CN107937307A - 一株细菌纤维素高产菌及其最优发酵条件 - Google Patents

一株细菌纤维素高产菌及其最优发酵条件 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细菌纤维素高产菌株，命名为Komagataeibacter rhaeticus TJPU03。该菌株由自然发酵过的腐败桔皮获得，为一株新的细菌纤维素菌株，其细菌纤维素产量(干重)可高达8.28g/L培养基，具有高产稳产的特点，在细菌纤维素生产产业具有广阔的应用前景。

Description

一株细菌纤维素高产菌及其最优发酵条件
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株来源于腐败水果残余中的细菌纤维素(BC)高产菌株的分离、鉴定及其生产细菌纤维素(BC)的最优条件。
背景技术
全球化石能源日益紧缺，可再生资源的开发利用越来越受到关注。纤维素是地球上最丰富，且具有可生物降解功能的一类生物大分子，其开发和应用已成为可再生能源的研究热点。目前天然纤维素可通过植物光合作用合成和微生物生物合成，植物纤维素往往伴生有木质素、半纤维素和果胶等杂质，在工业应用前需要进行预处理，这样不仅会造成对纤维素分子的破坏，而且会产生大量废水污染环境。而对于微生物合成的纤维素一细菌纤维素(BC)，以高纯度纳米级纤维素形式存在，应用前不需预处理，具有植物纤维素不可比拟的优越性，这使其在食品工业、生物医学、声学器材、造纸、环境等诸多领域存在广泛的应用，许多高附加值产品具有十分诱人的商业应用前景。
细菌纤维素(BC)性能优异，用途广泛，因此诸多领域对其有着海量的需求，但目前BC的生产存在菌种少、产量低、生产成本高等缺陷，以低成本方式筛选高产菌株，扩增生产BC的菌属，成为迫切需求，此举可从根本上改善BC供不应求的局面。为实现BC的工业化生产，首先需要筛选优良的菌种。截至到目前，研究报道自然界中产BC菌仅有少数几种，主要集中于醋酐菌属、土壤杆菌属、假胞杆菌属等微生物，其中醋杆菌中的木醋杆菌发现最早，研究较为彻底，是迄今为止合成纤维素能力最强的菌种，常用作纤维素基础性以及应用性研究的模式菌株。优良菌种的筛选，主要以自然界中的原材料为主进行分离。如马霞等以长膜的醋醅为材料分离纯化出一株醋化醋杆菌，结果显示该菌产量高且性能稳定。洪枫等以糖质原料、低值淀粉类原料和废弃纤维素类原料用于筛选产BC菌株的原料，杨光等以农林废弃物及副产物作为筛选产BC菌株的原料，均取得良好的研究成果。考虑到我国水果物产丰富，且水果的生产具有明显的季节性变化，容易发生水果大量腐败而丢弃处理的浪费现象，选取腐败水果作筛选产BC菌株的原料来源，成为深具潜力的发展趋势。这类研究既能充分利用废弃有机物质中所含的丰富的碳源等成分，又在一定程度上缓解由于大量弃埋所形成的固体有机污染物垃圾以及生产污水排放污染，充分体现绿色环保的可持续原则。目前关于BC高产菌株的筛选已基本以此绿色环保原则为指导，研究者们也进行着不懈的努力，但成功筛选出高产BC菌株的实例仍屈指可数，且生产成本仍居高不下，筛选高产BC菌株的方法还有待深入研究。
另一方面，培养基的组成、pH值、温度、溶氧等发酵条件以及发酵方式，对BC的发酵生产有很大影响，也是值得深入探讨的问题。产BC菌株的种类不同，所需的营养物质存在差异，而且培养基的组成对BC的产量有很大影响。国内外对此方面进行了大量的研究，Hestrin经过优化组合培养基成分以增加BC产量，确定了被广泛使用的基础培养基：葡萄糖2.0g/100mL、蛋白胨0.5g/100mL、酵母浸出液0.5g/100mL、磷酸氢二钠0.27g/100mL、柠檬酸0.11g/100mL、pH 6.0。后期人们针对不同菌株，对培养基的成分进行改良。目前较多的研究报道认为，果糖是生产BC的最佳碳源，其次是葡萄糖和蔗糖，山梨醇和甘露醇做碳源BC的产量也较高。但果糖较贵，葡萄糖和蔗糖作为碳源时会生成葡萄糖醛酸，降低了培养基的pH值，造成BC减产。为降低生产成本，有研究者采用工业废弃物，废棉织物处理液、酒糟浸出液等廉价物质代替培养基中的昂贵组分，这些原料虽然降低了成本，但增加了前期预处理和后期提纯难的弊端。还有研究采用产BC菌与乳酸菌共培养发酵、向培养基中加入乳酸或乙醇等增效因子，以提高BC产量。另外，适宜的温度、pH值、溶氧水平，对于不同的菌株存在不同的最优范围，并且不同的发酵方式影响着BC的结构、性质和产量。因此，扩增BC高产菌株，低成本高效生产BC是实现BC工业化生产的先决条件及当务之急。
发明内容
针对目前产BC菌株及BC生产现状及技术需求，本发明目的之一在于提供一株BC高产菌，该菌株分离于自然发酵的腐败桔皮，命名为Komagataeibacter rhaeticus TJPU03(K.rhaeticus TJPU03)，性状如说明书附图1所示，菌体为短杆状，单个或成对存在，具有明显的胞外多糖形成的荚膜，菌体大小在(1.82～2.5)×(0.78～0.95)μm之间，为革兰氏染色阴性菌株。通过16SrDNA测序并构建***发育树发现，该菌株与Komagataeibacterrhaeticus最为相似，相似度达到99.7％，因此我们把该菌株命名为K.rhaeticus TJPU03。K.rhaeticus TJPU03***发育树说明书附图2所示，图中Query为待测菌株。
本发明的目的之二在于提供一种所筛选K.rhaeticus TJPU03生产BC的最优工艺条件，其特征在于最优培养基组成为：葡萄糖35g/L、蛋白胨5.5g/L、酵母膏7g/L、磷酸氢二钠4g/L、柠檬酸1.4g/L；最优发酵条件为：10％的接种量，pH 3.5，32℃。最佳碳源为葡萄糖和蔗糖，最佳氮源为蛋白胨和酵母膏复合氮源。在最优条件下，BC产量(湿重)可高达63g/100mL培养基，而模型菌木醋杆菌的BC产量(湿重)为30g/mL培养基。
附图说明
图1是K.rhaeticus TJPU03和木葡糖酸醋杆菌(G.xylinum)的光学显微镜观察图。
图2是K.rhaeticus TJPU03的***发育树。
图3是K.rhaeticus TJPU03和木葡糖酸醋杆菌(G.xylinum)产BC的场发射扫描电镜图。
图4是K.rhaeticus TJPU03和木葡糖酸醋杆菌(G.xylinum)产BC的红外谱图。
具体实施方案
下面结合具体实施方式对本发明加以说明。
实施例1K.rhaeticus TJPU03的分离与纯化
将自然发酵过的腐败桔皮实验样品进行充分破碎等预处理后，称取10g用无菌水冲洗至小烧杯，充分搅拌确保其中的菌种全部溶解在水中，稀释过滤后接种至已灭菌处理的富集培养基中，30℃，150r/min振荡培养24h制得菌悬液。将菌悬液适度稀释后涂布在经过灭菌处理的、具有产酸菌筛选层的碳酸钙分离培养基上，150μL/板，在已除菌的超净台中30℃培养3～5d，挑取周边有透明区域的菌落反复划线纯化培养，得到产酸单菌落。每一株产酸菌接种至斜面保存培养基，置于-4℃冰箱中保存。使用时从冰箱中保存的斜面培养基接种菌株至新的已灭菌处理的斜面培养基，待菌落生长至茂盛，接种2～3环菌苔至已灭菌处理的种子活化液体培养基，30℃，130r/min振荡培养24h。将种子液接入已灭菌的HS发酵培养基，获得能够产生凝胶状BC膜的菌株。
实施例2K.rhaeticus TJPU03的鉴定
(1)形态学鉴定
菌体为短杆状，单个或成对存在，具有明显的胞外多糖形成的荚膜，菌体大小在(1.82～2.5)×(0.78～0.95)μm之间，革兰氏染色为阴性，如说明书附图1所示。
(2)分子鉴定
首先通过革兰氏染色方法确定该菌株为阴性菌，通过康维世纪公司的BacteriaGenomic DNA kit(Cat：CW05525)试剂盒提取其基因组DNA，然后用鉴定细菌的通用引物对1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)和27F8F(AGAGTTTGATCCTGGCTCA)基因组的16srDNA基因进行扩增。扩增用的是Takara公司的PrimeSTAR HS(Premix)高保真***(Cat：R040)。扩增体系为：PrimeSTAR HS(Premix，2X)25ul，1492R 0.5ul，27F8F 0.5ul，模板DNA 1ul，去离子水23ul。扩增条件为：98℃ 10s，60℃ 5s，72℃ 2min，30个循环。PCR产物经凝胶电泳，纯化并回收后送华大基因科技股份有限公司测序。***发育树说明书附图2所示。
实施例3利用K.rhaeticus TJPU03生产BC
将活化后的K.rhaeticus TJPU03，以10％的接种量，接种到已灭菌的装有100mL发酵培养基的250mL广口瓶中，发酵培养基组成为：葡萄糖35g/L、蛋白胨5.5g/L、酵母膏7g/L、磷酸氢二钠4g/L、柠檬酸1.4g/L、蒸馏水。调节pH至3.5，8层纱布封口后，于生化培养箱内30℃静置培养15d。待发酵结束后，生成的BC膜(K-BC)浮于发酵培养基液面。将BC膜取出，用蒸馏水振荡清洗数次后，用15％的NaOH溶液于80℃水浴中煮30min，去除产物中的多余培养基及菌体，之后再换用蒸馏水继续80℃水浴煮多次，待BC膜完全洗净至均一的乳白色凝胶状，取出用滤纸沥干水分，再将BC膜以8000r/min转速离心20min，然后称量得到湿重；将BC膜放在65℃烘箱中烘干至恒重，称量得其干重。K.rhaeticus TJPU03菌株发酵所得BC膜平均湿重为632.15g/L培养基，湿膜平均厚度为1.5cm，平均干重为8.28g/L。
实施例4利用木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)生产BC
采用实施例3相同的方法，以G.xylinum生产BC，所得BC膜(G-BC)平均湿重为242.62g/L培养基，湿膜平均厚度为1.0cm，平均干重为3.64g/L。通过场发射扫描电镜(FESEM)对K-BC和G-BC膜微观形貌进行了观察，如说明书附图3所示，可知K-BC膜比G-BC膜较疏松。通过红外光谱对K-BC和G-BC膜化学组成进行了分析，如说明书附图4所示，可知两者的化学组成相同，说明K.rhaeticus TJPU03的发酵产物确实为BC。

Claims (2)

1.一株细菌纤维素高产菌，其特征在于，该菌株命名为Komagataeibacter rhaeticusTJPU003。
2.根据权利要求1所述菌株，生产细菌纤维素的最优工艺条件，其特征在于最优培养基组成为：葡萄糖35g/L、蛋白胨5.5g/L、酵母膏7g/L、磷酸氢二钠4g/L、柠檬酸1.4g/L；最优发酵条件为：10％的接种量，pH 3.5，32℃；最佳碳源为葡萄糖和蔗糖，最佳氮源为蛋白胨和酵母膏复合氮源。
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