CN114437207A

CN114437207A - 具有中和活性的人源性抗汉滩病毒（HTNV）Fab抗体及应用

Info

Publication number: CN114437207A
Application number: CN202210020162.6A
Authority: CN
Inventors: 陈丽华; 李卓; 张宇丝; 侯永利; 马樱; 唐康; 方亮; 傅昭粤; 连建奇
Original assignee: Air Force Medical University of PLA
Current assignee: Air Force Medical University of PLA
Priority date: 2022-01-10
Filing date: 2022-01-10
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2042-01-10
Also published as: CN114437207B

Abstract

一种具有中和活性的人源性抗汉滩病毒（HTNV）Fab抗体及应用，包括轻链和重链可变区和一个恒定区，用体外致敏法、EBV转化技术结合噬菌体展示技术建立人源性抗HTNVFab噬菌体抗体库，从中筛选出高亲和力并且具有中和活性的抗HTNVFab抗体四‑19。克隆该单克隆抗体轻链和重链可变区基因，获得该Fab抗体轻链和重链可变区基因序列和氨基酸序列，确认这些基因序列与蛋白序列的惟一性。可变区的氨基酸序列以及编码这些可变区的基因序列在后续构建用于HFRS的紧急预防和特异性治疗的高亲和力高中和活性的人源性抗体或疫苗方面有重要的潜在应用价值。

Description

具有中和活性的人源性抗汉滩病毒(HTNV)Fab抗体及应用

技术领域

本发明属于抗病毒感染技术领域，涉及一种抗汉滩病毒(HTNV)Fab抗体，具体涉及一种具有中和活性的人源性抗汉滩病毒(HTNV)Fab抗体及应用，以及具有中和活性的人源性抗HTNVFab抗体(四-19)的轻链和重链可变区。

背景技术

汉坦病毒感染引起的疾病在全球大部分地区均有发生，在我国主要流行的是由隶属于汉坦病毒属的汉滩病毒(HTNV)感染引起的肾综合征出血热(HFRS)，对于HFRS的预防，除了做好疫情监测，监测鼠密度，鼠带病毒率和易感人群，防鼠、灭鼠，控制传染源，切断传播途径，还要对易感人群接种HFRS疫苗。目前主要采用的是双价HTNV灭活疫苗。调查显示，基础免疫后，疫苗接种者血清抗体阳性率和水平均明显增高，说明产生了较好的免疫应答，但一年后，阳性率迅速降低，通过加强免疫，阳性率又得以回升。然而，虽然疫苗可起到较好的保护作用，但是由于疫苗加强针接种率低。HFRS患者以发热、出血、急性肾功能损伤为主要症状，目前尚无特异性药物治疗，通常采用对症治疗和并发症治疗，除了支持疗法，也在尝试针对HTNV感染特异的治疗方法。如Ⅲ期临床试验显示，由鼠源性中和抗体3D8和3G1组成的HFRS治疗性单抗具有显著的疗效。

虽然目前鼠源性抗体已广泛用于HFRS相关领域，如疾病诊断、病原学研究、流行病学调查及疾病治疗的初步尝试等。然而，临床实践显示，鼠源性单抗用于人体疾病治疗时受到很大的限制，来源于鼠的抗体对人有较强的免疫原性，导致人抗鼠抗体(humananti-mouseantibody，HAMA)应答，引起严重的***反应，缩短治疗性单抗半衰期，使其疗效减弱，甚至可能危及患者的生命，限制了其临床应用。因此，制备人源性的单克隆抗体用于HFRS的紧急预防和治疗显得尤为重要。

抗体的重链(H链)和轻链(L链)包括氨基端(N)和羧基端(C)，靠近N端的可变区(V区)由高变区/互补决定区(HVR/CDR)和骨架区(FR)组成；靠近C端为恒定区(C区)。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)形成的蛋白质折叠是抗原结合部位，其中的CDR/HVR是抗体与抗原决定基互补结合的部位。抗体Fab段是由VL、CL和VH、CH结构域组成，只与单个抗原表位结合。抗体Fc段由CH结构域组成，与其他淋巴细胞表面Fc受体结合可引起相应的生物学效应。全人抗体因含有Fc段，可通过Fc段与细胞表面的Fc受体的结合，使病毒在细胞表面聚集，引起抗体依赖的增强效应(antibody dependent enhancement,ADE)，增强病毒对细胞的感染能力。目前，已建立多种方法生产小分子人源性抗体，其中用于人源性HTNV抗体制备的技术主要是噬菌体抗体库技术、转基因小鼠技术和单细胞PCR技术。噬菌体展示技术具有高特异性、高亲和性的特点，弥补了传统单克隆抗体制备繁琐、抗原性强、穿透力弱的缺点。并且噬菌体抗体库技术可在较短时间内可筛选出满足不同需要的抗体，但是由于库容量有限，筛选出的抗体亲和力多为中等强度。

因此，本发明通过构建大库容的抗HTNV噬菌体抗体库，筛选出具有中和活性的针对HTNV的人源性Fab抗体，具有分子量较小、穿透性强、易于到达病灶、免疫原性低和生产成本低等优点，在抗体治疗中具有不可替代的优势。本发明也为下一步筛选高亲和力的人源治疗性Fab抗体打下基础。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种具有中和活性的人源性抗汉滩病毒(HTNV)Fab抗体及应用，通过噬菌体表面呈现技术建立大容量且具有潜在中和活性的HTNV噬菌体Fab抗体库，获得一种针对HTNV的具有中和活性的人源性Fab抗体，包括其核苷酸和氨基酸序列，为下一步应用该人源性抗体进行HFRS的紧急预防和特异性治疗提供支持。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种具有中和活性的人源性抗汉滩病毒(HTNV)Fab抗体，其特征在于，包括轻链和重链可变区和一个恒定区；

所述轻链的可变区的3个互补决定区(CDR)序列为：

CDR1:Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr；

CDR2:Asp-Ala-Ser；

CDR3:Gln-Gln-Ser-Tyr-Ile-Thr-Pro-Gln-Arg-Thr；

所述重链的可变区的3个互补决定区(CDR)序列为：

CDR1:Val-Gly-Pro-Phe-His-Trp-Ser-Thr-Thr；

CDR2:Ile-Ser-His-Gly-Gly-Ser-Thr；

CDR3:Ala-Ser-Arg-Asp-Ser-Ser-Gly-Tyr-Tyr-Ala-Gln-Val-Gln-Asp-Ala-Phe-Asp-Phe。

所述的Fab抗体轻链可变区基因的序列如核苷酸序列表中SEQIDNO.1所示。

所述的Fab抗体重链可变区基因的序列如核苷酸序列表中SEQIDNO.2所示。

所述的编码Fab抗体轻链可变区的氨基酸序列如核苷酸序列表中SEQIDNO.3所示。

所述的编码Fab抗体重链可变区的氨基酸序列如核苷酸序列表中SEQIDNO.4所示。

一种具有中和活性的人源性抗汉滩病毒(HTNV)Fab抗体在治疗抗HTNV感染或设计HFRS疫苗的应用。

本发明的有益效果是，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明所述的抗HTNV人源性Fab抗体被命名为四-19，该抗体是具有高度特异性的抗HTNV人源性Fab抗体；经过间接ELISA检测证实Fab抗体四-19具有高效价，与HTNV-Ag能够特异性的结合。

2、本发明所述的抗HTNV人源性Fab抗体具有中和活性，经过微量中和实验检测了四-19Fab抗体对HTNV76-118株的中和活性，结果显示5μg四-19Fab抗体能够中和大约50％的HTNV，与其他同批筛出的Fab抗体兼具更好的特异性和中和活性。

3、本发明克隆了Fab抗体四-19的轻链、重链可变区基因和氨基酸序列，序列分析证实了该抗体序列的惟一性。

4、分别分析并获得了轻链和重链可变区的CDR，为后续改造该人源性Fab抗体或构建高亲和力的抗HTNV人源化基因工程抗体打下基础。

附图说明

图1为用间接ELISA检测四-19Fab抗体与HTNV-Ag的反应的图，其中以抗体稀释液作为阴性对照，以HTNV抗体阳性的恢复期患者血清作为阳性对照；

图2为用微量中和实验检测四-19Fab抗体对HTNV76-118株中和活性的图。

图3为四-19Fab抗体轻链CDR区：

图4为四-19Fab抗体重链CDR区：

图5为四-19Fab抗体轻链可变区核酸序列：

图6为四-19Fab抗体轻链可变区氨基酸序列：

图7为四-19Fab抗体重链可变区的核酸序列：

图8为三-12Fab抗体重链可变区氨基酸序列。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进一步叙述，但本发明不局限于以下实施例。

实施例1

一种人源性抗汉滩病毒(HTNV)Fab抗体，用体外致敏法、EBV转化技术结合噬菌体展示技术建立人源性抗HTNVFab噬菌体抗体库，从中筛选出高亲和力并且具有中和活性的抗HTNVFab抗体四-19；并确认该基因序列和相应蛋白序列的惟一性及其CDR序列；在后续进行HFRS的紧急预防和特异性治疗提供支持。下面结合具体潜在中和活性的HTNVFab噬菌体抗体库的构建方法、抗体特异性筛选、抗体中和活性筛选以及四-19Fab抗体序列的检测和唯一性的确定，以及结合图1、图2对本发明做详细说明。

1具有潜在中和活性的HTNVFab噬菌体抗体库的构建

1.1、提取中和抗体阳性BLCLs的RNA并合成cDNA；

收集中和抗体阳性的BLCLs约1×10⁸个，加入RNAisoPlus1ml，吹匀。加入氯仿200μl，剧烈震荡1min后，在室温静置10min。4℃，12000rpm离心15min。离心后被混合液自上而下分为三层：无色的水相、白色中间层和红色下层；将水相吸入无RNase的EP管中，缓慢注入500μl的异丙醇，室温静置10min，4℃，12000rpm离心10分钟。离心后，在管底和侧壁上可见RNA白色沉淀；弃去异丙醇，然后缓慢加入1ml用DEPC水配制的75％的乙醇，轻轻振荡后，4℃，12000rpm离心10min，弃去乙醇，可见白色沉淀。倒置于无菌滤纸上干燥15min，加入10～20μlDEPC水溶解，用Takara公司的PrimeScriptTMII1stStrandcDNASynthesisKit(CodeNo.6210A)逆转录得到cDNA第一链。

1.2、PCR扩增VH、VL、CH1及CL基因，连接成Fab基因；

引物由弘业新创抗体技术股份有限公司提供，如下表:

以cDNA为模板，第一轮PCR，扩增VH、VL，反应体系如下表：

94℃for3min；94℃for30s，55℃for30s，72℃for30s，30rounds；72℃for10min；1.5％AgaroseGel电泳。

通过PCR，将VH、VL、CH1及CL基因连接成Fab基因，反应体系如下表：

94℃for3min；94℃for30s，55℃for30s，72℃for60s，20rounds；72℃for10min；1％Agarosegel电泳，应用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0(CodeNo.9762)对PCR产物进行胶回收。HindIII和NotI酶切pHIAT-3噬菌粒载体，并将Fab基因与pHIAT-3噬菌粒载体连接，16℃，16h。连接产物用酚/氯仿抽提、乙醇沉淀后，溶于20μlddH₂O中。

1.3、制备E.coliTG1电转感受态细胞；

挑取E.coliTG1单菌落接种于5ml2×YT液体培养基中，在37℃下振荡培养直至对数生长期；以1:100的比例将该菌悬液接种于500ml2×YT液体培养基中，37℃摇床振荡培养2～3h至OD600≈0.5，然后将培养液转入离心管，于冰上放置10min，然后在4℃，4000g离心15min；弃去上清液，加入250ml预冷的含有10％甘油的去离子水进行悬浮，然后4℃，4000rpm离心15min；弃去上清液，分别用100ml、50ml预冷的含有10％甘油的去离子水悬浮细胞，然后4℃，4000rpm离心15min；最后，用2ml预冷的10％甘油的去离子水溶解菌体沉淀，感受态细胞分装成每份50μl，贮存于-70℃。

1.4、大肠杆菌的电转化及库容量测定；

先将电击杯及杯架放于冰上冷却，然后进行仪器参数设置，电压V＝l.8kV，脉冲控制单位设定为200Ω；在冷却的1.5mlEP管中加入50μl感受态细胞悬浮液和1～5μl乙醇沉淀纯化后的上述连接产物，轻轻混匀后冰浴约10min；将细胞与DNA的混合液转移到冷的电击杯底部，冰浴约10min；施加一个脉冲，5～6s，立即将37℃预热的1ml2×YTG培养基加至电击杯中。重新悬浮细胞转移到聚丙烯管中，在摇床中于37℃，220rpm，培养lh；取少许转化菌连续稀释后接种LBAG琼脂平板，待长出菌落后进行计数，测定原始库库容；剩余菌液涂于LBAG琼脂平板上，置于培养箱30℃培养24h，收集细菌集落，加终浓度15％的甘油于-70℃保存。随机选取40个克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

2抗HTNVFab噬菌体抗体库的富集筛选；

2.1、Fab噬菌体抗体的制备；

用2×YT-AG培养基将1ml噬菌体抗体库菌液稀释至OD600＝0.3，37℃摇床220r/min培养至OD600＝0.5；按照细菌数/辅助噬菌体数＝1/20的比例，加入辅助噬菌体M13KO7感染，通常1OD600nm细菌培养液约相当8×10⁸个细菌，37℃150r/min轻摇lh；经4℃5000rpm离心10min后，弃去上清，加入50ml2×YT-AK培养基重悬菌体，37℃，220r/min过夜培养；经4℃5000rpm离心20min后，将上清转移至新的离心管中，上清含有扩建的原始Fab噬菌体表面展示文库；上清中加入l/5体积的PEG/NaCl，混匀后，冰浴lh以上，在4℃下10000rpm离心20min，弃上清，用5ml1×PBS重悬Fab噬菌体展示文库；Fab噬菌体展示文库经梯度稀释后，取10μl加入到100μl处于对数生长期(OD600nm为0.4～0.6)的E.coliTG1菌液中，37℃150r/min摇动20min后铺LB-AG平板，于37℃培养过夜，计算菌落形成单位(cfu)，即为原始噬菌体展示库的滴度。

2.2、抗HTNVFab噬菌体抗体的筛选；

用0.1mol/LPH8.6碳酸钠-碳酸氢钠溶液将原TCID₅₀＝10-7的灭活HTNV1:10稀包被96孔酶标板，每孔55μl，4℃孵育过夜；1×PBS洗板3次，每孔加入200μl3％BSA-PBS进行封闭，37℃lh，弃封闭液；每孔加入55μl噬菌体抗体库溶液，在37℃孵育2h；用含Tween-20的PBS洗板，进行第一轮筛选时，洗5遍，进行第二轮筛选时，洗10遍，进行第三轮筛选时，洗15遍，拍干；每孔加入蒸馏水再洗两遍，吸净孔中的液体；每孔加入50μlpH2.2甘氨酸-盐酸洗脱缓冲液，于室温孵育10min；每孔加入3μl2mol/LTris碱，中和洗脱下来的噬菌体溶液；将洗脱下来的噬菌体溶液加入到2ml新培养的A600≈1的E.coliTG1中，置于室温孵育15～20min；向菌液中加入10ml2×YT-A(20μg/mL氨苄青霉素)培养液，混匀后，分别取10μl、1μl、0.1μl涂LB-A平皿，37℃孵育过夜，计算洗脱下来的噬菌体滴度，剩余菌液于37℃振荡培养lh；加入100ml2×YT-A(100μg/mL氨苄青霉素)培养液，37℃振荡培养lh；加入1012pfu的辅助噬菌体M13K07感染，37℃振荡培养2h；。加入70μg/mL卡那霉素，37℃振荡培养过夜；4℃5000rpm离心15min；将上清置另一无菌三角瓶，加入l/5体积的PEG/NaCl，冰浴lh以上；4℃10000rpm离心20min，2mlPBS重悬，过滤除菌后用于下一轮筛选或储存于-20℃；按照以上步骤筛选4轮。取3、4轮富集筛选后洗脱下来的噬菌体用于分析鉴定，还可感染E.coliTG1，保存37℃过夜培养后的单个菌落或用于鉴定。

2.3、单克隆Phage-Ab的制备；

从2.2第3、4轮筛选的板子上挑选50个克隆分别于装有200μl2YTGA的1.5mlEP管中，37℃振摇过夜；次日1:100转接于新的200μl2YTGA中，37℃振摇2.5h(0D600≈0.5)；以细菌数/M13K07＝1:20的比例感染，3500rpm离心20min，用200μl2YTGAK重悬细菌沉淀，振摇过夜；次日，10000rpm离心15min，取上清进行鉴定。

2.4、Phage-ELISA检测特异性HTNVFab噬菌体抗体；

每孔包被50μl1:100稀释的原TCID₅₀＝10-7的灭活HTNV，4℃过夜；用去离子水冲洗每孔20秒，洗2次，用5％脱脂奶粉-PBS150μl封闭37℃lh；用5％脱脂奶粉-PBS对噬菌体进行3倍稀释，每孔准备55μl，孵育5min～lh，RT；将封闭液倒出，洗板10次，拍干；

5)用5％脱脂奶粉-PBS1：1000稀释HRP标记的鼠源性抗噬菌体M13二抗，按每孔55μl准备；每孔加入50μl稀释的二抗，37℃，lh；洗板10次，每孔加入HRP底物50μl，显色后，2M硫酸作终止液，50μl/孔，终止显色反应，静置片刻后酶标分析仪450nm下读取OD值；实验用辅助噬菌体M13K07做为阴性对照，以P/N≥2.1为阳性阈值。

3.人源性抗HTNV可溶性Fab抗体的制备及鉴定；

3.1、阳性克隆噬菌体感染E.coliHB2151菌；

取E.coliHB2151菌株少许接种于5ml2×YT培养液中，37℃，250rpm振摇培养过夜；阳性克隆的噬菌体培养上清各2μL分别放入400μl对数生长期的HB2151菌液中，37℃，150rpm振摇培养30min；接种环取菌液分别接种于LB-A平板上，30℃孵育过夜，长出的菌落4℃保存，同时用处于对数生长期TG1、HB2151和重组噬菌体作对照。

3.2、HTNVFab噬菌体抗体的可溶性表达；

将生长分离良好的单菌落接种于10ml2×YT-AG培养液中，置摇床中在30℃下250rpm振荡培养过夜；吸取5ml过夜菌接种于500ml2×YT-AG培养液中，30℃，250rpm振荡培养至OD600nm≈0.5～0.8；观察不同浓度IPTG对Fab表达的影响，各取50ml菌液，分别加入终浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0及1.2mmol/LIPTG，30℃，250rpm振荡培养过夜。E.coliHB2151空菌作同步对照；4℃，8000rpm，10min离心，留取细菌沉淀，沉淀用终浓度为0.5mU多粘菌素B裂菌获取胞周质中的抗体。细菌胞周质提取物用0.45μm滤膜过滤后，4℃存放或用于检测和纯化；取等体积样本进行SDS-PAGE电泳，经ImageLab软件分析，比较目的蛋白表达量，确定最佳表达条件。

3.3、可溶性Fab抗体的间接ELISA分析；

用pH8.60.05M的碳酸盐溶液作为包被缓冲液，将TCID₅₀为10^-7的HTNV56℃30mim灭活后作为抗原，用包被缓冲液进行1:100稀释，包被酶标反应板，100μl/孔，4℃冰箱过夜；PBST洗涤液洗涤3次，拍干；用含3％BSA的1×PBS溶液封闭，200μl/孔，于37℃恒温封闭lh；PBST洗涤液洗涤3次，拍干；细菌裂解液和沉淀用PBS1:5稀释，将细菌培养上清、稀释的胞周质液和沉淀加入酶标板，100μl/孔，37℃作用lh，阴性对照为E.coli.HB2151空菌样品；PBST洗板3次，拍干；加入含3％BSA的1×PBS溶液1:4000稀释的HRP标记的抗人Fab抗体的二抗，100μL/孔，37℃作用lh；PBST洗涤液洗涤5次，拍干；加TMB显色液，100μL/孔，37℃恒温培育5～10min；2M硫酸作终止液，50μl/孔，终止显色反应，静置片刻后酶标分析仪450nm下读取OD值，以P/N≥2.1判为阳性。

3.4、可溶性Fab抗体的纯化；

对阳性克隆进行摇瓶发酵，IPTG诱导后留取细菌沉淀，沉淀用多粘菌素B裂菌法获取细菌胞周质中的抗体，用0.45nm滤膜后，4℃存放或立即进行下一步纯化。纯化方法参考常州天地人和生物科技有限公司HisPurNiNTAkit产品说明进行。纯化后用Miliipore10KD膜的超滤离心管超滤浓缩收集的液体，5000rpm，15min，4℃离心浓缩，用1×PBS进行缓冲液置换。用BCA法测定Fab纯化后的蛋白质浓度。

3.5、微量病毒中和实验检测Fab抗体对HTNV的中和活性；

用10％1640作为培养基，在96孔板中接种Vero-E6细胞，长成单层；将来自不同克隆的表达纯化的Fab抗体及对照分别与100TCID₅₀的汉滩病毒进行1:1混合，37℃孵育1.5h；同时以中和抗体3D8作为阳性对照，以1640稀释的汉滩病毒作为病毒对照，设细胞对照；以上混合物以每孔100μl加入板中，每个稀释度4孔，37℃孵育1.5h；弃去混合液，每孔加2％1640培养基培养10～14天，每隔3～4天换液一次；反复冻融3次；将单克隆抗体1A81:1000稀释，用pH8.60.05M的碳酸盐溶液作为包被缓冲液包被96孔板，每孔100μl，4℃过夜；PBST洗涤液洗涤3次，拍干；封闭液(含3％BSA的PBS溶液)200μl/孔，于37℃恒温孵育l.5h；PBST洗涤液洗涤3次，拍干；将冻融液加入酶标板，100μl/孔，37℃孵育lh；PBST洗涤液洗涤3次，拍干；每孔加入1:5000稀释的HRP-1A8100μl，37℃孵育lh；PBST洗涤液洗涤3次，拍干；加TMB显色液，100μl/孔，37℃恒温培育5～10min；2M硫酸终止反应，50μl/孔，静置片刻后，酶标分析仪450nm下读取OD值；能阻止50％细胞感染HTNV的Fab抗体被认为病毒中和实验阳性，抗体具有中和活性。

实施例2

在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中，进行核苷酸序列同源性分析(Blastn)，分析结果表明，四-19Fab抗体轻链基因与人2号染色体替代合成的CHM1_1.1序列(NC_018913.2，Homo sapiens chromosome 2,alternate assembly CHM1_1.1)同源性最高，同源性为311/322(rang1)和267/273(rang2)，同源性百分比为97％(rang1)和98％(rang2)，具有IGKC和IGKV3-11的特征(见BLASTN1)；

SEQ NO.1 BLASTN 1(轻链基因序列)

RID GABFWZ8S014

Query ID lcl|Query_58289

Database:All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences(but no EST,STS,

GSS,environmental samples or phase 0,1 or2 HTGS sequences)

Number of sequences:176,974 Number of letters:6,857,531,230

Query Length＝812

Homo sapiens chromosome 2,alternate assembly CHM1_1.1

Sequence ID:NC_018913.2 Length:243205335

Range 1:89086476 to 89086792

Score＝529bits(286)；Expect＝3e-147；Identities＝311/322(97％)；Gaps＝5/322(1％)；Strand＝Plus/Minus

Features:

IGKC

Range 2:89256297 to 89256569

Score＝472 bits(255)；Expect＝4e-130；Identities＝267/273(98％)；Gaps＝0/273(0％)；Strand＝Plus/Minus

Features:

IGKV3-11

实施例3

四-19Fab抗体重链可变区基因的同源性，分析结果表明，四-19Fab抗体重链基因与人14号染色体初步合成的GRCh38.p7序列(NC_000014.9，

Homosapienschromosome14,GRCh38.p7PrimaryAssembly)同源性最高，同源性为289/309(rang1)和274/303(rang6)，同源性百分比为94％(rang1)和90％(rang6)，具有IGHG1和IGHV4-34的特征(见BLASTN2)。

SEQ NO.2 BLASTN 2(重链基因序列)

RID GACJTK31015

Query ID lcl|Query_187201

Database All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences(but no EST,STS,

GSS,environmental samples or phase 0,1 or2 HTGS sequences)

Number of sequences:176,974 Number of letters:6,857,531,230

Query Length＝865

Homo sapiens chromosome 14,GRCh38.p7 Primary Assembly

Sequence ID:NC_000014.9 Length:107043718

Range 1:105742777 to 105743084

Score＝459bits(248)；Expect＝4e-126；Identities＝289/309(94％)；Gaps:2/309(0％)；Strand＝Plus/Plus

Features:IGHG1

Range 6:106373664 to 106373955

Score＝388 bits(210)；Expect＝5e-105；Identities＝274/303(90％)；Gaps＝12/303(3％)；

Strand＝Plus/Plus

Features:

IGHV4-34

Features:

IGHV4-34

实施例4

四-19Fab抗体轻链可变区氨基酸序列的同源性分析，分析结果表明，四-19Fab抗体轻链氨基酸序列与Nivolumab单抗Fab片段轻链(5GGQ_L，ChainL,CrystalStructureOfNivolumabFabFragment)同源性最高，同源性为188/194，同源性百分比为97％，(见BLASTX3)；

SEQ NO.3 BLASTX 3(轻链氨基酸序列)

RID GAD7KXCX014

QueryID lcl|Query_204593

Query Length 812

Description All non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF excluding environmental samplesfrom WGS projects

Chain L,Crystal Structure OfNivolumab Fab Fragment

Sequence ID:5GGQ_L,Length＝214

Score＝353bits(905),Expect＝6e-121,Method:Compositional matrixadjust.

Identities＝188/194(97％),Positives＝189/194(97％),Gaps＝1/194(0％)

实施例5

四-19Fab抗体重链可变区氨基酸序列的同源性分析，分析结果表明，抗体重链氨基酸序列与来自Ch103抗体血系的M链(4QHK_M,ChainM,Uca(unbound)FromCh103Lineage)同源性最高，同源性为181/232，同源性百分比为78％(见BLASTX4)。

SEQ NO.4 BLASTX4(重链氨基酸序列)

RID GADPU5TR015

QueryID lcl|Query_31493

Query Length 865

Chain M,Uca(unbound)From Ch103 Lineage

Sequence ID:4QHK_M Length＝232

Score＝289bits(740),Expect＝2e-95,Method:Compositional matrixadjust.

Identities＝181/232(78％),Positives＝193/232(83％),Gaps＝6/232(2％)

编码四-9Fab抗体的轻链和重链基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析结果表明未发现与其相同的基因序列。

利用IgBLAST分析四-19Fab抗体可变区结构，确定CDR区。将测序所得四-19Fab抗体轻链和重链可变区序列，在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/igblast.cgi)分析，得出其CDR区，见图3、图4、图5、图6、图7、图8所示。

核苷酸序列表如下：

序列表

序列表

<110> 中国人民解放军空军军医大学

<120> 具有中和活性的人源性抗汉滩病毒（HTNV）Fab抗体及应用

<141> 2022-01-09

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 325

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gaaattgtgt tgacgcagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacatta ccccccagag gacgttcggc 300

caagggacca aagtggatat caaac 325

<210> 2

<211> 378

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tgcagctaca gccagtgggc gcaggactgt tgaagccttc ggagacccct gtcccctcac 60

ctgcgctgtg tctggtgggt ccctttcact ggtccactac ctggaaactg ggtccgcctg 120

cccccccagg gaaggggctg gagtggattg gggagatcag tcatggtgga agcaccatct 180

acaacccgtc cctcaagagt cgtgtcacca tatcagtcga cacgtcgaag aaccagttct 240

ccctgaggct gagcgctgtg accgccgcgg acacggctgt gtatttctgt gcgagcagag 300

atagtagtgg ttattacgct caggttcaag atgcttttga cttctggggc caagggacaa 360

tggtcaccgt ctcttcag 378

<210> 3

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Gly Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr Ile Thr Pro Gln

85 90 95

Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 4

<211> 125

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Gln Leu Gln Pro Val Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Pro

1 5 10 15

Val Pro Ser Pro Ala Leu Cys Leu Val Gly Pro Phe His Trp Ser Thr

20 25 30

Thr Trp Lys Leu Gly Pro Pro Ala Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Glu Ile Ser His Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ala Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Arg Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Ala Gln Val Gln Asp Ala Phe

100 105 110

Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

Claims

1.一种具有中和活性的人源性抗汉滩病毒(HTNV)Fab抗体，其特征在于，包括轻链和重链可变区和一个恒定区；

所述轻链的可变区的3个互补决定区(CDR)序列为：

CDR1:Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr；

CDR2:Asp-Ala-Ser；

CDR3:Gln-Gln-Ser-Tyr-Ile-Thr-Pro-Gln-Arg-Thr；

所述重链的可变区的3个互补决定区(CDR)序列为：

CDR1:Val-Gly-Pro-Phe-His-Trp-Ser-Thr-Thr；

CDR2:Ile-Ser-His-Gly-Gly-Ser-Thr；

CDR3:Ala-Ser-Arg-Asp-Ser-Ser-Gly-Tyr-Tyr-Ala-Gln-Val-Gl n-Asp-Ala-Phe-Asp-Phe。

2.根据权利要求1所述的一种具有中和活性的人源性抗汉滩病毒(HTNV)Fab抗体，其特征在于，所述的Fab抗体轻链可变区基因的序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO.1所示；所述的Fab抗体重链可变区基因的序列核苷酸序列表中SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的一种具有中和活性的人源性抗汉滩病毒(HTNV)Fab抗体，其特征在于，所述的编码Fab抗体轻链可变区的氨基酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO.3所示；所述的编码Fab抗体重链可变区的氨基酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO.4所示。

4.一种具有中和活性的人源性抗汉滩病毒(HTNV)Fab抗体在治疗抗HTNV感染或设计HFRS疫苗的应用。