件为28～32℃，200～250r/min发酵65～72h；发酵液经回收过程获得威兰胶。

4.根据权利要求2所述的少动鞘氨醇单胞菌用于发酵生产威兰胶，其特征在于：所述发酵生产威兰胶的具体方法为：从活化的少动鞘氨醇单胞菌Y5菌种斜面挑取1～2环菌种接种到种子培养基，28～32℃，180～200r/min摇床培养16～18h得到种子液，然后按体积百分含量5％～10％接种量接种到发酵培养基，发酵罐培养条件为温度28～32℃，搅拌速度400～800r/min发酵65～72h，通气量1.0vvm，pH6.0～7.0，罐压0.01～0.03Mpa；发酵液经回收过程获得威兰胶。

5.根据权利要求3或4所述的少动鞘氨醇单胞菌用于发酵生产威兰胶，其特征在于：所述的种子培养基的成份及含量为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，K₂HPO₄·7H₂O2g/L，MgSO₄·7H₂O0.1g/L，溶剂为水。

6.根据权利要求3或4所述的少动鞘氨醇单胞菌用于发酵生产威兰胶，其特征在于：所述的发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐；发酵培养基初始pH6.0～8.0。

7.根据权利要求6所述的少动鞘氨醇单胞菌用于发酵生产威兰胶，其特征在于：所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉类水解液中的一种或几种，用量为40～60g/L；所述的氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、NaNO₃中的一种或几种，用量为3～5g/L。

8.根据权利要求6所述的少动鞘氨醇单胞菌用于发酵生产威兰胶，其特征在于：所述的无机盐为K₂HPO₄·7H₂O和MgSO₄·7H₂O，用量分别为2～4g/L和0.1～0.3g/L。

9.根据权利要求6所述的少动鞘氨醇单胞菌用于发酵生产威兰胶，其特征在于：所述的发酵培养基还包括表面活性剂，所述的表面活性剂为吐温80，司盘，脂肪酸甘油酯的一种或几种，用量为0.5～1g/L。

10.根据权利要求3或4所述的少动鞘氨醇单胞菌用于发酵生产威兰胶，其特征在于：所述的产品回收过程包括预处理、提取、干燥、粉碎和过筛过程，具体步骤如下：

1)预处理：发酵液经80℃灭活20min，蛋白酶处理结合离心、过滤除去菌体和不溶性杂质；

2)提取：加入1.5～2倍体积有机溶剂提取；

3)干燥：有机溶剂分离得到的沉淀60℃干燥；

4)粉碎：所得干燥的威兰胶用粉碎机粉碎；

5)过筛：粉碎后的威兰胶过60～120目筛，即得不同规格的威兰胶产品；

步骤2)中所述的有机溶剂为乙醇、甲醇或异丙醇中的一种或几种。