CN105505784A - 一种提高虫草素含量的蛹虫草培养基及生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高虫草素含量的蛹虫草培养基及生产方法，包括以下步骤：(1)母种制作；(2)液体菌种制作；(3)子实体培养。主要原料是：马铃薯、小米、大麦、黄豆粉、蔗糖、茧蛹粉、奶粉、红糖、蛋白胨及纯净水等。本发明在液体菌种培养基配方中添加了腺嘌呤，腺嘌呤与黄豆粉、蔗糖、茧蛹粉等营养物质协同互补，有效提高了虫草素的含量；选择小米和大麦作为子实体培养料，蛹虫草子实体中虫草素含量为8.0-8.5mg/g。且本发明的培养基成分容易得到，配制方便，成本低廉，实际应用操作简单，易于推广，适用于蛹虫草的规模化生产。

Description

一种提高虫草素含量的蛹虫草培养基及生产方法
技术领域
本发明涉及药用食用菌栽培领域，具体说是一种提高虫草素含量的蛹虫草培养基配方及生产方法。
背景技术
蛹虫草又名北冬虫夏草、北虫草，属于真菌门子囊菌纲肉座菌目麦角菌科虫草属，与冬虫夏草同属不同种，其化学成份和功效非常相似，其中含有虫草素、虫草多糖、虫草酸、腺苷等成份，具有增强免疫、调节内分泌、护肝保肺、增强性功能等营养保健功效和多种药用功效，可以作为冬虫夏草的替代品。
虫草素(Cordycepin)是蛹虫草产生的一种重要次生代谢产物，作为蛹虫草重要的生物活性成分，其化学结构为3′-脱氧腺苷，是由Cunningham(1951)首次从蛹虫草中发现的。由于虫草素具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等功效，市场需求越来越大，价格十分昂贵，国际市场上虫草素纯品的售价约高达2500美元/g。
目前，虫草素的化学合成存在诸多弊端，虫草素等核苷类物质的主要来源还是蛹虫草培养物，因此蛹虫草固体培养方法优化一直是蛹虫草研究中的热点。液体培养由于生产周期短、条件容易控制、虫草素易于提取且产量较稳定，是目前获取虫草素较为有效的培养方法。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种提高虫草素含量的蛹虫草培养基及生产方法，包括在液体培养基中添加前体物质-腺嘌呤和以小米、大麦为原料进行固体培养方法的优化。
本发明采用的技术方案是：一种提高虫草素含量的蛹虫草培养基，包括PDA加富培养基、液体菌种培养基和子实体培养基。
所述的PDA加富培养基组成为：马铃薯汁700-800ml、蔗糖18-22g，茧蛹汁200-300ml，奶粉90-100g，琼脂15-20g。
所述的液体菌种培养基组成为：茧蛹汁200-300ml，红糖10-15g，蛋白胨5-10g，黄豆汁200-300ml，纯净水400-600ml。腺嘌呤质量浓度0.8-1.0g/L。
所述的子实体培养基组成为：小米10-20g、大麦10-15g、液体菌种培养基35-45ml。
上述的一种提高虫草素含量的蛹虫草培养基，所述的马铃薯汁是将马铃薯加水煮熟，过滤取汁，按重量比，马铃薯:水＝1:5-8。
上述的一种提高虫草素含量的蛹虫草培养基，所述的茧蛹汁是将茧蛹粉加水煮沸20-40min，过滤取汁，按重量比，茧蛹粉:水＝1:8-10。
上述的一种提高虫草素含量的蛹虫草培养基，所述的黄豆汁是将黄豆粉加水煮沸20-40min，过滤取汁，按重量比，黄豆粉:水＝1:5-8。
上述的一种提高虫草素含量的蛹虫草培养基，所述的液体菌种培养基中，腺嘌呤的加入方法为，先将茧蛹汁、红糖、蛋白胨、黄豆汁和纯净水混合后，高压灭菌，以0.20um微滤膜除去杂菌后加入腺嘌呤，调至质量浓度0.8-1.0g/L。
上述的一种提高虫草素含量的蛹虫草培养基在培养蛹虫草中的应用。方法如下：
1)母种制作：将蛹虫草菌种，在无菌条件下接种于PDA加富培养基中，置23℃恒温避光培养，待菌丝萌发后见光培养，获得原始母种。
2)液体菌种制作：取原始母种接种于液体菌种培养基中，23℃摇床培养3-5d，得液体菌种。
3)子实体培养：将子实体培养基用聚丙烯薄膜封口，于121℃-126℃蒸汽灭菌，维持40min-60min，按2-5％接种量将液体菌种接种于灭菌后的子实体培养基中培养。
4)栽培管理：菌丝生长阶段要求避光培养；当菌丝完全吃透培养料后，于光强为50-100lx，温度15-25℃，空间湿度为70％-75％下，进行弱光培养；子实体形成后，经8-12℃温差刺激，加强通风，每天通风2次-3次，每次30min，于光强为200-500lx，温度16-20℃，空间湿度85％-95％下，培养40d-50d。
本发明所具有的优点：
1.本发明在液体培养基中添加前体物质-腺嘌呤，能迅速地运送到细胞中，有效的被蛹虫草吸收与利用，与黄豆粉、蔗糖、茧蛹粉等营养物质能够通过协同互补作用，有效地提高虫草素含量。
2.本发明以小米、大麦为原料进行固体培养方法优化。小米营养丰富，成本比大米低，但颗粒小，高压蒸煮后粘度高，阻碍菌丝生长。大麦颗粒大，通透性强，与小米混合使用，克服了小米粘度高的缺点，而且大麦中脂肪酸含量较高，国外大量文献报道了植物油能促进菌丝的生长，提高虫草素的含量。
3.本发明的蛹虫草生物转化率比使用现有普通培养基及现有技术培养方法增加25％；每1g蛹虫草子实体中虫草素含量为8.0-8.5mg、腺苷含量为17-21mg，明显高于使用现有技术方法所培养得到的蛹虫草。
4.本发明的培养基成分容易得到，配制方便，成本低廉，实际应用操作简单，易于推广，适用于辽宁省蛹虫草的规模化生产。
具体实施方式
实施例1：一种提高虫草素含量的蛹虫草生产方法
1.蛹虫草栽培区要求
直接与常规农田毗邻的食用菌栽培区必须设置大于30m的缓冲带，以避免禁用物质的影响。在培养场地和周围禁止使用化学合成农药。水源应符合GB5749的要求。
2.栽培基质：应采用有机生产或天然材料的基质。
3.母种制作：将蛹虫草菌种，在无菌条件下接种于PDA加富培养基中，置23℃恒温避光培养，待菌丝萌发后见光培养，选择菌丝生长整齐，健壮，见光后转色快，在显微镜下观察，菌丝粗壮、挺立的菌株为原始母种。
PDA加富培养基配方：马铃薯汁700ml、蔗糖18g，茧蛹汁300ml，奶粉90g，琼脂15g。
所述的马铃薯汁是：将马铃薯煮至酥而不烂，过滤取汁，按重量比，马铃薯:水＝1:5。
所述的茧蛹汁是：将茧蛹粉加水煮沸30min，过滤取汁，按重量比，茧蛹粉:水＝1:8。
4.液体菌种制作：取1块8-10mm2大小的原始母钟接种于装有150ml液体菌种培养基的三角瓶(250ml)中，23℃摇床培养(150r/min)3-5d终止培养。从培养第2d开始进行逐瓶目查，发现有菌液浑浊、菌丝迟迟不长或出现异味的即为污染菌瓶，随后在培养中期要抽样做平板培养和显微镜检查，以便及时发现有无细菌和霉菌的污染，保证菌种质量。
所述的液体菌种培养基组成为：茧蛹汁200ml，红糖10g，蛋白胨5g，黄豆汁300ml，腺嘌呤质量浓度0.8g/L，纯净水500ml。
所述的茧蛹汁是，将茧蛹粉加水，煮沸30min，过滤取汁，按重量比，茧蛹粉:水＝1:8。
所述的黄豆汁是，将黄豆粉加水，煮沸30min，过滤取汁，按重量比，黄豆粉:水＝1:5。
腺嘌呤的加入方法为，先将茧蛹汁、红糖、蛋白胨、黄豆汁和纯净水混合后，高压灭菌，以0.20um微滤膜除去杂菌后加入腺嘌呤，调至质量浓度0.8g/L。
5.子实体培养：将子实体培养基用聚丙烯薄膜封口灭菌。采用121℃-126℃高压蒸汽灭菌，维持时间40min-60min，冷却，按2％接种量将液体菌种接种于灭菌后的子实体培养基中培养。
所述的子实体培养基组成为：小米10g，大麦10g，步骤4)制得的液体菌种培养基35ml。
6.栽培管理：菌丝生长阶段要求避光培养，当菌丝完全吃透培养料后弱光培养，光强为50-100lx，温度15-25℃，空间湿度为70％-75％；子实体形成后，需经10℃左右温差刺激，加强通风，每天通风2次-3次，每次30min。光强为200-500lx，温度16-20℃，空间湿度85％-95％，培养40d-50d子实体成熟采摘，烘干待用。
实施例2：一种提高虫草素含量的蛹虫草生产方法
1.蛹虫草栽培区要求
直接与常规农田毗邻的食用菌栽培区必须设置大于30m的缓冲带，以避免禁用物质的影响。在培养场地和周围禁止使用化学合成农药。水源应符合GB5749的要求。
2.栽培基质：应采用有机生产或天然材料的基质。
3.母种制作：将蛹虫草菌种，在无菌条件下接种于PDA加富培养基中，置23℃恒温避光培养，待菌丝萌发后见光培养，选择菌丝生长整齐，健壮，见光后转色快，在显微镜下观察，菌丝粗壮、挺立的菌株为原始母种。
PDA加富培养基配方：马铃薯汁800ml、蔗糖22g，茧蛹汁200ml，奶粉100g，琼脂20g。
所述的马铃薯汁是，将马铃薯加水，煮沸30min，过滤取汁，按重量比，马铃薯:水＝1:8。
所述的茧蛹汁是，将茧蛹粉加水，煮沸30min，过滤取汁，按重量比，茧蛹粉:水＝1:10。
4.液体菌种制作：取1块8-10mm2大小的原始母钟接种于装有150ml液体菌种培养基的三角瓶(250ml)中，23℃摇床培养(150r/min)3-5d终止培养。从培养第2d开始进行逐瓶目查，发现有菌液浑浊、菌丝迟迟不长或出现异味的即为污染菌瓶，随后在培养中期要抽样做平板培养和显微镜检查，以便及时发现有无细菌和霉菌的污染，保证菌种质量。所述的液体菌种培养基组成为：茧蛹汁300ml，红糖15g，蛋白胨10g，黄豆汁250ml，腺嘌呤质量浓度1.0g/L，纯净水450ml。
所述的茧蛹汁是，将茧蛹粉加水，煮沸30min，过滤取汁，按重量比，茧蛹粉:水＝1:10。
所述的黄豆汁是，将黄豆粉加水，煮沸30min，过滤取汁，按重量比，黄豆粉:水＝1:8。
腺嘌呤的加入方法为，先将茧蛹汁、红糖、蛋白胨、黄豆汁和纯净水混合后，高压灭菌，以0.20um微滤膜除去杂菌后加入腺嘌呤，调至质量浓度0.8g/L。
5.子实体培养：将子实体培养基用聚丙烯薄膜封口灭菌。采用121℃-126℃高压蒸汽灭菌，维持时间40min-60min，按2％接种量将液体菌种接种于灭菌后的子实体培养基中培养。
所述的子实体培养基组成为：小米20g，大麦15g，步骤4)制得的液体菌种培养基45ml。
6.栽培管理：菌丝生长阶段要求避光培养，当菌丝完全吃透培养料后弱光培养，光强为50-100lx，温度15-25℃，空间湿度为70％-75％；子实体形成后，需经10℃左右温差刺激，加强通风，每天通风2次-3次，每次30min。光强为200-500lx，温度16-20℃，空间湿度85％-95％，培养40d-50d子实体成熟采摘，烘干待用。
实施例3对比例
1)母种制作：PDA培养基：马铃薯汁(将200g马铃薯加1000g水加热煮熟过滤取汁)，葡萄糖20g，蛋白胨3g，MgSO41.5g，KH2PO43g，琼脂15g，纯净水1000ml。将蛹虫草菌种，在无菌条件下接种于PDA培养基中，置23℃恒温避光培养，待菌丝萌发后见光培养。选择菌丝生长整齐，健壮，见光后转色快，在显微镜下观察，菌丝粗壮、挺立的菌株为原始母种。
2)液体菌种制作：液体培养基：马铃薯汁(将200g马铃薯加1000g水加热煮熟过滤取汁)，红糖20g，蛋白胨3g，MgSO41.5g，KH2PO43g，纯净水1000ml。取1块8-10mm2大小的原始母种接种于装有150ml液体培养基三角瓶(250ml)中，23℃摇床培养(150r/min)3-5d终止培养。从培养第2d开始进行逐瓶目查，发现有菌液浑浊、菌丝迟迟不长或出现异味的即为污染菌瓶，随后在培养中期要抽样做平板培养和显微镜检查，以便及时发现有无细菌和霉菌的污染，保证菌种质量。
3)子实体培养：每瓶(750ml罐头瓶)加入小麦10g，步骤2)制得的液体培养基35ml，用聚丙烯薄膜封口灭菌。采用高压蒸汽灭菌121℃-126℃，维持时间40min-60min，按2％接种量将液体菌种接种于灭菌后的子实体培养基中培养。
4)栽培管理：菌丝生长阶段要求避光培养，当菌丝完全吃透培养料后弱光培养，光强为50-100lx，温度15-25℃，空间湿度为70％-75％；子实体形成后，需经10℃左右温差刺激，加强通风，每天通风2次-3次，每次30min。光强为200-500lx，温度16-20℃，空间湿度85％-95％，培养40d-50d子实体成熟采摘，烘干待用。
结果与分析
表1
虫草素(mg/g) 虫草腺苷(mg/g) 生物转化率(％)
实施例1 8.2 21 150
实施例2 8.4 19 148
对比例 2.1 7 120
由表1可以看出，采用本发明的培养基配方培养出的蛹虫草，其虫草素、虫草腺苷含量明显高于普通培养基，生物转化率也增加25％。

Claims (7)

1.一种提高虫草素含量的蛹虫草培养基，其特征在于包括PDA加富培养基、液体菌种培养基和子实体培养基；
所述的PDA加富培养基组成为：马铃薯汁700-800ml、蔗糖18-22g，茧蛹汁200-300ml，奶粉90-100g，琼脂15-20g；
所述的液体菌种培养基组成为：茧蛹汁200-300ml，红糖10-15g，蛋白胨5-10g，黄豆汁200-300ml，纯净水400-600ml，腺嘌呤质量浓度0.8-1.0g/L；
所述的子实体培养基组成为：小米10-20g、大麦10-15g、液体菌种培养基35-45ml。
2.根据权利要求1所述的一种提高虫草素含量的蛹虫草培养基，其特征在于：所述的马铃薯汁是将马铃薯加水煮熟，过滤取汁，按重量比，马铃薯:水＝1:5-8。
3.根据权利要求1所述的一种提高虫草素含量的蛹虫草培养基，其特征在于：所述的茧蛹汁是将茧蛹粉加水煮沸20-40min，过滤取汁，按重量比，茧蛹粉:水＝1:8-10。
4.根据权利要求1所述的一种提高虫草素含量的蛹虫草培养基，其特征在于：所述的黄豆汁是将黄豆粉加水煮沸20-40min，过滤取汁，按重量比，黄豆粉:水＝1:5-8。
5.根据权利要求1所述的一种提高虫草素含量的蛹虫草培养基，其特征在于：所述的液体菌种培养基中，腺嘌呤的加入方法为，先将茧蛹汁、红糖、蛋白胨、黄豆汁和纯净水混合后，121℃-126℃高压灭菌，以0.20um微滤膜除去杂质后加入腺嘌呤，调至质量浓度0.8-1.0g/L。
6.权利要求1-5任一所述的一种提高虫草素含量的蛹虫草培养基在生产蛹虫草中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于方法如下：
1)母种制作：将蛹虫草菌种，在无菌条件下接种于PDA加富培养基中，置23℃恒温避光培养，待菌丝萌发后见光培养，获得原始母种；
2)液体菌种制作：取原始母种接种于液体菌种培养基中，23℃摇床培养3-5d，得液体菌种；
3)子实体培养：将子实体培养基用聚丙烯薄膜封口，于121℃-126℃蒸汽灭菌，维持40min-60min，按2-5％接种量将液体菌种接种于灭菌后的子实体培养基中培养；
4)栽培管理：菌丝生长阶段要求避光培养；当菌丝完全吃透培养料后，于光强为50-100lx，温度15-25℃，空间湿度为70％-75％下，进行弱光培养；子实体形成后，经8-12℃温差刺激，加强通风，每天通风2次-3次，每次30min，于光强为200-500lx，温度16-20℃，空间湿度85％-95％下，培养40d-50d。
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